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音标学习计划范文1
【摘要】 目的 对亚洲牛带绦虫成虫延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)基因进行克隆、表达和免疫学初步研究。方法 将亚洲牛带绦虫成虫EF-1克隆到原核表达质粒pET-28a(+)中，在大肠杆菌BL-21/DE3中用异丙硫代-β-D半乳糖苷诱导表达，表达产物通过十二烷基磺酸钠－聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)进行鉴定，用镍离子金属螯合剂亲和层析柱进行纯化，用蛋白印迹法(Western blotting)进行免疫学分析。结果 PCR、双酶切及DNA测序结果均表明重组质粒pET-28a(+)-EF-1构建成功。重组蛋白可被感染了亚洲牛带绦虫患者血清和猪血清识别，表明其具有免疫反应性。结论 亚洲牛带绦虫成虫EF-1基因可在原核表达系统中获得具有免疫学活性的表达，为进一步研究该蛋白的功能奠定了基础。
【关键词】 亚洲牛带绦虫；延伸因子-1；基因克隆；原核表达
ABSTRACT: Objective To clone and express the novel gene named elongation factor 1 (EF-1) of Taenia saginata asiatica in order to analyze the immunogenicity of the recombinant protein. Methods By screening the full length cDNA plasmid library， the coding region of EF-1 was amplified with PCR， and cloned into the prokaryotic expression vector pET-28a(+) and then expressed in E.coli BL21 with IPTG induction. The recombinant protein was detected by SDS-PAGE and purified by Ni-IDA affinity chromatography， and its immunogenicity was analyzed by Western blotting. Results PCR， double enzyme digestion and DNA sequencing confirmed that the recombinant expression plasmid was successfully constructed. Western blot analysis of EF-1 recombinant protein testified that the recombinant protein could be recognized by immunizing the serum of swine and patient， therefore indicating its immunogenicity. Conclusion A novel gene coding EF-1 of Taenia saginata asiatica was cloned and expressed successfully. The purified protein of EF-1 will be of importance for further research on the biological function of the gene.
KEY WORDS: Taenia saginata asiatica; elongation factor 1(EF-1); molecular cloning; prokaryotic expression
亚洲牛带绦虫(Taenia saginata asiatica)是近30年来发现的一种成虫形态与牛带绦虫相似，而囊尾蚴却与猪囊尾蚴相似并以猪作为中间宿主的人体带绦虫。2006年我们在前期研究的基础上进一步系统地开展对亚洲牛带绦虫在分类地位、分子诊断和疫苗等方面的研究［1-4］，为制定预防人体带绦虫病策略提供依据。本研究从亚洲牛带绦虫成虫cDNA质粒文库中筛选出一个延伸因子-1(elongation factor 1， EF-1)的同源基因，构建了pET-28a(+)-EF-1原核表达载体，并对其原核表达产物进行了初步的免疫学研究，为进一步研究其生物学功能奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 血清来源
感染亚洲牛带绦虫猪血清由贵阳医学院寄生虫学教研室提供，患者血清采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，健康人血清由中山大学热带病重点实验室提供。
1.1.2 文库、质粒、菌株
虫体标本采自亚洲牛带绦虫流行区贵州省都匀市米秀乡，亚洲牛带绦虫成虫全长cDNA质粒文库的构建、EST测序及Unigene 分析与上海联合基因有限公司合作完成。原核表达质粒pET-28a(+)和大肠杆菌BL-21/DE3由中山医学院病原生物学实验室保存。
1.1.3 主要试剂和工具酶
Ex Taq酶(含dNTP)、EcoRⅠ、XhoⅠ、T4 DNA连接酶及DNA标准(DL2000)均购自大连宝生物工程公司；异丙硫代-β-D半乳糖苷(IPTG)购自美国Promega公司；Ni-IDA Agarose(cat No：69670)购自美国Novagen公司；蛋白分子量标准购自立陶宛MBI公司；DNA凝胶回收试剂盒、质粒纯化试剂盒购自北京赛百盛基因公司；辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪IgG二抗、DAB(3，3二氨基联苯胺)显色试剂盒均购自武汉博士德有限公司；PVDF膜购自Millipore公司；TMB显色试剂盒购自美国BD公司；SDS、丙烯酰胺、亚甲叉双丙烯酰胺、过硫酸胺、尿素等试剂均购自上海申友生物科技公司。
