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对标学习计划范文1
一、新课程标准下高中化学教学的目标和意义
高中化学是全国在九年义务教育的基础上设置的较高层次的基础学科，满足学生自身发展所需要的化学基础知识和化学技能，促使学生的全方面发展，更能培养学生的创新精神和实践能力。
高中化学学科有助于学生对物质世界的认识，学生通过在学习过程中的探究和实践，加深学生对科学本质的认识，有利于学生形成严谨的求学态度，明确科学和实际生活之间的联系。
高中化学注重培养学生的知识技能，知识是指化学科目中的一些基础知识，技能是指学生在实际操作上的技术能力，培养学生知识技能，是因为这样更有助于学生了解化学学科的重要作用。
高中化学也培养了学生的能力，包括学生的观察力、动手能力、实际操作能力和学习能力。培养学生能够运用化学知识解决一些简单的实际问题，并把化学和其他学科综合，对学生的知识进行综合，培养学生潜能，同时高中化学还有助于学生个性和特长的发展。
高中化学培养了学生的情感态度，激发学生对化学的兴趣，更有助于加强学生对现如今社会存在的某些问题的关心，比如能源问题、环境污染问题、卫生问题和健康问题等等。化学学科结合实际生活，不但对学生进行了情感上的培养，而且让学生体会到实际生活和化学课程的设置是不可分割的，从而激发学生的学习兴趣，培养学生的爱国主义情怀。
二、新课程标准下高中化学教学设计的探究
（一）情景教学，引人入胜。化学这门课程是以实验为基础的自然科学，高中化学也将实验作为教学中的重点，所以在实施教学的过程中，将学生带到氛围中去至关重要。
在课堂上要给学生充足的自由发挥时间，培养学生的问题意识，让学生自主发现问题并解决问题。教师不要将固定的实验步骤告知学生，而是启发学生自己开动脑筋，通过自己动手实验得出相应的结论。
（二）教师教学理念的更新。教师的教学模式一定要符合新课程标准，传统的教学模式，教师为了节省时间，增加教学内容。为了完成大纲要求，经常会将结论直接传授给学生，或者实验教学时将实验步骤直接告知给学生，学生按部就班的进行试验，学生失去了对知识探索的乐趣。
作为教育者，要跟着新课程的标准走，所以一定要解放应试教育思想，突出学生是课堂的主体，尊重学生的个体差异，对学生多用鼓励的言语，要积极看到学生努力的一面，用客观正确的眼光对待所有的学生。在教学中，更应该多引导学生自主探究，多进行合作交流，不仅要注重学生掌握的效果，也要注重学生探究的过程，培养学生自主学习能力和探究问题能力。
（三）创造新型的师生关系，营造和谐愉快的学习氛围。教学成果是否高效，很大一部分原因取决于课堂氛围。传统教学中教师占主导地位，在学生心中大都是严师的形象，学生惧而远之，造成师生间最基本的交流都成为问题，自然而然教学成果不会非常理想。
在新课程的背景下，新型师生关系是一种必然的产物，因为师生关系直接影响到教学的质量。在这种新型关系中，教师不再是高高在上，而是更贴近于学生，和学生站在同样的立场。
（四）教师要丰富教学方式，教学可以和现代化信息技术相结合。在高中化学科目中，大部分都是非常抽象的，仅限于文字式难以理解的。教师除了要鼓励学生通过实验证明观点外，还可以借助强大的多媒体进行教学，图片的展示和动画展示都是很好的例子，不但直观，而且还可以三百六十度全面观察。例如在进行“晶体的结构和性质”的教学时，教师可利用多媒体将金刚石、石墨、CO2等晶体的内部空间结构用立体图形展示出来，从不同的角度都可以观察到内部结构，教师还可以通过动画形式，配以简单的讲解，和学生共同分析晶体形成的原因、结构和晶体的性质。
对标学习计划范文2
关键词：话语标记语，语用功能，语言学习，就是说
中图分类号：H0-05 文献标识码：A 文章编号：1006-026X（2013）10-0000-01
绪论
话语标记词是指那些被用来标示会话语段之间的各种逻辑或时空关系的词或者短语。它的主要作用可看作说话者用来促进受话者对语句，交际情景的理解。按照Levinson（2001）的话来说，话语标记语的作用在于“通过各种方式来标明话语标记语所在的话语是如何与前面的话语互相照应，彼此延续的”。见下例：
这个是回民的，这个死人哪，是比较省钱，就是比汉民的这个省钱了。哎，就是你，你比如说吧，过去就是说白崇禧，那个大军阀，他是回民。什么马洪奎， 哎，就是这些大军。
由于话语标记语对会话的推进具有十分重要的作用，国内外越来越多的学者对其进行了大量的研究。如Schiffrin（1987）对oh，well，and，but等11个话语标记语进行的研究，以及Fraser（1996），Blakemore（1987）从语法或语义特征及语用角度对话语标记语进行的研究。国内学者如，熊学亮（1999），何自然（1999）以及冉永平（2000，2002，2003）等也对话语标记语进行了研究，并探讨了you know，well，and，I mean等的语用功能。亦有众多学者对汉语中的话语标记语进行了探讨，诸如“幸亏”（杨亦鸣等，2004）、“我想”（郭昭军，2004）、“其实”（王江，2005）。尽管研究的角度和方法各有不同，但就话语标记语的基本特征而论，学者们业已达成共识，即：①功能上具有连接性；②语义上具有非真值条件性，即话语标记的有无不影响语句命题的真值条件；③句法上具有非强制性，即话语标记的有无不影响语句的句法合法性；④语法分布上具有独立性，可见于句首或句中，不与相邻成分构成任何语法单位；⑤语音上具有可识别性，可以通过停顿、调值高低等来识别。
