微生物范例

一、常用微生物检测技术

1.染色技术

染色技术则是对微生物细胞进行染色后，对微生物进行观察检测的一种技术，不过由于染色后微生物标准基本是死的，其形态和结构会在染色过程中发生一定变化，无法切实反应出活细胞的真实情况，因此通常只作为辅助检测手段。在实际操作中，整个流程也较为繁琐，染色、脱色都需要严格控制，否则将会影响检测结果的准确性。

2.分离纯化技术

自然环境中的微生物通常是杂居混生的，在微生物检测中需要对混生微生物群体进行分离纯化，以对纯微生物进行检测的技术，分离纯化技术常用于菌种鉴定中，分离纯化技术是微生物检测的一项重要技术，是微生物检测的重要基础。

3.其它技术

在微生物常规检测中，通常对微生物进行形态结构、培养特性方面的观察，再利用化学反应来测定微生物的代谢物，以鉴别一些形态和其它方面不易区别的微生物，以更好的进行微生物分类鉴定。近年来，在环境监测中，微生物检测技术运用方法较为广泛，如运用细菌总数和粪便污染指示菌监测水质，运用发光细菌检测环境有毒物质，运用水中藻类生长量监测水质或物质霉性等等，这些方法都已经有了较为成熟的操作手段和检验标准，具有较强的实践价值。

0引言   酯酶（Esterases，EC3．1．1．X）是一种催化酯键水解和合成的酶的总称，水解时催化酯键产生甘油和脂肪酸；合成时，把酸的羧基与醇的羟基脱水缩合，产物为酯类及其他香味物质．它广泛存在于动物、植物和微生物中．动物胰脏酯酶和微生物酯酶是酯酶的主要来源．1834年Eberle在兔胰脏中首次发现脂肪酶，微生物酯酶则以1935年Kirsh发现产脂肪酶的草酸青霉（PenicilliumOxalicum）为最早．由于微生物资源丰富，同时利用微生物发酵产酶具有便于工业化生产等优点，微生物酯酶得到关注，并且已经广泛应用于农业、食品酿造、医药化学、污水处理和生物修复等领域，又由于酯酶的酶促反应具有较高的底物专一性、区域选择性或者对映选择性，它是合成手性化合物（如手性药物，农药等）的高效生物催化剂，微生物酯酶已成为研究热点．   1微生物酯酶的组成及来源   1．1酯酶的组成   酯酶主要包括脂肪酶（Lipase，triacylglycerolhydrolases，EC3．1．1．3）和羧酸酯酶（carboxylesterases，arboxylesterhydrolases，EC3．1．1．1）［1－2］，两者在生化方面没有本质区别，只是在底物特异性上，羧酸酯酶倾向于水解酰基链长度小的底物（≤10），而脂肪酶倾向于水解酰基链长度大的底物（≥10）［3－4］，在结构上，酯酶属于α／β水解酶超家族，具有Ser－His－Asp构成的催化中心三组合（catalytictriad），其中Ser通常位于具有保守的Gly－Xaa－Ser－Xaa－Gly五肽结构内［1－2］．细菌脂肪酶又包括八大家族：truelipase，GDSL，FamilyIII，thehormone－sensitivelipase（HSL），FamilyV－VIII，其中truelipase又包括7个亚族SubfamilyI．1－I．7［2，5］．阿魏酸酯酶（Ferulicacidesterase，EC．3．1．1．73）又称为肉桂酸酯酶，是最近分离出一种酯酶，它是羧酸酯水解酶的一个亚类，它能水解阿魏酸甲酯、低聚糖阿魏酸酯和多糖阿魏酸酯中的酯键［6］．   1．2微生物酯酶的来源   在自然界中能产生酯酶的微生物资源是非常丰富的，从分类上看主要是真菌，真菌中主要是青霉、链孢霉、红曲霉、黑曲霉、黄曲霉、根霉、毛霉、酵母菌、犁头霉、须霉、白地霉和核盘菌等12属23种；其次是细菌，在细菌中主要是芽孢杆菌属、假单胞菌属以及伯克霍尔德菌属等；另外，放线菌中的个别种类也能产生一定量的酯酶．2产酯酶微生物的筛选及酶活力的测定一般筛选流程为：样品→富集培养→平板分离→平板初筛（观察透明圈）→摇瓶复筛（测酶活力大小），三油酸甘油酯是产酯酶微生物初筛加入培养基中的常用底物，因为初筛选用平板培养基，而在培养基中存在不互溶的油、水两相，所以要对它们先进行乳化，乳化剂可选用聚乙烯醇或者吐温．溴甲酚紫由于反应后pH变化显色，而RhodamineB由于可以和分解后的物质结合形成显色物质，它们被用作常用指示剂加入培养基内［7］．对于酯酶活力的测定，常见方法有以下几种：酯酶活力比色法，即以对硝基苯酚为底物，分光光度计测定400nm处吸光度值［7］；酯酶活力滴定法，以NaOH滴定三醋酸甘油酯在酯酶作用下释放的醋酸来测定；α－乙酸萘酯比色法，即先绘制α－萘酚标准曲线，然后在pH10的Tris－HCl缓冲液中，以α－乙酸萘酯为底物和粗酶液反应，在595nm处测其吸光度值［8］．   3微生物酯酶与基因克隆   随着分子生物学和宏基因组学的发展，越来越多的研究人员从不同环境样品中筛选产酯酶微生物，克隆酯酶基因，构建高产的基因工程菌为进行后续的工业化生产打下基础．其中的环境样品的主要来源是土壤以及海洋，特别是海洋环境样品，因为海洋环境包括低温、高温、高静水压、强酸、强碱以及营养条件极为贫乏的各种极端环境，微生物要在这样的环境中生存，生理结构、代谢方式等都会发生一系列改变，所以从海洋中筛选到的微生物可能具备某些特殊的代谢产物，另外低温酯酶的研究也十分广泛，近年来已纯化或克隆表达了从南北极、深海、高山冻土中分离到的低温微生物产生的低温脂肪酶，如菌株PseudomonasfragiIFO3458（PFL），Pseudomonassp．KB700A，Pseudomonassp．B11－1，Aeromonassp．LPB4的脂肪酶［9－12］．郑鸿飞等［13］从青岛前海和胶州湾海区样品中分离到1株产酯酶活力和稳定性较高的菌株EB21；邵铁娟等［14］从2000多份渤海海区海泥样品中分离出一株新型脂肪酶高产菌株BohaiSea－9145，经鉴定为适冷性海洋酵母（Yarrowialipolytica）；张金伟等［15］从南极普里兹湾深海沉积物中筛选到一株产低温脂肪酶的菌株7195；林学政等［16］从南大洋普里兹湾的水样中筛选到一株产低温脂肪酶的深海嗜冷菌25101；JeonJH等［17］从南韩江华岛潮汐平原沉淀物宏基因文库中分离到一种耐盐的酯酶基因亚型；一个新的酯酶基因estDL30从冲积土宏基因组文库中被筛出，它由1524个核苷酸组成，编码的蛋白质又507个氨基酸组成，这个酯酶蛋白属于familyVII［18］；一个超表达的阿魏酸酯酶基因estF27从土壤宏基因组文库中被筛出［19］．   4微生物酯酶的应用   4．1在食品加工方面的应用   酯酶主要通过酯交换［20］、水解［21，22］及合成化合物等方式应用于食品加工方面．固定化脂肪酶现在已用于芳香酯的合成，而低分子量芳香酯多呈天然水果味，它们广泛应用于食品、饮料等食品工业，Melo等［23］研究用Rhizopussp．脂肪酶合成香茅醇芳香酯优化条件；利用酯酶使乳制品增香［24］，在酿酒和食用醋的生产中，利用酯酶提高乙酸乙酯、乳酸乙酯等酯类的含量，使口感有明显提高；食用油脂精炼工艺中，借助微生物酯酶在一定条件下能催化脂肪酸与甘油之间的酯化反应，从而把油中的大量游离脂肪酸转变成中性甘油酯，提高了食用油的价值；脂肪酶在面包专用粉中还有面团调理的功能，使面包质地柔软，颜色更白；酯酶催化合成单甘脂［25］是使用量最大的食品乳化剂；阿魏酸是天然抗氧化剂，也是近年来国际认知的防癌物质，广泛应用于食品原料中，目前已使用阿魏酸酯酶与其他酶协同从各种农作物副产品中提取阿魏酸［26］，并且阿魏酸作为合成天然香兰素的前体，利用微生物方法产生香兰素，具有毒性低、安全性高的特点，应用于食品中．#p#分页标题#e#   4．2在精细化工中的应用   表面活性剂在化妆品、洗涤用品中有重要用途，传统的化学生产具有选择性差、需要高温等缺点，酶法克服了这些缺点，酯酶催化糖酯等生物表面活性剂的合成，而糖酯是一种重要的生物表面活性剂；酯酶还有提高表面活性剂的释放［27］的作用；在洗涤剂中添加碱性脂肪酶，可以提高去污力，降低三聚磷酸钠等的用量，减少污染；酯酶的底物特异性及高度立体专一性可合成具有应用价值的精细化工产品，如化妆品的长链脂肪酸酯等．   4．3在手性化合物中的应用   由于酯酶酯化反应具有高底物专一性、区域选择性、对映选择性等优点，因此酯酶是有机合成中重要的生物催化剂，而且催化效率比化学试剂高出很多．手性化合物是指分子量、分子结构相同，但左右排列相反，如实体与镜中的映体的化合物，而医药领域很多药物都是手性化合物，而近年来酶拆分已经成为手性化合物拆分的研究热点，酯酶又是酶拆分中研究最为广泛的一种．WENS等［28］考察了实验室自制的LipaseCAN、LipaseRH两种酯酶对α一苯乙胺的拆分效果，并与几种商品酶做了对照，结果表明Novozyme435这种商品酶的拆分效果最好．GodinhoLF等［29］用酯酶高效的对1，2－O异亚丙基甘油酯进行拆分，其中对映体过量值可达到72％～94％；研究人员改良不同介质中固定化脂肪酶拆分手性化合物，如任梦远等［30］以自制的平均粒径为4．5μm磁性高分子微球为载体，采用离子交换法固定化Candidarugosa脂肪酶，催化（±）－薄荷醇的酯化反应，所制备的固定化脂肪酶在离子液体［bmin］PF6中催化拆分（±）－薄荷醇的效果最佳，与游离酶相比固定化脂肪酶的立体选择性有很大的提高，对映体过量值可达93％，对映体选择值为35．Zheng等［31，32］利用纯化后的重组后酯酶（Escherichiacoli．BL21）对薄荷醇进行转酯化拆分，结果显示，底物／酶质量比S／C≥50条件下，相对于丙烯酸、正丁酸酯化剂，乙酸酯化剂的效果最好（酯酶对乙酸薄荷酯的E＞100），且通过回收，固定化酶重复使用次数达4－5次．戴大章等［33］采用改性Ultrastable－Y分子筛固定化P．expansumPED－03脂肪酶（PEL），利用固定化PEL在微水相中对（R，S）－2－辛醇进行拆分，在以正己烷为溶剂，含水量为0．8％的体系中，于50℃反应24h的转化率（c）可达到理论值的97．68％，对映体过量值（e．e．）可达到98．75％．对于手性药物，是手性化合物中的研究热点，研究人员利用酯酶对其进行拆分，如（R）－氟比洛芬［34］、酮基布洛芬［35］等，使对映体过量值得到提高，提高了药物的有效值．   4．4在环境治理方面的应用   随着农业生产中农药的大量使用，农药污染、残留等问题也日趋严重，而农药中菊酯类杀虫剂广泛应用于果蔬、果树、花卉、林木等，由于其自然条件下难以快速降解，农药残留带来潜在的食品安全和环境污染问题．研究表明，菊酯类杀虫剂具有类固醇结合活性，可能影响人体激素正常水平［36］．研究人员对菊酯类杀虫剂的降解进行了大量研究［37，38］，而利用微生物降解农药是一条重要途径，研究表明从环境样品中筛选出的微生物对拟除虫菊酯［39］，包括氯氰菊酯［40］、丙烯菊酯［41］等有高效降解作用，随着分子生物学技术的发展，许多研究人员已经克隆到酯酶基因［42，43］，而利用基因克隆和酯酶的定向化技术，构建产酯酶的高效基因工程菌也已经成为环境保护的一个发展趋势．   5展望   近年来，随着宏基因组文库、基因工程、定向进化技术、固定化技术的发展，以及界面酶促过程等技术的深入开展，微生物酯酶的研究已经进行到分子层面，高效产酯酶菌株的筛选、诱变育种、基因克隆及其定向进化构建高效基因工程菌的研究取得了长足发展，随着人们生活水平的提高，食品、医药、化妆品等中的添加天然成分将受到广泛关注，特别是天然底物的生物合成和手性化合物的酶拆分，因此，微生物酯酶在食品、医药、精细化工等领域具有广泛的应用前景．由于微生物酯酶广泛的应用前景，本实验室最近从红树林土壤样品中通过宏基因组文库的方法筛选到一新型低温耐碱酯酶基因，已经提交到Genbank，其登录号码为（JQ701700）．实验室成员正在进行深入研究，酯酶的工业化生产及其在各领域的应用将会逐步实现．

