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(一)基本假设
意象对话技术的基本假设是意象具有象征性,人的心理状况是可以通过人的意象反映,而改变意象可以改变人的心理状况;沟通的两者通过使用意象,通过意象的象征意义进行交流。心理咨询师可以通过意向对话技术进入来访者的潜意识区域或者心理的深层,在使用意象交流的过程中,改变来访者的心理意象,从而达到改变来访者心理状况的过程。
(二)意象与象征性
意象(imagery)是脑对不在眼前的事物的形象的反映,可以分为两种[1]:一种是客观世界在头脑中的图象表征,也就是类似于“表象”,例如,说到蛇的时候,在头脑中出现的蛇的形象;第二种,意象代表一种象征意义。例如,在梦里见到一条蛇,也许它代表的是人生活中的一个阴险小人;也许它代表的是一个男人的欲望等。在意象对话技术中,意象的第二种意义更为重要。意象对话技术中提出元意象的概念。元意象是当一类事物被综合了它的特点后,找到了一个有代表性的形象,也就是一个概括的意象。
(三)心理能量学
意象对话技术中,认为人的心理能量是里比多,但是里比多是人的生命力,而不是性能量。心理能量的产生有两种形式[1]:一是自发产生,在适当的心理状态下,心理能量自发产生;二是被激发产生,是本能的力量被激发而产生。人从本能中获得自发心理能量,通过激发后,可以产生多种形式的激发能量。心理能量在一定的情况下能够相互转化,并遵循能量守恒原则。被激发的能量在一定的时候会释放。释放有正常的释放与不正常的释放两大形式。正常的释放形式是自然地释放,例如当人觉得很悲伤,大哭一场是自然的、正常的释放。当人的心理能量得到正常的释放时,人会保持一个健康的心理状态水平。心理能量的不正常释放具有两种形式———压抑与沉溺。压抑引发的冲突及沉溺引发的情绪都可以转换为各种各样的意象。意象对话技术,使人在醒着的时候,人仍可以看到各种化身为意象的心理冲突。
(四)心理障碍
心理障碍是人情绪和心理能量的郁结。过去的经历让人压抑和沉溺,而压抑和沉溺是人心理的情结。内容相似的情结会相互结合,形成更大的情结,是心理能量的郁结。情结具有强大的心理能量。如果人不设法调走情结的能量,那么它会永远留在人的心灵深处,久而久之,便产生了心理障碍。
二、意象对话技术的应用
意象技术是咨询者与来访者用象征性语言在交流,是心和心的交流,意象技术的基本程序如下:
(一)引入过程
意象对话技术中,咨询者是处于一个引导的角色,引导来访者进行想象。在引导的过程中,咨询师可以对成年人解释一下意象对话技术;对有心理问题的来访者,可以告知本方法对治疗这种心理问题是有效的。
(二)想象过程
心理咨询者和治疗者可以先设定一个内容,让来访者想象。要求来访者针对某些特殊问题进行想象,相当于投射性的测验。咨询者可以给来访者设定起始意象。设定的起始意象可以有很多,例如,可以是房子、花、蛇、坑等,也可以是来访者的梦。
(三)咨询者分析意象
来访者想象的意象都有象征意义,心理咨询者和治疗者可以分析其象征意义。分析来访者的意象时,可采用分析原始意象的方式进行,并分辨出来访者意象的变种。
(四)心理咨询师作诱导
心理咨询师用象征性意象诱导来访者改变。心理咨询师或者引导者有两种基本方法,一种主要是让来访者想象,心理咨询师只是听他的想象,并用语言诱导;另一种是心理咨询师介入,心理咨询师让来访者想象的时候,把咨询师也作为想象的一个对象。
(五)反复想象和强化
利用反复的想象和强化,让一个新的意象替代旧的意象。咨询者可以通过布置意象作业,让来访者练习,以巩固来访者心中的意象。这是对意象的反复想象和强化。
(六)学会区分想象和现实
意象对话可以把消极的意象原型转化为积极的,但是,来访者本身的想象与现实的区分能力可能会比较的弱,如果仅仅是停留在意象中,可能会造成来访者在想象中可以调节出很好的心理状态,但是不能在现实生活中调节自己的心态,于是让来访者在意象对话的过程中区分想象与现实是很必要的。心理咨询与治疗师可以用两种方法使来访者辨别想象和现实:一种是忽然唤醒法,也就是在来访者做意象的时候,忽然让来访者睁开眼睛,并说出现在看到的是什么。第二种是借鉴格式塔疗法中的一个小技术,就是用8分钟的时间让来访者不停地说“我现在……”。
三、大学生是意象对话的适合人群
(一)意象对话技术有利于大学生探索自我。大学生处于心理意识加速发展的时期,在这一阶段,生活环境的改变,生理的发展,生活经验的增加等给大学生带来极大的冲击,也促进大学生从生理自我、社会自我、心理自我等方面全面地重新认识自我。然而,在认识自我的过程中,“我是谁”这个问题大大地困扰着大学生。意象对话技术可以让大学生在无意识中理顺自己对自己、人生、对世界的认识,形成良好的自我观、人生观和价值观。
(二)大学生的思维、领悟力的发展,能更好发挥意象对话技术的效果。随着大学生的思维能力的发展,抽象思维的发展、思维的灵活性、创造性、领悟力处于发展的高峰期,让意象对话技术中的意象想象中较容易呈现出需要的意象。思维的发展加上大学生自我探索的迫切需要,让大学生在进行意象诱导环节时,更容易领悟及进行自我探索,使意象对话技术产生较大的效果。
(三)大学生区分现实与想象的能力增强,更能避免意象对话的消极效应。意象对话的一个较大的弱点是担心来访者沉溺于想象中,也无法区分现实与想象。皮亚杰认为现实监控能力是在12岁左右发展成熟,大学生处在18-25岁之间,具有较强的现实区分能力,更容易从想象意象中抽离。
四、意象对话技术在大学生心理教育中的应用
(一)利用房子意象对大学生进行心理测试。根据意向对话技术的原理,教育者可以利用意象对话技术中的意象了解大学生的真实心理状态,尤其是其中的房子意象。当大学生坦诚地回答纸笔测试中的问题时,测试能够较好地反映他们的心理状况,然而大学生具有一定的封闭性心理,有时自己的心理状态不愿意真实地呈露,容易在一般的心理测试中进行虚假回答,掩饰自己的真实心理状况;意象是利用人的无意识心理呈现,减少测试者的掩饰性,能够更好地反映大学生的真实心理状态。研究者也发现,房子意象与艾森克人格问卷、症状自评量表等不同维度有显着性相关。因此教育者可以利用意象对话技术中的意象作为心理测试的补充,了解学生的真实心理,更有针对性地开展工作。
(二)利用意象对话技术开展团体训练。研究者利用意象对话技术进行团体训练,发现参与人员的强迫症状、人际关系敏感、抑郁、精神病性等因子分显着下降,认为意象对话技术对改善心理健康有着积极的影响。在大学生的心理调整过程中,针对大学生的情绪调整、人际关系等尝试使用意象对话技术开展团体训练,会对大学生的心理调整产生意象不到的效果。