1.1.4 引物合成和DNA测序
基因扩增引物和重组质粒DNA测序由Invitrogen上海生物技术有限公司合成。
1.2 方法
1.2.1 EF-1基因的识别
将获得的亚洲牛带绦虫unigene进行Blastx分析，获得编码亚洲带绦虫成虫延伸因子-1基因文库质粒编号为T.a HC23-E9，GenBank登录号为EF420501的同源基因；并通过瑞士生物信息学研究所的蛋白分析专家系统(ExPASY， ca.expasy.org/)预测其理化特性。
1.2.2 EF-1基因的扩增 根据已获得的EF-1编码序列，利用DNAClub和PCRdesign设计引物。上游引物：CTAGAATTCATGGAGTGTGCGTTGAAGTTC，带EcoRⅠ酶切位点；下游引物：GGGCTCGAGTTACAATTTGTTGAAGGAAG，带XhoⅠ酶切位点。以亚洲牛带绦虫成虫cDNA文库中EF-1基因的克隆质粒为模板，94 ℃预变性5 min后，热循环参数为94 ℃ 1 min，57 ℃ 1 min，72 ℃ 1 min，共35个循环，最后72 ℃延伸10 min。PCR产物10 g/L琼脂糖凝胶电泳回收。
1.2.3 重组原核表达质粒［pET-28a(+)-EF-1］的构建及鉴定
将PCR产物和原核表达质粒pET-28a(+)经EcoRⅠ、XhoⅠ双酶切后回收，连接、转化大肠杆菌BL-21/DE3感受态细胞，卡那霉素筛选阳性克隆。对阳性克隆提取质粒进行PCR、双酶切和测序鉴定。
1.2.4 重组蛋白的表达
将确定能表达重组蛋白的单菌落接种于5 mL LB培养基中，过夜培养后1∶100转接到1 000 mL培养基中，培养至A600约为0.6时加入IPTG至终浓度为1 mmol/L，28 ℃、250 r/min进行诱导。诱导4 h后离心收菌，用SDS-PAGE检测蛋白质的表达。
1.2.5 菌体的裂解、重组蛋白可溶性判断及待纯化融合蛋白上清的制备
取单菌落接种于1 000 mL含卡那霉素的LB培养基中，37 ℃震荡培养至A600为0.6时，加入IPTG使其终浓度为1 mmol/L，28 ℃震荡培养4 h，4 ℃离心(6 000 g×10 min)，收集菌液，按文献［5］的方法，每克菌(湿重)加入3 mL裂解缓冲液，重悬细菌沉淀，裂解液冰上超声破碎(160 W，超声1 s，停2 s，超声5 min)，4 ℃ 13 000r/min离心20 min，收集上清和沉淀，分别取上清10 μL加入4×SDS上样缓冲液和沉淀微量加1×SDS上样缓冲液，煮沸5-10 min后行150 g/L SDS-PAGE判断重组蛋白的可溶性。
1.2.6 尿素变性纯化重组蛋白
在得到的包涵体(超声后沉淀)中加入A液10 mL重悬，4 ℃ 12 000 r/min离心15 min，弃上清，重复2次，再用B液洗涤1次，4 ℃ 6 000 r/min离心15 min。将洗涤后的包涵体沉淀加入8 mol/L尿素(溶于基础液)18 mL放置1 h左右，沉淀完全溶解，溶液清亮透明。采用透析法，逐步降低尿素浓度(8-6-5-4-3-2-1 mol/L PBS溶液)。
1.2.7 Western blotting检测重组蛋白的免疫反应性
将纯化的蛋白进行120 g/L SDS-PAGE电泳，使用电转移仪于100 V冰浴转印1.5 h，将蛋白转移至PVDF膜上，将含预染蛋白Marker条带剪下，PVDF膜转入感染亚洲牛带绦虫猪和患者血清中(1∶100稀释)，室温孵育2 h，PBS洗涤3次，每次5 min。然后加入辣根过氧化物酶标记的山羊抗猪和抗人IgG(1∶2 000稀释)，室温孵育1 h，PBS洗涤3次，每次5 min，DAB显色至出现目的条带，超纯水终止反应［6］。
2 结 果
2.1 生物信息学分析
该基因与细粒棘球绦虫EF-1基因(登录号为AAF641192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%；全长988 bp，编码区67-868，编码269个氨基酸。理论分子质量和等电点分别是28 067.8 u和4.88［7］。
2.2 原核重组质粒的鉴定
将重组质粒进行PCR和双酶切鉴定，产物进行10 g/L琼脂糖凝胶电泳。结果显示在500-1 000 bp之间有一清晰的条带，与目的基因的大小基本相符，证明重组质粒构建成功(图1)。
2.3 蛋白表达纯化结果
将构建好的重组质粒转化到E.Coli BL-21/DE3中表达，SDS-PAGE电泳分析结果如图2中第4、5泳道所示，大约在34 ku左右处出现表达条带，与目的蛋白分子量基本相符。通过破包涵体，将蛋白进行纯化，结果如图2中第6、7泳道所示，其位置与目的蛋白相符，证明目的蛋白纯化成功。
2.4 Western blotting鉴定
感染亚洲牛带绦虫的猪血清以及感染亚洲牛带绦虫的患者血清对纯化蛋白的Western blotting均显示出清晰的条带(图3)。
3 讨论
研究表明，EF-1是一种在细胞内普遍存在且大量表达的多聚体核糖体蛋白质，在基因表达、翻译过程中起重要作用［8］。EF-1可能由α、β、γ、δ四个亚基组成，其中EF-1α属于G蛋白家族，它和氨酰tRNA、GTP一起组成复合体，通过正确地识别mRNA上的密码子和tRNA上的反密码子，负责转运氨酰tRNA 到80S核糖体，并具有低水平GTP酶的活性。EF-1β具有鸟苷酸交换活性，在EF-1α从核糖体离开并且构象由GDP形式变成GTP准备与新的AA-tRNA相互作用的过程中，需要EF-1β作为催化剂。EF-1γ常与EF-1β形成复合物，具有增加后者鸟苷酸交换的功能。至少在脊椎动物中，EF-1还有第四个亚基EF-1δ，尤其在其羧基端与EF-1β具有同源性，而在氨基端无同源性，表明它们可能具有不同的功能［9-10］。我们从亚洲牛带绦虫cDNA文库中识别出了一个EF-1的全长编码基因，其编码的氨基酸序列与GenBank中细粒棘球绦虫的EF-1基因 (登录号为AAF64192.1)的氨基酸序列的一致性达87%，相似性达91%，推测其为亚洲牛带绦虫EF-1基因，并且含有完整的开放阅读框，是一个全长cDNA序列。