从前文对“就是说”进行的分析来看，“就是说”显然符合了话语标记语的这五项基本特征。那么，“就是说”作为话语标记语又有怎样的具体特点以及语用功能呢？
话语标记“就是说”语用特点研究
目前各类主流中文词典均未收录“就是说”这一词条，因此对话语标记语“就是说”的主要相关研究还仍见诸于学者文章中，如下：
盛新华，邱野（2009）总结了“就是说”在语篇中所发挥的作用，认为：“就是说”作为话语单位之间的连接成分，它所标示的前行句A和后续句B之间具有解释与被解释、抽象与具体、深奥与浅显、补充与被补充、强调与被强调、限制与被限制、概括与被概括、前提与结论等关系。
郭莉琳则对“就是说”的词汇化过程进行了研究，探究了它从最初的连词副词和动词组合，到成为解释说明的话语标记、话语组织功能的话语标记、停顿填充功能的话语标记。
H？lker（1991，cf.[6]）指出，话语标记语或语用标记语的功能主要体现为这样四个方面：（a）不对话语的真值条件产生任何影响；（b）不会增加话语的命题内容；（c）与说话时的情景有关；（d）具有一定的情感功能或表达功能。
以下是笔者基于北京大学语料库“就是说”的语料，总结的“就是说”作为话语标记语的几个语用功能。
1.延缓标记语
延缓标记语，顾名思义，是说话者用来避免在会话中可能出现的过长的停顿、同时标示说话者对下文的内容还没有完全想好而用以争取时间，填补空缺的词语。如下面例子中的“就是说”：
一直在天津呢，所以这点儿音呢也不，也不是太纯正北京音。另外呢就是说，哦，怎么说呢，在我们那时候就已经，虽然家庭还是老家庭
上例中，说话人在谈及天津口音和北京口音的不同之处过后，另起了一个小话题，但是在小话题的内容上，或者表达方式上还有不确定的地方，因此，说话人在这句话中连续用了两个表示延缓的话语标记语（“就是说”和“怎么说呢”）来拖延话题的推进，为自己争取时间。再如下例：
不是说说是个别的这个迷信事儿，这不是。就过去我们吧哈，就是说烧， 北京吧就是没烧香啊磕头哇，这些个不要，这些都是迷信的
上面例子中说话者便是利用“就是说”来延缓节奏，争取时间。但此类用法不甚多。
2.解释说明的作用
口语会话带有很重的即时、不连贯、所含信息较乱等特点，因此在会话中常常会出现讲话者提供的信息与听话者的预期不一致，或者讲话者对听话者就信息各成分的重要程度理解不一的情况，因此当讲话人意识到后可能会立即对话语内容进行修正。笔者发现，“就是说”也具备了充当解释说明标记语的功能，表示对前面信息的进一步说明或指示，比如：
所以根据这个我上一辈儿的，我的父亲叫存琦，就是说姓存名琦；
同时，讲话者为了更准确、明显地表现出自己考虑到双方的认知差距而做出了进一步的说明，话语标记语“就是说”往往会变体为“也就是说”，更体现解释的功能，见于下例：
决定：“力争于1968年进行氢弹装置的爆炸试验。”也就是说，要以比美、英、苏都快的速度把氢弹研制出来。
“就是说”的作为话语标记语的这种用法体现了口语会话中的连贯性原则，这一用法是“就是说”作为话语标记语而言比较普遍的用法，因此这一用法对于英语学习而言具有十分重要的作用。
“就是说”对语言学习的意义
前文说到“就是说”作为话语标记语具有解释说明的功能，在结构上起着联系、衔接的作用，内容上则是更进一步的解释说明。会话实际上是一个动态的交流过程，在这个过程中会话双方互相施加影响，说话者会根据语境、上下文内容或者认知预期通过补充的方式解释话语，帮助听话人的理解。也就是说，在会话中，“就是说”后面的内容更详细、更细节，前面可能语焉不详，或者简单明了，但“就是说”后面的内容是说话者在考虑到听话者的认知差距后补充进行的解释。从这个意义上讲，在语言的学习中，受话者只要着重理解到“就是说”后面的内容，便不影响对整个内容的把握。对中国学生而言，“就是说”的作用在英语学习的听力理解和阅读理解中尤为如此。
结论
本文探讨了“就是说”的语用功能和效用，并提出了其对于语言学习，尤其是对于外语听力理解和阅读理解学习具有重要作用。从衔接和连贯的角度来说，语言学习者掌握“就是说”的此项语用功能，在学习中能取得事半功倍的效果。“就是说”的此种功用与语篇连贯究竟如何作用，还有待进一步的研究。
参考文献
[1]Halliday & Hassan.Cohesion in English[M].London：Longman，1976.
[2]Schiffrin，D.Discourse Markers[M].Cambridge：Cambridge University Press，1987.郭莉琳.“就是说”的话语标记功能及其词汇化过程[J].牡丹江师范学院院报，2012，（5）.
[3]刘丽艳.作为话语标记语的“不是”[J].语言教学与研究，2005，（6）.
[4]莫爱屏.话语标记语的关联认知研究[J].语言与翻译，2004，（3）.
[5]冉永平.话语标记语 well 的语用功能[J].外国语，2003，（3）.
[6]盛新华，邱野.“就是说”所标示的A、B之间的语义关系及语用特点[J].延安大学学报，2009，（1）.
