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宿管申请书范文1
申请人：赵天伦 男 汉族 初中文化 56岁 住界首市王集镇赵集行政村赵玉庄157号
被申请人：赵天现 男 汉族 初中文化 56岁 住界首市王集镇赵集行政村赵玉庄
请求事项：请求依法确认，将位于赵玉村东头桥西柏油路南的一宗土地的使用权（东邻赵天现、西邻沟北邻路南邻地）确权给申请人使用。
事实和理由：申请人和被申请人同住赵玉庄，申请人赵天伦的父亲赵金亮和被申请人赵天现的父亲赵金拔是亲兄弟。申请人赵天伦的父亲赵金亮在世时，因申请人赵天伦的弟弟李修贤（小时候给姓李的了）1988_1998年在赵玉村桥西路南烧吊窑，占用赵集寨瞿金佳组的荒地，申请人的父亲赵金亮就把自己的可耕地1.7亩，和同村村民赵天山的可耕地（东地大园子）进行调换，赵天山又和同村村民赵锦金的可耕地（在赵集寨后）进行调换，赵锦金又和瞿金佳进行调换。这样经过四次调整，就把赵集寨瞿金佳组在赵玉村东头的可耕地调到了赵集寨后。1998年申请人赵天伦的弟弟李修贤不烧吊窑时，又把此1.7亩可耕地，退还给申请人赵天伦的父亲赵金亮。1993年因申请人的父亲赵金亮年老多病，就把此地块交给被申请人赵天现代耕代种至今。申请人的父亲赵金亮死后，有申请人赵天伦一人出钱出物办的丧事，其他人没有出过一分钱，因为申请人的继母曹美荣仍然在世，申请人赵天伦并没有主张使用权，因此地块的收入属于申请人的继母曹美荣受益，现在申请人的继母曹美荣已去世，申请人依法要回此地块的使用权。申请人赵天伦多次找到被申请人赵天现协商解决此事，但被申请人赵天现，以替申请人的父亲赵金亮看病付过药费（没有任何证明只是口说）和此地块已经曹美荣调到梁庄西头为由拒不把此地块的使用权交给申请人赵天伦。经村干部、镇司法所多次调解无效。申请人根据《中华人民共和国土地法》第十六条、《安徽省土地权属争议处理条例》第三十条 第三十四条之规定，申请王集镇人民政府依法支持申请人的请求。
附：1、身份证复印件一份以证实自己有诉讼的权利。
2、1994年地改时赵玉村的地亩册子以证明所争议地块的使用权属于申请人的父亲赵金亮。
3、2005年3月3日赵天现与赵华东签订的合同及被申请人领取租金的证词一份以证明被申请人赵天现说2005年之前已调整为假话。
此致
王集镇人民政府
申请人：
宿管申请书范文2
【关键词】肾上腺切除；高血压；相关因素
后腹腔镜肾上腺切除术治疗原发性醛固酮增多症目前已得到广泛的的临床应用。据张旭等的研究结果显示[1-2]，经后腹腔途径行肾上腺切除术具有多方面优点，如入路较传统方法更为直接、解剖关系也较传统方法清楚。临床上原发性醛固酮增多症的患者主要表现为高血压症状。本研究旨在探讨影响后腹腔镜肾上腺切除术后患者高血压改善情况的相关因素，便于临床医生对原发性醛固酮增多症患者行肾上腺切除术后高血压是否会得到改善进行评估。
1 研究对象与方法
1.1 研究对象
收集2011年6月～2015年6月于我院外一泌尿外科科行后腹腔镜肾上腺切除的原发性醛固酮增多症合并高血压患者79例。病例纳入标准：（1）明确诊断为原发性醛固酮增多症（2）合并高血压（3）口服降压药不能控制血压。病例排除标准：（1）非原发性醛固酮增多症引起的高血压（2）嗜铬细胞瘤。本研究经过我院医学伦理会批准同意，所有患者均自愿参加并签署知情同意书。
1.2 研究方法
收集2011年6月～2015年6月于我院外一泌尿外科行后腹腔镜肾上腺切除的原发性醛固酮增多症合并高血压患者79例的相关临床资料，并于术后一年后对患者进行随访，统计患者血压改善情况，将79例患者分为术后血压改善组和术后血压未改善组，通过统计学分析处理，探讨影响患者术后高血压改善情况的的相关因素。
1.3 统计学处理