通过生物信息学分析，该蛋白的理论分子质量为28 067.8 u，而质粒pET-28a(+)的载体标签序列的分子质量为6 ku，所以重组蛋白的分子质量大约应为34 ku。图2的4泳道显示的重组蛋白条带与预期的大小是一致的，并且条带很浓，但从该图的5泳道看出上清没有表达，说明该蛋白是以包涵体的形式表达，通过尿素变性纯化重组蛋白，得到了条带很浓的纯化蛋白(图2第7泳道)。本研究为包涵体蛋白的纯化积累了经验，同时还证实了重组蛋白在纯化后具有免疫反应性，获得了具有免疫活性的重组蛋白，为进一步研究其生物学功能以及在诊断尤其是疫苗研究方面的作用奠定了基础。
参考文献
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【关键词】 非小细胞肺癌
【Abstract】 AIM: To investigate the correlation between the expression of transforming growth factor beta (TGFβ) and the angiogenesis in nonsmall cell lung cancer (NSCLC). METHODS: MVC and expression of TGFβ1 in 50 carcinomatous specimens and expression of TGFβ1 in 35 paracarcinomatous specimens from the same 50 cases with NSCLC were detected by SP immunohistochemistry. RESULTS: Active angiogenesis in NSCLC was detected and it was related with NSCLC progression and lymph node metastasis， but not related with histological types. Significant difference of the expression of TGFβ1 was found between stage Ⅰ and Ⅱ (P
【Keywords】 NSCLC; TGFβ; angiogenesis; immunohistochemistry
【摘要】 目的：研究血管生成与转化生长因子β（TGFβ）在非小细胞肺癌（NSCLC）的表达及其相互关系. 方法：通过应用SP免疫组化方法检测50例NSCLC组织内微血管计数（MVC）及50例NSCLC组织和35例癌旁组织中TGFβ1的表达. 结果：NSCLC癌组织中存在活跃的血管生成，血管生成与病变分期进展和淋巴结转移有关，与组织分型无关. TGFβ1阳性表达在NSCLC的I期与II期及I期与III期之间有显著意义（P
【关键词】 非小细胞肺癌；转化生长因子β；血管生成；免疫组织化学
0引言
肿瘤的血管生成（angiogenesis）与肿瘤的发生、发展和转移的全过程密切相关. 肺癌细胞通过合成、分泌血管生成因子调节肿瘤组织的血管生成从而影响肺癌的发生、发展和转移，其中的转化生长因子β(transforming growth factorβ， TGFβ)在原发性肺癌的表达、生物学作用及其与血管生成的关系为人们所关注. 为进一步了解其在非小细胞肺癌（nonsmall cell lung cancer， NSCLC）的进展和转移中的表达及与血管生成的关系，我们采用免疫组化的方法对TGFβ1在非小细胞肺癌及癌旁组织中的表达及其与肿瘤血管生成的关系进行了观察.
1材料和方法
1.1材料
199801/200012经手术切除的NSCLC标本50(男35，女15)例， 年龄33～85（平均58士9）岁. 其中35例含癌旁组织. 鳞癌29例，腺癌21例（包括肺泡细胞癌3例）. TNM I期18例，II期20例，III期12例. 有肺门、纵隔淋巴结转移32例，无淋巴结转移18例. 兔抗人多克隆TGFβ1抗体，浓度1∶60（武汉博士德生物技术公司）；鼠抗人VIII因子相关抗原抗体，浓度1∶100（北京中山生物技术有限公司）；链霉菌抗生物素蛋白过氧化酶免疫组化染色超敏试剂盒（福州迈新生物技术开发公司）等.
1.2方法
石蜡标本切成5 μm厚度切片，脱水、透明、中性树胶封片. 严格按照产品说明书进行SP免疫组化染色. 取已知含有待检抗原的切片作为阳性对照，用PBS缓冲液代替第一抗体同上方法染色作为阴性对照. TGFβ1表达以每张切片不少于3个视野中的细胞内棕黄色颗粒状染色，且着色明显高于背景或背景不着色而细胞着色者为阳性表达. 按染色强度（未着色、弱、中、强）及染色阳性细胞的百分数（0%，1%～25%，26%~50%，>50%），分别积分为0，1，2，3，两项分数之和为0～2分者计为染色（-），3～6分者计为染色（＋）. 以癌旁间质细胞中出现同上染色颗粒为癌旁组织阳性表达. 微血管计数（microvessel count， MVC）按照Fontanini（J Pathol， 1995;177:57）的方法，用抗FVIIIRA mAB标记血管内皮细胞，可见呈棕色或棕黄色染色的血管内皮细胞，先在低倍镜（4×15）下观察确定微血管数量最多的部位，再在高倍镜（10×15）下，以与周围细胞和结缔组织成分明显区别的任何一个棕色染色的内皮细胞、或细胞丛为一个血管，只要结构不相连，其分支结构也计作一个血管计数. 肿瘤内硬化区及与肿瘤交界处软组织内的微血管，有厚的平滑肌及管腔直径大于8个红细胞的血管除外. 在高倍镜下分别计数3个视野内取其平均值即为该例的平均MVC.
统计学处理: 数据以x±s表示，采用SPSS 11.0软件进行统计分析，多组间均数比较采用方差分析，两两组间比较采用最小显著差法；两组间均数比较采用t检验，方差不齐时采用非参数检验；计数资料采用χ2
检验；等级资料采用等级资料秩和检验.