对标学习计划范文3
【关键词】血标本；放置时间；放置方式；生化指标
临床上待检测的血液标本的保存是医学检验分析中质量控制的一个十分重要的组成部分，常规生化检验由于血液标本量较大，标本采集后往往不能及时上机检测，从采样到上机检测耗时较长，这是否对生化检验结果有影响，是分析前质量控制中需重点关注的问题之一。有研究显示血液标本的不同放置时间以及放置方式，会对各项生化指标的检测结果具体值产生十分显著的影响[1]。为了探讨标本放置时间和方式对生化检验结果的影响，本研究随机选取2013年4月――2013年5月在我院住院的62例患者，每例患者抽取血液标本5ml，对采集到的血液标本进行分组检测，并对不同放置时间和方式下血液标本的各项生化检测结果进行比较分析，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料选取2013年4月――2013年5月在我院住院并进行生化检测的62例患者的血液标本为研究对象。
1.2方法所有人员于清晨采取空腹血5ml，分别注入3支干净试管中。待凝固后以3000r/min离心10min，即刻取血清进行生化指标测定。剩余血液贴好标签，注明时间，其中1管血放置室温下（20℃），另l管血放置4℃冰箱内存放，第3管采血后即刻离心取血清放置于4℃冰箱内。分别在2h、12h、24h后对3种存放方式下的血液标本的生化指标展开检测，并对检测结果进行对比分析。
1.3仪器与试剂采用日立7600全自动生化分析仪及其原装配套试剂、标准品和质控品。标本采集使用浙江拱东医用塑料厂生产的一次性真空促凝管。
1.4检测项目谷丙转氨酶（ALT）、天冬氨酸氨基转移酶（AST）、尿素氮（BUN）、二氧化碳（CO2）、葡萄糖（GLU）、血钾（K+）。所有操作均严格按照说明书进行。
1.5统计学分析采用SPSS14.0统计学软件进行处理，计量资料以均数±标准差（χ±s）表示，比较采用t检验，以P
2结果
与即刻检测的生化指标结果比较，室温放置2h后，GLU、K+结果降低，12h后及24h后，GLU持续下降，而K+重新升高；4℃冰箱存放12h、24h后GLU下降，K+逐渐升高；离心分离血清放置于4℃冰箱2h后K+结果降低，12h、24h后又逐渐升高；在3种存放方式下，CO2从2h后就开始持续降低，以上变化与采血后即刻离心分离血清进行检测的结果相比较，差异具有统计学意义。ALT、AST、BUN在3种存放方式下随时间不同结果无明显变化，结果见表1。
3讨论
在临床上，血液化验结果的准确性对于指导临床诊断和治疗具有十分重要的意义。研究显示，血液标本放置时间及放置方式的不同会对检验结果产生一定程度的影响[2]。在实际检测工作中，为保证生化指标的准确性，检验人员一定要严格按照操作规程进行，合理安排检测顺序，对于不稳定的检测项目一定要在短时间内测定，对于暂时不能上机的标本，应针对不同的需要采取不同的保存措施。
参考文献
对标学习计划范文4
鉴定是否学好一门外语需要从学习目的方面来检验。《英语课程标准》指出：“此次英语课程改革的重点是发展学生的综合语言运用能力，使语言学习的过程成为学生形成积极的情感态度、主动思维和大胆实践、提高跨文化意识和形成自主学习能力的过程……要帮助学生了解世界和中西方文化的差异，拓展视野，培养爱国主义精神，形成健康的人生观，为他们的终身学习和发展打下良好的基础”。而我国中小学英语教学中，割裂了语言和文化的关系，认为只要进行听、说、读、写的训练，掌握了语音、词汇和语法规则就能理解英语和用英语进行交际，这种教学存在的显著问题就是缺少了对目标语言的文化内涵教育。中小学英语教育都是英语教学中不可或缺的重要组成部分，小学英语教育是基础中的基础，而初中英语教学更是英语教育的起步和发展阶段。在新课程标准的宏观目标指导下，当前中小学生英语教育中的文化教育不可或缺，其重要性不言而喻。
一、中小学英语教育中文化教育缺失现状的表现及原因
1.学生学习片面，忽视文化内涵
在中小学英语学习中，有此学生不了解英美文化习俗，因而与外国人交流时会问许多可能会误解甚至涉及个人隐私的问题，对国人来说不过就是唠唠家常，拉近对方距离的问题，但在外国文化中，这种涉及隐私的问题是不礼貌的举动，会引起了外国人的不快，最后导致交际失败。这种失败其实正是一种语言学习的失败，试想，一门语言若失去其文化内涵，导致交际失败，那学习该门外语的目的就亟需考证了。
2.教师的文化涵养需要提高
英语教学中的文化教育不像听、说、读、写、译那样可以单独设课以进行专门学习。文化知识的导入和文化意识的培养，贯穿整个教学过程，纵横交错在各个环节之中，而这一重任则主要落在教师身上。在这一逐渐渗透过程中，英语教师肩负着“汇通中西”的重任，因此，只有提高自身的英语文化知识，教师才能在教授学生的时候注重文化知识的传授。教师应该言传身教，处处做学生的楷模，处处留心关于英语的文化知识，提高自己的能力。我国的英语教学中一个比较大的问题就是忽略文化教学。长期以来，我国的中学英语教师一直重视的是学生语言能力的培养。在中学英语课堂上，很多教师经常讲的就是单词和语法，却没有认识到英语作为一门语言，其最终的日的是用来交流，忽略了英语和我们母语之间是有文化上的差别的，也就是忽略了对学生语用能力的培养。
二、目标语言的文化教育在外语学习中的重要性
著名学者胡文仲在其1999年出版的《跨文化交际学概论》一书中指出：“只注意形式，而不注意语言的内涵是学不好外语的”。语言是文化的载体，文化的任何内容都可通过语言来反映。英语教学是语言教学，当然离不开文化教育。然而当前我国中小学学生的英语语言学习现状却是尽管学生可以说出非常完美的口语，然而无法理解中间的文化背景含义；或者是学生会读写英语词语，但无法理解词语背后独特的文化背景意义，很多时候往往根据母语翻译机械的理解。由于没有文化教育，很多学生学会与掌握的只是英语词汇与短语，可以熟练阅读，背诵与记忆英语词汇，然而无法真正理解其中的内在含义与文化背景，仅仅是掌握了英语形式上的“含义”，没有融入到英语语言文化中去。由于英语教学中缺乏文化的内涵，所以导致了中学生在英语学习后出现了能“说”却不会“道”――学生能够“说”一口流利的英语，但却“道”不出其中的文化内涵。
三、针对文化教育缺失现状的对策研究及提高文化教育质量的方法和途径
1.转变“老师单一教”和“学生盲目学”的观念
在中小学英语教育中必须加入文化元素，转变老师教学和学生学习的观念，注重文化素养的培养。其次，要将英语文化教育作为重要的教学内容对待。在语言学习领域，学生要面对来自不同文化之间的冲突，因此，就必须帮助学生坚定一个信念：任何文化都有其存在的理由，都是可以理解和掌握的。在日常教学过程中，教师要针对不同家庭背景的学生给予包容心，要从他们的实际情况着手，为他们创造良好的语言学习条件。
2.寓教于乐，改变传统教育方式
在中学英语课堂上很多教师经常讲的就是单词和语法，却没有认识到英语作为一门语言，最终的日的是用来交流，忽略了英语和我们母语之间是有文化上的差别的，也就是忽略了对学生语用能力的培养。日常学习生话中善于利用一切机会进行英语口语的练习，乐于用英语与他们进行交流，做到“润物细无声”的导入英语文化。教师配置一定的教具和配套的音像资料等，可以引起学生的兴趣，从而达到更好的教学效果。
