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微生物方法学研究范文1
[关键词]微生物 分子生态学 RFLP DGGE Real-Time PCR
[中图分类号] Q938.1 [文献码] B [文章编号] 1000-405X（2015）-2-267-1
0引言
微生物分子生态学是利用分子生态技术手段研究微生物与环境之间相互关系及其相互作用规律的科学，主要研究微生物生态学基础理论问题。
1微生物分子生态学常用分析方法
1.1寡核苷酸探针检测
该方法利用目标核酸序列与特异性探针特异性互补的特点，检测荧光标记的特定DNA序列[1]。探针为一段特定方式标记的核酸序列，具有较高灵敏度。做种群鉴定时选用DNA制备探针，利用cDNA避免繁琐的克隆程序，确保探针与种内全部菌株杂交。除此之外，cDNA探针若具有表型特异性，则可检测某一特定表型是否存在。
1.2 DNA-DNA杂交
DNA-DNA杂交针对微生物整体基因组的重组[1]，为检测DNA序列相似性提供可能性。该方法基于高温双链DNA解链、低温复性与碱基配对可转移的特点，通过温度等条件控制形成杂交DNA，检测其杂交率。由于来源不同的两条DNA单键难以配对重组，DNA杂交率可用于估计序列相似度。
1.3 16SrRNA序列分析
该方法在微生物分类学研究中最为常用[2]。微生物16SrRNA基因由保守区与可变区构成。可变区具有种属特异性，不同种属微生物间存在较大差异；保守区为所有微生物共有基因序列。微生物进化过程中，基因序列基本不变化，因此可根据保守区基因序列设计通用引物，或根据可变区基因序列设计特定引物，从而分析不同微生物的进化距离及亲缘关系。
1.4 编码蛋白质基因
该方法利用基因序列控制合成蛋白质[3]。微生物代谢过程实质为生物酶催化作用下的一系列氧化还原反应，而不同功能微生物的催化反应酶具有一定特异性，因此编码功能蛋白的基因不同，主要用于研究特定功能微生物，尤其在毒理学方面。
2微生物分子生态学常用技术
2.1限制性片段长度多态性分析（RFLP）
在RFLP分析过程中，以所提取的微生物DNA为模版，利用特异性引物进行聚合酶链式反应（PCR）得微生物16SrRNA序列，将其连接到载体，转至大肠杆菌感受态细胞，通过挑取克隆子，进而获取质粒DNA来实现克隆文库构建。不同微生物DNA序列不同，进而酶切位点不同，因此利用特异性限制性内切酶消化，可得到长短不一、数目不同的限制性酶切片段，琼脂糖凝胶电泳分离得到呈现多态性的图谱，进而获取环境微生物群落结构信息[4]。
2.2变性梯度凝胶电泳技术（DGGE）
DGGE是一种检测DNA突变的电泳技术，根据DNA在不同浓度的变性剂中解链行为的不同而导致电泳迁移率发生变化，从而将碱基组成不同的DN段分开。该技术具有以下优点：①检测极限低、速度快；②结果准确可靠；③无需微生物的培养；④可同时检测多种微生物。但其存在以下局限性：无法获取样品中全部微生物DNA，而DNA回收率越低，重复性越低；不均等扩增造成结果代表性低；敏感度较低，采样和样品处理会对结果产生影响。
2.3荧光定量PCR技术（Real-Time PCR）
Real-Time PCR为微生物生态学研究的定量分析方法，通过荧光染料或荧光标记的特异性的探针，标记跟踪PCR产物，实时在线监测反应过程，结合相应的软件分析产物，计算模板浓度。该技术具有以下优点：①利用扩增产物数量与荧光信号强度成对应关系的原理，实时检测PCR反应进程，避免了终点定量重现性差；②自动化程度高，操作安全、简单，可避免产物被污染；③检测特异性强，灵敏度与精确度高；④可实现多重扩增。其缺点在于无法对不确定对象进行分析。
3结论与展望
微生物分子生态学克服了传统培养法的不足，为全面掌握微生物多样性提供了可能。若将各方法结合，以便掌握更为全面的信息，可更好揭示微生物对环境变化的影响，预示环境变化趋势，为从微观方面改善环境提供依据。
参考文献
[1]杨霞，陈陆，王川庆.16SrRNA基因序列分析技术在细菌分类中应用的研究进展[J].西北农林科技大学学报（自然科学版），2008，36（2）：55-60.