统计分析软件采用SPSS 19.0进行统计分析，用x±s表示计量资料，采用t检验进行组与组之间的比较，用百分数表示计数资料，采用卡方检验。差异无统计学意义则P>0.05，差异有统计学意义则P 0.05。多因素Logistic回归分析患者术后高血压改善情况的相关因素，结果用优势比（OR）和95%置信区间（CI）表示。
2 结果
表1原发性醛固酮增多症患者肾上腺切除术后高血压改善组与术后高血压未改善组单因素分析结果（x±s）
2.1 如表1所示，把79例患者中术后高血压改善组有67例，占比84.81%，术后高血压未改善组12例，占比15.19%，这表明患者经后腹腔镜肾切除术后大部分血压状况能够得到改善。通过分析处理发现，两组之间在性别、年龄、体质指数方面没有明显差异（P>0.05），在高血压病程是否大于6年上有明显差异，差异具有统计学意义（P
2.2 如表2所示，多因素Logistic回归分析发现，高血压病程大于6年（P
3 讨论
腹腔镜手术在临床上目前已经得到广泛应用，与传统开腹手术相比，其对腹腔干扰和损伤均较小，有利于患者术后康复。目前，后腹腔镜肾上腺切除术治疗原发性醛固酮增多症已得到广泛的的临床应用。近年来，据研究提示[3-4]，原发性醛固酮增多症患病率达到了20%，其已发展成为继发性高血压的首要病因。
Kim等[5]研究指出，术后血压得到改善的患者为85.2%，未得到改善的为14.8%。本研究选取的79例患者中术后高血压改善组有67例，占比84.81%，术后高血压未改善组12例，占比15.19%，这与Kim等的研究结果大致相同。本研究显示经后腹腔镜肾上腺切除的原发性增多症的患者血压改善情况与性别、年龄、体质指数方面无相关性，高血压病程大于6年是影响患者术后血压能否得到改善的危险因素之一。
综上所述，高血压病程小于6年的原发性醛固酮增多症患者通过后腹腔镜肾上腺切除术能够较好地改善高血压情况，病程大于6年的患者希望经后腹腔镜肾上腺切除术达到改善高血压情况则有一定的风险。
【参考文献】
[1]张旭.解剖性后腹腔镜肾上腺切除术的手术方法和技巧[J].临床泌尿外科杂志，2007，22（8）：561-564.
[2]张旭，傅斌等.后腹腔镜解剖性肾上腺切除术[J].中华泌尿外科杂志，2007，28（1）：5-8.
[3]Lim PO，Rodgers P，Gardalek，et al.Potentially high prevalence of primary aldosterronism in a primary-care population[J].Lanc et，
1999，353（9146）：40.
[4]Fogari R，Preti P，Zoppi A，et al，Prevalance of primary aldoste
ronism among unselected hypertensive patients：a prospective study based on the use of an adldosterone/reninratio above 25 as a screening test[J].Hyperten Res，2007，30（2）：111-117.
宿管申请书范文3
关键词 滋阴益肾 清热疏肝法 特发性血小板减少性紫癜激素减撤
特发性血小板减少性紫癜(ITP)是一种免疫介导的以外周血小板破坏增多而引发的疾病。以皮肤、黏膜或内脏出血为主要临床表现，约占出血性疾病的30%。80%成年ITP患者均为慢性过程，起病隐匿，病因不明。治疗上，西医常用糖皮质激素、各类免疫抑制剂、脾脏切除、大剂量丙种球蛋白、促血小板生长因子等治疗，少数难治性患者甚至需动用联合化疗或造血干细胞移植等方法治疗。然而，激素依赖的问题越来越受人们的关注。为此，在给予西医常规治疗的同时加用中药滋阴益肾，清热疏肝治疗，取得了较好的治疗效果的同时也明显减轻了患者的激素依赖性，减少了激素治疗的不良反应。现报告如下。
资料与方法