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【关键词】大学艺术设计教育；数字化技术；应用
计算机的普及以及互联网的推广，使人类进入了信息化的时代，由于互联网具有开放性、全球化等特点，数字化技术对艺术设计领域造成了很大的冲击。计算机技术、网络技术等数字化技术逐渐的应用与高校艺术设计教育中。通过我国教学改革的进行，许多的教学方式得到了大力的推广和应用，实践证明，这些新教学方法的应用，在教学过程中发挥着不同程度的作用。数字化技术教学是这些新教学方法中的一种，其在高校艺术设计教学中可以发挥更大的优势，对提高艺术设计水平有重大的意义。
一、数字化技术教学概述
随着信息时代的到来，信息产业得到了长足的发展，越来越多的数字化设备应用到人们的生活与工作当中，人们正式的进入数字化时代。教育行业在数字化环境下也得到了很大的冲击与发展，高校的硬件、软件设施都以具有一定的规模。随着社会对人才需求量的增多，对高校教育水平也提出了更高的要求，要求大学生不仅能够学好专业知识，还应该德智体美全面发展。在大学艺术设计教学中，利用数字化技术，将传统的艺术设计与丰富的数字化有机的结合起来，能够使学生更加的直观的感受到艺术设计的本质，并促使学生积极主动的参与到教学活动中，帮助学生整合相关的知识点，设计出更多更富有艺术的作品。这样能够提升大学生的艺术创造力，充分的发挥出大学生自身的潜力。
在艺术设计领域，随着信息数字化技术的快速发展，艺术设计教育应该面向媒体，逐渐的培养学生的认知能力，促使学生在设计理念、艺术审美等各个方面得到全面的提升。在艺术设计过程中，越来越多的软件被应用，虽然其能够达到手工无法达到的效果，但在时间、工作量等方面有一定的局限性，所以在实际的创作过程中，需要根据实际的情况进行选择，手工与先进技术的有效结合，才是艺术设计的方向。
二、数字化技术教学在大学艺术设计教育中的有效应用
（一）在大学艺术设计教学中加快软件的融入
随着科技的发展，越来越多的数字化设备与软件应用到大学艺术设计教学过程中，但由于大学艺术设计的特殊性，需要表现不同的艺术形式与空间，这就要求教学使用的软件能具备多样性。在高校艺术设计教学中，教师应该将这些软件功能以及使用方式交给学生，使学生能够有效的掌握并熟练的应用。目前艺术设计专业的课程中，有一种或几种艺术设计软件，不能满足艺术设计的各项要求，缺乏多样性，这就需要大学艺术教学不能将重点放于一款软件上，要根据专业的具体安排，多层系、多角度的引入各类应用软件，加强对大学生的教育，充分调动学生学习的积极性，提高学生掌握并应用先关软件的能力。
（二）采用启发式教学模式，增强学生的应用能力
利用数字化技术进行艺术设计，计算机效果图是艺术设计中具有较强应用性的课程，效果图的每一个参数以及命令都是效果图的集中表现，衡量效果图制图者的水平，一般以参数的搭配以及调整参数的灵活性作为标准。这就需要的大学艺术设计教学中，根据教学的实际情况与内容，加强对学生自主操作能力的培养，使其能够有效的运用数字化技术，提高学生解决实际问题的能力。我国大学艺术设计教育教学过程中，往往是教师对软件的操作进行逐一讲解，学生根据老师的步骤完成相关的操作，缺乏自主操作。在这种教学模式下，学生没有主动学习的意识，进行艺术设计也受到老师思想的束缚，只是不断的模仿。所以必须利用启发式教学模式，让学生参与到实际的艺术设计项目中，提倡学生独立完成设计工作。
（三）在数字化技术的基础上，加大艺术设计创新教育
在数字化技术的大环境下，传统的艺术设计教育受到了很大的冲击，这就需要转变传统的教育理念，开拓创新。首先要从大学艺术设计课堂做起，坚持学生为课堂主体的中心思想，教师复杂指导与引导，注重教学内容、方式上的变化，积极开展课堂讨论、辩论，培养学生自主思考的能力；其次需要从校园文化做起，积极的开展校园文艺表演、美术展览、学术讲座等活动，为学生艺术创造营造良好的校园环境；最后，鼓励学生积极开展各项社会调查活动，鼓励学生参加各项社会实践活动，使其充分的认识社会，丰富自身的艺术才干，避免艺术设计推理了实际，产生违和感。
三、总结
数字化时代的到来，是我们的文化形象得到了改变，艺术设计教育也发生了巨大的变化。数字化设备为艺术设计提供了技术工具，并且计算机技术、网络技术等创造了新的艺术表达方式，实现了艺术信息的交流及共享。在数字化时代，艺术教育只有加强创新，才能适应时代的发展，使艺术设计作品更加贴近生活，使学生充分的掌握现代艺术的潮流，为社会培养更多更优秀的艺术设计人才。
参考文献：
[1]关洁.数字化：艺术教育创新的助推器[J].河南社会科学.2010，15（5）：256-257
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[关键词]MMP_2；MMP_9；TIMP_1；血管平滑肌细胞；增殖；迁移；阿齐沙坦
中图分类号：R544.1文献标识码：A文章编号：1009_816X（2014）04_0274_04
[Abstract] Objective To investigate the effects of azilsartan on TGF_β_induced spontaneously hypertensive vascular smooth muscle cells （VSMCs） proliferation and migration. Methods Rat VSMCs were cultivated by the method of tissue explants adherence. Cells of generation 3 to 5 were used as the experimental system. The MTT test was used to measure cell proliferation and Boyden chamber assay was used to measure cell migration. Primary cultured VSMCs were treated by 10 ng/ml TGF_β and azilsartan for 24 hours. The expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1 were measured by Western blot and RT_PCR. Results The expression of MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 in rat VSMCs stimulated by TGF_β increased significantly. VSMCs migration and proliferation also increased significantly. Azilsartan significantly inhibited TGF_β induced MMP_2， MMP_9 and TIMP_1 production in rat VSMCs， as well as VSMCs proliferation and migration. Conclusions Azilsartan inhibited TGF_β_induced VSMCs proliferation and migration by down_regulation the expression of MMP_2， MMP_9， TIMP_1.
[Key words] MMP_2； MMP_9； TIMP_1； Vascular smooth muscle cells ；Proliferation； Migration； Azilsartan
自发性高血压是最常见的心血管疾病，以体循环动脉压升高为主要特点。高血压伴发的血管重构包括血管壁腔比增加、小动脉稀少及血管功能异常。基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMPs）是参与降解全身各种组织细胞外基质（extracellular matrix，ECM）的蛋白酶家族，参与正常和病理条件下的组织重构，金属蛋白酶组织抑制物（TIMP）是MMPs的特异性抑制物[1]。MMPs/TIMP的动态改变，造成选择性的降解ECM，从而调整血管内皮细胞形态、生长和成活[2]。血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂可能是通过抑制局部肾素血管紧张素醛固酮系统（RAS）活性和缓激肽的降解来抑制或逆转血管重构[3]。阿齐沙坦是一种血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂，多用于治疗高血压病[4]。但沙坦类药物是否可抑制血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMCs）中MMPs/TIMP的表达则鲜有报道。通过药物抑制MMPs/TIMP活性，减少细胞外基质的降解，阻止血管平滑肌细胞的增殖和迁移是防治高血压发生、发展的一个可能的切入点。本研究观察血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂阿齐沙坦对血管平滑肌细胞中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达的影响，探讨转化生长因子_β（TGF_β）在自发性高血压大鼠发生、发展进程中诱导细胞外MMPs/TIMP分泌及促平滑肌细胞迁移、增殖能力，为临床应用阿齐沙坦治疗高血压提供指导信息。
1资料和方法
1.1材料：自发性高血压大鼠（SHR）和同一株系的正常血压大鼠（WKY）大鼠（购自上海第二医科大学附属瑞金医院高血压研究所），雄性，7～10周龄。血压：SHR>170mmHg（1mmHg=0.113kPa），WKY
1.2实验分组：将大鼠断头处死，无菌情况下分离胸主动脉，剪碎后加入含有20%胎牛血清的DMEM培养液，用贴壁细胞培养法行原代细胞培养至细胞长成致密单层后传代，取3～5代细胞用于实验。在传代过程中，细胞以5×105个/ml接种于6孔板培养板上。实验前48h换成不含血清的DMEM，使细胞处于静止状态。将培养的VSMC分成6组：WKY组、SHR组；TGF_β刺激WKY组、TGF_β刺激SHR组：10ng/ml TGF_β诱导增殖；TGF_β刺激WKY组阿齐沙坦给药组、TGF_β刺激SHR组阿齐沙坦给药组：50μmol/ml阿齐沙坦预处理30min后，用10ng/ml TGF_β诱导增殖。各组均应用0.2%胎血清培养液培养，培养24h后收集细胞。
1.3MTT法检测阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞增殖的作用：取对数生长期细胞，以每孔3×104/孔均匀接种于96孔培养板内，按照上述分组方法将各组细胞悬液接种于96孔板上，培养24h后，结束实验，将每孔的培养液吸出，重新加入180μl培养液，然后每孔加入浓度为5mg/ml的MTT液20μl。在37℃培养箱内继续培养4h后，吸取培养液，每孔加入DMSO 200μl振荡10min，用酶联免疫检测仪在490nm波长测定各孔A值，取每组3孔的均值。
1.4Boyden趋化小室检测阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响：取对数生长期的VSMCs，将培养的VSMCs分成6组观察VSMCs迁移：WKY组、SHR组：上室中加入未经处理的VSMCs悬液，下室中加人DMEM；TGF_β刺激WKY组、TGF_β刺激SHR组：上室中加入未经处理的VSMCs悬液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml；TGF_β刺激WKY组阿齐沙坦给药组、TGF_β刺激SHR组阿齐沙坦给药组：上室中加入50μmol/ml阿齐沙坦孵育2h的VSMCs悬液，下室中加入10ng/ml TGF_β 0.5ml。上、下室之间隔以8μm孔径聚碳酸酯滤膜。将建立好的Boyden小室放入一容器培养24h后取出滤膜，固定、染色，在高倍镜下（×400）随机观察6个视野，计数移行细胞数，取平均值。
1.5Western blot检测蛋白表达：取对数生长期细胞，0.05%胰蛋白酶消化，PBS洗涤两次后离心弃上清，加入含全酶抑制剂和PMSF的RIPA裂解液冰浴裂解提取总蛋白。BCA法测定样品蛋白浓度，完成十二磺基硫酸钠/聚丙烯酸胺凝胶电泳和蛋白转膜操作，膜片分别与一抗（抗MMP_2多克隆抗体、抗MMP_9多克隆抗体、抗TIMP_1多克隆抗体）进行抗原抗体结合反应，再与辣根酶标记二抗反应，经适当洗涤，膜片与ECL温浴1min，保鲜膜包裹后，经X光片曝光，显影和定影，最后对结果进行光密度扫描分析。