[2]邓小宽，张新宜，田敏.现代生物技术在分子微生物生态学中的应用[J].国外医药（抗生素分册），2006，27（4）：164-170.
微生物方法学研究范文2
关键词：多潘立酮片；平皿法；验证
微生物限度检查法分为平皿法和薄膜过滤法。当供试品具有抑菌活性时，应消除抑菌活性后，再依法检查，常用方法为：稀释法、离心沉淀法、薄膜过滤法、中和法。
1 实验条件
1.2 培养基
2.1 细菌、霉菌及酵母菌计数方法合格标准
在3次独立的平行试验中，稀释剂对照组的菌回收率（稀释剂对照组的平均菌落数占菌液组的平均菌落数的百分率）应不低于70%。若试验组的菌回收率（试验组的平均菌落数减去供试品对照组的平均菌落数的值占菌液组的平均菌落数的百分率）均不低于70%，照该供试液制备方法和计数法测定供试品的细菌、霉菌及酵母菌数。
2.2 控制菌检查方法合格标准
阴性菌对照组不得检出该试验菌。试验组检出试验菌，按此供试液制备方法和控制菌检查法进行供试品的该控制菌检查。
2.3 菌液的制备
接种大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌新鲜培养物用0.9% 无菌氯化钠溶液制成50-100cfu/ml的菌悬液。接种黑曲霉的新鲜培养物用含0.05% （ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化纳溶液制成50-100cfu的孢子悬液。
菌液制备后在室温下放置，于2 小时内使用。菌液制备后在2～8℃保存，在24 小时内使用。
3 样品制备
4.1.6实验检查结果：3次独立的平行试验中试验组的菌回收率均大于70%，稀释剂对照组的菌回收率也均大于70%，结果符合规定。
4.2 控制菌检查法的验证
控制菌检查方法验证用菌种：大肠埃希菌。
4.3 菌液制备：（同菌液的制备2.3）。
4.4 大肠埃希菌的验证
4.4.1试验组
取供试液10ml及50～100cfu大肠埃希菌1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，混匀，按照《中国药典》2010年版中国药品检验标准操作规范中控制菌检查方法验证项下方法进行检查。
4.4.2 阳性对照组
取50～100cfu试验菌1ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，依试验组项下方法进行大肠埃希菌检查。
4.4.3 阴性对照组
取稀释液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中，依试验组项下方法进行大肠埃希菌检查。
4.4.4 实验检查结果：：试验组均应能检出该试验菌，阳性对照组检出试验菌，阴性对照组无菌生长。结果符合规定。
5 结束语
试验表明：多潘立酮片的细菌、霉菌及酵母菌的计数方法验证结果符合规定，大肠埃希菌的方法验证结果也符合规定。多潘立酮片的微生物限度方法学验证结果符合规定，可以采用药典中片剂的微生物限度方法检查微生物限度。
参考文献
微生物方法学研究范文3
全书分为综述、玻璃酸的理化性质、生产工艺、分析检验、药理作用和生理功能，在化妆品和保健品、给药体系及眼科、关节疾病中的应用，预防术后粘连和对组织的修复作用以及其他共11章(66万8千字)。
该书主要有以下几个特点：
1 全面综述了玻璃酸及其衍生物的研究与应用进展，内容丰富，范围较广，信息量大。并在“其他”一章中综述了2003～2008年我国生化药物研究的进展，为生化药物的研究提供了大量的有关资料和国内外参考文献。