2结果
2.1NSCLC组织中的微血管生成NSCLC患者50例的平均MVC为（16.0±4.7）/HP，鳞癌、腺癌的平均MVC值分别为(15.5±4.2)，(17.1±5.7)/HP，二者无统计学差异（P＞0.05）；癌组织与癌旁组织比较有显著统计学意义（P
2.2TGFβ1在NSCLC组织中的分布在50例NSCLC中30例可检测到TGFβ1表达（Fig 2），阳性表达产物主要分布于癌细胞的胞质内（Fig 2A，B）；癌旁组织中检测到的TGFβ1蛋白表达主要分布于间质细胞胞质内和极少数吞噬细胞胞质内（Fig 2C，D）. 癌组织TGFβ1阳性率高于癌旁组织（P
3讨论
肿瘤的发生、发展和转移伴随着新生血管的形成［1］. 肿瘤组织内MVC反映了新生血管生成的强度. 本结果表明NSCLC中存在活跃的血管生成，与癌旁组织比较有统计学差异（P
NSCLC细胞由于其异常的生物代谢，可通过合成、分泌血管生成因子和血管生成抑制因子调节肿瘤组织的血管生成［4］. 体外实验表明TGFβ通过对VEGF的旁分泌调节作用促进内皮细胞的长入和毛细血管腔的形成，因此促进血管内皮细胞的生长而发挥了促肿瘤血管生成作用［5］.
参考文献
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【关键词】癌；肝细胞；NF-κB；免疫组织化学；表达
文章编号：1009-5519（2008）12-1746-03 中图分类号：R73 文献标识码：A
核转录因子（NF）-κB是与免疫球蛋白κ轻链增强子B区结合，具有和某些基因上启动子区固定核苷酸序列结合而启动该基因转录的蛋白质。NF-κB是具有多向性调节作用的核转录因子，可调控多种基因(免疫、炎症反应、病毒和原癌基因)的转录表达[1]。激活的NF-κB参与癌症的启动、发生及发展过程，在炎症性相关的肝癌（HCC）发生发展中呈高表达，在肝细胞炎症与癌变间起桥梁作用，其中包括肝脏免疫炎症反应相关基因、肝炎病毒相关基因和原癌基因的转录表达。在肝癌组织中异常激活，可抑制细胞凋亡，促进肝细胞存活，与肝癌的发生发展密切相关[2]。本文采用免疫组织化学方法，分析了按自身配对法留取的肝癌患者术后肝癌的癌灶组织和癌周组织标本中NF-κB表达、胞内分布及其临床病理特征。
1 材料和方法
1.1 研究对象：于2005～2007年间，按自身配对法收取南通大学附属医院原发性肝癌患者35例(男29例，女6例)术后新鲜肝脏组织，分别留取肝癌切除后的癌灶组织、癌周组织(距癌灶边缘5 cm)各35份(每份约200 mg)，除部分作组织病理学检查外，其余置组织-85℃保存。35份标本中肝癌肿块直径≥5 cm 7例，
1.2 试剂与标本切片：兔抗人NF-κB多克隆抗体及S-P免疫组化试剂盒均购自武汉博士德生物工程有限公司。新鲜肝组织标本经取材，以10％中尔马林固定，石蜡包埋，制成厚度4 μm的组织切片。
1.3 免疫组织化学分析NF-κB（S-P法）：NF-κB在癌组织和癌周组织中的表达均采用免疫组织化学S-P法。4 μm厚的组织切片按常规脱蜡、水化；双氧水阻断内源性过氧化物酶；高压加热法修复抗原；正常动物血清封闭非特异性结合；滴加NF-κB抗体，4 ℃过夜，磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗；滴加生物素标记的第二抗体，室温孵育10 min，PBS漂洗；滴加链霉素抗生物素蛋白-过氧化酶，室温孵育10 min，PBS冲洗；滴加新鲜配制的四盐酸二氨基联苯胺(DAB)溶液，室温显色，蒸馏水洗涤；苏木素复染。无水乙醇脱水透明、封片。OLYMPUS BX 50光学显微镜观察、摄像。以0.01 mol/L PBS液(pH=7.5)分别替代一抗、二抗和SP试剂作阴性对照，已知表达NF-κB的肝癌组织作阳性对照。
1.4 NF-κB判断标准：肝组织中NF-κB表达强度，以阳性细胞数≥10%作为阳性判断标准，进而根据阳性细胞百分率分为NF-κB表达弱阳性(+)：阳性细胞数为10%～25%；NF-κB表达阳性(++)：阳性细胞数为26%～75%；NF-κB表达强阳性(+++)：阳性细胞数>75%。
1.5 统计学处理：以stata7.0统计软件分析和处理数据。计数资料以卡方检验或Fisher确切概率法分析和处理，以P
2 结果
2.1 肝癌组织中NF-κB表达的胞内分布与定位：肝癌组织及其癌周组织中NF-κB阳性表达呈棕黄色。癌组织中NF-κB表达呈巢状分布，深染，细胞胞浆和细胞胞核均呈阳性；而它对应的癌周组织NF-κB阳性表达，主要定位于胞浆，而细胞核无明显的阳性着色。镜下定性观察肝癌组织中NF-κB表达强度明显高于癌周组织。
2.2 肝癌与癌周组织中NF-κB表达差异：肝癌的癌灶组织与癌周组织中NF-κB表达差异见表1。
2.3 肝癌组织NF-κB表达的病理学特征分析：见表2。NF-κB在癌组织的阳性率为100%，其NF-κB表达强度与肿瘤的分化程度、肿瘤数目、HBsAg和肿瘤大小间的关系，经确切概率法分析，各组间均差异无显著性(P>0.05)。
2.4 癌旁组织NF-κB表达的病理学特征分析：癌旁组织中NF-κB表达与癌灶组织相比，表达强度低，有近1/3的癌旁组织中未见NF-κB的表达。NF-κB表达的病理学特征见表3，NF-κB在癌旁组织的阳性率为68.6%(24/35)，NF-κB表达强度与分化程度、肿瘤数目、HBsAg、肿瘤直径间的关系，经确切概率法分析，各组差异无显著性(P>0.05)。