慢性型ITP患者80例，依其就诊先后顺序，采用随机数字表法将其随机分为两组，每组40例。治疗组40例，男14例，女26例，病程3.1～9.2年，平均3.5年。对照组40例，男16例，女24例，病程3.0～8.8年，平均3.4年。经统计学分析，两组的性别、病程、临床症状、血小板计数及骨髓巨核细胞等方面无显著差异(P＞0.05)，具有可比性。
病例诊断标准及排除标准：⑴诊断标准：均符合张之南主编《血液病诊断及疗效标准》(第2版)ITP诊断和分型标准［1］。所有病例除符合诊断标准外，还符合以下条件：前期经正规泼尼松治疗，治疗效果达到良效标准(血小板＞50×109/L)［2］，且泼尼松已减量30mg/日。⑵排除标准：如有下列情况之一不纳入该研究：①有高血压病、糖尿病、冠心病等口服糖皮质激素治疗的禁忌症者；②依从性差，不愿服用中药；③存在心、肺、肝、肾、脑等重要脏器功能不良，影响疗效观察；④合并严重的脑出血，导致神志昏迷，无法从事研究。同时符合上述诊断标准及排除标准方可纳入本研究。
治疗方法：对照组继续口服泼尼松，30mg/日，每周减量2.5mg，8周后减至10mg，维持治疗。治疗组在对照组基础上加服滋阴益肾，疏肝清热的中药汤剂。处方：熟地20g，首乌20g，山茱萸10g，白芍15，旱莲草15g，鸡血藤30g，巴戟天10g，鸡内金10g，白术12g，茯苓12g，石斛20g，柴胡15g，女贞子10g，黄精15g，黄芩6g。水煎，日1剂。观察12周后判断疗效。
疗效判断标准［2］：①显效：血小板数恢复正常，无出血症状，持续3个月以上；②良效：血小板回升至50×109/L，或较原水平上升＞30×109/L，无或基本无出血症状，持续＞2个月；③进步：血小板上升，出血症状改善，持续＞2周；④无效：血小板计数及出血症状无改善或恶化。激素减撤反跳判断：观察期间不能继续维持显效、良效、进步，导致激素减撤时间延长(或不能继续减撤)判为反跳。反跳率=(1-该组未出现反跳的人数/该组总人数)×100%。
统计学处理：采用SPSS统计学软件进行数据处理。
结 果
总体疗效比较：治疗组总有效率95%，对照组总有效率80.0%。经统计学处理，两者有显著性差异(P＜0.05)。见表1。
治疗组与对照组比较：见表2。
讨 论
试验证明，补肾中药与激素合用，可减轻或消除长期应用皮质激素所致的脑垂体前叶的形态改变。滋阴中药有减轻或防止长期应用皮质激素所引起的肾上腺皮质萎缩的作用。温阳药有类似激素的作用，但无激素的不良反应，它可能是在改善HPA轴功能的基础上而发挥作用［3］。在从肾论治减轻激素不良反应的同时肝亦起到重要的作用。肝藏血，具有调节血量的功能。人体在应激状态下，肝脏对血液的调节作用可保证心脑肾等重要脏器精微物质的灌流。而且肝脏对内分泌具有促进作用。推测神经递质、激素的释放等神经内分泌活动均与肝脏功能有关［4］。
因此，确立滋阴益肾，清热疏肝的治疗方法。方中取熟地、首乌、黄精，补阴益肾，填精养血；石斛滋阴除热、旱莲草、女贞子既能滋阴清热，又有凉血止血之功；白芍、柴胡和黄芩相伍疏肝清热凉血，鸡血藤为补中寓行，补血行血；巴戟天补肾助阳、山茱萸既能补精，又可助阳，二药温而不燥，于大剂滋阴药中无伤阴化火之弊，使阳得阴助而生化无穷，阴得阳升而泉源不竭；再佐以白术、茯苓和鸡内金运脾消食，防诸药滋腻碍脾。诸药同用，切中患者激素减撤时之病机，共奏滋阴益肾、清热疏肝之功。
中药防治激素不良反应由来已久，本次临床观察采用随机对照的方法，发现治疗组的总体有效率明显高于对照组，且治疗组治疗后反跳率明显低于对照组，进一步明确应用滋阴益肾、清热疏肝可以稳定ITP患者激素减撤时血小板数，减少反跳复发，疗效确切，值得临床推广应用。
参考文献
1 张之南.血液病诊断及疗效标准［M］.北京:科学出版社,1998:279-284.
2 薛志忠,周永明,何伟,等.生血灵治疗原发性血小板减少性紫癜止血机制探讨［J］.上海中医药杂志,1999,(10):19-20.