2 除综述外，其他内容包括理化性质、生产工艺、分析检验、药理作用和生理功能以及应用等方面，均为编者和他们的同工作者在国内外杂志上发表的原始研究论文，因此殷实可靠。在有关疾病中的应用研究，大部分对实验结果展开了讨论，有的还进行了初步评价，对玻璃酸在有关疾病中的应用提供了理论基础。
3 通过开创性的实验研究，对玻璃酸的生产工艺、理化性质、分析检验提出了新工艺、新技术和新方法。例如：在生产工艺方面首创微生物发酵工业生产方法，国内率先研制成功眼科手术用和关节腔注射用的玻璃酸注射液；在分析检验方面，通过实验建立了测定玻璃酸含量的凝胶色谱法，经过对比简化了测定特性黏度的多点稀释法，提出了一点法，使实验操作简化。经过方法学研究提出了应用较新的联用技术――MALLS-SEC测定玻璃酸的相对分子质量(Mt)，有利于玻璃酸的质量控制和进一步应用研究。在应用方面，国内首创用于外科术后防粘连和烧伤治疗等，拓宽了其应用范围。
微生物方法学研究范文4
【摘要】
目的研究建立青皮、醋青皮饮片质量标准。方法采用高效液相色谱法测定青皮炮制品中4种成分。结果对青皮饮片的质量作了系统的研究，包括鉴别、检查、含量测定等。结论该研究系统、规范，数据准确、可靠，方法稳定、简单，可为国家制定青皮、醋青皮饮片质量标准提供科学依据。
【关键词】 醋青皮； 橙皮苷； 辛弗林； N-甲基酪胺
青皮为橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的幼果或未成熟的果皮，具有疏肝理气、消积化滞的功效。用于治疗肝气郁滞之肝郁胸胁胀痛、乳房胀痛、寒疝疼痛、食积气滞、胃脘胀痛及癥瘕积聚等。青皮中主要含有挥发油和黄酮类成分，其中挥发油中主要含有右旋柠檬烯、芳樟醇、月桂烯、α-蒎烯等；黄酮类成分中有橙皮苷、柚皮苷、柚皮芸香苷等，另还含有辛弗林等成分。橙皮苷是青皮中的主要有效成分，辛弗林是青皮升压的有效成分。目前对青皮饮片的质量标准研究未见有详细报道。2005年版《中国药典》仅收载了青皮药材的薄层鉴别及高效液相法测定橙皮苷含量，但醋青皮饮片质量标准没有规定。同时我们在按药典法测定橙皮苷时，发现样品中成分提取不够完全，因此，对青皮饮片的质量作了系统的研究，并对HPLC法测定橙皮苷等进行了详细的方法学研究，对药典法进行了改进，以期为制定青皮、醋青皮饮片质量标准提供科学依据。现报道如下。
1 材料
1.1 原材料购买个青皮，产地为浙江杭州、湖北宜昌、湖北及市售品；四花青皮，产地为四川、浙江、江西、福建，经鉴定为芸香科植物橘Citrus reticulata Blanco及其栽培变种的干燥幼果或未成熟果实的果皮。
1.2 炮制辅料米醋，恒立牌镇江米醋，镇江市润州区恒运酱醋厂出品，总酸度为3.5%。
1.3 炮制品制备
1.3.1 药典法炮制品制备取青皮片或丝，以每100 kg加醋15 kg的比例拌匀，闷透，置锅内，炒至微黄色，取出，放凉。
1.3.2 本研究新法炮制品制备（中试样品）
净制：将个青皮、四花青皮挑去发霉、破瓣杂质等不合格药材。
切制：将净四花青皮药材放入洗药机内，用慢速洗2 min左右，放入筐内闷润，其间再用水冲1～3次，闷1 h后切2 mm左右丝。
个青皮：取净个青皮放洗药机内慢速洗涤，取出放筐内闷润4 h左右，其间用水冲3～4次，然后切2～3 mm厚片。
醋炒青皮：将个青皮片和四花青皮丝分别称重，加15%米醋拌匀，闷7～10 min左右。四花青皮以投药底锅温140℃左右炒10 min。个青皮以投药底锅温145～150℃分别炒10 min左右，出锅，阴凉处晾晒。以上样品均放通风处阴干。
1.4 仪器及试剂
惠普1100单泵高效液相色谱仪，Waters600单泵高效液相色谱仪。橙皮苷、辛弗林、N-甲基酪胺（中国药品生物制品检定所提供），硅胶G（自制），甲醇为色谱纯及分析纯，其他试剂均为分析纯。