对标学习计划范文5
[关键词] 葛根素;溶血磷脂酰胆碱;动脉粥样硬化;基质金属蛋白酶-9;平滑肌细胞
[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210(2010)04(b)-015-03
Effect of Puerarin on the expression of matrix metalloproteinase-9 induced by lysophosphatidylcholine in vascular smooth muscle cells
CAI Zhichun1, WANG Songqing1, FANG Yunxiang2
(1.Changde Vocational Technical College, Changde 415000, China; 2.Department of Pharmacology, Xiangya School of Medicine, Central South University, Changsha 410078, China)
[Abstract] Objective: To observe the effect of Puerarin on the expression of matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) induced by lysophosphatidylcholine (LPC) and investigate the anti-atherosclerosis mechanism of Puerarin. Methods: The vascular smooth muscle cells (VSMCs) were incubated with different concentrations of LPC (1.0-10.0 mg/L) for 24 h to detect the level of MMP-9 in supernatants. The VSMCs were treated with LPC (5.0 mg/L) for 24 h following pretreatment with various concentrations of Puerarin(10-6-10-4 mol/L) for 4 h. The level and mRNA expression of MMP-9 were determined by enzyme linked immunosorbent assay (ELISA) and real-time quantitative reverse transcription-polymerase chain reaction (real-time RT-PCR) respectively. Western blot analysis was used to investigate the activity of nuclear factor kappa B p65 (NF-κB p65). Results: LPC significantly increased the level of MMP-9. The increased level and mRNA expression of MMP-9, and the activity of NF-κB p65 were markedly inhibited by different concentrations of Puerarin in a dose-dependent manner. Conclusion: LPC enhances the expression of MMP-9 by activating NF-κB p65 in VSMCs, while Puerarin is able to inhibit these effects.
[Key words] Puerarin; Lysophosphatidylcholine; Atherosclerosis; Matrix metalloproteinase-9; Smooth muscle cells
在动脉粥样硬化(atherosclerosis,AS)的形成过程中,氧化型低密度脂蛋白(oxidized low density lipoprotein,ox-LDL)是重要的损伤因素[1],除可通过促进内皮细胞(endothelial cell,EC)凋亡和平滑肌细胞(smooth muscle cell,SMC)增殖外[2-3],还能诱导基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinase,MMPs)的产生而参与AS的发生及发展[4]。研究表明,溶血磷脂酰胆碱(lysophosphatidylcholine,LPC)是ox-LDL的主要脂质成分,能模拟ox-LDL的主要作用[5],其在AS发病中的作用也越来越受到重视。
葛根素是从中药葛根中提取的有效成分之一,具有调节血管活性物质、改善微循环、减轻钙超载等作用,已广泛应用于各型心血管疾病的治疗。研究发现,葛根素通过调节糖尿病肾病大鼠肾组织MMPs的表达而具有改善肾功能的作用[6],但是其在SMCs中的作用的研究较少。因此,本实验用LPC处理体外培养的SMCs,观察葛根素对MMP-9表达的影响,并初步探讨其机制。
1 材料与方法
1.1 主要试剂、仪器及药物
胎牛血清、DMEM培养基、胰蛋白酶、Trizol Reagent均购自Gibco公司;LPC和PDTC(NF-κB特异性阻断剂)购自Sigma公司;MMP-9 ELISA试剂盒和SYBR Green Ⅰ RT-PCR试剂盒购自深圳晶美生物工程有限公司;NF-κB p65单克隆抗体购自武汉博士德公司;葛根素注射液(东药欣舒)由山东方明药业股份有限公司生产;其余试剂均为国产分析纯。主要仪器有5% CO2恒温培养箱(SANYO,日本),细胞超净工作台(北京昌平长城空气净化工程公司),倒置显微镜(Olympus,日本),7500型实时荧光定量PCR仪及分析软件SDS(Applied Biosystems,美国)。
1.2 SMCs的原代培养
原代培养采用组织贴块法,培养液为20%胎牛血清加DMEM培养液。取大鼠胸主动脉,中间剪开,放入D-Hank液中冲洗,剥净外膜后用弯头吸管轻轻刮除内膜,撕取内2/3层中膜组织,剪成约1 mm2的小组织块接种于培养瓶内。培养瓶至于37℃、5% CO2培养箱内,待SMCs贴壁4 h后加培养液1 ml,然后置于37℃、5% CO2培养箱内培养24 h后补液至5 ml,以后每隔3~5 d换液,倒置显微镜下动态观察细胞生长情况。细胞生长融合出现“峰与谷”后,用含0.125%胰蛋白酶和0.01% EDTA的混合消化液传代培养。第三代细胞用抗α-actin肌动蛋白免疫组化进行鉴定。实验用第3~7代细胞,按5×105个/ml接种于6孔板中培养。待细胞融合后,换用无血清的DMEM培养液培养24 h,使细胞同步化,然后即可进行分组实验。