宿管申请书范文4
基金项目：苏州市2013年“科教兴卫”青年科技项目（KJXW2013026）
作者单位：215007 江苏省苏州， 苏州大学附属第二医院急诊与重症医学科[陆件（在读硕士研究生）、钱会银（在读硕士研究生）、刘励军、周保纯、肖盐]，心内科[毛锦宁、安国印（在读硕士研究生）]，血液科[芮明忠（在读硕士研究生）]，检验科[王涛（在读硕士研究生）]；南通大学医学院电镜教研室（朱昌来）
通信作者：刘励军，Email：
【摘要】目的 观察亚低温（MH）对心肺复苏（CPR）后海马神经细胞活性氧（ROS）产生量和半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3（caspase-3）mRNA和自噬相关蛋白轻链3（LC3）表达的影响。方法 65只健康成年雄性SD大鼠随机数字法随机分为2组：空白对照组（BC，n=5）；CPR组（n=60）。CPR组制作窒息法心肺复苏模型，在自主循环恢复（ROSC）后再随机分为2组：常温CPR组（NT）和低温CPR组（HT）。NT组在ROSC后保持37 ℃恒温，HT组在ROSC后立即行低温32 ℃干预4 h。根据观察时点的不同，再将两组CPR组随机分2个亚组：即 ROSC后12 h和24 h组（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。到达观察时点先对存活大鼠进行神经功能缺损评分（NDS），然后立即取双侧海马组织，应用流式法检测大鼠海马单细胞悬液ROS水平。利用透射电镜观察海马神经细胞细胞核和线粒体的超微结构形态学变化。利用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）技术测定海马神经细胞caspase-3mRNA的表达水平；蛋白免疫印迹法（WB）测定海马神经细胞LC3蛋白水平。应用SPSS 19.0软件包，计量数据以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用成组t检验，多组间比较采用单因素方差分析。结果 60只大鼠中有44只（73%）成功ROSC，存活到观察时点的有33只大鼠（55%）。NT和HT组各时点的NDS明显低于BC组（F=8.107，P
【关键词】亚低温；心肺复苏；活性氧；半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶3；轻链3；自噬
The impact of mild hypothermia on the ROS and expression of caspase-3mRNA and LC3 of hippocampus nerve cells in rats after cardiopulmonary resuscitation Lu Jian， Qian Huiyin， Liu Lijun， Zhou Baochun， Xiao Yan， Mao Jinning， An Guoyin， Rui Mingzhong， Wang Tao， Zhu Changlai. Department of Emergency and Critical Care Medicine， The Second Affiliated Hospital of Soochow University， Suzhou， 215007， China
Corresponding author： Liu Lijun， Email：
【Abstract】Objective To observe the impact of mild hypothermia （MH） on the reactive oxygen species （ROS） and expression of cacpase-3mRNA and light chain 3 （LC3， a subunit of immunoglobulin） in hippocampus nerve cells of rats after cardiopulmonary resuscitation （CPR）. Methods A total of 65 healthy male Sprague Dawley （SD）rats were randomly（random number） divided into 2 groups： blank control group （n=5） and CPR group （n=60）. Cardiac arrest （CA） was induced in rats of CPR group by asphyxia. The survival rats after CPR were randomly（random number） divided into 2 groups： normothermia CPR group （NT） and hypothermia CPR group （HT）. Homeothermia of 37 ℃ was maintained in NT group after restoration of spontaneous