传统的功能微生物鉴定方法是在含有特定碳源培养基上对目标微生物进行富集、分离与纯化，由于实验室可培养的微生物只占微生物总数的0.1~1%[1]，因此以纯培养技术为代表的鉴定方法存在很大局限性。20世纪后半叶，以分子生物学为特色的现代土壤微生物研究方法取得突破性进展，包括以磷脂脂肪酸（PLFA）技术为代表的生物化学方法，以BIOLOG技术为代表的生理学方法和基于DNA多态性的微生物群落结构和功能多样性的分子生态学技术，如变性梯度凝胶电泳（DGGE）、限制性片段长度多态性（RFLP）、末端限制性酶切片段长度多态性分析（T-RFLP）和实时荧光定量PCR技术（RT-PCR）等。上述技术提高了人们对土壤微生物群落结构组成的认识，但仍难提供有关微生物间相互作用及代谢功能微生物的直接信息[1-2]。例如，DGGE和T-RFLP等分子指纹图谱方法只能检测环境样品中的优势微生物群落，但具有特定生态和环境功能的微生物通常在数量上并不占优势[3]。因此，功能微生物很难被这些分子指纹图谱方法所鉴别[2]。据估算，每克土壤含有约100亿个微生物个体，包括100万种不同的微生物种群。利用上述技术，从这些难以计数的土壤微生物中原位鉴别特定生态过程的微生物驱动者是难以想象的[4]。近年来得到广泛关注的稳定性同位素探针技术与现代分子生物学相结合，可以在相对未受干扰的环境样品中培养功能微生物，利用稳定性同位素示踪复杂环境中的功能微生物核酸（DNA/RNA）或PLFA[5]，在分子水平鉴定生态系统重要过程的微生物驱动者。其基本原理是在土壤中添加含有稳定性同位素标记的代谢底物，土壤中利用该标记底物的微生物细胞在其生长繁殖过程中同化合成含标记元素的生物标志物。通过对生物标志物进行提取、分离、鉴定和比对分析，鉴别土壤中驱动特定生态过程的功能微生物。该方法可以准确获得功能微生物的目的基因，避免了从浩瀚基因库里一个个筛选目的基因的烦劳工作，已成为原位鉴定功能微生物的重要手段。   1土壤功能微生物SIP鉴定技术流程   SIP技术是耦合微生物遗传多样性与代谢多样性最有力的工具之一，该技术以复杂的原位或微宇宙土壤样品为研究对象，采用稳定性同位素原位标记土壤样品中特定微生物的DNA、RNA或PLFA。目前绝大多数研究采用13C标记底物培养土壤，利用13C-底物的微生物细胞不断分裂、生长、繁殖，合成含13C标记的DNA或RNA等生物标志物。提取土壤样品中13C-核酸和12C-核酸总混合物，用超高速离心技术将13C-核酸与12C-核酸分离，利用分子生物学手段对生物标志物进行分析，以鉴别土壤功能微生物。近年来，以15N和18O为基础的SIP技术也被成功应用于微生物驱动的土壤生态过程研究[6]。   1.1土壤SIP技术前处理方法选择   SIP技术前处理包括标记底物的培养和特定微生物核酸或磷脂脂肪酸提取两个步骤。培养方式主要包括添加营养液富集培养和仅添加标记底物培养等方式。添加营养液富集培养法可以为微生物生长提供相对稳定的环境，并促进微生物的生长，以获得足够的核酸或磷脂脂肪酸提取量[7]。土壤DNA/RNA的提取方法主要包括试剂盒提取法和液氮研磨法等。试剂盒法操作简单，提取纯度高，但提取量较低，费用高。液氮研磨法可以较好保证DNA/RNA的完整性，提取量相对较高，且操作费用低，时间短，但需纯化后才能满足RT-PCR等后续分子生物学要求[8]。土壤PLFAs提取方法主要为两种：一种是PLFAs法，即先通过氯仿-甲醇单相萃取浸提土壤微生物脂肪酸，再经硅胶柱纯化以及酯化作用得到活体细胞膜结合态FAME，提取的脂肪酸种类仅有El-脂肪酸，多为细菌所特有。另一种是TSFAMEs法，即通过碱甲醇分解法提取总土壤FAMEs。提取的脂肪酸种类包括酯连接和非酯连接PLFAs，多为真菌所特有[9]。   1.2土壤SIP技术中生物标志物的选择   土壤SIP技术中特定微生物的生物标志物为PLFA、DNA和RNA3种。PLFA-SIP法是将PLFA从重稳定性同位素（如13C）标记过的环境样品中提取出来，通过PLFA图谱分析微生物群落的结构和多样性，再通过气相色谱-燃烧-同位素比率质谱联用法测定各种PLFA中13C的丰度[7]。PLFA-SIP的标记底物浓度要求较低，灵敏度较高，但存在一些缺点：（1）对于未知PLFA分子图式的不可培养微生物，或者土壤中的某种特殊脂肪酸无法与特定种类的微生物相对应，该方法就无法鉴定功能微生物。（2）该方法在很大程度上依赖于标记脂肪酸来确定土壤微生物群落结构，标记上的变动将导致群落估算上的偏差。（3）细菌和真菌生长条件的改变或环境胁迫都能导致脂肪酸类型的改变[9]。同PLFA-SIP法相比，DNA-或RNA-SIP可获得更直接的功能微生物遗传信息。DNA-SIP的优点是：标记的13C-DNA一定来自新产生的子代微生物细胞，是证明微生物原位生长并驱动生态过程的最直接证据。另外，DNA完美的双链结构保证了遗传物质的稳定[10]。DNA-SIP的缺点是：自然环境中能被微生物利用的底物浓度通常很低，微生物大量分裂繁殖的可能性低，常需使用较高浓度的标记底物来刺激目标微生物的分裂繁殖，可能导致研究结果与原位自然环境的实际情况不相吻合[6,11]。RNA-SIP在一定程度上能克服上述缺点。自然环境中特定功能微生物发挥作用的同时，即使没有大量增殖生长，但具功能基因得到表达并在核糖体内合成蛋白质，获得标记的13C-RNA则表明微生物可能具有较强的活性。因此，RNA-SIP能够采用更低的标记底物浓度培养环境样品，研究结果更接近原位状况[12]。但因mRNA半衰期短、降解速度快，mRNA-SIP的实际应用仍存在较大的技术难度[13]。DNA-SIP和RNA-SIP的结合将会大大提升SIP技术的潜力。   1.3土壤SIP分离后的分析方法   13C-核酸与12C-核酸分离后，可以利用分子生物学手段对功能微生物的DNA/RNA进行分析，以鉴别土壤中重要生态过程的微生物驱动者。目前的主要分析方法包括分子指纹图谱法、实时定量PCR法和454高通量测序法等。（1）分子指纹图谱法是目前进行功能微生物的DNA/RNA分析的广泛使用的快捷方法，但分子指纹图谱分析方法的灵敏度较低。环境样品中微生物通常数以百万计，采用古菌或细菌通用引物的DGGE和T-RFLP只能检测环境样品中数量上占优势的微生物[14]。具有较为重要的生态和环境功能目标微生物通常在数量上不占优势。因此，目标微生物同化利用13C-底物后发生的微小变化很难被分子指纹图谱法所鉴别。（2）实时定量PCR法直接针对目标微生物的功能基因，采用高度灵敏的实时定量PCR测定不同密度层级中目标微生物的数量，显著提高了SIP技术的可靠性。然而，采用特异引物定量研究目标微生物存在一定难度。土壤中数量众多的微生物基因组DNA可能被13C标记，很难采用单一的功能基因或16SrRNA基因特异引物，同时研究众多目标微生物在不同密度层级中的分布规律。我们无从得知哪一种微生物可能利用稳定性同位素标记底物，无法设计特异的功能引物，只能通过选择性定量目标微生物，明确目标微生物在不同密度层级中的分布规律，同时判定SIP技术的可靠性[13，15]。（3）454高通量测序法是通过检测各浮力密度层中微生物16SrRNA基因组成，分析目标标记微生物占该层总微生物的比例，从而鉴别前所未知的重要功能微生物。该技术可规避PCR扩增，直接对标记13C-RNA测序，每次分析可获得大约100万16SrRNA基因序列，显著增强了重浮力密度层中13C-标记微生物DNA序列的检测灵敏度。高通量测序可全面分析微生物群体的物种、基因功能组成，最大程度地认识未培养微生物的遗传组成和生命活动，是目前最准确的方法[16]。但该方法目前测试费用较高，后续数据处理复杂，但随着技术发展必将成为功能基因组学研究的主流技术。#p#分页标题#e#   1.4构建克隆文库   超高速密度梯度离心分离并鉴别13C-DNA/RNA后，通常采用建立基因克隆文库，构建遗传系统发育树的方法分析13C-RNA和12C-RNA的微生物群落组成，并比较二者的差别，鉴定被13C底物所标记的微生物群落。   2SIP技术在土壤功能微生物鉴定中的应用   目前SIP技术在土壤分子生态学研究领域主要应用在原位鉴定介导有机污染物生物降解和碳氮循环过程的功能微生物方面。有机污染物生物降解研究多集中于单环芳烃、PAHs和PCBs的研究，碳氮循环研究多集中于植物-微生物相互作用对陆地生态系统中碳氮转化、土壤中碳氮周转速率、稻田产甲烷机理及产甲烷菌的研究。   2.1SIP技术在土壤有机污染物生物降解研究中应用   在有机污染物生物降解的微生物生态学研究中，SIP技术可以帮助了解在复杂原位土壤环境中，参与各个降解过程和途径中功能微生物种类。Hanson等首次使用PLFA-SIP技术研究甲苯的生物降解，总共提取发现的59种PLFAs中有16种出现13C标记[17]。Christopher等在对农田土壤中苯酚降解菌的研究中，对13C标记苯酚的DNA进行18S-28S内转录间隔区的PCR扩增，T-RFLP分析，成功分离出一种白色细状的真菌，并证实该真菌能加速苯酚的降解[18]。Sueoka等[19]利用RNA-SIP技术对13C标记苯酚的RNA反转录PCR和T-RFLP分析，新发现了3种苯酚降解菌。罗春玲、Xie等[20-22]利用DNA-SIP技术研究了甲苯、苯和间二甲苯的降解菌，对分离出的13C-DNA进行T-RFLP分析、克隆文库的构建，获得了相应的降解菌，并首次报道了TM7门对甲苯具有降解作用。Woods等使用H218O-DNA-SIP技术鉴定甲苯退化细菌，鉴定出一株已知的甲苯降解菌RHA1[23]。Padmanabhan等在Collamer地区的田间试验中，向受试的粉砂壤土供应13C标记的葡萄糖、咖啡因、萘和苯酚，通过GC/MS监控土壤中释放的13CO2浓度，以此估测底物降解速率，并将分离得到13C-DNA用通用引物对16SrRNA基因进行PCR扩增，最终得到29个完整的DNA序列[24]。Maiysha等利用DNA-SIP技术，研究了土壤中具有降解萘、菲和芘等6种多环芳烃功能的微生物群落，将13C作为标记元素，构建13C-DNA的16SrRNA克隆文库和RT-PCR分析，结果表明不可培养菌PG2不仅可以降解芘，还能降解荧蒽和苯并[A]蒽，从而说明PG2菌对四环PAHs有着良好的降解效果[6]。Tillmann等设计了一个PLFA-SIP微宇宙实验，将PCBs高度污染土壤暴露于13C-2,-2′-二氯联苯中，采用GC-C-IRMS测定不同PLFA13C的丰度，结果表明非优势菌在PCBs好氧降解过程中的主导作用[25]。Shahid等在对五氯酚降解菌的研究中，比较了DNA/RNA-DGGE和DNA/RNA-SIP-DGGE技术的鉴定效果，结果表明RNA-SIP技术可以更好反映功能微生物群落的变化趋势[11]。Sul等将DNA-SIP和宏基因组技术结合，对13C-联苯-DNA中芳烃双加氧酶基因片段PCR扩增，得到两串与bphA相似的序列组，构建1568粘粒克隆文库，发现除含bphAE基因外，还含有属于γ-变形菌纲的未知基因片段，该片段的G+C含量和bphAE相近，可能由于bphAE基因水平转移而形成的[26]。   2.2SIP技术在土壤C循环中的应用   土壤C转化是微生物主导的生物地球化学过程，SIP技术能够很好地将微生物群落与其功能联系起来，加深人们对陆地生态系统重要C循环过程的认识。Boschker等最先使用PLFA-SIP技术进行甲烷营养菌的研究[7]，随后，DNA-SIP技术被用于研究土壤中甲烷氧化菌的活性功能种群。Hutchens等在微宇宙中用13CH4对取自罗马尼亚MovileCave地下水系统的样品进行短期培养，以DNA-SIP技术为前提确定了3类含有编码甲烷单氧化酶基因的甲烷营养菌，并通过与非甲烷营养菌比对证明了交叉取食的存在[27]。Cebron等在研究养分添加对甲烷营养菌多样性的影响时，人工添加养分在一定程度上可避免交叉取食，改进了DNA-SIP方法[28]。Bengtson等研究了松树林土壤中的甲烷营养菌群落结构组成与CH4氧化率的联系，并简短讨论了DNA/RNA-SIP的局限性[29]。Borodina等用DNA-SIP法考查了英国不同陆地生态系统土壤中氯化甲烷营养菌的多样性，通过与培养分离法的结果比较，揭示出土壤中仍存在大量不可培养的卤化甲烷营养菌，并将卤化甲烷的全球循环同一组目前已知的卤化甲烷营养菌特征群联系了起来[30]。Radajewski等最先使用DNA-SIP技术进行甲醇营养菌的研究，通过13CH3OH培养森林土壤，证明被13C标记的细菌16SrRNA基因序列与已知可培养的甲醇营养菌及嗜酸甲烷氧化菌相似，首次表明此类细菌还存在于森林土壤中[6]。Feng等利用DNA-SIP技术证明了稻田土壤中，甲酸盐中的C首先被光营养的初级和次级生产者利用，随后产生的有机物被其他微生物利用[31]。陆雅海等用13CO2对水稻进行脉冲标记培养，利用RNA-SIP技术与T-RFLP分析，获得水稻根际的产甲烷菌，并通过厌氧和好氧条件的对比，表明根际环境和降解过程的多相性[32，13]。该团队还利用PLFA-SIP描述了水稻根际微生物活性的空间变化，提出在根际革兰氏阴性菌和真核微生物在同化根派生碳过程中最活跃，同时描述了围绕根际的活性群落的空间系统变化[9]。   2.3SIP技术在土壤N循环中的应用   15N作为生物体内大分子合成的组成元素，可结合SIP技术研究土壤中氮循环过程的各类微生物功能群及其相互作用。Georg等利用标记和未标记的N进行纯微生物培养，结果显示15N-DNA-SIP技术是可行的，但存在一定局限性，如可视条带需要大量的DNA，15N-DNA的理想丰度要求大于50%等[33]。Buckley等通过改变基因G+C含量来增加15N-DNA的浮密度，增加了15N-DNA的分离强度，为原位追踪利用N的微生物群落提供了新的研究方法，并采用15N2-DNA-SIP原位鉴定了独立生存的固氮微生物，通过分析15N标记DNA的16SrRNA，发现了3组新固氮微生物[34-35]。贾仲君等采用SIP技术示踪农田土壤氨氧化微生物DNA，发现相对于古菌，细菌是土壤硝化过程的主要驱动者[36]。贺纪正等对农田土壤生态系统中氨氧化古菌（AOA）和氨氧化细菌（AOB）进行一系列研究，得出二者在根际土壤中的丰度、组成对环境的响应占主导作用[37]，并发现土壤中硝化作用伴随着古菌amoA的基因丰度和多样性变化，进一步证明了氨氧化古菌可同化CO2，属于自养型微生物[38]。Jennifer等结合RNA-SIP和DNA-SIP技术，再次证明AOA可通过两种途径固定CO2，并在泉古菌（Crenarchaeota）中得到验证，进而强调了AOA在硝化和CO2固定过程中的重要性[39]。Karen等以北美黄松林为研究对象，应用H218O-SIP技术调查土壤中氨氧化微生物的生长与死亡情况，发现人工添加氨可刺激AOB的生长，与此同时AOA的死亡数量增加，而AOB则不受影响[40]。Ishii等在研究N2O在水稻土中的消减过程时，用13C标记的琥珀酸盐作为电子供体，鉴定了同化琥珀酸盐的微生物，指出大多数N2O消减微生物属于草螺菌属和固氮螺菌属。并证明前者消减速度大于后者，在水稻土N2O的减少过程中发挥重要作用[41]。#p#分页标题#e#   3研究展望   SIP技术能有效降低环境微生物群落分析的复杂度，获得功能微生物的目的基因，已成为原位分离功能微生物的重要手段。随着新一代454高通量测序技术的发展，SIP技术可最大程度地认识不可培养微生物的遗传组成和生命活动，获取其功能基因，优化并人工合成在原位环境中具有高效同化或降解作用的新基因。结合土壤化学等方面知识，共同探讨土壤环境中功能微生物的代谢途径和同化过程，挖掘微生物基因资源，鉴别土壤关键元素循环的微生物驱动机制等，将是未来研究发展的热点和重点。