1.3 实验分组
实验共分为四组,正常对照组:SMCs中不加任何试剂;LPC处理组:不同浓度(1.0~10.0 mg/L)的LPC孵育SMCs 24 h;葛根素组:根据葛根素浓度(10-6~10-4 mol/L)的不同分为三个亚组,在每个亚组中先加入葛根素预处理4 h,然后加入5.0 mg/L的LPC孵育24 h;PDTC组:PDTC预先孵育SMCs 2 h,然后加入5.0 mg/L的LPC作用24 h。
1.4 实时荧光定量PCR检测MMP-9 mRNA的表达
细胞完成相应处理后,用Trizol提取各处理组细胞总RNA,逆转录合成cDNA第一链,取cDNA进行PCR扩增。MMP-9引物序列,上游:5’-CTT CGA GGG CCA CTC CTA CT-3’,下游:5’-CAG TGA CGT CGG CTC GAG T-3’(129 bp);GAPDH引物序列,上游:5’-CCT CAA GAT TGT CAG CAA T-3’,下游:5’-CCA TCC ACA GTC TTC TGA GT-3’(141 bp)。
1.5 Western blot 检测核提取物NF-κB p65蛋白的表达
细胞处理完毕后,用胰酶消化收集细胞,PBS冲洗、离心,将沉淀重悬于500 μl低渗液中,冰浴15 min,加入25 μl 10% NF-40溶液,振荡、离心,沉淀重悬于100 μl裂解液中,再次振荡、离心,取上清即为白,分装并保存于-70℃冰箱中备用。取核提取物与等体积的2× 电泳加样缓冲液混合后煮沸。配制10% SDS-聚丙烯酰胺凝胶,每一泳道上加40 μl进行凝胶电泳分离蛋白,然后将蛋白转移至硝酸纤维素膜上过夜。将转印蛋白质后的硝酸纤维素膜置于非特异性血清封闭液中,室温封闭1 h,继之将膜与用封闭液稀释的NF-κB p65单克隆抗体(1∶100)4℃过夜,漂洗后与1∶500稀释的辣根过氧化物酶标记的山羊抗小鼠IgG室温反应1 h。化学发光法显色,X线片曝光。将X线片用扫描仪采集图像,用Geipro软件系统分析平均灰度值,以同一标本β-actin的产物灰度值作为内参,并计算相对值。
1.6 ELISA法检测培养上清液中MMP-9的含量
操作严格按照说明书进行。
1.7 统计学分析
采用SPSS 11.0软件进行统计学处理,数据以均数±标准差(x±s)表示,多组间差异比较用方差分析,组间比较用q检验,P
2 结果
2.1 不同浓度LPC对SMCs培养上清液中MMP-9含量的影响
正常情况下,SMCs分泌的MMP-9水平极低。不同浓度(1.0~10.0 mg/L)的LPC作用24 h后,MMP-9明显升高,与正常对照组比较,差异有统计学意义(P
表1不同浓度的LPC对SMCs分泌MMP-9的影响(x±s)
与正常对照组比较,*P
2.2 葛根素对上清液中MMP-9含量、SMCs MMP-9 mRNA和NF-κB p65蛋白表达的影响
由于LPC在5.0 mg/L时对SMCs分泌MMP-9具有最强的诱导作用,因此本实验选择LPC 5.0 mg/L这一浓度来观察葛根素对LPC诱导SMCs MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白表达的影响。结果显示,正常对照组细胞MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白表达水平均较低,LPC(5.0 mg/L)作用24 h后,MMP-9含量、mRNA和NF-κB p65蛋白的表达明显升高(P
表2葛根素对上清液中MMP-9含量、SMCs MMP-9 mRNA
和NF-κB p65蛋白表达的影响(x±s)
与正常对照组比较,**P
图1 Western blot检测SMCs核提取物NF-κB p65蛋白的表达
[1:正常对照组;2:LPC组;3:葛根素(10-6 mol/L)组;4:葛根素(10-5 mol/L)组;5:葛根素(10-4 mol/L)组;6:PDTC组]
3 讨论
MMPs是一组同源的以无活性酶原形式分泌的Zn2+依赖性肽链内切酶,能分解细胞外基质(extracellular matrix,ECM),并参与胚胎正常发育及组织重塑。激活后的MMPs参与多种病理过程,如炎症反应、肿瘤转移和脑血管疾病等。另外,大量研究证实,激活后的MMPs在AS的发生和发展中起着重要的作用[7-8]。MMP-9即明胶酶B,是MMPs家族成员之一。研究证实,MMP-9可加剧炎症反应,从而促进AS的形成[9]。MMP-9的高表达可降解细胞外基质,促进血管平滑肌细胞的增殖和移行。另外,过度分泌的MMP-9也可通过降解纤维帽内的胶原,促进动脉粥样硬化斑块的破裂[10],从而增加恶性心血管病事件的危险[11]。临床研究表明,冠状动脉内径狭窄程度与MMP-9呈正相关,冠心病患者血清MMP-9水平高于正常人[12],提示MMP-9与AS的发生、发展、斑块破裂、冠状动脉血管闭塞以及急性心血管事件的发生有着密切的关系。因此,如能抑制MMP-9的过度合成,将有可能延缓AS的形成和降低急性心血管事件的发生。
葛根素是豆科属植物葛根中异黄酮的主要有效成分,其化学名为4,7-二羟基-8-β-D-葡萄糖基异黄酮。研究发现,葛根素具有抗心律失常、降血压、扩张冠状动脉、减轻缺血-再灌注损伤、影响血流动力学等作用,因而在心血管系统疾病中广泛应用。
本实验观察到,LPC能够增加SMCs MMP-9 mRNA表达和培养上清液中的MMP-9含量,而预先应用不同浓度的葛根素处理后,SMCs MMP-9 mRNA表达和上清液中的MMP-9含量均明显降低,并且随着葛根素浓度的升高,上述抑制效应也逐渐增强,即具有剂量依赖性。由于NF-κB是调节基因转录的关键因子之一,参与许多基因特别是与机体防御功能及炎症反应有关的基因的表达调控,因此推测,本实验中MMP-9表达的变化可能与NF-κB活性变化有关。笔者用Western blot检测了SMCs核提取物中NF-κB p65蛋白的表达水平,以此来反映NF-κB的活性。结果显示,LPC能明显增加NF-κB p65蛋白的表达,而预先应用不同浓度的葛根素干预后,在显著降低NF-κB活性的同时,SMCs MMP-9 mRNA表达和上清液中MMP-9含量也明显减少,这与预先应用NF-κB特异性阻断剂PDTC得到的结果一致。以上结果说明,葛根素可能通过抑制NF-κB的活性而抑制MMP-9的过度合成,进而延缓AS的形成和降低急性心血管事件的发生。
[参考文献]
[1]Tsimikas S. Oxidized low-density lipoprotein biomarkers in atherosclerosis [J]. Currrent Atherosclerosis Reports,2006,8(1):55-61.
