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一、稳定碳同位素分析方法
目前常用的稳定碳同位素测定方法有：质谱法、核磁共振法和光谱法，其中质谱法是稳定同位素分析中最通用、最精确的方法。稳定同位素质谱分析法是先使样品中的分子或原子电离，形成各同位素的相似离子，然后在电场、磁场的作用下，使不同质量与电荷之比的离子流分开进行检测。稳定同位素质谱仪不仅能用于气体，也可用于固体的研究，能用于几乎所有元素的稳定同位素分析。近年来，随着生物地球化学元素循环研究的发展，借助同位素质谱（EA－IRMS），多用途气体制备及导入装置－同位素质谱（GasBenchII－IRMS）及痕量气体预浓缩装置－同位素质谱（PreCon－IRMS）联用技术的兴起，碳稳定同位素的研究有了更快的发展。稳定同位素质谱仪测定同位素比率大致分3个步骤（见图2）：（1）样品的收集、制备和前处理；（2）将材料转化成具有所测元素的纯气体，（3）进入质谱仪检测。
一般样品通过前处理后，同位素质谱联用装置可以完成后续的气体转化和测定。通常，稳定同位素质谱仪在计算机辅助下直接给出同位素比值，更先进的仪器已可以进行自动化分析，如美国热电公司的Thermosci－entificMAT253，德国元素公司的Isoprime100稳定同位素质谱仪等。植物和土壤等固体样品，在进行同位素质谱分析之前必须进行干燥、粉碎、称量等处理。如果采集的土壤样品中含有无机碳，在干燥前应该进行酸处理。制备好的样品称量后通过固体自动进样器送入到元素分析仪－同位素质谱（EA－IRMS）进行碳氮同位素测定。测定土壤样品中碳酸盐δ13C的样品称量后放入样品管，置于GasBenchII仪的恒温样品盘中通过酸泵滴加100％磷酸，生成的CO2气体通过气体自动进样器送到同位素质谱进行碳同位素测定。
液体样品包括土壤DOC和微生物生物量碳（MBC）等浸提液在进行同位素质谱分析之前要进行分离转化、冷冻干燥等前处理。其中土壤DOC和微生物MBC按照参考文献方法用0．05mol／LK2SO4溶液提取，浸提液经冷冻离心浓缩或者冻干机干燥获得的粉末称量后通过固体自动进样器送入到元素分析仪－同位素质谱（EA－IRMS）进行碳氮同位素测定。气体样品包括空气和培养富集气体，用已抽真空的顶空样品瓶采集，其中CO2气样需采集20～30mL，样品中的碳同位素比值可直接通过多用途气体制备及导入装置－同位素质谱联用仪（GasbenchII－MS）测定。对于空气中的CH4需采集100～150mL，样品中的C同位素比值可通过带有全自动气体预浓缩装置－同位素质谱联用仪（如，美国热电公司的PreCon－IRMS）测定。
二、稳定同位素技术应用
土壤是地球表层最为重要的碳库也是温室气体的源或汇，但对关键过程及其源或汇的研究却十分有限。随着全球变化趋势的日趋明显，农田生态系统在碳素的吸收、转移、贮存和释放过程中所起的作用越来越受到人们的关注。农田土壤碳的动态变化和循环特征及其微生物驱动机理研究，成为当今生态学、生物地球化学和环境科学研究的共同热点。
1.稳定同位素技术与Keeling曲线法
土壤呼吸是农田土壤碳循环的重要组成部分，也是其排放CO2到大气中的主要途径。土壤呼吸以根系呼吸和土壤微生物呼吸为主。利用微气象法能够测定生态系统CO2通量，但是不能精确量化和区分根系呼吸和土壤微生物呼吸作用。应用稳定碳同位素技术，通过脉冲标记法（13C－CO2标记示踪）和持续标记法（自然丰度或FACE），造成根呼吸和土壤微生物呼吸CO2碳同位素组成的差异，然后分别测定土壤总呼吸、土壤微生物呼吸和根呼吸的δ13C值，追踪土壤呼吸的来源，并根据碳同位素质量守恒原理即可区分根系呼吸和土壤微生物呼吸，定量土壤呼吸中根系呼吸和土壤微生物呼吸的比例。目前用于测定土壤呼吸CO2碳同位素组成的取样方法包括静态箱（KeelingPlot）法、静态箱平衡状态法和动态箱连接红外分析仪法等，其中静态箱法相对比较成熟，而且成本低廉。Buchmann和Ehleringer采用静态箱研究了冠层尺度C3（紫花苜蓿）和C4（玉米）作物光合作用和土壤呼吸通量及其δ13C同位素组成变化规律，通过土壤有机碳及土壤呼吸的δ13C同位素组成差异，区分了轮作系统土壤呼吸及作物光合作用对净通量的贡献。随着静态箱方法经过不断的修改和完善，通过Keeling曲线法测得的农田生态系统呼吸释放CO2的碳同位素组成（δ13C）能够反映作物土壤根系和微生物呼吸释放CO2的δ13C同位素组成，以较好地理解生态系统的同位素鉴别。