1.6RNA的提取及RT_PCR检测m_RNA表达：以Trizol提取细胞总RNA，按照试剂盒要求操作。MMP_2上游引物序列：5’_GCGACAAGAAGTATGGCTTC_3’，下游引物序列：5’_TGCCAAGGTCAATGTCAGGA_3’；MMP_9上游引物序列：5’_CGCAGACATCGTCATCCAGT_3’，下游引物序列：5’_GGATTGGCCTTGGAAGATGA_3’；TIMP_1上游引物序列：5’_CAATTCCGACCTCGTCATCA_3’，下游引物序列：5’_TCAGAGCCTTGGAGGAGCT_3’，按实验室常规方法进行PCR扩增。用反转录反应液2μl作为模板，加入2μl上游及下游引物和2μl Taq酶后用PCR仪扩增。循环步骤如下：变性94℃ 1min，58℃ 1min和72℃ 1min共35个循环；末次长7min，终止反应。以β_actin为内参，依据2_ΔΔCT法计算各组细胞mRNA的相对表达量。
1.7统计学处理：以SPSS16.0统计分析软件进行统计，计量资料用（x-±s）表达，组间比较采用t检验分析，P
2结果
2.1MTT法检测TGF_β对VSMCs细胞的增殖作用：见图1。MTT法检测结果如图所示：SHR和WKY组VSMCs，TGF_β刺激组细胞增殖水平均显著高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组（P0.05）。另外，SHR组VSMCs细胞增殖水平均显著高于相同干预的WKY（#P
图1各组大鼠VSMCs细胞增殖水平的比较
2.2阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响：见图2。与WKY组相比，SHR组细胞迁移数目明显增多（#P
图2阿齐沙坦对TGF_β诱导的VSMCs细胞迁移的影响2.3各组VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1蛋白水平比较：Western blot检测结果如图3所示：SHR和WKY组VSMCs，TGF_β刺激组MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均高于对照组和TGF_β+阿齐沙坦给药组（P0.05）。各组SHR大鼠VSMCs中MMP_2、MMP_9和TIMP_1蛋白表达水平均显著高于相同干预的WKY大鼠（P
图3MMP_2、MMP_9和TIMP_1在各组细胞中的蛋白的表达
2.4各组VSMCs中MMP_2、MMP_9、TIMP_1 mRNA水平比较：RT_PCR检测结果见图4。SHR和WKY组VSMCs，TGF_β刺激组MMP_2、MMP_9和TIMP_1 mRNA表达水平均高于TGF_β+阿齐沙坦给药组（*P
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【摘要】 ［目的］探讨怀牛膝总皂苷（ABS）大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响，阐明其抗动脉粥样硬化的机制。［方法］采用oxLDL诱导大鼠主动脉平滑肌细胞增殖的方法，采用MTT法测定VSMC增殖，采用伤口愈合法测定VSMC迁移能力，观察ABS对oxLDL诱导的大鼠血管平滑肌细胞增殖、迁移的影响。［结果］oxLDL浓度为30mg/L促进VSMC增殖最强；ABS（50、100、150mg/L）显著抑制oxLDL诱导的VSMC增殖，作用呈浓度依赖性；ABS（20mg/L）显著抑制oxLDL诱导的VSMC迁移。［结论］ABS能抑制oxLDL诱导的VSMC增殖与迁移，说明其具有抑制血管内膜增厚和斑块形成的作用。
【关键词】 怀牛膝总皂苷；oxLDL；血管平滑肌细胞；增殖；迁移
Abstract：［Objective］To investigate the influence of Achyranthes bidentata saponins（ABS）on the proliferation and migration of rats aorta vascular smooth muscle cells，and to elucidate its mechanism of antiatherosclerosis.［Methods］The oxidized low density lipoprotein （oxLDL） was used to induce the proliferation of rats aorta vascular smooth muscle cells（VSMC） and Methyl thiazolyl tetrazolium（MTT） assay was used to determine the growth of them，wound healing assay was used to determine the influence of ABS on the ability to migrate of VSMC.All methods were used to observe the effect of ABS on the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.［Result］The proliferation of VSMC was at the highest level when the concentration of oxLDL was 30mg/L，and this effect of oxLDL could be significantly inhibited by ABS（50，100，150mg/L） in a concentrationdependent manner;ABS could also inhibit the migration of VSMC induced by oxLDL at 30mg/L.［Conclusion］ABS could inhibit the proliferation and migration of VSMC induced by oxLDL.From these results，it appears that ABS can reduce the thickness of vascular intima and inhibit the development of vascular plaque.