3 讨论
NF-κB是一个具有广泛生物活性的转录因子，受多种信号途径调控，同时也调控多种信号途径，作为细胞内信号传递的一个枢纽参与多种生理过程的调控，其表达异常会导致机体的多种病理改变[3]。NF-κB主要存在于胞质中，与NF-κB抑制蛋白(IκB)家族成员结合，形成无活性的三聚体。当其受到细胞因子、有丝分裂原、病毒等刺激后，IκBα通过磷酸化、泛素化而降解，从而使NF-κB的核定位信号暴露，NF-κB进入到细胞核内，与靶基因的κB位点结合，从而发挥其转录调节作用[4]。NF-κB在炎症与肿瘤的联系中起作用，是调控癌细胞凋亡的主要因子，能调节肿瘤的血管生成与侵袭能力[5]。我们采用免疫组织化学方法，分析了人肝癌及癌周组织中NF-κB的组织分布及其临床病理特征。在众多被感染和炎症所活化的信号途径中，NF-κB也许是肿瘤促进机制中最重要的一环，因为NF-κB是抗凋亡基因表达的主要激活子。研究中发现NF-κB的表达阳性率在肝癌组织明显高于癌周组织，且阳性强度亦明显高于癌周组织，对照临床资料分析发现在肝癌组织中NF-κB的阳性率及强度与分化程度、肿瘤数目、肿瘤直径均未见统计学差异，是否与病例选择有关，还有待探讨。NF-κB表达的定位分析发现，在肝癌组织中有点灶状的胞核阳性，而在癌周组织未发现有胞核阳性，提示NF-κB在激活后进入胞核发挥其转录活性，从而参与肝癌的发生发展[6]。
HCC是由病毒、化学致癌物等多病因作用，因癌基因或癌相关基因激活、抗癌基因失活或胚胎期某些酶基因重新复活等诸多因素引起肝细胞生长失控而致癌变，经启动、促进、演变多阶段的发病过程，并与基因调控和表达等密切相关[7]。肝炎病毒(HBV和HCV)的慢性持续感染是肝癌发生的主要背景[8]。文献报道HBV病毒感染诱导和激活NF-κB表达，但在本组资料中仅分析NF-κB表达与HBsAg之间的关系，结果显示HBsAg阳性的病例癌组织与癌周组织NF-κB强度均有高于HBsAg阴性病例的趋势，在统计学上未见有明显差异。在肝癌组织中NF-κB表达与HBV复制的关系待进一步研究。
多基因、多阶段癌基因或抑癌基因变异，构成肝癌发生、发展的分子基础[9]。NF-κB表达，受多种信号途径调控，同时也调控多种信号途径，作为细胞内信号传递的一个枢纽参与多种生理过程的调控。肝癌发生过程中NF-κB过度表达，参与了肝癌的发生、发展[10]。NF-κB通过上调抗凋亡基因的表达等作用抑制细胞凋亡，从而参与肿瘤的发生发展，其在调控肿瘤的发生发展及凋亡的复杂信号网络中处于中心环节，在肝细胞炎症与癌变间起桥梁的关键作用，因此有望成为临床上肝癌基因治疗的理想靶点。
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随着义务教育化学课程标准（2011版）的颁布，沪教版九年级化学教材也随之进行了改版，教材原先的编排体系、结构等发生了相应的一系列变化。这也引发了九年级化学教师研读新课标、解读新变化的浪潮，激起了进一步进行课堂教学改革的浪潮。细数新教材的种种变化，均与新课标的理念更为贴切，其中实验部分尤为明显。
一、新课标中实验部分的变化
1. “课程性质”中增加了“加强化学实验教学，发展学生的科学探究能力”内容，更加突出了化学的特点和实验的地位与作用。
“课程内容”部分在“科学探究”主题中增加了“完成基础的学生实验”这一二级主题，不仅明确提出“教师应结合具体的教学内容和学习实际，积极创造条件，组织学生开展化学实验活动”，而且还明确规定应安排和组织学生至少完成8项实验。
2. “课程目标”部分的“过程与方法”目标中，将“能提出问题，进行初步的探究活动”改成了“能进行简单的探究活动，增进对科学探究的体验”。
“课程内容”中“有关科学探究学习的实例”部分，删去了难度较大的活动探究案例。并删去了部分“活动与探究建议”的内容，降低一些实验的要求。
3. “课程内容”部分的“学习基本的实验技能”中，增加了“化学实验应高度关注安全问题，避免环境污染”，强化了“实验安全”和实验中的“环境保护”意识。
4. “课程内容”部分的“科学探究”功能得以强化，内容和目标要求更为具体和明确。“发展科学探究能力”中，对5处内容在表述上进行了修订，删除了1处内容，使得科学探究要素的语言表述更具有科学性、针对性和实用性。
二、新教材中发生的相应变化
1. 将八项学生基本实验编排到教材相应章节中，这是在教学实践层面上的最大变化。这样的编排方式将学生实验与教学内容更为有机地结合在一起，引导学生自己动手做实验，亲身经历、感受实验和探究过程，这在化学教学中具有不可替代的意义和价值。
2. 部分知识或实验活动要求下降。如原教材上册第34页的活动与探究中，要求根据实验记录木炭、铁丝、蜡烛在氧气中燃烧的实验现象。而新教材中则在正文部分详细描述了几个实验的原理和现象，表2-1中要求填写的实验现象和结论只是作为验证出现。
再如原教材44页对于二氧化碳的实验室制法只有一句简单的描述以及文字表达式，而新教材43页中则以活动与探究为载体，提供了实验室制备、检验二氧化碳的实验装置图，更是在正文部分详细描述了实验现象、原理，提供了制备、检验的文字表达式；新教材中删去了第6章“活动与探究”栏目“水、蔗糖溶液、食盐水溶液的凝固点测定”实验。