2.土壤有机碳来源及其周转规律研究
2.1C3／C4植物变迁自然丰度法
碳、氮、氧、氢这些轻元素在自然环境中的循环和周转过程中，其同位素比值间的差异较大，同位素分馏效应比较明显，利用13C／12C、15N／14N、18O／16O和D／H同位素丰度比的变异携带有环境因素的信息，具有原位标记特性。通过测定土壤或者植物中δ13C，可以研究植物－土壤生态系统碳来源及其周转规律。稳定碳同位素比值（δ13C）分析方法在土壤有机质分解程度评估、土壤有机质来源探讨、C3／C4植被变化历史研究等领域中得到日益广泛的应用。由于不同植物类型具有不同的δ13C值，C3植物δ13C的变化范围为－9‰～－17‰。；C4植物δ13C的变化范围为－10‰～－22‰，当C3植物被C4植物所取代时就会导致土壤有机质δ13C值的改变。因此，可以通过土壤有机碳δ13C值相对于参考土壤（未改变种植作物的土壤）的变化来探讨土壤有机碳的周转速度，及不同C3和C4植物来源碳占土壤碳库各组分及气体CO2中的比例。Balesdent和Mariotti最早通过C3和C4植物类型的变迁来研究土壤碳库各组分的稳定性及周转规律，研究发现，长期耕种小麦（C3作物）的农田土壤在连续13年种植玉米（C4作物）后，22％的土壤有机碳获得了更新，而且不同粒径土壤有机碳的周转速率不同，其中＞50μm和＜2μm团聚体中含有更多的新碳，而粘粒中土壤有机碳的更新速度最慢。
Dignac等通过C3和C4植物类型变迁长期定位试验，采用铜氧化法结合稳定同位素质谱分析技术进一步研究了植物根系残留物（木质素）的稳定性及其对土壤有机碳库的贡献，结果发现，连续9年种植玉米（C4作物）对土壤有机碳含量、木质素及其生物降解程度（分解和周转）虽未产生显著影响，但其碳同位素组成发生了显著变化，其中有机碳中9％而木质素有47％来源于玉米（C4作物），木质素大分子的周转速率较土壤有机碳库更快。作为土壤碳库中的活性组分，MBC的稳定性和周转速率也可以通过土壤碳自然丰度δ13C值的变化进行研究。Blagodatskaya等通过54d室内培养实验研究了C3和C4植物类型的变迁后各碳组分的周转速率、新老碳对土壤有机碳（SOC）、微生物碳（MBC）和CO2气体的贡献以及微生物在碳分馏过程中的作用。研究结果发现，土壤SOC及MBC的周转时间分别为16．8年和29～30d，而且随着种植年限的增加，周转时间将会延长。新老碳库对SOC、MBC和CO2气体的贡献不同，其中MBC中20％碳来源于老碳（C3），CO2气体中60％来源于老碳（C3），由于微生物对土壤老碳的偏好利用，土壤中SOC中新碳贡献将逐年增加。13C自然丰度法灵敏度和分辨率较低，而且C3／C4植物更替，限制了应用。
2.2稳定碳同位素示踪法
碳的稳定同位素（13C）示踪技术能有效地阐明地下碳动态变化和土壤碳储量的微小迁移与转换，以及定量化评价新老土壤有机碳对碳储量的相对贡献。利用13C标记秸秆研究作物秸秆、残茬或作物根系在土壤中的分解动态或对土壤有机质的贡献，可为阐明土壤碳转化过程及土壤肥力演变过程提供新的技术支撑。以植物残体形式输入的作物光合碳对土壤有机碳库的贡献及转化规律已有大量的研究。窦森等在室内培养条件下，研究了添加13C玉米秸秆后，土壤有机碳库中胡敏酸和富里酸含量随时间的动态变化，发现在培养期间内，原有土壤有机碳较新形成的有机质的分解速度慢；同时也证明该方法用于研究短期培养条件下新加入有机质在土壤中的分解动力学是可行的。