Key words：Achyranthes bidentata saponins; oxLDL;vascular smooth muscle cells; proliferation; migration
动脉粥样硬化（atherosclerosis，AS）的发病机理有许多学说，但以氧化损伤学说研究最多［1］。氧化修饰LDL（oxLDL）能促进泡沫细胞形成及血管平滑肌细胞增殖和迁移，导致动脉粥样硬化［2］。本研究采用中医临床治疗心血管疾病的常用药物怀牛膝，观察其对oxLDL诱导的VSMC增殖和迁移的影响，报道如下。
1 材料和方法
1.1 材料
怀牛膝总皂苷（浙江中医药大学化学教研室提供），SD大鼠（浙江中医药大学动物实验中心提供），人血浆（购自浙江省血液中心），胎牛血清（杭州四季青生物工程材料研究所），DMEM（美国GIBCOBRL公司），胰蛋白酶（杭州宏博生物工程有限公司Amresco分装），MTT（华美生物工程公司），二甲基亚砜（浙江杭州双林化工试剂厂），其余试剂为国产分析纯试剂，超速离心机（日本Hitachi公司），荧光倒置显微镜（日本OLYMPUS公司），UV754紫外分光光度仪（上海分析仪器总厂），HEPA CLASS 100型细胞CO2培养箱（美国THERMO公司），SWCJ1F超净工作台（苏州安泰空气技术有限公司），UR4100型酶标仪（美国Dynatech公司）。
1.2 方法
1.2.1 低密度脂蛋白制备、氧化与鉴定
参考郭刚等方法［3］，取人血浆，用序列超速离心法，获得LDL区带（密度范围为1.019～1.063）。取LDL于试管中加入CuSO4溶液氧化，使Cu2+终浓度为10μmo1/L，37℃分别孵育20h。氧化后的LDL加入终浓度为20μmol/L EDTA，4℃放置2h终止氧化，再以pH 7.4 PBS缓冲液透析24h除去EDTA，PEG 2，0000浓缩到一定体积。通过Lowery法检测蛋白含量为4.8g/L。制备的oxLDL尽快0.22μm过滤除菌，保存4℃备用，两周内用完。对氧化后的LDL苏丹黑预染，通过琼脂糖凝胶电泳检测oxLDL比LDL迁移速度大。
1.2.2 大鼠胸主动脉平滑肌细胞的培养
参考任立群等方法［4］，雄性SD大鼠处死后，无菌条件下取胸主动脉，去除血管内膜和外膜，将中膜以组织块法培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中，置于37℃、5%CO2孵箱中静置培养。待细胞铺满培养瓶底达80%时，用0.15%胰酶和0.02%EDTA消化，进行传代培养，传代比例为1∶2，传代周期为4～5d。选生长良好的第5～10代传代细胞用于以下实验。
1.2.3 确定oxLDL诱导的VSMC生长的最佳浓度
取对数生长期的细胞以每孔6000个细胞接种于96孔板中，每孔200μl，分7组，每组6个孔。用含10%FBS的DMEM培养一天后，换用无血清DMFM培养，次日各组换用含5%FBS的DMEM并分别处理如下：第1组不加oxLDL；其余各组加oxLDL，终浓度分别为10，20，30，40，50，60 mg/L，24h后加入5mg/ml MTT，每孔20μL，置37℃，5%CO2培养箱中培养4h后取出，加入二甲基亚砜，每孔150μL，振荡充分溶解结晶。用酶联免疫仪检测在570nm的吸光度值（OD）值（OD值与细胞数正相关），实验重复3次，以每组各孔平均OD值绘制增殖曲线，确定以oxLDL的浓度为30mg/mL促细胞增殖最佳浓度。
1.2.4 MTT法测定VSMC增殖的反应
取对数生长期的细胞以每孔6000个细胞接种于96孔板中，分5组，每组六个孔。用含10%FBS的DMEM培养一天后换用含5%FBS的DMEM并分别处理如下： 1、空白组；2、oxLDL组：30mg/L oxLDL；3、低剂量组：30mg/L oxLDL+50mg/L ABS；4、中剂量组：30mg/L oxLDL+100mg/L ABS；5、高剂量组：30mg/L oxLDL+150mg/L ABS。24小时后通过MTT法（同上）检测细胞增殖情况。测各孔OD值，实验重复三次，比较每组平均OD值大小差异。
1.2.5 伤口愈合法测定VSMC迁移能力
参考相关文献方法［5］，取对数生长期的细胞，以每孔5×104个细胞接种于24孔板中，每孔1ml，分3组。用含10%FBS的DMEM培养，待细胞长满瓶底80%左右，用200μl枪头在每个孔中划出基本相同的宽度，5%DMEM培养并分别如下分组：1、空白组；2、oxLDL组：30mg/L oxLDL；3、给药组：30mg/L oxLDL+ 20mg/L ABS，拍照记录，设为0点，用ipp6.0图像处理软件测定划带宽度W0，在显微镜下分别记录并测定24h划带的宽度，每孔取6处划带宽度值求平均值w，计算各个时间段细胞实际迁移距离即h= （W0w）/2，比较每组平均h值大小差异。
1.2.6 统计学处理
所有数据以表示，由SPSS 13.0软件进行统计分析，数据采用t检验。
2 结果
2.1 ABS对oxLDL诱导的VSMC增殖的影响
见表1。表1 不同浓度ABS对oxLDL诱导的VSMC增殖的影响（略）
2.2 ABS对oxLDL诱导的VSMC迁移能力的影响
见表2。表2 ABS对oxLDL诱导的VSMC迁移的影响（略）
3 讨论
文献表明，oxLDL在AS形成过程中起着重要作用［2］。一方面oxLDL与清道夫受体结合，导致VSMC内吞oxLDL，继而产生平滑肌源性泡沫细胞，而脂质在泡沫细胞中沉积所造成结果是动脉壁的纤维斑块和粥样斑块。另一方面oxLDL通过促进平滑肌细胞释放血小板源生长因子（PDGF）、碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）等因子，而这些细胞因子可促进VSMC增殖和迁移。［3］结果造成血管内膜增厚、斑块形成及管腔狭窄等效应，从而促进 AS 的发生和发展。本实验结果证明ABS能显著抑制血管平滑肌细胞增殖与迁移，表明ABS抑制血管内膜增厚和斑块形成的作用，这为临床上防治动脉粥样硬化提供可靠的理论依据。
参考文献
［1］Bediner JA，Heinecke JW.The role of oxidized lipoproteins in atherogenesis.free radic bio Med，1996，20 （5）： 707727.