3. 课本多处增加了有关实验安全和环保要求的文字。
三、关于实验教学的建议
在新课标和新教材的变化中，有三方面与实验相关的内容最值得引起我们关注：一是强化了学生的实验探究；二是降低了实验探究活动的难度，力求保证各类不同学校都有条件去开展并完成课本实验；三是对实验的描述和解释更为详细、真实并增加了人文关怀因素。
面对以上变化，如何在课堂上突出“实验为主”的科学探究，如何在教学中提高学生的创新能力，如何贴近初中生的认知水平紧扣教学要求进行授课已经必然成为当下教学的重点。笔者认为可以从以下几个方面予以关注。
1. 注重演示实验与强化学生实验并举
随着新课程改革的不断深入，各校教学硬件设施与实验室条件的有效改善，使得学生分组实验成为可能，并且越来越被重视。因此，教师应指导学生亲自动手体验化学实验的乐趣，培养学生基本的化学实验技能，这也是学习化学和进行探究活动的基本保证。
2. 充分释放实验的探究效应，力求科学探究能力的可持续发展
以化学实验作为探究性学习的途径，就必须变“验证性实验”为“探究性实验”，恢复化学实验探究性的本来面貌。通过对课程标准（2011版）的学习，教师应根据实际情况，对探究要素和难度做适当的调整，让所有学生都能参与探究，让更多的学生获得真实的科学探究体验。充分发挥化学实验的探究功能，要不断研究开发适合于探究性学习的化学实验，要注意从生产、生活实际中挖掘素材设计实验方案，因为来源于生产生活实际的实验探究性强，能极大程度的调动学生探究的主动性，使学生产生强烈的探究欲望。同时，教师要引导学生学会学科联系与渗透，将其他学科的科学探究与化学科学探究融合起来，形成科学探究学习的合力。
3. 增强实验教学的趣味性，创设生活化实验情境
伟大的科学家爱因斯坦说过：“兴趣是最好的老师”，初中化学教学更是如此。在日常教学中教师要通过一些有趣味性的实验来进行探究活动，培养学生学习化学的兴趣，尤其是学生能亲自动手的学生实验的趣味性，使学生养成自由开放式的追问风气。
在校学生接触社会的机会有限，通过实验让学生了解化学在实际生产生活中的作用，可以提高学生发现问题的能力和产生解决问题的迫切欲望。例如在进行关于“燃烧条件”的学习时，从实验室酒精灯的熄灭、燃烧木柴要把木柴架空、液化气灶及煤炉都留有通风口等学生非常熟悉的实验情景出发，引导学生思考，发现问题。另外，实验的生活化还体现在实验用品上，使用一些生活中的物品，如在粉尘爆炸实验中利用金属易拉罐和小眼药瓶，测pH选择生活中的一些物质等，这样的代用品实验虽然不多，但它能启发学生在生活中随时利用生活中的物品进行一些简单的实验探索。
4. 渗透安全环保理念，培养良好学科习惯
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结果乳腺癌组COX-2、VEGF-C表达的阳性率及表达程度均高于纤维腺瘤组(P
【关键词】 乳腺癌;环氧化酶-2;血管内皮生长因子C;淋巴结转移
ABSTRACT: ObjectiveTo detect the expression of cyclooxygenase-2 (COX-2) and vascular endothelial growth factor C (VEGF-C) in breast cancer and get further understanding of the correlation between these two indexes and lymph node metastasis of breast cancer.MethodsImmunohistochemical SP method was adopted in detecting COX-2 and VEGF-C protein expression in 60 cases of invasive ductal carcinoma and 15 cases of breast fibroadenoma.ResultsThe positive rate and expression level of COX-2 and VEGF-C in breast cancer were higher than those in fibroadenoma group (P
KEY WORDS: breast cancer;cyclooxygenase-2; vascular endothelial growth factor C; lymph node metastasis
乳腺癌是全世界范围内女性最常见的恶性肿瘤之一。经淋巴道转移是乳腺癌最常见的转移途径，淋巴结受累程度是决定乳腺癌分期及选择治疗方案、判断预后的关键因素之一。检测与淋巴结转移有关因素的表达对乳腺癌转移和预后有一定预测价值。环氧化酶-2(cyclooxygenase-2， COX-2)是花生四烯酸合成前列腺素的限速酶，在乳腺癌、胃肠道肿瘤等多种肿瘤中呈过度表达。研究发现，COX-2可能通过上调血管内皮生长因子C(vascular endothelial growth factor C， VEGF-C)的表达而参与肿瘤新生血管的形成，利用抗VEGF及其受体的特异性单克隆抗体，可阻断VEGF诱发的血管及淋巴管内皮细胞的信号传导，抑制肿瘤血管、淋巴管的形成和经血液及淋巴道转移。本研究通过检测乳腺癌组织中COX-2及VEGF-C表达，探讨其与淋巴结转移的关系。