随着同位素技术的发展和应用，研究者开始了对生育期内植物—土壤体系中碳分配的量化研究，定量化评价根际沉积对土壤碳储量的相对贡献。比如，Li－ang等通过13C稳定同位素培养试验研究了玉米根际沉积碳在土壤碳库中的分配，认为水溶性有机碳（DOC）和MBC是“新碳”的主要去向。而Yevdokimov等的研究表明燕麦根际沉积碳的主要去向为MBC、呼吸碳和SOC，而土壤DOC并不主要来源于“新碳”。何敏毅等应用13C示踪技术研究表明，玉米在其生育期内输入到地下的总碳量为4．6t•hm－2，其中42％存在于根系中，7％转化为土壤有机碳，剩下的41％通过根际呼吸进入大气。不同研究结果的差异可能由于不同学者采用的研究方法、作物及土壤类型不同造成。
3.稳定同位素探针技术（SIP）
农田系统是半开放的人工系统，进入土壤的新鲜有机物质包括自然归还的植物残体和根系分泌物、人为归还的有机肥等，而系统碳输入是影响土壤有机碳动态的最主要因素之一。土壤微生物是土壤有机质、土壤养分转化和循环的动力，是土壤有机质转化的执行者。外源有机质（“新碳”）进入矿质土壤基质后，发生由微生物介导的物理–化学–微生物的转化过程。“新碳”输入土壤，经土壤微生物作用转化为有机质，影响土壤有机碳含量及其组分的变化，或转化为CO2和CH4等气体返回大气。应用同位素示踪技术结合微生物分子生物学技术（PLFA／DNA／RNA－SIP）能够定量化“新碳”在土壤碳库中的转化动态及其对土壤碳储量的相对贡献，阐明微生物种群结构与“新碳”转化及稳定性之间的关系。Lu等用13CO2对水稻进行脉冲标记，通过13C－PLFA图谱分析发现，不同根际微生物对植物光合作用产物有不同的吸收特征，证明了水稻根际微生物种群与植物光合作用密切相关。进一步对土壤13C－DNA进行分析，发现水稻ClusterIArchaea类群的核糖体RNA中含有13C，表明此类细菌可能在由植物碳源产生甲烷的过程中起重要作用，对全球气候变化具有重要影响。
Bastian等定量研究了土壤外源添加小麦秸秆后，参与秸秆分解过程的（共168d，8个时间点）微生物种群结构动态变化，结果发现在秸秆降解的前期（14～28d）和后期（28～168d）细菌和真菌群落结构差异明显，这主要是秸秆降解过程中养分由丰富向贫瘠转化诱导的微生物r选择和k选择的结果。另外，农田土壤除作物光合碳根际输入外，还存在大量的光合自养微生物，通过卡尔文循环固定大气CO2合成有机物，并转化为土壤有机碳，对农田土壤有机碳累积的贡献不可忽视。而农田土壤中参与了“新碳”的输入、分配与转化的主要微生物种群，及其与“新碳”转化的相互关系如何，有待进一步研究。SIP能够将功能和种群分类联系起来，在微生物生态学研究中有着巨大的应用潜力，随着可用底物种类的增加（N、H），SIP技术将有可能鉴定出更多在碳、氮及其他元素循环中发挥重要作用的微生物。
三、展望
稳定碳同位素技术已在土壤有机质的转化、土壤中碳素的来源及其影响因素等方面得到了较广泛的应用。然而，我国农田土壤碳同位素研究大多集中于对C3和C4植物碳同位素、土壤CO2和土壤有机碳的同位素组成的测定与分析，对于农田土壤管理方式以及土壤质地、温度等环境条件对土壤碳周转过程的影响机理研究还很少。另外，土壤微生物是土壤有机质和土壤养分转化和循环的动力，是土壤有机质转化的执行者，但有关微生物种群结构和数量与农田土壤碳转化及稳定性之间的关系尚知之甚少。因此，有以下几方面的问题有待进一步的研究：
（1）利用13C自然丰度法和示踪技术相结合，定量土壤有机碳的周转速度，确定土壤有机碳的来源，深入研究不同农田管理方式对农田土壤碳素累积和转化的影响；
（2）分析土壤13C有机碳富集的基本机制、阐明土壤13C丰度与植被类型、土壤温度、质地之间的关系，进一步评价不同农田生态系统碳贮存潜力；
（3）通过稳定碳同位素示踪结合微生物分子生物学技术，探讨农田土壤有机碳周转的微生物分子机理。综上所述，我国农田土壤碳循环过程的稳定同位素技术研究还处于探索发展阶段，有许多关键问题有待解决。随着稳定同位素分析仪器品种的增加、自动化程度的提高和分析方法的不断完善，该研究领域将会进入一个全面发展的新阶段。
作者：袁红朝 李春勇 简燕 耿梅梅 许丽卫 王久荣 单位：中国科学院亚热带农业生态过程重点实验室 湖南农业大学生物科技学院