【摘要】为了确保我国国民的身体健康，必须要对所有市场上的食品进行微生物检测。现阶段我国常用的针对食品进行微生物检测的技术种类相对较多，而在针对不同食品进行检测的过程中必须要合理地选择检测技术，这样才能够提高检测的效率和检测的准确性。基于此，本文通过分析现阶段食品微生物检测技术的具体分类，以及在应用过程中的现状，探究食品微生物检测技术的发展前景和发展方向。

【关键词】食品；微生物检测技术；应用现状；展望

食品微生物检测技术是当前保证我国国民食品安全的重要基础技术，随着国民生活水平的不断提高，国民对食物的种类和数量也有了更高的追求。但是现阶段由于国民在食用食品的过程中，出现了很多食品安全事故，所以导致国民的生命健康受到了一定威胁，因此，食品管理人员必须要通过食品微生物检测技术，提高食品的微生物检测准确度，确保在市场上进行流通的食品能够具备相应的安全性，在食品的生产、加工及包装、运输等过程中，要针对不同的环节，采取合理的微生物检测技术，确保我国国民不会因为食品的微生物污染而出现一系列的病症。

1传统食品检测技术

当前，一些传统的食品检测技术还在我国食品微生物检测过程中具有广泛的应用，由于传统的食品检测技术具有丰富的实践，所以在实际检测过程中，虽然效率性得不到保障，但是仍然具备一定的准确性，目前我国常用的传统食品检测技术主要分为显微镜检测法和平板培养法，尤其是在平板培养法的应用过程中，由于需要对食品进行抽样检测，并且提取相应的微生物组织，所需要的时间相对较长。因此，传统食品检测技术可能不符合现阶段我国逐渐发展的食品检测流程。不过仍然要对传统的食品检测技术进行相应的分析，确保一些科技相对最为落后的地区，能够通过传统的显微镜检测法和平板培养法，对食品中的微生物进行合理的检测，保证我国国民的生命健康和食品安全。

1.1显微镜检测法。显微镜检测法是现阶段在微生物检测过程中较为常用的方法，通过显微镜检测法不仅可以更加直观的检测出微生物的数量和形态，还可以提高检测的效率，通过显微镜对食品进行检测，存在的优缺点主要体现在以下两个方面：首先，由于在使用显微镜检测的过程中，只需要通过染色油镜进行镜检即可，因此，其在检测时更加具备快捷性和简便性。即使一些对于微生物检测方法不太了解的工作人员，在食品进行微生物检测的过程中，只要掌握了显微镜的使用方法，也可以明确食品中的微生物形态及数量，同时显微镜检测方法由于在我国食品安全的应用过程中时间相对较长，所以具备丰富的实践经验和理论基础，所以为食品安全检测工作人员提供了很多的方便。但是显微镜检测方法也具有一定的缺点，例如在针对微生物进行检测的过程中，由于只可以看到微生物的具体位置和数量，但是不能够明确微生物的生存状态，一旦过多的活性微生物在食品中，仍然会导致食品具有较大的毒性。所以显微镜检测法作为传统检测技术中的重要组成部分，在后期的使用过程中，可能会具备一定的局限性。同时负责显微镜检测法使用的工作人员也应该明确现阶段产生的新型检测技术，并且尽量结合新型的检测技术与显微镜检测法相结合，确保能够提高检测的准确性和检测效率，使我国传统检测技术既不会丧失应有的价值，又可以更加广泛的应用在现阶段的食品微生物检测中。

1.2平板培养法。在传统检测技术中的第二种经典方法为平板培养法，这是在现阶段我国食品微生物检测中最为经典的方法，通过这种方法可以对微生物的具体生存状态，数量以及种类等进行明确的判断。平板培养法的优点主要体现在实际的培养过程中，由于可以真正的将食品中的微生物进行相应的培养，并且明确微生物的具体种类，所以在实际检测的过程中，可以为食品安全检测提供一定的理论基础，但是这种方法也存在很多的缺点，例如使用平板培养法时间相对较长，并且操作也相对较为复杂，而且针对培养的环境要求更为苛刻，既需要保证无菌培养又需要在适当的温度和湿度环境下进行培养，所以在进行检测的过程中降低了检测的效率，因此，这种传统的检测技术，已经不再适用于现阶段对所有种类食品进行检测的过程中。由于检测效率相对较低，现阶段这种检测方法已经不再被我国食品安全监管部门广泛使用。