1材料与方法
1.1标本来源收集西安交通大学医学院第一附属医院2006年3月～2007年5月间手术切除的乳腺非特异性浸润性导管癌标本60例为研究对象，其中有腋淋巴结转移的30例，无腋淋巴结转移的30例;肿块长径≤2cm 23例，>2cm且≤5cm 30例，>5cm 7例。按WHO乳腺浸润性导管癌病理学分级标准，Ⅰ级19例，Ⅱ级18例，Ⅲ级23例。所有患者均为女性，年龄29～70岁，平均(45.21±8.23)岁，术前均未接受放疗、化疗等其他治疗，未合并其他系统恶性肿瘤，均行乳腺癌改良根治术，清除淋巴结数目均大于10枚。取门诊乳腺纤维腺瘤手术标本15例作为对照。
1.2主要试剂鼠抗人COX-2、VEGF-C单克隆抗体及SP试剂盒均购自中山生物技术有限公司。
1.3检测方法采用链霉素抗生物素蛋白-过氧化物酶免疫组织化学染色方法(SP法)，操作在室温下进行。切片常规脱蜡脱水，微波抗原修复，3mL/L双氧水孵育，正常山羊血清室温孵育30min;分别滴加鼠抗人COX-2、VEGF-C单克隆抗体50μL，4℃过夜;滴加生物素标记二抗40～50μL，37℃孵育15min;滴加辣根酶标记链霉卵白素工作液，37℃孵育15min;DAB显色，苏木素复染，酒精脱水，树胶封片。每批免疫组化染色均采用PBS稀释液代替一抗作为阴性对照，用已知阳性的结肠组织切片作阳性对照。
1.4结果判断结果判定标准根据SHIMIZU法[1]改良而成：显微镜下细胞质显示棕黄色颗粒视为阳性着色。结合着色范围和着色强度，对图片进行半定量处理。①着色范围积分：在显微镜下(×200)随机选取5个视野，以阳性染色细胞占视野中所有细胞的百分比均值作为着色范围：≤1%为0分，2%～20%为1分，21%～50%为2分，≥51%为3分。②着色强度积分：无着色为0分，浅着色为1分，深着色为2分。上述两项积分相乘之积为范围强度积分：≤1.9为阴性(-)，2～2.9为弱阳性(+)，3～3.9为阳性()，≥4为强阳性()。
1.5统计学处理应用SPSS16.0统计分析软件行统计学处理。数值均以均数±标准差(±s)表示，计数资料比较使用χ2检验或Fisher确切概率法，计量资料使用t检验，采用Spearman法进行相关分析。P
2结果
2.1COX-2蛋白的表达情况
2.1.1两组COX-2蛋白阳性表达率的比较
COX-2主要表达于乳腺癌癌细胞的胞质中，呈淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色。60例乳腺癌组织中，COX-2的阳性率为73.3%(44/60)，明显高于对照组的20.0%(3/15)，差异具有统计学意义(χ2=14.590，P
2.1.3COX-2蛋白表达程度的比较乳腺癌组COX-2蛋白表达程度明显高于对照组(P
2.2VEGF-C蛋白的表达情况
2.2.1两组VEGF-C蛋白阳性表达率的比较VEGF-C主要表达于乳腺癌癌细胞的胞质中，呈淡黄色或棕黄色颗粒，细胞膜及细胞核未见染色。乳腺癌组VEGF-C表达阳性率为71.7%(43/60)，明显高于对照组的13.3%(2/15)，差异具有统计学意义(P
2.2.2VEGF-C表达与乳腺癌淋巴结转移的关系乳腺癌淋巴结转移组VEGF-C表达的阳性率明显高于淋巴结无转移组，差异有统计学意义(P
2.2.3VEGF-C蛋白表达程度的比较
乳腺癌组VEGF-C蛋白的表达程度明显高于对照组，差异具有统计学意义(P
2.3乳腺癌中COX-2与VEGF-C蛋白联合表达的分析
2.3.1COX-2与VEGF-C蛋白表达的关系经Spearman相关分析，乳腺癌组COX-2与VEGF-C表达呈正相关关系(r=0.582)。
2.3.2COX-2与VEGF-C联合表达与乳腺癌淋巴结转移的关系
COX-2及VEGF-C均阳性组淋巴转移发生率(76.7%)明显高于COX-2及VEGF-C均阴性组(6.7%)，差异有统计学意义(χ2=6.481，P
3讨论
COX是一种膜结合型的含有血红素的蛋白，是催化花生四烯酸(arachidonic acid， AA)转化成为前列腺素(prostaglandin， PG)和血栓素(thromboxane， TX)的限速酶[2]。目前已识别出COX的3种同工酶：COX-1、COX-2和COX-3。COX-2是诱导型酶，正常生理状态下在大多数组织中表达极低或不表达，但是它可以被许多刺激因素所诱导而发生高表达，因而可作为对包括肿瘤在内的多种疾病进行治疗性干预的良好靶点。COX-2已被报道表达于包括胰腺癌、肺癌、乳腺癌等在内的多种恶性肿瘤中，而应用COX-2抑制剂有助于肿瘤的预防和治疗，而研究COX-2与恶性肿瘤的关系具有重要的临床意义[3]。
VEGF又名血管通透因子或血管调理素，具有促进细胞有丝分裂，防止内皮细胞凋亡、诱导血管生成、增加微血管通透性等作用。VEGF-C具有诱导淋巴管生成及血管生成的双重作用。研究证实，多种人类肿瘤组织如乳腺癌、前列腺癌、肺癌、大肠癌等中VEGF-C表达均增高，且VEGF-C表达上调与这些肿瘤的淋巴结转移密切相关，因而，VEGF-C已成为研究肿瘤生长及淋巴转移的新途径。