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【关键词】 海洛因；p38丝裂原活化蛋白激酶；前额叶皮层；海马；伏核；杏仁核
0引言
近年来，女性滥用者增多，且大多属于育龄期妇女［1-2］. 研究表明，子宫内海洛因暴露不但可引起新生儿宫内窘迫和发育迟缓，还可导致子代成年后长期的认知行为缺陷和社会行为障碍［3-4］，但其细胞、分子机制未完全阐明. p38是mapk(mitogenacti vated protein kinase) 超家族的重要成员之一，属于应激活化激酶，p38 mapk不但与其他信号传递途径共同介导细胞应激诱发的基因表达和酶活性的改变，还在细胞凋亡、细胞因子的合成释放、细胞骨架重排等机制中发挥重要作用［5-6］. 本研究旨在探讨p38 mapk 通路是否参与了海洛因导致后代神经、行为异常的机制.
1材料和方法
1.1材料标准品海洛因（heroin），学名二乙酰吗啡，纯度98.5%，由中国药品生物制品检定所（国家麻醉品实验室）提供，批号171206-200614. 兔抗鼠磷酸化p38 mapk mab，山羊抗βactin pab （美国cell signalling 公司）；辣根过氧化物酶(hrp)标记的抗兔或山羊二抗（博奥森公司）；ecl化学发光试剂盒、pvdf 膜及hyperfilm 胶片（德国merck 公司）；蛋白质提取及浓度测定试剂盒（美国biorad 公司）. fs600超声波粉碎仪(上海生析超声仪器有限公司)；离心机（德国eppendorf公司）；电泳仪（德国whatman biometra公司）；紫外成像扫描仪及分析系统（美国biorad公司）.
1.2方法
1.2.1动物分组及模型建立选健康活泼balb/c 小鼠60只(第四军医大学实验动物中心)，雌雄各半，2 mo龄，体质量(25±5)g. 自由饮食饮水，昼夜12 h交替光照，室温25℃，湿度60% 左右. 每日21∶00 雌雄合笼，次日晨查精栓或阴道涂片，以精栓或阴道涂片查到做为受精标志，记为e0d. 将体质量相近的实验动物随机分为海洛因组和盐水组. 从e0～e8 各组动物自由进食, e9～e18 d，盐水组于21∶00在小鼠大腿外侧皮下注射生理盐水20 ml/（kg·d），1/d，海洛因组组给予海洛因10 mg/（kg·d） 注射，1/d，将药物溶于生理盐水中，0.5 g/l. 子代分组同亲代孕鼠.
1.2.2蛋白印迹实验仔鼠30 d龄时在各脑区取材，0.16 mol/l戊巴比妥钠腹腔麻醉，速断头、开颅、分离各脑区，即刻入液氮，冻存管分装，-80℃贮存. 用时加入4℃胞质蛋白提取液裂解，20∶1 加入蛋白酶抑制剂pmsf，高速分散器组织匀浆，冰浴1 h，12000 g 4℃离心10 min，沉淀加入4℃预冷核蛋白提取液，震荡混匀，冰浴1 h，再12000 g 4℃离心30 min，取上清为核蛋白，其蛋白浓度经考马斯亮蓝法定量，取上清加等体积2×sds 样品缓冲液，煮沸5 min 使蛋白变性. 取50 μg待测蛋白加入等体积2×上样缓冲液煮沸5 min，行sdspage 电泳，蛋白半干转至pvdf膜. 100 v 恒压转移2 h后，将pvdf 膜在含5%脱脂奶粉的tbst中室温下封闭1 h，与1∶1000一抗pp38 mapk 兔多抗4℃孵育过夜，pbst 缓冲液洗膜3次，每次10 min；随后加入羊抗兔 igghrp 37℃孵育1 h，洗膜3次，每次10 min. ecl化学发光试剂显影，胶片曝光，uvp 凝胶成像系统扫描目的条带，labworks 软件测量各阳性条带的光密度，将pp38 mapk阳性条带与相应的βactin 条带吸光度比值作为其蛋白的相对表达量.
统计学处理：所有数据均采用spss12.0进行处理，多样本均数比较采用单因素方差分析.
2结果
分析各组间相应蛋白带的平均吸光度值，以βactin作内参蛋白，调整后进行半定量分析. 与盐水组相比，海洛因组动物的前额叶皮层、海马、伏核和杏仁核4个脑区组织的p38 mapk磷酸化蛋白表达均明显增加（p< 0.05，图1，2）.
