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周末学习计划范文1
【关键词】亚洲带绦虫;膜联蛋白b2;基因克隆;免疫反应性
abstract: objectiveto clone and express the gene named as annexins b2 of taenia saginata asitica so as to analyze the immunogenicity of its recombinant protein.methodsby online analysis of the gene at bioinfomatics websites to identify the gene from the taenia saginata asiatica full-length cdna plasmid library, the gene was cloned into prokaryotic expression vector pet-28a(+) and then transformed to e.coli bl21 with iptg induction. thereafter, the gene product was analyzed by sds-page and purified by ni-nta affinity chromatography. in addition, the immunoreactivity of the purified recombinant proteins was analyzed by western blotting.resultsas demonstrated by pcr, double enzyme digestion and dna sequencing indicated that the recombinant plasmid was successfully constructed and highly expressed. the recombinant protein tested with western blotting analysis could react with taenia asiatica and taeniarhynchus saginatus infected patient serum.conclusionthe annexins b2 of taenia saginata asitica has been cloned and expressed in the prokaryotic expression system and the purified protein has been confirmed with immunogenicity.
key words: taenia saginata asiatica; annexins b2; gene cloning; immunoreactivity
鉴于亚洲带绦虫与猪带绦虫及牛带绦虫在起源、分类学地位存在的差异[1-2]，本课题组率先构建亚洲带绦虫成虫全长cdna质粒文库，并对该虫进行功能基因组的研究工作[3]。本文利用生物信息学工具从文库中筛选到了一个膜联蛋白b2(annexins b2)的同源基因，构建了原核表达载体，并对其原核表达产物进行免疫学方面的初步研究。
1材料与方法
1.1材料
1.1.1血清、载体与菌株3种人体带绦虫患者血清取自粪检阳性的带绦虫患者。原核表达质粒pet-28a(+)及大肠埃希菌bl-21/de3由中山大学热带病防治教育部重点实验室惠赠。
1.1.2主要试剂和工具酶ex taq酶(含dntp)，bamhⅰ，xhoⅰ，t4 dna连接酶 (大连宝生物工程公司);异丙硫代-β-d半乳糖苷(iptg)(美国promega公司);质粒纯化试剂盒(广州东盛科技公司);辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪igg二抗、兔抗人二抗、3，3二氨基联苯胺(dab)显色试剂盒(武汉博士德生物工程有限公司);氯化钙、氯化钠等为国产分析纯试剂。
1.2方法
1.2.1annexins b2基因的识别及扩增将获得的亚洲带绦虫annexins b2基因进行blastx分析。并根据已获得的该基因全长编码序列的开放阅读框，利用软件设计引物(引物由上海联合基因公司合成)，分别带上bamhⅰ和xhoⅰ的酶切位点进行pcr反应。
1.2.2重组原核表达质粒的构建及鉴定pcr产物和pet-28a(+)载体分别用bamhⅰ和xhoⅰ双酶切，回收、连接后转入大肠埃希菌bl-21/de3感受态细胞，对阳性克隆依次进行质粒的提取、双酶切和pcr鉴定，并进行重组质粒dna测序鉴定(测序由英俊科技股份有限公司完成)。
1.2.3重组蛋白的表达及纯化按照常规方法进行蛋白诱导表达，考马斯亮兰蛋白染色液染色观察蛋白表达情况。确定蛋白表达后，进行大量的诱导表达，并判断重组蛋白的可溶性，再将样品加入预先处理好的ni-ida his.bind树脂亲和层析纯化柱中，最后再用pbs 24h透析以去掉过柱时留下的咪唑。
1.2.4western blotting分析重组蛋白的免疫反应性用3种人体带绦虫患者及正常人血清与辣根过氧化物酶(hrp)标记的兔抗人igg进行western blotting鉴定。
2结果
2.1annexins b2基因的识别和序列分析该基因全长922bp，编码区为224～686bp。其最大orf为其完整编码区。