本实验检测了60例乳腺癌及15例乳腺纤维腺瘤中COX-2及VEGF-C的表达，二者在乳腺癌组织中表达率及表达程度均明显高于乳腺纤维腺瘤(P
关于COX-2和VEGF-C的表达与乳腺癌淋巴结转移的关系，DENKERT等[4]研究发现，乳腺癌组织中COX-2的表达与淋巴结转移相关;亦有文献显示，VEGF-C通过促进淋巴管内皮细胞增生，使淋巴管数目增多，增大瘤细胞与淋巴管内皮的接触面积与淋巴管的通透性，改变淋巴管内皮黏附特性或表面趋化因子的表达，从而促进肿瘤转移[5]。本研究结果表明，COX-2与VEGF-C表达与乳腺癌淋巴结转移相关，淋巴结转移组COX-2及VEGF-C表达率明显高于淋巴结无转移组(P
研究表明，COX-2可通过上调VEGF-C的表达诱导淋巴管内皮细胞增殖，从而促进胚胎及肿瘤中淋巴管的生成及淋巴网络的形成，最终导致肿瘤细胞经淋巴转移[6]。COX-2可以通过EP1/SRC/HER-2/NEu途径促进VEGF-C的高表达，从而促进淋巴管的形成[7]。实验已证明，COX-2基因敲除的小鼠比野生型小鼠瘤体内血管密度低30%[8]，体外COX-2基因转染或高表达的肿瘤细胞对凋亡的抵抗能力、血管形成因子的生成能力、转移能力及促血管内皮细胞迁移能力均增强，而且与肿瘤生长及血管生成有关的多种因子表达都明显增强[9]，而COX-2抑制剂则可抑制VEGF的表达，降低微血管密度[10]。
本研究结果显示，COX-2阳性表达组中VEGF-C的表达率明显高于COX-2阴性组;COX-2与VEGF-C在乳腺癌中的表达呈正相关，且COX-2及VEGF-C联合表达与乳腺癌淋巴结转移有关，即COX-2及VEGF-C均阳性组淋巴转移发生率明显高于COX-2及VEGF-C均阴性组。提示COX-2及VEGF-C在乳腺癌淋巴结转移过程中可能有一定的协同作用，VEGF可能是COX-2影响淋巴结转移的一个重要介质，COX-2通过调节VEGF而参与了促进乳腺癌的发展和转归。联合检测COX-2与VEGF-C在乳腺癌中的表达有助于判断乳腺癌的发展状态并制定合理的治疗方案。
参考文献
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\[2\]SUGIMOTO Y， NARUMIYA S. Prostaglandin E recepters \[J\]. J Biol Chem， 2006， 282(16):11613-11617.
\[3\]DANNENBER AJ， ALTORKI NK， BOYLE JO， et al. Cyclooxygenase-2: a pharmacological target for the prevention of cancer \[J\]. Lancet Oncol， 2001， 2(9):544-551.
\[4\]DENKERT C， WINZER KJ， MULLER BM， et al. Elevated expression of cyclooxygenase-2 is a negative prognostic factor for disease free survival and overall survival in patients with breast carcinoma \[J\]. Cancer， 2003， 97(12):2978-2987.
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一、时间安排
1、每天的四个“1小时保障”
每天保障做一小时的语文或数学作业;
每天保障一小时的无负担课外阅读;
每天保障一小时的英语自学;
每天保障一小时的户外活动或运动。
2、计划与非计划
如无特殊情况，每天必须完成以上计划;
每天的计划在得到“保障”的前提下，可灵活自由安排;
如果因外出旅游、回乡下度假等意外安排，可临时不予执行;
可以偶尔睡懒觉，但不要影响当日计划的实施。
二、学习计划
1、不参加语文、数学的培优，不请家教，相关课程自己独立完成。
2、语文课程计划
7月份完成暑假作业，8月中旬前检查、改正，查漏补缺;
把自己的藏书系统再读一遍，重点读历史、百科知识大全、漫画、中外名着导读等丛书;
假期可以自己买三本自己喜欢的任何书籍;
把以前稍显薄弱的阅读题的规范回答、错别字系统复习。
3、数学课程计划
7月份完成暑假作业，8月中旬前检查、改正，查漏补缺;
假期完成五年级《奥数提高班》的自学，基本掌握其要领，有选择性挑选典型题目做。
自己注意计算细心化的纠正。
4、英语课程计划
英语学习能力和成绩一般，要重点加强学习兴趣和能力的培养;
把三年级和四年级的学校课本系统复习一遍，每天坚持听剑桥英语的磁带，时间不限;
假期把以前记得的英语单词都记在小本子上，分类汇总;
若有兴趣、有机会，可以把语音和音标接触、巩固一下，尽量保证发音标准。
三、活动安排
1、随父母至少省内出去旅游一次，争取省外旅游去一次;
2、至少去乡下亲戚家2次，体验生活，其中爷爷家族亲戚去一次，外公家族亲戚去一次;
3、每天保障一小时的户外活动或运动，散步、溜冰、找小朋友玩等，要注意安全;
4、每两天至少帮家里做一件家务事(10分钟以上)，洗衣服、择菜、简单做饭等;
5、一个人尝试独立在家呆1-2天;邀请同学或者小朋友在家玩若干次，并独立招待;
6、每周玩电脑2小时左右，重点加强打字能力的提高;