3讨论
mapk信号系统作为真核细胞内各种信息传递的最后通路和共同通路，能够将细胞外的各种刺激信息转移到细胞核内，是神经细胞发生一系列可塑性变化的分子基础. p38 mapk 多见于促炎和促凋亡的途径中，它在细胞分化、凋亡、迁移和增殖等基本生理过程中也发挥着不可忽视的作用［5］，许多细胞外刺激如应激刺激、炎性细胞因子、细胞因子、脂多糖、生长因子等通过细胞内信号转导通路激活p38 mapk，进而磷酸化激活 mapk apkinase2 等，并最终激活atf2，max 和mef2 等转录因子而产生生物学效应［6］，但其具体调制及与其他信号通路之间的关系尚未明了.
海洛因暴露导致的行为异常与海洛因作用的时间、时程、剂量和给药方式等有密切关系，作用方式不同可导致的行为学损伤不完全相同. 我们采用的模型已报道动物有成年后迷宫学习记忆行为缺陷［7］，海马胆碱能系统及pkc 细胞学定位的改变［8］. 海洛因可迅速通过胎盘和血脑屏障，直接作用于发育中的神经细胞，导致子代成年后的神经行为损伤，但其细胞、分子机制未完全阐明. 我们的结果显示，发育早期海洛因暴露，上调了小鼠前额叶皮层，海马，伏核，杏仁核脑区中p38 mapk 磷酸化蛋白的表达，提示在这些与成瘾和学习记忆相关的脑区里，存在着p38 mapk 信号通路可能参与的生理病理学过程的改变，提示海洛因对子代动物成年后神经行为异常的长期影响，至少是部分源于海洛因在动物的神经系统发育早期，作用于神经行为相关的靶区，使该靶区的神经活动异常或作用于相关基因，使海洛因的致畸作用持续到生后，如海马损伤导致海马依赖的空间学习记忆损伤.
p38 mapk在疾病发展的不同阶段，发挥的作用有所不同. 在细胞应激反应或炎症反应的早期，p38 上调发挥脑保护作用，但随着反应进程的加深，上调的p38 可以通过加强细胞的炎性反应，介导其他胞外信号引起的炎性细胞因子或炎性产物的表达和释放，以介导凋亡性细胞死亡的方式损伤神经细胞［6, 9］. p38 蛋白在成瘾和学习记忆相关脑区的持续表达上调，是损伤神经发育，或是激发了损伤后的神经代偿机制，需要进一步研究.
我们结果的提示，p38 mapk 通路可能参与了海洛因对胚胎脑发育的毒性作用，进而影响动物成年后的行为，为进一步探讨子代神经行为的损伤机制及后期临床干预中靶蛋白的确定提供了有意义的资料.
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[关键词] Notch信号通路；γ-分泌酶抑制剂；血管平滑肌细胞；双向电泳
[中图分类号] R587.1 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2017）02（c）-0024-04
糖尿病足（DF）是糖尿病（DM）的慢性并发症之一，是高血糖、周围血管病变、周围神经病变等多种因素共同所致，病因复杂，致残、致死率高，治疗费用高。目前针对DF及微血管病变的治疗效果难以令人满意。Notch信号通路具有促进非DM动物缺血区血管新生、动静脉分化等作用。本课题通过γ-分泌酶抑制剂（DAPT）干预体外培养的DM大鼠血管平滑肌细胞（VSMCs），研究对Notch信号通路中Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白表达的影响。
1 材料与方法
1.1 实验材料
冻存的DM大鼠VSMCs（SPF级SD大鼠购自大连医科大学动物实验中心，质量合格证号：0003546，经DM大鼠模型建立、取材后冻存）[1]。
1.2 主要试剂和仪器
DAPT（美国Sellect公司）；全自动凝胶电泳图像分析系统（日本Olympus公司）；Mini-Protean 3电泳系统、Mini Trans-Blot转移系统（北航图像中心）；蛋白浓度测定试剂、β-actin（美国Sigma公司）；兔抗Notch1单克隆抗体、兔抗Notch3单克隆抗体、兔抗Notch4单克隆抗体、仓鼠抗大鼠Jagged-1蛋白（JAG1）慰寺】固濉⒉质罂勾笫Jagged-2蛋白（JAG2）单克隆抗体、仓鼠抗大鼠DLL4蛋白单克隆抗体（美国Santa Cruz公司）；Bio-Lyte载体两性电解质、IEF电泳槽、IPG预制胶条（美国BioRad公司）。
1.3 细胞培养
取冻存的DM大鼠VSMCs进行细胞复苏，将其接种于96孔板，D-Hank′s液冲洗2遍，加入0.25%TRYPSIN+0.02% EDTA・4Na约3 mL进行消化，制成单细胞悬液。按1∶2传代培养，传至3代后，随机分为两组：正常培养基（con）组和加入DAPT的培养基（实验）组（浓度梯度分别为0.15、1.25、7.50 μmol/L），继续培养传至6代。
1.4 方法
1.4.1 蛋白提取 取配置好的单细胞悬液，加入预冷的细胞裂解液400 mL，冰浴静置40 min，提取蛋白。
1.4.2 双向电泳检测目标蛋白 在198 mm×256 mm×1 mm SDS凝胶上，标记纵横坐标，将目的蛋白加入坐标原点，进行第一向等电聚焦电泳，聚焦结束后的胶条经平衡处理后立即进行第二向SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，电泳结束后，取出凝胶，拍照，应用计算机软件分析处理。取提取的蛋白，BCA试剂盒测定蛋白浓度，计算上样量。煮沸，变性，标记，上样检测或于-80℃保存。
1.4.3 Western blot 检测蛋白表达情况 取30 μg蛋白，进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳，转膜，封闭，加入抗Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4单克隆抗体（1∶200），4℃孵育过夜，加入二抗IgG（1∶5000稀释），室温孵育1 h，ECL试剂盒显影，以β-actin为内参进行数据标准化，以对照组为参照样本，计算Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白的相对表达水平。实验重复3次。
1.5 统计学方法