circulation （ROSC）， and hypothermal intervention to 32 ℃ was carried out in HT group for 4 hours immediately after ROSC. Both NT group and HT group were then randomly divided to 2 subgroups 12 hours and 24 hours after ROSC （NT-12， NT-24， HT-12， HT-24 subgroups）. During observation， the neurological deficit （NDS） of rats was scored， then the bilateral hippocampi were obtained from rats' head， and monoplast suspension of fresh hippocampus tissue was made immediately to determine the level of intracellular ROS by flow cytometry. Transmission electron microscope was used to observe the ultrastructure changes of cellular nucleus and mitochondria. Reverse transcription-polymerase chain reaction （RT-PCR） was used to determine the expression of caspase-3mRNA and Western-blotting （WB） was used to determine the level of LC3 in frozen hippocampus tissue. Measured data were analyzed with paired sample T test and One-Way ANOVA. Results Of 60 rats with CA， 44 were successfully resuscitated （73%） and 33 survived until the end of the experiment （55%）. The NDSs of rats in NT and HT groups were significantly reduced in comparison with BC group （F=8.107， P
【Key words】Mild hypothermia； Cardiopulmonary resuscitation； Reactive oxygen species； Caspase-3； LC3； Autophagy
随着心肺复苏（CPR）技术和急诊医学的发展，大多数心脏骤停（CA）患者能恢复自主循环，但均遗留有不同程度的神经功能障碍，造成家庭和社会的巨大负担[1]。神经细胞凋亡是CA后存活患者神经功能障碍的主要病理生理过程，如何预防和控制CA后脑神经细胞凋亡的发生和发展是减少继发性神经功能障碍的重要治疗措施之一[2]。脑神经细胞在缺血缺氧后凋亡的发生与细胞自噬程度密切相关[3]，这种自噬与凋亡的关系以及其调节机制尚需进一步的明确。本研究采用窒息法大鼠心肺复苏模型，来观察亚低温（mild hypothermia， MH）对CPR后大鼠海马神经细胞活性氧（reactive oxygen species， ROS）产生量和神经功能的影响，并探讨其相关机制。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组
采用雄性健康成年SD大鼠[由中科院上海动物实验研究所提供，合格证号：SCXK（沪）2007-0005，周龄16～18 周，体质量（450±45）g，共65只；随机（随机数字法）分为两组：空白对照组（BC，n=5）、CPR组（n=60）。BC组用3.6%水合氯醛（批号：120203，国药集团化学试剂有限公司）按10 mL/kg进行腹腔内注射麻醉后，气管插管和股动、静脉置管，不建立窒息CPR模型，待稳定后开始计时，到达观察时间点后进行NDS，然后在麻醉状态下处死大鼠取脑。CPR组在麻醉后，气管插管和股动、静脉置管，并复制窒息大鼠CPR模型（详见模型制备），待成功自主循环恢复（ROSC）后，再将大鼠分为常温CPR组（NT）、低温CPR组（HT）。NT组在ROSC后保持其体温在
37.0 ℃，HT组在ROSC后立即予32 ℃低温干预，持续4 h后开始缓慢复温至正常体温。根据观察时点的不同，再将上述CPR组大鼠随机分为2个亚组，即ROSC后12和24 h组（NT-12，NT24，HT-12，HT-24）。
1.2 模型制备和神经功能缺损评分