2.2原核重组质粒的鉴定将重组质粒进行pcr和双酶切鉴定，产物行0.8g/l琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500bp左右有一清晰条带，与目的基因大小基本相符。此外，重组质粒的测序报告表明插入序列与理论序列一致，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.2蛋白表达及纯化结果将构建好的重组质粒转化到e.coli bl/de3中，超声裂解后sds-page电泳分析结果显示在大约25ku处出现高效表达条带(图2)，与目的蛋白基本相符。测得纯化产物的蛋白浓度为0.526g/l。
2.3western blotting鉴定纯化蛋白的免疫反应性
用感染亚洲带绦虫、猪带绦虫、感染牛带绦虫的患者血清以及亚洲带绦虫感染猪的血清与纯化蛋白反应的结果均显示出较清晰的条带，而阴性对照血清在相应位置未识别出该蛋白条带(图3)，表明该表达产物具有良好的免疫反应性。图1重组质粒的pcr和双酶切鉴定
fig.1 the identification of the pet-28a(+)-ta annexins b2 by pcr amplification and digestion with restriction enzymesm1：dna标准(dl2000);1：pcr产物;2：pet-28a(+)质粒双酶切;3：pet-28a(+)-annexins b2重组质粒双酶切;m2：dna标准(dl 15000)。图2100g/l sds-page分析pet-28a(+)-ta annexins b2在大肠埃希菌中的表达产物及其纯化产物fig.2 100g/l sds-page analysis of the prokaryotic expression product and purified product
m：蛋白marker;1：pet-28a(+)iptg未诱导;2：pet-28a(+)iptg诱导;3：pet-28a(+)-annexins b2 iptg未诱导;4：pet-28a(+)-annexins b2 iptg诱导;5：pet-28a(+)-annexins b2上清;6：pet-28a(+)-annexins b2沉淀;7：pet-28a(+)-annexins b2纯化蛋白。
3讨论
带绦虫病的流行在我国西部一直是一个严重的公共卫生问题。每年由带绦虫病造成的健康和畜牧业经济损失上百亿，严重影响西部欠发达地区的社会发展。目前，亚洲带绦虫病的防治研究的重点集中在诊断和疫苗候选抗原、药物靶标、致病的分子机制研究。图3重组蛋白的western blotting 鉴定fig.3 western blotting analysis of the recombinantsm：蛋白marker;1：纯化蛋白与亚洲带绦虫患者血清的反应结果;2：纯化蛋白与牛带绦虫患者血清的反应结果;3：纯化蛋白与猪带患者血清的反应结果;4：纯化蛋白与亚洲带绦虫感染猪血清的反应结果;5：纯化蛋白与正常人血清的反应结果。
本实验通过生物信息学方法从已经构建好的亚洲带绦虫成虫cdna质粒文库中筛选出了一个膜联蛋白(annexins b2)的同源基因，并且预测出该基因位于胞浆，无跨膜区，二级结构基本上是以α螺旋为主。这些都符合膜联蛋白家族的共同特征[4]。根据膜联蛋白家族分布广泛，表达丰富且稳定的特性，可以推测其在绦虫的生理活动中可能起着重要的作用。
膜联蛋白是一个广泛存在的蛋白家族，在所有真核基因组中广泛表达。具有内部重复单位和“g-x-g-t-(38residues)-d/e”基序[5]，即ca2+结合区域的特征，用以结合带有负电的脂质。虽然它为钙结合蛋白，但是在结构上却没有ef手，而且在和ca2+结合后，还可以与磷脂再次结合而发挥生物学效应。例如，细胞的胞吞胞吐，离子通道的形成，调节磷脂酶a2的活性及细胞内外ca2+浓度、抗炎症反应等。在长期的生物进化过程中，膜联蛋白家族各成员在生物学特性和生理功能方面表现出非常复杂的关系，且在研究过程中发现，annexins没有信号肽，没有跨膜结构，是一个典型的细胞内蛋白。但是，却有学者发现它可以与细胞外基质发生作用。例如，抗炎[6]、抗凝[7]、抑制肿瘤[8]等。最新的研究报道，当将其作为疫苗的候选因子时，可以消除一些寄生于哺乳动物体内的寄生虫。此外，学者们认为膜联蛋白是维持细胞膜表面结构和信号转导功能的重要蛋白。并可能具有激活纤维蛋白酶原的功能，有助于破坏宿主的结缔组织，使虫体抗原更加容易进入宿主机体，诱发免疫应答。因此，对该基因的研究有助于进一步了解它的生物学功能及开辟预防治疗寄生虫病的新途径[9-10]。
目前，annexins b2已经在猪囊尾蚴的研究被发现并命名，但是具体的生理功能还不清楚，且在亚洲带绦虫研究领域还是空白。因此，本研究将亚洲带绦虫成虫annexins克隆到原核表达质粒pet-28a(+)中，构建重组质粒，在大肠埃希菌bl-21/de3中用iptg诱导表达，表达产物通过sds-page电泳进行鉴定。sds-page结果表明，该蛋白在全菌和沉淀中都有表达，上清中有微量的表达，说明annexins主要表达在包涵体中。因此，进一步溶解包涵体[11]，经变性处理并亲和层析纯化后，得到了大量较纯的重组蛋白。此外，还尝试性的用上清过柱纯化并用蔗糖进行蛋白浓缩，也得到部分有活性的蛋白。western blotting就是以抗体-抗原沉淀反应为基础的，可用于不同抗原的比较和定量。其检测结果表明所获得的重组蛋白与猪带绦虫、牛带绦虫及亚洲带绦虫有较强的交叉反应且在绦虫中的诊断特异性不高，推测其不能作为免疫诊断抗原的合适候选分子。但是，其具有免疫活性的高效表达。由此可推测它是一个具有开发潜力的基因。总之，本项研究填补了该蛋白在亚洲带绦虫研究领域的空白，也为进一步研究该基因的生物学功能及在诊断尤其是疫苗研究方面奠定了基础。
【参考文献】
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\[4\]moss se, morgan ro. the annexins \[j\]. genome biol, 2004, 5:219-221.