20世纪70年代后期，科学家在东太平洋洋隆（EPR）和加拉帕戈斯扩张中心发现了一种低温热液从玄武质基岩的裂隙中弥散溢出，在这些弥散流的溢出点周围发育着大量的与硫氧化菌共生的管状蠕虫和双壳贝类热液生物群落［1］。此后的几十年来，大量的现代海底热液活动相继被报道，而在这些海底热液场中，大范围的低温弥散流区域总是同时伴随着高温集中流出现［2－4］。这些热液环境中发育的生态群落与地球上其它以光合作用为基础的生态群落有所不同，它们是以化能合成的自养微生物为基础。这些微生物通过氧化热液流体中的还原性物质（CH4，H2，H2S，Fe2＋和Mn2＋等），从而获取新陈代谢的能量［5－7］。研究者采用比较测量等手段对热液场进行详尽地分析后发现，低温弥散流的化学通量比高温集中流大［8］，热通量也是高温集中流的几倍以上［9－10］。因此，低温热液对于依靠流体中的化学物质生长与繁衍的热液生态群落具有更重要的意义。然而相对高温热液喷口大量的微生物学研究，人们对低温热液弥散流的关注程度仍非常低［11－12］。近年来，随着对热液系统的研究深入，人们逐渐认识到低温热液对海洋热通量和化学通量的贡献，以及对生命起源和深部生物圈探索的意义，对低温热液弥散流的微生物研究也重视起来［13－17］。本研究综述了近年来低温热液弥散流区域微生物生态的研究进展，以及这些研究对深部生物圈探索的启示。   1　海底低温热液弥散流的形成机制与化学组成   研究低温弥散流的形成机制与热液地球化学环境参数的变化，对于理解低温弥散流区域微生物多样性与变化具有重要意义。研究者结合目前已经发现的低温热液弥散流热液场的数据，提出了低温热液流体的3种形成机制：1）高温热液相分离的流体与洋壳中海水相互混合而被稀释［11－12］；2）高温热液流体在浅层地壳中的传导性冷却；3）高温流体、海水和被改造的海水的3组分相混合［18］。这3种机制中由第一种占据主导地位，共同控制现代海底热液弥散流的形成［19］。海底低温热液弥散流体的化学组成复杂，通常富含CO2，CH4，H2，H2S和Si在一些样品中也富含Fe2＋，Mn2＋［4，20－24］（表1）。它们的组成在时间和空间上是高度变化的［5，17，25－27］，即使在同一个热液区域，如东北太平洋形成的低温热液流体，其热液化学成分的变化也很大（表1）。这种多变性是由热液终端端元流体的时空变化所控制，并受到深海底部的热液流体稀释强度的影响［2，5，25，28］；另外，海底深部传导性热交换、沉淀过程、火山活动、潮汐作用以及微生物改造等也是影响化学成分多变性的重要因素［17］。总之，低温热液流体中化学组分多变，富含丰富的还原性物质，正是这些还原性物质所引起的氧化还原放能反应为海底热液生态系统的繁衍提供了充足的物质基础。   2　海底低温热液弥散流区微生物生态的研究进展   目前，对现代海底低温热液弥散流区微生物学的研究手段主要为传统的富集分离培养和非培养技术［30］；特别是基于16SrRNA基因和特征性功能基因的系统发育分析等现代分子生物学技术的发展，加快了对现代热液系统微生物研究的步伐。目前在大多数已发现的低温热液区域都有关于热液微生物的研究报道，包括胡安•德福卡洋脊［13，15，31］，大西洋中脊［24］，有机质丰富的Guaymas盆地［32］，冲绳海槽［33］，马里亚纳扩展盆地［34］和深海海山［22，35］等。研究结果表明，在这些低温弥散流热液场内的微生物具有一些共同的生态学特征：微生物生物量大、种类丰富、覆盖广。其中已发现的微生物种类包括α，β，γ，ε，ζ和δ变形杆菌，酸杆菌门（Acidobacteria）、产水菌目（Aquificales）、拟杆菌门（Bacteroidetes）、壁厚菌门（Firmicutes）、浮霉状菌（Planctomycetes）、各种Candidate　Divisions细菌、嗜热球菌（Thermococcus）、甲烷球菌（Methanococcus）和其他一些嗜热和超嗜热古菌等［15，31－32，34，36－39］。在这些丰富的微生物类型中，化能合成自养微生物是海底热液系统中生命新陈代谢的初级能量制造者，它们的存在是热液生物群落繁衍的基础。这些化能合成反应包括了硫氧化、铁氧化、氢氧化、甲烷氧化和硫酸盐还原等，其中硫氧化与铁氧化反应最为重要，与之相关的微生物在低温热液场中的发现也最为频繁（表2）。   2．1　硫氧化微生物   与硫氧化相关的新陈代谢反应是低温热液环境中微生物获取能量的重要途径。与周围背景环境相比，低温热液弥散流中H2S的浓度相对周围海水呈数量级倍数增加［22］，这些含硫化合物的存在为化能合成自养微生物提供了新陈代谢反应所需的电子供体［42］。目前在低温热液系统中发现的硫氧化微生物主要属于ε、γ和α变形杆菌。ε变形杆菌的生理机能多样，能在高温条件下以硫元素的化学反应进行自养或异养活动［43］，其中的一些类群是典型的从硫或硫代硫酸盐氧化反应过程中获取能量的微生物，如Sulfurovum　lithotrophica，Sulfu－rimonas，Thiovulumspp．和弓形杆菌Arcobacter　spp．等。ε变形杆菌在热液环境中广泛存在，包括流体、微生物菌席或与热液大型生物共生［36，44－47］。Opatkiewicz等［43］在胡安•德福卡洋脊Axial海山上的低温热液场中就发现了丰富的ε变形杆菌，并指出它们的分布与流体中氢、硫和铁等元素的浓度有关。Rassa等［35］在夏威夷Loihi海山上的低温热液场中不同温度梯度的弥散流处放置了41个原位生长微腔体（microbialgrowth　chambers）。经过短期（4～10d）和长期（1～6a）的观测，发现在中间温度（51℃）的弥散流处ε变形杆菌是微生物群落的主要组成之一，而在温度较高处（71℃）其占据更主导的地位。此外，Perner等［24］在大西洋中脊最南部（9°S）的Lilliput低温热液场中也发现了大量的ε变形杆菌，有长杆、丝缕、短杆和球状等多样形态结构。除了ε变形杆菌外，γ变形杆菌中的Thiomicrospira　spp．也是热液环境中常见的硫氧化菌。如在Lilli－put低温热液场，γ变形杆菌中的Thiomicrospira　spp．与ε变形杆菌一样占据优势地位［24］。Podgorsek等［40］在斐济盆地北部的富H2S的低温弥散流热液场中也分离获得大量α和γ变形杆菌中的自养或兼养硫氧化细菌。#p#分页标题#e#   2．2　铁氧化微生物   铁既可以作为化能自养的电子供体也可以作为厌氧呼吸的电子受体［48］。低温热液弥散流体中富含的还原性铁为铁氧化的自养微生物提供了丰富的能量，因此在富铁的海底热液低温弥散流区域内发现了铁氧化菌的广泛分布。目前在热液场中已经发现的铁氧化微生物包括α、β和γ变形杆菌，如赭色纤毛菌Lepto－thrix　ochracea，含铁嘉氏铁柄杆菌Galliionella　ferruginea，Gallionella　capsiferriformans，Sideroxydanslithotrophicus等［49－51］，以及最近发现的ζ变形杆菌［52］。Mariprofundus　ferrooxydans是从Loihi海山上富铁菌席中分离获得（图1a），它是1种嗜中性的化能自养铁氧化菌，以二氧化碳为碳源，能从二价铁转变成三价铁的氧化反应中获取新陈代谢的能量［52－53］。通过对纯培养微生物M．ferrooxydans的分类鉴定结果进行评估，人们将其划归为变形杆菌门下一个新的亚类－ζ变形杆菌。ζ变形杆菌在低温热液流体及其沉积物中的发现具有重要意义。因为从20世纪80年代开始，在现代和古代的热液矿物中发现了大量的茎状铁氧化物［54］，当时科学家从形态学上推测这是1种生物成因的铁氧化物，但却缺乏有力的生物学证据。而最近的研究发现，M．ferrooxydans在生长过程中能够产生结构相似的铁氧化物（图1b）［53］，当其死亡后铁氧化物并能在其表面保存下来（图1c）［53，55］。因而，ζ变形杆菌的发现为茎状铁氧化物的生物成因推论提供了有力的支持。人们最初认为ζ变形杆菌在自然界中的分布比较少，而随着进一步调查后发现它们其实广泛分布于一些富铁的低温热液场中。例如，在Tonga　Arc海山上发现了一些富铁低温弥散流（30～70℃，Volcano　1），其流体形成的主要矿物是二峰水铁矿（two－line　ferrihydrite）。透射电镜显示，这些铁氧化物的形态与M．ferrooxydans形成的构型非常一致［56］，随后的分子生物学的研究结果也证实了在Volcano　1处分布了大量的ζ变形杆菌［41］。