模型参照Idris等[4]所建立的方法进行。用3.6%水合氯醛（10 mL/kg）腹腔注射麻醉，然后将大鼠固定于铺有控温毯（型号：MODLE6900，深圳瑞沃德公司）的操作台上。大鼠气管插管后用24 G套管针行股动、静脉置管，股动脉置管成功后接压力换能器。所有大鼠均行心电、肛温及有创动脉压监测（8导生物信号采集系统MD3000，安徽淮北正华生物仪器设备有限公司）。操作完成后再稳定5 min，期间予心肺复苏装置（型号：A-CPR-IIC，中山大学心肺脑复苏研究所）机械通气，心肺复苏装置参数如下：呼吸频率100次/min、潮气量6 mL/kg、吸氧体积分数100%通气1 min，然后将吸氧体积分数改为21%继续通气4 min。采用呼气末夹闭气管导管模拟窒息，CA判定标准如下：收缩压（SBP）≤25 mmHg（1 mmHg=0.133 kPa），并持续至心电图呈直线。此后，开始复苏，予机械通气 （呼吸频率50次/min，潮气量6 mL/kg，氧浓度100%）；同时，使用心肺复苏装置进行胸外心脏按压，频率250次/min，按压深度为大鼠胸廓前后径的1/3。复苏开始10 s后，经股静脉注射肾上腺素（批号：120505，上海禾丰制药有限公司）（0.01 mg/kg）。CPR后ROSC的标志：出现自主心律和SBP≥60 mmHg，
并持续10 min以上[4]。复苏前和复苏时动物肛温均控制在（37.0±0.5）℃。HT组在复苏后立即予控温毯、冰袋和风扇等降温措施将肛温降至32 ℃，持续4 h后再以0.5 ℃/h的速度缓慢复温至37.0 ℃。到达观察时点先按Geocadin等[5]的方法进行神经功能缺损评分（neurological deficit scores， NDS），然后在麻醉下处死大鼠获取海马组织标本。
1.3 检验取材方法
CPR组大鼠在窒息前、ROSC后0.5 h和4 h均从股动脉抽取0.5 mL动脉血（取血后补充等量生理盐水）行血气分析。各组大鼠在到达观察时间点之前均予5%GNS灌胃（10 mL/kg，1次/6 h），到达相应的观察时间点后，先对大鼠进行NDS，然后在麻醉状态下心内注射10%氯化钾2 mL处死大鼠，切开胸骨，分离心包，暴露心脏，将穿刺针经左心室送入升主动脉，剪开右心耳，经心脏快速灌注4 ℃生理盐水250 mL至右房流出液清，迅速断头取脑，分离双侧海马。左侧海马切取2/3立即在冰上研磨制作单细胞悬液，剩余1/3行电镜观察；右侧海马-80 ℃冻存，用于caspase-3mRNA和LC3B表达的测定。
1.4 流式细胞仪检测细胞内ROS水平
左侧海马取出后切取2/3在冰上用装有冷PBS的玻璃匀浆器内匀浆10次，经300目尼龙过滤网过滤，收集滤液600×g 4 ℃离心5 min，弃上清，冷PBS重悬沉淀，反复吹打后再离心，重复上述操作3次，最后用冷PBS重悬沉淀，用活性氧检测试剂盒（货号：S0033，碧云天生物技术研究所）中的DCFH-DA按1∶1000的浓度装载探针，37 ℃孵育20 min后用PBS洗涤3次，最后重悬后用流式细胞仪（型号：FACSCalibur，美国BD公司）检测，分析100000个单细胞内的DCF荧光强度，取其平均值。
1.5 caspase-3mRNA表达测定
采用RT-PCR法测定：用Trizol（批号：120805，美国GIBCO公司）抽提RNA；逆转录mRNA至cDNA；再用PCR扩增仪（型号：9700，美国应用生物系统中国公司）扩增cDNA。由invitrogen上海提供合成引物，caspase-3引物：上游5’-GCA CTG GAA TGT CAG CTC GCA-3’，下游5’-GCC ACC TTC CGG TTA ACA CGA-3’，扩增产物大小559 bp；β-actin引物：上游5’-CAT CTC TTG CTC GAA GTC CA-3’，下游5’-ATC ATG TTT GAG ACC TTC AAC A-3’，扩增产物大小300 bp。反应条件：94 ℃变性5 min；94 ℃变性30 s，50 ℃退火30 s；72 ℃延伸30 s，共30个循环；最后72 ℃终末延伸7 min。扩增产物用电泳仪（型号：三恒ECP3000，北京市六一仪器厂）电泳，电泳后摄片，并应用Vilber凝胶成像分析系统（型号：Type T2A，法国Lourmat公司）进行吸光度扫描，以目的条带与β-actin的积分比值表示caspase-3mRNA的相对表达量。
1.6 LC3B表达测定
采用Western blot法测定：用蛋白裂解液RIPA（中）（货号：P0013C，碧云天生物技术研究所）在玻璃匀浆器中裂解冻存组织，高速离心后得上清蛋白溶液。采用BCA蛋白含量测定试剂盒（货号：P0010S，碧云天生物技术研究所）测定蛋白浓度；然后，用SDS-PAGE（货号：P0012A，碧云天生物技术研究所）制备12%的分离胶和6%浓缩胶。加样后恒压100V电泳，电泳结束后转PVDF膜，转膜后加一抗（anti-LC3B 1∶1000；anti-GAPDH 1∶800）；过夜后加二抗（second anti-LC3B 1∶3000；second anti-GAPDH 1∶4000）。孵育后将膜包好进入暗室压片并洗片，使用凝胶成像分析系统对胶片进行扫描分析，以特定的目标蛋白条带OD值（volume）与内参蛋白GAPDH（volume）比值表示LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达水平。