采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 双向电泳检测结果
DM大鼠VSMCs蛋白双向电泳检测结果显示，在凝胶上可以看到800多个蛋白点，其中大多数蛋白位于pH 5.0～8.5，分子量为134～300 kD。应用计算机软件Image-Master 2D Platinum software分析，其中“十字”表示计算机探测到的凝胶分离出的蛋白质点，“标签”表示经过计算机软件自动编号后的目标蛋白点，说明提取的蛋白质中含有实验所需目的蛋白。见图1。
2.2 Western blot检测结果
Western blot检测结果显示：随DAPT浓度的增加，Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白表达水平递减；7.50 μmol/L组与con组相比，差异有高度统计学意义（P < 0.01），0.15、1.25 μmol/L组与con组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.15、1.25 μmol/L组与7.50 μmol/L组相比，差异有统计学意义（P < 0.05）；0.15 μmol/L组和1.25 μmol/L组比较，差异无统计学意义（P > 0.05）。见图2～3。
3 讨论
DM已成为世界性疾病[2]，根据国际糖尿病联盟（IDF）的2015全球DM版图[3]，目前世界成年DM患者约4.15亿人，中国目前为1.096亿人，且处于不断增加中。据统计，15%～25%的DM患者一生中会发生DF[4]，而DM患者的截肢率与非DM患者相比要高40倍[5]，且截肢预后较差。据统计[6]截肢后5年死亡率达40%。
在DM血管病变过程中，VSMCs从中膜移行到内膜，增殖、分泌生长因子，参与纤维膜的形成，VSMCs还分泌合成许多基质分子参与血管病变的发生[7-8]。因此可见，VSMCs在DM血管病变的进展过程中发挥着重要作用。
目前针对DM血管病变的治疗主要以内科药物保守治疗、腔内介入手术[9]、旁路移植手术[10]为主，但效果均欠佳，近年来开展的细胞因子治疗[11]用于诱导和促进DM血管缺血区血管再生的探索取得一定效果，但也存在一定不足。因此，寻求新的方式以促进更多血管生成是非常有必要的。
有研究证实，Notch信号通路能促进非DM动脉缺血区的血管新生[12-14]，在血管发育的过程中发挥重要的作用。在Notch信号通路的受体和配体中，Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4在血管平滑肌细胞表达[15]。Notch1、Notch3、Notch4受体分别主要由Jagged-1、Jagged-2、DLL4配体启动[16-17]。Qiao等[18]、Zela等[19]证实Notch信号通路对体外培养正常大鼠血管VSMCs的增殖、分化、凋亡等具有重要的调控作用，进而促进血管新生。但是Notch信号通路是否对DM动脉缺血区具有相同的作用尚未清楚。DAPT是Notch信号通路的抑制剂，可特异性抑制γ-分泌酶活性，进而抑制Notch受体在S3位点的酶切，有效抑制Notch信号通路的激活[20]。
本课题组既往实验经流式细胞学检测证实，体外培养的DM大鼠VSMCs经DAPT作用72 h，对其细胞的抑制率较其余各时间段明显，且当DAPT浓度在0.25、1.25、7.50 μmol/L时，其半抑制率最为明显[1]，所以本实验选用以上3个浓度的DAPT作用72 h后行相关检查。实验结果显示：各实验组与con组提取Notch1、Notch3、Notch4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白后行双向电泳及Western blot检测证实DAPT可以抑制Notch信号通路的活动，抑制Notch相关蛋白的表达。双向电泳图谱经计算机软件分析表明提取蛋白中含有目的蛋白。Western blot检查结果显示：随DAPT浓度的增加，各蛋白的表达均递减，说明DAPT干预Notch信号通路能抑制DM大鼠Notch信号通路相关蛋白的表达；其中，当DAPT浓度在7.50 μmol/L时，对Notch信号通路各蛋白表达的抑制作用最明显；当DAPT浓度在0.15～1.25 μmol/L之间时，干预Notch信号通路后对相关蛋白的抑制作用无明显差异；当DAPT浓度在1.25～7.50 μmol/L之间时，随着浓度的升高，DAPT对Notch信号通路的抑制作用逐渐增强，呈剂量依赖型。从结果中可看出，Nocth1、Nocth3、Nocth4蛋白分别与Jagged-1、Jagged-2、DLL4蛋白降低的幅度相似，证实了Notch1、Notch3、Notch4受体分别主要由Jagged-1、 Jagged-2、DLL4配体启动这一理论。本实验结果提示：Nocth1、Nocth3、Nocth4、Jagged-1、Jagged-2、DLL4各蛋白在体外正常条件下培养的DM大鼠VSMCs中均有所表达；且DAPT能不同程度阻断DM大鼠VSMCs Notch信号通路的活性，抑制Notch信号通路相关蛋白的表达，且该抑制作用在一定浓度范围内（1.25～7.50 μmol/L）呈正相关。结合本课题前期实验证实DAPT干预Notch信号通路后可抑制DM大鼠VSMCs的增殖、促进凋亡等，提示Notch信号通路与DM大鼠VSMCs的增殖、凋亡等有关。此项研究提示，促进Notch信号通路的表达或许可以促进DM患者缺血区VSMCs的增殖，促进更多新生血管的再生，但目前对Notch信号通路在DM患者中的具体机制还存在许多亟需解决的问题。
总之，DAPT干预DM大鼠VSMCs后能抑制Notch信号通路相关蛋白的表达，抑制Notch信号通路的活性，证明Notch信号通路在DM大鼠血管再生中起着重要作用，而进一步研究Notch信号通路在DM大鼠中的作用C制或许为治疗DM患者缺血区血管新生提供一种新的可能。
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