此外，Davis等［23］在胡安•德福卡洋脊Cleft段低温弥散流场中所采集的沉积物柱也发现大量的ζ变形杆菌。而在马里亚纳盆地的低温热液弥散流区的微生物菌席中，荧光定量PCR的结果表明，它们更是占到了原核细胞总数的22％［34］。关于低温弥散流中发现ζ变形杆菌的报道还有很多，如马尼亚纳岛弧中的Eifuku海山和夏威夷Loihi海山［35］等。虽然对ζ变形杆菌发现的报道越来越多，然而目前对它们的研究尚属起步阶段，上述研究也表明，M．ferrooxydans只是ζ变形杆菌中一个较小的分支，仅凭一株可培养的M．ferrooxydans还不能将ζ变形杆菌的所有功能研究清楚。因此，还需要开展大量的ζ变形杆菌的适应性培养工作，深入探索它们的生理化学特征。   2．3　氢氧化微生物   在超基性基岩上发育的海底低温热液弥散流体中通常富含H2，H2在氧化过程中能释放大量的能量，这就为以H2的氧化反应获取能量的微生物提供了存在的基础。微生物消耗或产生氢气是由氢化酶所催化，氢化酶包括3种，分别为［NiFe］－氢化酶、［FeFe］－氢化酶和［Fe］－氢化酶，它们之间并没有分子进化上的联系［29，57］。Perner等［29］对大西洋中脊不同基底上发育的低温热液场进行了对比，研究对象包括ComfortlessCove热液场中的Clueless低温弥散流喷口（玄武质基底）和Logatchev热液场中的Quest弥散流喷口（超基性岩基底）。结果表明，以玄武质为基底的Clueless低温热液流体中H2浓度很低，且氢化酶基因仅有2种；而以超基性岩为基底的Quest低温热液流体中H2浓度非常高，相应的氢化酶基因也非常丰富。这一研究结果同时表明在海底低温热液场中影响氢氧化微生物分布的重要因素是水体中H2和O2的浓度的大小［29］。目前在低温热液区域发现的氢氧化微生物有产水菌目（Aquificales），Dehalococcoidales，Desulfurococcale和ε变形杆菌中的一些下属菌种微生物，以及利用H2和CO2产甲烷的甲烷球菌目Methanococcales等［29，58－60］。   2．4　其他新陈代谢途径的微生物   除硫氧化、铁氧化和氢氧化等化能自养微生物的频繁出现外，在低温热液喷口微生物系统中，甲烷氧化菌、产甲烷古菌、氨氧化古菌和硫酸盐还原菌也是不可忽略的组成部分，它们通过自养或异氧方式进行生命活动。前人利用甲烷氧化（pmoA）、氨氧化（amoA）和硫酸盐还原（dsrAB）等功能基因已经对这些微生物在热液环境中的分布进行了研究。Nercessian等［61］对东太平洋洋隆13°N和大西洋中脊Rainbow热液场的低温流体、沉积物进行了分析，通过功能基因发现了大量的甲烷氧化、产甲烷与硫酸盐还原微生物的存在，包括超嗜热的Methanopyrales和甲烷暖球菌科（Methanocaldococcaceae）、嗜热和喜温的甲烷球菌科（Methano－coccaceae），嗜热的甲基热菌属（Methylothermus）和喜温的I型甲烷氧化菌，和超嗜热的古烷菌目（Archaeo－globales）、嗜热的热脱硫杆菌目（Thermodesulfobacteriales）和喜温的脱硫叶菌科（Desulfobulbaceae）。   3　海底低温热液弥散流体所揭示的深部生物圈   低温热液流体研究的一个重要意义在于其环境是研究地球深部生物圈的窗口［62］。Gold［63］认为嗜热与超嗜热微生物占据了地壳的部分区域，其生物量很可能超过地表生物的总和。因为海底上部500m以内的洋壳中孔隙度较高，热液流体与海水在其中能够轻易运移而循环，这种循环能引起化学梯度的变化，其为一些极端微生物在洋壳深部中的生存提供了良好的物质基础和环境。在纽芬兰岛边缘的ODP210钻探结果显示微生物存在的深度甚至可以延伸至1　600多m［64］。由于样品采集的限制，直接导致对洋壳内部的研究非常困难，所以，通过低温热液流体的研究来探测洋壳深部生物圈就显得弥足珍贵［13，15，31］。通过对流体中地球化学参数的分析，可以有效地了解微生物在深部生物圈中的生物地球化学作用，如O2，S2－，NO－3，SO2－4和H2的消耗，NH＋4和CH4的产生都是微生物在热液流体中作用的标志［16－17，25，65－66］。例如，在东太平洋9°50′N和Suiyo海山的热液场中，通过对低温热液流体与高温热液流体中的甲烷与二氧化碳同位素的分馏证明了深海底部存在着产甲烷与甲烷消耗的微生物活动的存在［19，27］。通过培养和非培养手段对低温热液流体中微生物进行研究，能更直接反映深部微生物的分布状态和新陈代谢方式。例如，Holden等［13］在胡安•德福卡洋脊CoAxial低温热弥散流体（15～30℃）中分离出了一些最佳生长温度为55～60℃的嗜热和超嗜热微生物；在排除了这些微生物来自周围高温流体的微生物污染这个可能后，研究人员指出它们应当来源于环境温度更适合其生存的洋壳深部。另外，Kato等［67］研究了马里亚纳南部热液场中采用钻孔所取得的低温洋壳流体（2～69℃），表明在这些流体中存在大量的细菌和古菌，其中Thiomicrospira和ζ变形杆菌占优势地位，ζ变形杆菌的细胞数量占原核细胞总数的32％。这些对低温热液流体的研究结果证明了洋壳深部生物圈的存在，其新陈代谢的能量主要来源于甲烷、铁的氧化和硫的氧化与还原。#p#分页标题#e#   Huber等［15］通过对东北太平洋Axial海山的低温热液场（Marker33）中流体微生物多样性的长期跟踪，基于前人对该区域地质和化学的报道，提出了洋壳深部生物圈的微生物种群与热液化学过程的理想模式（图2）［15］。根据热液与海水两端元的混合模式，将洋壳上部深部生物圈内划分成3个层位：1）上层，以海水为主，混入了少量的热液。海水为这一层中的微生物提供了足够的碳源、能量和电子受体，其优势群体为喜温的硫、铁或甲烷的氧化者，如ε，ζ，β和γ变形杆菌等；2）最下面的深部层为厌氧、温度高于50℃的环境，以热液流体为主，并混入少量的海水。这个区域为一些喜温嗜热的硫还原菌和利用热成因有机质的嗜热古菌提供了适合的生存环境，如脱硫杆菌属（Desulfurobacterium）和热球菌目（Thermococcales）［13，22，64］；3）中间层是化学梯度变化最大的氧化还原层，热液流体和海水在此能够充分混合，提供了从无氧到有氧，中温到高温的各种微环境。该层中主要发育一些厌氧嗜温的产甲烷生物，如甲烷球菌目（Methanococcales）或一些新发现的细菌，如Candidate　Division　ABY1和WS6以及一些需氧或微需氧的硫、铁与甲烷氧化细菌，如ε和γ变形杆菌［15］。   4　结　语   海底热液系统是现代海洋科学研究的热点，近年来，该系统中的低温热液弥散流受到越来越多的关注。通过对低温弥散流区域微生物学的研究，我们逐步了解低温弥散流区域的微生物生态学特征及化能合成自养微生物，尤其是铁氧化和硫氧化相关的化能自养微生物在低温热液区域的分布规律，充分认识到这些自养微生物在热液生态系统中的支柱作用，并肯定了地球化学因素对微生物生态分布的制约。对低温热液流体中的微生物研究，也为我们得以窥探深部生物圈，进一步揭示地壳深部微生物的新陈代谢机理，从而了解其生命演化与发展奠定了基础。   然而，目前国内外在这方面所开展的研究工作还有一定的局限性，包括样品的采集、原位地球化学参数的分析以及生物学手段自身的缺陷，都会对当前的研究结果造成影响。其局限性主要表现为：首先，由于DNA在常温条件下容易降解，这就为样品的保存和及时分析提出了严格的要求。但受到船载实验设备的限制，样品在船上不能立即展开分析，只能采取室内分析，而且从采集、存储、运输和室内分析这一过程往往需要花费较长的时间，这就在一定程度上导致了样品中微生物量的失真和群落结构的细微变化。其次，原位流体化学数据缺失严重。原位流体化学数据能够有效反映原位沉积环境的信息，但是目前的采样手段主要是电视抓斗和海底拖网，这些采样设备在起样的过程中会导致背景海水与原位流体大量的混合，从而造成原位流体数据失真。因此，这就需要科学与技术的完美结合，进一步完善海底热液研究的技术手段，如我国正大力发展的载人深潜器和海底观测网的建设。这些技术手段的实现将对海底低温热液场原位数据的准确测量和连续观测提供有力的保障。另外，基因芯片的应用可以全面而翔实地获取原位环境中微生物新陈代谢途径的信息，而针对低温热液，目前世界上还未展开类似的工作。这些新的采样、测量和分析技术的运用，将进一步揭示低温热液区微生物与地球化学的相互耦合、生物矿化机制、微生物对洋壳的改造、深部生物圈的演化以及生命起源等重大科学问题的答案。