1.7 透射电镜标本制作
将左侧海马剩余1/3新鲜组织块用手术刀片切成1 mm3大小，并用4%戊二醛固定，然后用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗2次，每次15 min。1%锇酸固定1 h，再用0.1 mol/L磷酸缓冲液洗2次，每次15 min。30%丙酮脱水15 min，50%丙酮脱水15 min，70%丙酮饱和醋酸铀过夜。过夜后再用80%丙酮脱水15 min，90%丙酮脱水15 min，100%丙酮脱水3次，每次10 min。将包埋剂与100%丙酮按1∶1比例放置1 h，然后将组织块放入胶囊包埋，放入烘箱，制超薄切片并枸橼酸铅染色待检。
1.8 统计学方法
用SPSS 19.0和office excel 2007统计软件进行统计分析，计量资料以均数±标准差（x±s）表示，两组间均数比较用成组t检验，多组间比较用LSD-t检验，以P
2 结果
2.1 CPR组大鼠窒息和复苏时间以及存活情况
60只大鼠制模成功44只（73%），存活到观察时点者33只（55%）。心脏骤停后大鼠主要复苏措施以机械通气和胸外心脏按压为主。在复苏过程中大鼠的心律未见长时间的心室颤动，故在复苏过程中未使用心脏电除颤。各组大鼠窒息和复苏时间差异无统计学意义（P>0.05）。见表1。
2.2 CPR组大鼠基本生命体征及血气分析变化
CPR组大鼠在窒息前、ROSC后0.5和4 h各项生命体征（除Tc外）差异无统计学意义（P>0.05）。动脉血气分析结果比较，HT组ROSC后4 h乳酸水平明显低于NT组（t=2.146，P=0.036），余各相同时点血气分析指标间比较差异无统计学意义（P>0.05）。见表2、3。
2.3 ROSC后各组NDS情况
结果发现，CPR组各组大鼠的NDS显著低于BC组（F=8.107，P
NDS满分为80分，0分为脑死亡；BC：空白对照组；NT：常温CPR组；HT：亚低温CPR组；ROSC：自主循环恢复；NDS：神经功能缺损评分。NT和HT组与BC组比较，aP
图1 各组NDS比较
Fig 1 NDS in each group
2.4 各组大鼠海马单细胞悬液ROS的变化
与BC组比较，CPR组各组大鼠海马组织单细胞悬液反应ROS水平的指标――DCF值均明显上升（F=16.824，P
A：空白对照组；B：常温CPR组ROSC后12 h；C：低温CPR组ROSC后12 h；D：常温CPR组ROSC后24 h；E：低温CPR组ROSC后24 h。每组的左图是通过流式细胞术分辨出的在单细胞悬液中不同的有形物质，白色箭头标注的是所计数的单细胞群，右图是该细胞群的平均荧光度
图2 各组大鼠海马单细胞悬液ROS检测流式细胞图
Fig 2 ROS flow cytometry in hippocampus monoplast suspension of each group
2.5 海马神经细胞caspase-3mRNA表达水平
与BC组相比，CPR组各组大鼠海马神经细胞caspase-3mRNA表达均明显升高（F=24.527，P
BC：空白对照组；NT12：常温CPR组ROSC后12 h；HT12：低温CPR组ROSC后12 h；NT24：常温CPR组ROSC后24 h；HT24：低温CPR组ROSC后24 h；ROSC：自主循环恢复。ROSC后NT和HT组的平均荧光强度与BC组比较，aP
图3 各组大鼠海马单细胞悬液ROS检测结果比较
Fig 3 ROS compare in monoplast suspension of each group rats
A：目的基因caspase-3mRNA（559 bp）的表达。从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h；B：为内参照β-actin （300bp）的表达，从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h。BC，空白对照组；NT，常温CPR组；HT，低温CPR组
图4 各组大鼠海马神经细胞caspase-3mRNA表达
Fig 4 Caspase-3mRNA expression in hippocampus nerve cells of each group
2.6 大鼠海马神经细胞LC3B表达水平
与BC组相比，CPR组各组大鼠海马神经细胞LC3B表达均明显升高（F=6.584，P
2.7 透射电镜观察结果
ROSC后24 h取各组大鼠海马组织作电镜观察。空白对照组大鼠的海马神经细胞核，核膜完整、光滑，核染色质分布均匀；线粒体，外膜完整，嵴光滑清晰可见，基质均匀。常温复苏组大鼠的海马神经细胞核体积缩小，核膜有皱褶，核染色质边集、密度不均匀；线粒体体积明显减小，嵴紊乱、粗糙，基质浓缩。低温复苏组大鼠的海马神经细胞核体积略有缩小，核膜尚光滑，核染色质略有边集，分布尚均匀；线粒体体积略有减小，嵴可分辨，基质浓度略不均匀。见图8。
BC：空白对照组；NT-12：常温CPR组ROSC后12 h；HT-12：低温CPR组ROSC后12 h；NT-24：常温CPR组ROSC后24 h；HT-24：低温CPR组ROSC后24 h。NT和HT组的caspase-3mRNA表达量与BC组比较，aP