[2]Choi JS, Chui YJ, Shin SY, et al. Dietary flavonoids differentially reduce oxidized LDL-induced apoptosis in human endothelial cells: role of MAPK- and JAK/STAT-signaling [J]. J Nutr,2008,138(6):983-990.
[3]Zhao GF, Seng JJ, Zhang H, et al. Effects of oxidized low density lipoprotein on the growth of human artery smooth muscle cells [J]. Chin Med J (Engl),2005,118(23):1973-1978.
[4]Akiba S, Kumazawa S, Yamaguchi H, et al. Acceleration of matrix metalloproteinase-1 production and activation of platelet-derived growth factor receptor beta in human coronary smooth muscle cells by oxidized LDL and 4-hydroxynonenal [J]. Biochim Biophys Acta,2006,1763(8):797-804.
[5]Matsumoto T, Kobayashi T, Kamata K. Role of lysophosphatidycholine (LPC) in atherosclerosis [J]. Curr Med Chem,2007,14(30):3209-3220.
[6]Duan HJ, Liu SX, Zhang YJ, et al. Effects of puerarin on renal function, expressions of MMP-2 and TIMP-2 in diabetic rats [J]. Yao Xue Xue Bao,2004,39(7):481-485.
[7]Liu P, Sun M, Sader S. Matrix metalloproteinases in cardiovascular disease [J]. Can J Cardiol,2006,22(Suppl B):25B-30B.
[8]Beaudeux JL, Giral P, Bruckert E, et al. Matrix metalloproteinases, inflammation and atherosclerosis: therapeutic perspectives [J]. Clin Chem Lab Med,2004,42(2):121-131.
[9]Schonbeck V, Mach F, Libby P. Generation of biologically active IL-1β by matrix metalloproteinase: a novel caspase-1-independent pathway of IL-1β processing [J]. J Immunol,1998,161(7):3340-3346.
[10]Lofus IM, Naylor AR, Goodall S, et al. Increased matrix metalloproteinase-9 activity in unstable carotid plaques. A potential role in acute plaque disruption [J]. Stroke,2000,31(1):40-47.
[11]Orbe J, Fernandez I, Rodriguez JA. Different expression of MMPs/TIMP-1 in human atherosclerotic lession. Relation to plaque features and vascular bed [J]. Atherosclerosis,2003,170(2):269-276.
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【关键词】 二烯丙基三硫化物；，血管成形术；，支架；，iNOS蛋白;，，一氧化氮
Effect of diallyl trisulfide coated stents on iNOS protein expression and NO level in canine models of coronary restenosis
【Abstract】 AIM: To investigate the effect of diallyl trisulfide coated stents on iNOS protein expression and NO level in the canine models of coronary restenosis， and to explore the mechanisms of diallyl trisulfide coated stents inhibiting neointima formation. METHODS: The diallyl trisulfide coated stent and the control stent were implanted into distal and proximal left circumflex coronary arteries of 20 dogs， respectively. They were sacrificed 1， 3， 10 and 28 d after stenting. The expression of iNOS proteins was assessed by Western blot and the NO level was measured by nitrate reductase. RESULTS: Expression of iNOS proteins was seen on day 1 following the control stent implanting， developed on day 3， peaked on day 10 and lasted till day 28. iNOS expressions at all time points in diallyl trisulfide coated stent group were higher than those in control stent group. Compared with normal blood vessel tissue， the NO production after stenting decreased on day 1， increased on day 3， maximized on day 10， went down to its prestenting level on day 28. At all time points， NO levels in allitridistented sites were higher than those in controlstented sites. CONCLUSION: Diallyl trisulfide coated stent could significantly enhance the iNOS expression and NO production， which may play an important role in inhibiting neointimal hyperplasia.