摘要：为研究我国内蒙古特色干制发酵乳制品中微生物物种多样性、游离氨基酸和短链脂肪酸组成的其相关性。该研究通过高通量测序技术对内蒙古地区5种特色干制发酵乳制品中的微生物16SrDNAV4~V5区测序分析其细菌多样性，利用GC-MS和HPLC分别测定短链脂肪酸和游离氨基酸含量。结果表明奶渣子的微生物，群落多样性和总体丰度最高。5种样品之间的微生物群落物种组成差异较大，在属水平上阿如勒、奶豆腐和酸奶豆腐的优势细菌为乳球菌属（Lactococcus）和乳杆菌属（Lactobacillus），奶皮子的优势细菌为假单胞菌属（Pseudomonas）和不动杆菌属（Acinetobacter），奶渣子的优势细菌为乳球菌属（Lactococcus）和沙雷氏菌属（Serratia）。在主成分分析（principalcomponentanalysis，PCA）中，酸奶豆腐和奶豆腐的样两者之间的物种组成度相似度最高。短链脂肪酸分析中，共检测出23种短链脂肪酸，奶皮子含有短链脂肪酸的种类最多，游离氨基酸分析中，共检测出24种游离氨基酸，奶豆腐包含24种游离氨基酸，且含量也明显高于其他4个样品，5种样品中所包含同种的短链脂肪酸和游离氨基酸含量均存在显著差异（P＜0.05）。在冗余分析（redundancyanalysis，RDA）中，羟脯氨酸和谷氨酸与乳球菌（Lactococcus）和乳杆菌（Lactobacillus）呈现正相关，绿脓杆菌（Pseudomonas）与丁酸、己酸、辛酸和癸酸呈现正相关。研究揭示了内蒙古特色干制发酵乳制品中微生物组成、短链脂肪酸和游离氨基酸之间的关系，为传统发酵干制乳制品产业发展优化提供一定的理论依据。