图5 各组大鼠海马神经细胞caspase-3mRNA表达水平比较
Fig 5 Caspase-3mRNA in hippocampus nerve cells in groups
（A）目的蛋白LC3B-Ⅱ/Ⅰ（16/18 kd）的表达，从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h；（B）内参照GAPDH（36 000）的表达，从左向右依次为BC组、NT组ROSC后12 h、HT组ROSC后12 h、NT组ROSC后24 h和HT组ROSC后24 h。BC，空白对照组；NT组，常温CPR组；HT组，低温CPR组
图6 各组大鼠海马神经细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达
Fig 6 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
3 讨论
治疗性低温已成为心脏骤停患者脑复苏治疗的有效措施之一；然而，它也主要对院外心室颤动心脏骤停患者有益，提示低温可能仅对轻、中度脑损伤患者有益；但是其有效的主要机制仍有待研究。
BC：空白对照组；NT-12：常温CPR组ROSC后12 h；HT-12：低温CPR组ROSC后12 h；NT-24：常温CPR组ROSC后24 h；HT-24：低温CPR组ROSC后24 h。NT和HT组的LC3B- Ⅱ/Ⅰ表达量与BC组比较，aP
图7 各组大鼠海马神经细胞LC3B-Ⅱ/Ⅰ表达水平比较
Fig 7 LC3B-Ⅱ/Ⅰ expression in hippocampus nerve cells of each group
A：空白对照组大鼠的海马神经细胞核（×8000）；B：常温复苏组大鼠的海马神经细胞核（×8000）；C：低温复苏组大鼠的海马神经细胞核（×8000）；D：空白对照组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）；E：常温复苏组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）；F：低温复苏组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）；G：常温复苏组大鼠的海马神经细胞线粒体（×40 000）被双膜结构（黑箭头所示）包围形成自噬体
图8 各组大鼠海马神经细胞核和线粒体的超微结构变化
Fig 8 Electron micrographs of nucleus and mitochondria in each group
心脏骤停后全身各器官、组织和细胞缺血缺氧，使呼吸链传递电子的效能下降，并使电子受体减少，造成缺血区ROS的产生并未增加[6]。经CPR治疗恢复自主循环（ROSC）后，再灌注血液中含有大量的氧，而此时线粒体呼吸链的酶活性却未能迅速恢复，致使氧经单电子还原成氧自由基增多[7]。此外，Ca2+超载也使线粒体功能受损，细胞色素氧化酶系统抑制，最终使ROS的产生超过组织的清除能力[6]，进而造成细胞膜和细胞器不同程度受损，甚至引起细胞坏死和凋亡[8]。本研究结果表明，大鼠海马神经细胞在缺血-再灌注（I/R）后胞内ROS明显增高，这与细胞在缺血缺氧后发生级联反应的结果是一致的。低温治疗使ROS的产生量较相同时点的NT组明显减少（图2、3），其原因可能与MH能降低ROS的产生，同时具有保护清除ROS的酶系统有关。
Caspase-3是凋亡通路的最后执行者，能从一定程度上反应细胞凋亡的程度[9]，已有研究结果表明，MH能通过减少神经细胞的凋亡而使神经功能得到保护[10]。本研究中发现，MH能显著减少脑细胞I/R后ROS的产生量，并且与caspase-3mRNA的表达有一定的相关性。其原因可能是ROS的减少，通过抑制钙介导的兴奋性氨基酸与氧自由基之间的恶性循环，使caspase-3mRNA表达减少（图4、5），在一定程度上降低了细胞凋亡的程度。
另外，自噬通常被认为是细胞的一种保护性作用，它在维持缺血缺氧等应激状态下使细胞存活[11]，并清除细胞内衰老细胞器和错误折叠蛋白中起重要作用[12]。但是，近年来也发现，在某些条件下细胞自噬也能导致细胞死亡，即所谓过度自噬[13]。除利用电镜可观察自噬体形成外，还可以利用WB的方法检测LC3的形成，从而判断自噬发生的程度[14]。由于LC3B在脑中表达较多，可以用作脑细胞自噬的分子标志[15]。在自噬过程中，LC3-I被泛素样体系修饰和加工，产生相对分子质量为16 000的LC3-Ⅱ，并被定位到自噬小体中。故此，自噬小体中存在的LC3I和LC3-Ⅱ均可成为细胞发生自噬的分子标志，并且LC3Ⅱ的含量和发生自噬的程度成正比[16]。本研究也发现，HT组LC3B-Ⅱ/Ⅰ的表达较相同时相点的NT组有所下降（图6、7），表明MH减小了细胞的自噬程度，并可能是大鼠神经功能改善的原因之一（图1）。提示大鼠复苏后脑神经细胞发生的自噬是过度的、有害的。
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