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\[6\]高奋堂，曹云山，徐义先，等. 氟伐他汀对人外周血单个核细胞膜联蛋白a1表达水平的影响 \[j\]. 临床心血管病杂志, 2006, 22(4):209-211.
\[7\]王义会，闫强，王平，等. 膜联蛋白b2基因的克隆及其真核表达载体的构建 \[j\]. 动物医学进展, 2007, 28(3):31-33.
\[8\]朱逢佳，曾苏，曹江. 膜联蛋白-1与肿瘤\[j\]. 细胞生物学杂志, 2008, 30(5):581-585.
\[9\]zhang y, wang kh, guo yj, et al. annexin b1 from taenia solium metacestodes is a newly characterized member of the annexin family \[j\]. biol chem, 2007, 388(6):601-610.
周末学习计划范文2
[关键词]英语教学；初高中衔接；高一学生；策略
学生从初中升入高中，不仅是人生的一个转折，在学业上也将有重大转变。高一学生的英语学习非常关键，教师要让高一学生在短时间内适应高中的英语学习，当务之急是要做好初高中英语教学的衔接工作。
一、初高中英语教学衔接存在的问题
笔者从事高中英语教学多年，在每次接手高一时，发现学生学习英语时普遍感到听不懂、念不顺、译不出，课堂气氛沉闷，难以完成教学任务。这是为什么呢？分析原因主要由以下三个因素导致。
（一）学生的情绪发生变化，学习方式却没有改变
我校的高一学生都是来自各个乡镇，他们能考上我校，在初中学习成绩不是学校的佼佼者，就是班里的领头人，令他们产生了强烈的优越感。但他们进入高中后，发现班里的同学有的比自己更优秀，心里产生失落感。还有些学生学习方式单一，英语基础不扎实，到了初三靠死记硬背才在中考中取的了好成绩。进入高中后，随着教学要求的不同，教材内容的增加，延用原来的学习方式无法取得他们想要的成绩。由此他们对高中英语学习产生畏惧心理，甚至有的失去了信心。
（二）初高中教师的教学方法不同
初中英语知识单一，题型简单，课时也充足。在课堂教学时，教师有足够的时间去反复讲解一个句型或一个语法点，直到学生弄明白。而高中英语知识综合性强，课时少，教师对重难点内容在课堂上没有多余时间进行反复教学，对各类型题也不可能讲全讲细和巩固强化。教师侧重对各个知识点进行精讲精练，讲究系统知识的学习、归纳，引导学生举一反三，这使高一新生开始不适应高中英语学习而影响英语成绩的提高。
（三）初高中教材的不同
初中教材浅显易学，对话丰富有趣，课文篇幅较短，课堂上也有充分的时间学习，所以考试很容易得到高分。而高中教材内容丰富，知识容量大，并在初中的基础上注入了大量的语法点、知识点，使句子结构更为复杂，所以要求学生学习教材后，还要掌握一定的学习方法。学生要想考出好成绩单靠死记硬背是不够的，它还需要靠学生平常知识的积累和对知识体系透彻完整的了解和掌握。
二、搞好初高中英语教学衔接的策略
（ 一）正确引导学生的心理转变是做好衔接工作的前提
刚进高一的学生往往要通过一段时间才能适应新环境，接纳新老师和新同学。在这段时间里，教师要和学生勤沟通，多交流，通过主题班会等形式，消除他们头脑里的各种消极情绪。要让他们知道高一英语在整个高中英语中所占的位置和作用，对于那些情绪上有失落感的学生，教师要告诉他们只有发奋努力，继续发扬拼搏精神，才不至于落后于他人。
（二）选择合适的教学策略是做好衔接工作的必要条件
高一英语教师在开学之初，要细致入微地了解每一个学生的知识面和对基础知识的掌握情况。从学生实际情况出发，采取“低起点、小梯度、多练习、分层次”的方法，将教学目标分解成若干递进层次逐层落实。在速度上，放慢起始进度，逐步加快教学节奏。在知识导入上，要注重由已知引入未知，帮助学生温故而知新，从而缓解教学坡度，分解知识难度。
此外，教师要精心准备每一堂课。课堂是教师展示自己才华的最好舞台和阵地，如何吸引学生的眼球和注意力，让他们一节课上完回味无穷，这就需要教师提前做足功课，把每一堂课都当成自己的第一堂课，这样才能使自已有激情，才能让学生有新鲜感。
（三）指导学生正确的学习方法是做好衔接工作的首要条件
学生进入高中后，如果还是采取初中死记硬背的学习方法，是无法提高学习效率的，教师要教给学生正确的学习方法并提供指导。
1.制订学习计划。古人说：“凡事预则立，不预则废。”意思就是不论做什么事，事先有准备，就能得到成功，不然就会失败。因此教师在开学初要指导学生根据自身的情况确立英语学习目标，制订学习计划。
2.搞好课前预习。上好每一堂课是教师完成教学任务的关键，所以课前教师都会认真备课。学生也要跟老师一样，课前应根据教学内容先去预习。在我班里，我会把每一节预习内容打在讲义上，要求学生课前自己查字典，自己用新词造句，自己找出课文中的难点。让学生在预习中发现问题自主解决，也可以跟同学讨论。