关键词：短链脂肪酸；游离氨基酸；微生物多样性；高通量测序；干制乳制品

发酵是一种有着数千年历史的食品保存和加工的方法[1]，发酵赋予食品丰富的微生物组成使其具有独特的风味和营养组分[2]。传统发酵制品多采用自然发酵的方式，而自然发酵过程中的微生物多来自于外部环境[3-4]，因此不同的地理环境和气候条件造就了各具特色的发酵制品。内蒙古地区位于我国北部地区，独特的气候条件和自然资源成功造就了内蒙古地区“世界黄金奶源带”的地位，丰富和优质的奶资源为各类乳制品的产业化发展提供了坚实的基础。发酵乳制品作为乳制品中的典型代表，已成为不同牧区主要的创收乳制品。阿如勒、奶豆腐、奶皮子、奶渣子和酸奶豆腐作为内蒙古地区最具代表的干制发酵乳制品，因其营养丰富且风味独特而一直受到消费者的青睐。食品发酵中微生物的代谢决定食品的风味和营养[5]，发酵食品的风味主要来源于食品中的呈味物质如游离氨基酸[6]。短链脂肪酸的产生受到微生物群的数量和类型的影响[7]，与发酵食品的营养品质和理化性质密切相关[8]。产生短链脂肪酸的益生菌主要有乳球菌、乳杆菌、双歧杆菌等，有助于促进干制发酵乳制品中蛋白和脂肪的酶解，产生游离氨基酸和短链脂肪酸，可以改善干制发酵乳制品的风味和营养特性[9-10]。传统的发酵技术极好的保存了自然条件下的微生物组成，微生物在发酵过程中占据主要作用[11]。传统培养方法对于微生物群落的组成研究方法具有一定的局限性，高通测序技术属于非培养方法，具有通量高，不偏向优势菌群的条件下测序真实、客观、准确等特点，能够全面解析食品中微生物群落结构，逐渐成为微生物群落多样性解析的主要工具[12]。麻和平等[13]基于高通量测序分析比较不同保存温度下牦牛酸奶细菌多样性，周继福等[14]基于高通量测序技术比较不同来源原料乳中的细菌特征，马静等[15]基于高通量测序技术分析青藏高原牦牛和犏牛乳中微生物多样性的研究。本研究通过采集内蒙古地区五种最具特色的干制发酵乳制品，通过分析微生物物种多样性组成，测定游离氨基酸和短链脂肪酸含量，探讨微生物、游离氨基酸和短链脂肪酸对干制发酵乳制品品质风味和营养物质之间的关系。

1材料与方法

1.1材料与试剂

干制乳制品阿如勒（ARL）、奶豆腐（NDF）、奶皮子（NPZ）、奶渣子（NZZ）和酸奶豆腐（SNDF）采自内蒙古自治区锡林郭勒盟西乌珠穆沁旗地区；E.Z.N.A.®soil试剂盒，美国OmegaBio-tek公司；琼脂糖，西班牙biowest公司；FastPfu聚合酶，北京全式金生物技术有限公司；AxyPrepDNA凝胶提取试剂盒，美国Axygen公司；测序试剂盒，美国Illumina公司；邻苯二甲醛（o-Phthalaldehyde，OPA）（分析纯）、氯甲酸-9-芴基甲酯（9-fluorenylmethyloxycarbonylchloride，FMOC）（分析纯）、3-巯基丙酸（分析纯）、17种氨基酸混合标准品（2.5μmol/mL）（天冬酰胺、谷氨酰胺、瓜氨酸等），sigma；硼酸（分析纯）、二水合磷酸二氢钠（分析纯）、十二水合磷酸氢二钠（分析纯）等，广州化学试剂厂；甲醇（色谱纯）、乙腈（色谱纯）等，上海安谱实验科技股份有限公司CNW。