【Keywords】 diallyl trisulfide；angioplasty; stent; iNOS proteins; nitric oxide
【摘要】 目的：研究二烯丙基三硫化物涂层支架对犬冠状动脉损伤后血管壁内诱导型一氧化氮合酶（iNOS）蛋白表达及NO水平的影响. 方法：进行冠状动脉左回旋支支架置入术的犬，将二烯丙基三硫化物涂层支架和对照支架分别置入左回旋支的远端和近端. 术后1，3，10和28 d分别处死动物，蛋白质印迹杂交法测定血管壁中iNOS蛋白的表达、硝酸还原酶法检测NO水平. 结果： 对照支架组术后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白表达，3 d表达增加，10 d达高峰，28 d时仍有表达，二烯丙基三硫化物涂层支架组iNOS蛋白在各时间点的表达量均高于对照支架组；对照支架组术后1 d时NO生成量低于正常组织，3 d时NO水平升高，10 d时最高，28 d时降至基线水平，二烯丙基三硫化物涂层支架组各时间点的NO水平明显高于对照支架组. 结论：二烯丙基三硫化物涂层支架可显著增加iNOS表达，并提升NO产量，提示二烯丙基三硫化物涂层支架可能是抑制内膜增生的一个重要机制.
【关键词】 二烯丙基三硫化物； 血管成形术； 支架； iNOS蛋白; 一氧化氮
【中图号】 R541.405
0引言
研究已证实血管损伤后诱导型一氧化氮合酶（iNOS）在血管平滑肌细胞（VSMC）中大量表达［1-4］，但这种高表达对内膜增殖的意义尚处在争议之中. 先前的实验结果表明二烯丙基三硫化物涂层支架可显著抑制犬冠状动脉损伤后内膜增生［5］. 我们通过观察二烯丙基三硫化物涂层支架对犬冠状动脉损伤后血管壁内iNOS蛋白表达及NO水平的影响，来探讨iNOS在内膜增生中的作用，并进一步阐明二烯丙基三硫化物涂层支架的作用机制.
1材料和方法
1.1材料苯甲基磺酰氟（PMSF）、十二烷基硫酸钠（SDS），Tris，NP10，Leupeptin和蛋白标准品均为Sigma公司产品；Lumiol发光底物和iNOS多克隆抗体为Santa Cruz产品；HRP耦联山羊抗兔IgG购自北京中山公司；NO试剂盒，南京聚力生物医学工程研究所；密度扫描仪，美国BioRad，Model GS700；显微镜微机彩色图像处理系统，BHEC型，北京惠中公司.
1.2方法
1.2.1模型的建立杂种犬，体质量25~30 kg，呈仰卧位缚于导管床，建立静脉通道并予以心电监护. 戊巴比妥钠麻醉后右股动脉穿刺，插入自行塑型的7F冠状动脉导引管进行冠状动脉造影，将支架用生理盐水湿润后固定在PTCA球囊上（球囊/动脉直径之比为1.3∶1），将二烯丙基三硫化物涂层支架和对照支架（制作方法同二烯丙基三硫化物涂层支架，只是不浸泡二烯丙基三硫化物液）分别植入左回旋支的远端和近端. 术后口饲阿斯匹林250 mg/d至处死.
1.2.2病理学检查术后28 d，取出支架置入处冠状动脉血管于40 g/L甲醛中固定，带支架的血管用塑料包埋，碳化钨钢刀切片，HE染色，光镜下观察. 计算机图像分析系统测量内膜面积平均的内膜（每个支架丝至管腔的距离）和中膜厚度（相邻两个支架丝之间的中膜的厚度）.
1.2.3蛋白质Western blot支架置入术后1，3，10和28 d（n=8）分别处死动物，取出支架置入处冠状动脉血管. 剥离血管外附着的结缔组织，剪碎，加入1 mL裂解液（10 mmol/L Tris和10 g/L SDS），冰浴条件下进行组织匀浆. 用考马斯亮蓝方法测蛋白质的浓度. 根据标准曲线计算样本蛋白浓度. 取15 μg蛋白，加入上样缓冲液，煮沸5 min后进行120 g/L SDSPAGE电转膜，用1∶1000的抗iNOS多克隆抗体进行杂交，采用1∶5000稀释的辣根过氧化物酶标记的二抗，利用化学发光法进行显色反应，用图像分析系统对所得区带积分光密度进行扫描.
1.2.4一氧化氮（NO）水平测定标本处理、储存和组织匀浆液提取同Western blot，-80℃保存. 按照试剂盒说明测定NO水平.
统计学处理: 数据用x±s表示，SPSS统计软件处理，两组数据间比较采用t检验，多组比较采用多个样本均数比较的ANOVA方差分析，两两比较采用NewmanKeuls法q检验. P
2结果
2.1病理学术后28 d，对照支架组血管内膜明显增生，支架丝处中膜受压，轻度萎缩；二烯丙基三硫化物支架组血管内膜增生较对照组显著减轻（图1），计算机图像分析结果有差异（表1）.
2.2支架置入术后iNOS蛋白表达Western blot及其积分光密度分析结果显示，正常动脉的iNOS蛋白表达量为0.80±0.12，对照支架置入术后1 d血管壁中有少量iNOS蛋白（4.3±0.6）表达，术后3 d（14.1±2.7）表达增加，术后10 d（37.3±2.5）达高峰，28 d（11.5±1.3）时仍可检测到iNOS蛋白表达（图2）. 二烯丙基三硫化物涂层支架组iNOS蛋白表达的动态变化规律同对照支架组，但在各时间点的表达量（1 d：29±4；3 d：49.9±3.0；10 d：101±12；28 d：38±3，P均＜0.01）均高于对照支架组.
图1病理学观察支架置入28 d后内膜增生情况HE ×200（略）
表1术后28 d， 二烯丙基三硫化物涂层支架组和对照支架组结果比较（略）
图2对照支架和二烯丙基三硫化物涂层支架置入犬冠状动脉后iNOS蛋白表达（略）
2.3支架置入术后一氧化氮水平支架置入后血管组织中一氧化氮水平变化与iNOS蛋白变化基本一致，术后1 d时一氧化氮生成量［(42±7) μmol/L］低于正常组织［(110±12) μmol/L］，3 d时一氧化氮水平［(126±17) μmol/L］升高，10 d时［(396±39) μmol/L］最高，28 d时为［(195±41) μmol/L］降至基线水平. 二烯丙基三硫化物涂层支架组术后1， 3和10 d时一氧化氮水平［(170±29) μmol/L，P＜0.05；(393±58) μmol/L，P＜0.05；(780±115) μmol/L，P＜0.01］明显高于对照支架组，28 d时一氧化氮水平［(278±37) μmol/L］与对照支架组无明显差异(P>0.05).