1.2仪器与设备

0引言   土壤微生物是森林生态系统中的重要分解者，它分解动植物残体，促进土壤腐殖质的形成以及有机质的分解和转化，加快土壤团粒结构的形成，改善土壤健康状况，利于植物生长和发育[1-3]。土壤微生物数量和生物量是研究和评价土壤微生物调控功能的重要参数[4-6]。土壤微生物数量直接影响土壤的生物化学过程及土壤养分的组成与转化，同时体现土壤中的生物活性，也是恢复和维持林地生产力的主要因素之一[2,7-8]。土壤微生物量可反映土壤同化和矿化能力的大小，是土壤活性大小的标志[5]，其参与生态系统养分循环、有机质分解等生态过程，影响土壤有机质的转化，因而在陆地生态系统碳氮循环中发挥着重要作用[9-10]。土壤微生物数量和生物量受气候、土壤和植被因子的显著影响，即使在相同的气候条件和土壤类型下，不同植被下的土壤微生物仍然存在较大差异[11]。在森林生态系统中，土壤的理化性质受凋落物、根活性和相关微气象因子的影响，其中树种组成起着决定性作用[12]。   以往有关植被对于土壤微生物影响的研究主要针对生态系统不同演替阶段[13]、生态恢复和退化过程[14-15]，但对同一条件下不同植被类型，尤其是混交林的土壤微生物生物量的研究还比较少。马尾松(Pinusmassoniana)和樟树(Cinnamomumcamphora)是亚热带最常见的针叶林和阔叶林，在森林资源上占有重要地位。本试验在湖南省长沙市天际岭国家森林植物园分别对樟树林、马尾松林、樟树-马尾松混交林土壤微生物数量和微生物碳氮生物量进行研究，比较同一气候条件下不同林型土壤微生物数量和生物量的差异，旨在揭示3种森林类型微生物数量和碳、氮生物量特征，以期为森林生态系统的碳氮循环机理、有机质分解等提供基础数据。   1试验地概况   研究样地位于湖南省长沙市天际岭国家森林植物园(113°03'—113°04'E，28°06'—28°08'N)。属典型的亚热带湿润季风气候，年均气温17.1℃，1月最冷，平均为5.0℃，极端最低温度为-11.3℃；7月最热，平均气温为29.0℃，极端最高气温41.0℃；全年无霜期270~300天，年均日照时数1677.2h；雨量充沛，年均降水量1425mm。地层主要是第4纪更新世的冲积性网纹红土和砂砾，属于典型红壤丘陵区。   研究样地坡度为13°~20°，海拔55~100m；樟树、马尾松和混交林均为24年生的人工林，混交林为樟树和马尾松混交，其混交比例为4:6，3种群落基本情况见表1。林下植被有毛叶木姜子Litseamollis、油茶Camelliaoleifera、枸骨Ilexcornuta、山苍子Litseacubeba、栀子Gardeniajasminoides、满树星Ilexaculcolata、狗脊蕨Woodwardiaprolifera、杜荆Vitexagnuscastus、大青Clerodendroncyrtophyllum、紫金牛Ardisiajaponica、黄檀Dalbergiabalansae、苔草Carextristachya、山麦冬RadixLiriopes、乌桕Sapiumsebiferum、喜树Camptothecaacuminate、鳞毛蕨Dryopterischinensis、野柿Diospyroslotus、一枝黄花Solidagocanadensis、华山矾Symplocoschinensis、盐肤木Rhuschinensis、白栎Quercusfabri、小叶女贞Ligustrumquihoui、淡竹叶Lophatherumgracile、鸡矢藤Paederiascandens、青桐Firmianasimplex、芒萁Dicranopterisampla、铁线蕨Adiantumcapillusveneris、井栏边草Pterismultifida、蛇葡萄Ampelopsissinica等。   2研究方法   2.1样品采集   2009年7月初，在湖南省长沙市天际岭国家森林植物园的马尾松、樟树、樟树马尾松混交林3种群落中，每种森林类型设置6块3m×4m的固定样地，每块样地间相隔10m以上。本次试验采样时间是2011年7月初，采样时，先去除地表面凋落物，用自制直径5cm、长10cm的钢管打入到地下0~10cm土层，取500g左右的土样，3种林型共采集24个样，然后将每种林型采集的6个样进行两两混和后，及时装入自封袋带回实验室放入冰箱4℃下保存，供土壤微生物数量和微生物生物量的测定。   2.2土壤微生物的分离与鉴定   土壤微生物数量的测定采用稀释平板培养计数法，稀释倍数为细菌10-4~10-6、真菌10-2~10-4、放线菌10-3~10-5，每个稀释浓度做3个重复，选择长出菌落数10~200的培养皿计数[16]。细菌分离采用牛肉膏蛋白胨培养基，鉴定通过菌体形态结构观察和生理生化指标测定，具体参照文献[17]。真菌分离采用孟加拉红培养基，鉴定参照文献[18-19]。放线菌分离采用高氏一号培养基，鉴定参照文献[20]。   2.3土壤微生物生物量碳和氮的测定   土壤微生物量C、N采用氯仿熏蒸浸提方法测定[21]。提取液中C的测定用重铬酸钾-硫酸消煮，硫酸亚铁滴定法，N的测定采用凯氏消煮法。微生物量C、N的计算，见公式(1)、(2)。Cmic=EC/KEC(1)Nmic=EN/KEN(2)式中：EC、EN分别表示熏蒸与未熏蒸土壤提取液中所测C、N含量之差，KEC、KEN分别表示微生物量C、N浸提测定的比例，数值分别为0.38、0.54。   2.4试验仪器   全自动凯氏定氮仪（产地：山东；滴定精度：1μL/步）；石墨消解仪（产地：山东；精度：±1.0℃）；真空干燥器（产地：巩义）；微生物培养箱（产地：宁波；精度：±1）；无菌操作台（产地：天津；洁净等级：100级）；高温灭菌锅（产地：山东）。   2.5统计分析   试验数据的处理和运算采用Excel2003软件，用统计软件SPSS18.0进行单因素方差分析和相关性分析，检验相同条件下土壤微生物数量、碳氮生物量的显著差异性和相关性。   3结果与分析   3.13种林型土壤理化性质及养分比较   由表2可知，3种林型土壤养分中含水量和土壤平均温度差异都达到显著水平(P<0.05)，其特征均为：樟树>马尾松>混交林。土壤中有机碳为：樟树林>混交林>马尾松林，其中樟树林和马尾松林之间差异性达到显著水平(P<0.05)；土壤全氮为：樟树林>混交林>马尾松，其中樟树林与马尾松林、马尾松林与混交林的差异性达到显著水平(P<0.05)；pH值为：樟树林>马尾松林>混交林；凋落物量为：樟树林>混交林>马尾松林，3种林型之间差异性均达到显著水平(P<0.05)。#p#分页标题#e#   3.2土壤微生物总数特征比较   对3种不同林型土壤微生物的总数量进行统计，其微生物总数量分别为：樟树林751.6×103个/g干土、混交林298.2×103个/g干土、马尾松林174.3×103个/g干土，特征为樟树林>混交林>马尾松林（见图1）。进行单因素方差分析，结果表明3种森林类型的土壤微生物总数量存在显著差异(P<0.05)，进行组间两两比较，发现3种林型两两之间的微生物总数的差异性均显著(P<0.05)；其差异特征说明3种不同森林类型的土壤微生物在其分布上存在明显的非均匀性。   3.3森林类型与土壤中微生物的关系   由表3可知，3种林型微生物中细菌比例特征为樟树林>马尾松林>混交林，其比例分别为：樟树林82.63%，马尾松林78.39%，混交林64.46%；真菌比例特征为混交林>马尾松>樟树林，比例分别为：混交林18.55%，马尾松林12.62%，樟树林10.44%；放线菌比例特征为混交林>马尾松>樟树林，比例分别为：混交林18.55%，马尾松林8.99%，樟树林6.93%。可见，3种林型对土壤微生物数量的影响有差异，这与不同的林型的凋落物量有一定关系[22]，从而影响其分解速率[23]。有研究[24]发现，不同林型混交林的土壤微生物数量组成比例也因林地不同而发生变化，不同林型的根际环境对细菌、真菌和放线菌也有不同影响[25]。   3.4土壤微生物生物量碳氮特征   由图2可知，3种林型土壤微生物生物量碳的平均含量分别为543.01、421.48、370.95mg/kg，其特征为马尾松林>混交林>樟树林；微生物生物量氮平均含量为37.28、23.20、15.12mg/kg，特征则为：樟树林>马尾松林>混交林。进行单因素方差分析，其结果表明3种森林类型的土壤微生物生物量碳、氮均不存在显著差异(P>0.05)。进行相关关系分析表明（见表4）：土壤微生物生物量碳和氮与土壤有机碳、全氮、碳氮比呈显著线性相关，微生物生物量碳、氮均与土壤中水分相关性不显著，微生物生物量碳氮之间也存在显著线性相关。因此说明水分不是影响土壤中微生物生物量碳、氮的主要因素，土壤中的有机碳和全氮才是影响微生物生物量碳、氮的主要因素，而且微生物生物量碳与氮之间还会相互影响。   4结论   （1）3种林型下的土壤微生物总数量有显著差异性(P<0.05)，总的特征是：微生物总数最大的是樟树林，混交林次之，马尾松林的数量最小。这种微生物数量的差异与林型存在密切关系，这在一定程度上反映了不同林型土壤有机质转化程度和肥力水平。   （2）林型对土壤微生物数量和比例有显著的影响。不同林型生境为微生物提供了异质性的生境条件，小生境理化因素的差异对3大类异养微生物的组成和比例有显著的影响。研究结果表明，不同林型土壤微生物中细菌、放线菌、真菌的数量和比例都不尽相同。   （3）3种林型的土壤微生物生物量碳、氮无显著差异性(P>0.05)。与土壤有机碳、全氮、碳氮比呈显著线性相关，与土壤水分无明显著的相关关系，表明土壤有机质是影响土壤微生物生物量的重要因素。   5讨论   不同凋落叶分解的土壤微生物效应[26]研究结果表明，阔叶林凋落物分解速度影响土壤微生物的数量，其凋落物分解速度越快，其土壤微生物数量越多，而针叶林凋落物的土壤微生物效应就较差。5种不同人工林型下土壤微生物类群数量特性[27]的研究结果表明，混交林群落中的土壤微生物总数比单一林型中的数量多，其原因可能是在混交条件下，合理布局空间，根系发达，加速有机物分解和养分的积累，加速土壤微生物的活动，从而改善土壤的理化性状，因此比单一林型更有利于微生物的生长。但是，本研究结果与众多结论不同，经过对比分析3种林型的基本条件发现，混交林林地密度大，郁闭度大，所以在相同关照条件下，地面温度相对较低，光照条件比较差，地被植物少，凋落物多，导致土壤微生物数量减少[28]。   有研究[29-30]发现，土壤微生物中以细菌所占的比例最多，真菌次之，放线菌最少，土壤微生物的组成以细菌为主，占微生物总数的71.4%~87.7%，放线菌次之，占总数的9.2%~22.7%，真菌最少，占1.1%~9.6%。可见，不同林型对土壤微生物数量的影响效果有差异。其原因可能与不同的林型的凋落物量有一定关系[31]，从而影响其分解速率[32]。在不同混交林地土壤养分、微生物和酶活性的研究[33]中发现，不同林型的混交林的土壤微生物数量组成比例也因林地不同而发生变化，不同林型的根际环境对细菌、真菌和放线菌也有不同的影响[34]。   细菌的数量很大程度上与土壤有机质含量呈正相关[35]。土壤细菌主要营养来源是植物残体，在肥沃土壤和有机质丰富的土壤中，细菌数量相应偏多，而在缺乏有机质的土壤中其数量较少[30]，本试验3种林型中以樟树林的有机质含量最高，因此樟树林更有利于细菌的生长。而真菌则是以混交林最多，马尾松林次之，樟树林最少，这是因为真菌相比放线菌和细菌更适合于pH较低的土壤条件下发育[36]，3种林型中混交林的pH相对较低，而真菌数量最多，这也与表2中的数据相印证。放线菌比例则是混交林所占比例最大，马尾松次之，樟树林最少。众多研究[35,37]结论得出，放线菌具有喜热耐旱以及适合在碱性的土壤环境中生存，本试验3种林型中虽然混交林放线菌所占比例最大，但放线菌总数以阔叶林最高，放线菌特征也与众研究结论相符。   土壤微生物生物量与温度、湿度、土壤理化性质等环境因素有关[38-39]。本研究结果表明，土壤微生物生物量碳、微生物生物量氮与土壤水分无显著相关关系，说明在本研究的3种林型中土壤湿度不是影响土壤微生物生物量的限制性因子。关于微生物生物量碳氮与土壤水分关系的研究报道较多[40-42]，但至今都对其相关性没有定论。另外，相关分析表明，土壤微生物生物量碳和氮与土壤有机碳、全氮呈显著正相关，这表明土壤有机质是影响土壤微生物量的重要因素[43]，有机质含量高，就能够为微生物在进行自身合成与代谢过程中提供足够的碳、氮物质来源以及能量来源[44]。此结果与以往研究结论相符，如金发会等石灰性土壤微生物量碳、氮与土壤颗粒组成和氮矿化势的关系[45]研究结果表明，土壤微生物量碳和微生物量氮与土壤养分高度正相关。除有机碳、全氮与微生物生物量碳氮相关之外，杉木人工林土壤微生物生物量碳氮特征及其与土壤养分的关系[46]的研究结果揭示，土壤微生物量碳氮含量与铵态氮、全钾和速效钾含量之间存在显著正相关；刘占锋等[47]研究揭示，土壤微生物量碳与土壤全磷呈显著正相关。#p#分页标题#e#

摘要：微生物与免疫学是高职高专药学专业的一门必修课程，旨在使学生掌握微生物基础知识、免疫学基础等基本知识和技能。分析选择药学专业微生物与免疫学课程思政建设内容的方法，并提供大量的案例素材。同时，结合授课经验，分享如何将思政案例与专业理论内容相结合。

关键词：微生物与免疫学；课程思政；教学改革

微生物与免疫学课程覆盖学生面广，在科学研究、社会服务、实际工作及日常生活中均具有重要的应用价值。在微生物与免疫学的发展、实践过程中，我国科学家和世界各国研究人员都做出了卓越的贡献，将他们的案例与课程知识点相结合，不但能使学生对理论知识点产生浓厚的兴趣，也能“润物无声”地提高学生的思想政治修养，发挥“立德树人”的作用[1]。

1思政视域下药学专业微生物与免疫学课程思政建设内容选择

在实际授课中，一线教师就特别重视课堂理论知识与相应思政点相融合的新型教学模式探究[2]。基于此，整理归纳思政素材对于新型教学模式的应用就显得尤为重要，本课程团队经过不断的探索、研究、实践后，总结归纳出微生物与免疫学课程的思政素材库，现进行简单介绍，以期为其他教师提供思路与借鉴（见表1）。

1.1挖掘具有文化自信、人文素养的思政案例

现代免疫学发展了120多年，中国的传统医学在人类与传染病的“斗争”中发挥着重要作用[3]。2020年初发生的新冠肺炎疫情是百年来全球发生的最严重的传染病大流行，在抗疫过程中，中国政府反应迅速，应对及时，保证了疫情没有大规模扩散。这里面有中国的制度优势，其实还有一个独特优势，那就是传统中医药的作用。这其中，“三药三方”就发挥了重要的作用，“三药”指的是血必净注射液、金花清感颗粒、连花清瘟颗粒和胶囊3种中成药；“三方”代表了宣肺败毒方、清肺排毒汤、化湿败毒方3个方剂。清肺排毒汤由东汉时期的张仲景所著的《伤寒杂病论》中的四首经典方剂加减配伍而成[4]。连花清瘟颗粒和胶囊、金花清感颗粒、血必净注射液、宣肺败毒方和化湿败毒方也是传统中医药在防治传染病方面发挥重要作用的代表。