3讨论
血管损伤后iNOS高表达已成共识. 血管损伤后iNOS高表达、NO大量产生，因NO具有舒张血管，抑制血小板粘附、血栓形成，抑制VSMC增殖和细胞外基质合成以及促进VSMC凋亡等作用，故有利于防止损伤后血管收缩和血栓形成［1-4］；但也有研究者发现去除iNOS基因的小鼠在血管损伤后内膜增生程度反而比正常小鼠减轻［6］，从而认为iNOS基因的高表达可能促进了内膜增生. 本研究结果首先证实了支架置入后iNOS大量表达这一观点，还发现二烯丙基三硫化物涂层支架可使损伤局部iNOS蛋白表达进一步增加的同时抑制了内膜增生，表明iNOS的高表达可减轻血管损伤后内膜增生.
那么为何血管损伤后iNOS高表达，NO大量生成，VSMC增殖仍然旺盛呢？Yan等［1］解释了这一看似矛盾的现象，他们发现血管内膜和中膜SMC在受到诱导后均可表达iNOS，并产生NO，但相同浓度细胞因子刺激下，内膜SMC表达iNOS和产生NO量远高于中膜（8~10倍），然而内膜SMC增殖被抑制程度却远低于中膜，这表明内膜SMC不仅具有在受刺激后表达更多iNOS的能力，而且对iNOS的产物―NO的抗增殖作用具有抗性. 这就解释了为什么内膜SMC可以在高浓度NO环境下仍然存活并具有较高的增殖特性. 也就是说，虽然血管损伤后iNOS大量表达可产生高水平NO，但对于“迟钝”的内膜SMC来说依然是不够的. 我们观察到支架置入损伤血管后虽然iNOS高表达，NO水平上升，但内膜增生非常显著，二烯丙基三硫化物涂层支架进一步增加损伤局部iNOS蛋白表达量，提高NO水平后，内膜增生受到抑制也证实了这一发现.
二烯丙基三硫化物具有抗血栓、扩血管以及抑制VSMC增殖等多种生物学作用，而这些生物学效应也被NO所具有的，提示二烯丙基三硫化物可能通过NO途径发挥作用. 为此，研究者分别从体外、体内和临床观察等不同角度研究了二烯丙基三硫化物与NO，iNOS的关系［7-12］，发现二烯丙基三硫化物在体外可通过NO产生舒血管作用、提高血小板内和胎盘绒毛膜组织和绒毛膜癌组织中iNOS和NO水平，进一步体内研究表明二烯丙基三硫化物的舒血管作用与增加NO产量有关，临床试验也发现，二烯丙基三硫化物治疗冠心病心绞痛的作用与升高患者血浆中NO水平有关. 以上资料显示了二烯丙基三硫化物的治疗效应与iNOS和NO密切相关. 我们首次观察了二烯丙基三硫化物在体内抑制血管损伤后内膜增生的作用与iNOS和NO的关系，结果显示二烯丙基三硫化物涂层支架植入血管后iNOS蛋白的表达明显增加，NO水平显著升高，提示这可能是二烯丙基三硫化物涂层支架抑制内膜增生的一个重要机制.
支架置入术后血管壁iNOS动态高表达和NO水平的变化，是机体的一种保护性代偿反应；二烯丙基三硫化物涂层支架可显著增加iNOS表达，提升NO产量，这可能是大蒜素涂层支架抑制内膜增生的一个重要途径，表明血管损伤后提高局部NO浓度可减轻再狭窄，这为将来开发新的支架提供了思路.
参考文献
［1］ Yan ZQ， Hansson GK. Overexpression of inducible nitric oxide synthase by neointimal smooth muscle cells ［J］. Circ Res， 1998， 82(12): 21-29.
［2］ Fernando GF， Antonio LF， Juan RF， et al. Expression of inducible nitric oxide synthase after endothelial denudation of the rat carotid artery ［J］. Circ Res， 1998，83:1080-1087.
［3］ Hansson GK， Geng YJ， Holm J， et al. Arterial smooth muscle cells express nitric oxide synthase in response to endothelial injury ［J］. J Exp Med， 1994，180: 733-738.
［4］ Banning AP， Groves PH， Buttery L， et al. Reciprocal changes in endothelial and inducible nitric oxide synthase expression following carotid angioplasty in the pig ［J］. Atherosclerosis， 1999，145:17-32.
［5］ Nie XM， Jiang H， Li GS， et al. The effect of diallyl trisulfide coating stents on restenosis in canines［J］. Chin Circ J， 2002， 17(2): 229-231.
［6］ Chyu KY， Dimayuga P， Zhu J， et al. Decreased neointimal thickening after arterial wall injury in inducible nitric oxide synthase knockout mice［J］. Circ Res， 1999，85(9): 1192-1198.
［7］ Ozturk Y， Aydin S， Kosar M， Endotheliumdependent and independent effects of garlic on rat aorta［J］. J Ethnopharmacol， 1994， 44(10): 109-116.
［8］ Morihara N， Sumioka I， Moriguchi T， et al. Aged garlic extract enhances production of nitric oxide［J］. Life Sci， 2002， 71(5): 509-517.
［9］ Das I， Khan NS， Sooranna SR， et al. Potent activation of nitric oxide synthase by garlic: a basis for its therapy application［J］. Curr Med Res Opin， 1995，13(8): 257-263.
［10］ Maslin DJ， Brown CA， Das I， et al. Nitric oxide-a mediator of the effects of garlic?［J］. Biochem Soc Trans， 1997，25(9): 408S.