2 方法与结果
2.1 青皮饮片性状研究
2.1.1 青皮药材
个青皮：呈类球形，直径0.5～2 cm。表面灰绿色或黑绿色，微粗糙，有细密凹下的油室，顶端有稍凸起的柱基，基部有圆形果柄痕。质硬，断面果皮黄白色或淡黄棕色，厚1～2 mm，外缘有油室1～2列。瓣囊8～10瓣，淡棕色。气清香，味酸、苦、辛。
四花青皮：果皮剖成4裂片，裂片长椭圆形，长4～6 cm，厚1～2 mm。外表面灰绿色或黑绿色，密生多数油室；内表面类白色或黄白色，粗糙，附黄白色或黄棕色小筋络。质稍硬，易折断，断面外缘有油室1～2列。气香，味苦、辛。
2.1.2 青皮饮片性状
生四花青皮丝：类半圆形薄片或成规则丝状。表面黄白色或淡黄棕色，外缘有油室1～2列。外表面灰绿色或黑绿色。气清香，味苦、辛。
生个青皮片：个青皮饮片多为直径0.5～2 cm环形薄片，表面黄白色，外缘有油室1～2列，可见瓤囊，周边灰绿色或黑绿色。气清香，味酸苦、辛。
2.1.3 醋青皮形如青皮丝或片，色泽加深，微有醋气。
2.2 粉末显微特征
2.2.1 青皮饮片粉末淡灰棕色。中果皮薄壁组织众多，细胞形状不规则，壁稍增厚，有的作连珠状。果皮表皮细胞表面观多角形或类方形，垂周壁增厚，气孔长圆形，直径20～28 μm，副卫细胞5～7个；侧面观外被角质层，靠外方的径向壁稍厚。草酸钙方晶存在于近表皮的薄壁细胞中，呈多面形、菱形或方形，直径8～28 μm，长24～32 μm。橙皮苷结晶棕黄色，呈半圆形、类圆或无定形团块。螺纹、网纹导管细小。其中个青皮果皮表皮细胞壁较薄。
2.2.2 醋青皮与生品差异在于部分表皮细胞壁呈棕色。
显微特征图省略。
2.3 薄层鉴别取个青皮、四花青皮生品、炮制品粉末各0.3 g（大生产10批样品），加甲醇10 ml，超声20 min，滤过，取滤液5 ml，浓缩至约1 ml，作为供试品溶液。另取橙皮苷对照品，加甲醇制成饱和溶液，作为对照品溶液。吸取供试品溶液2 μl，对照品溶液10 μl，点于同一用0.5％氢氧化钠溶液制备的硅胶G薄层板上，以醋酸乙酯甲醇水（100∶17∶13）为展开剂，展至约3 cm，取出，晾干，再以甲苯－醋酸乙酯甲酸水（20∶10∶1∶1）的上层溶液为展开剂，展至约8 cm，取出，晾干，喷以三氯化铝试液，至紫外光灯（365 nm）下检视。供试品色谱中，在与对照品相应的位置上，显相同颜色的荧光斑点。见图1～2。
2.4 检查
2.4.1 水分测定
按2000年《中国药典》附录IX H53页。测定青皮生品、炮制品结果见表1～2。
2.4.2 总灰分及酸不溶性灰分测定按2000年《中国药典》附录IX J54页。总灰分测定、酸不溶性灰分测定结果见表1～2。
2.4.3 浸出物测定
按2000年《中国药典》附录XA 63页。测定结果见表1～2。表1 个、四花青皮生品中总灰分、酸不溶性灰分、水分、浸出物含量（略）表2 醋个、四花青皮中试品中总灰分、酸不溶性灰分、水分、浸出物含量测定（略）
2.4.4 重金属及农药残留测定重金属测定，农药残留量测定，微生物检查由北京谱尼理化分析测试中心测试，方法略。结果见表3。表3 醋个、四花青皮中试品中重金属、农药残留量、微生物测定（略）
2.5 含量测定橙皮苷测定方法见文献［1］；辛弗林和N-甲基酪胺测定方法见文献［2］。
2.5.1 高效液相色谱条件色谱柱：填料为Kromasil-C18，5 μm，4.6 mm×250 mm（北京分析仪器厂填装）；橙皮苷 流动相：甲醇-水-醋酸乙酯（35∶61∶2）；柱温35℃；检测波长284 nm；流速1.0 ml/min。
辛弗林N-甲基酪胺 流动相：甲醇-水-十二 烷基硫酸钠（55∶45∶0.1）；检测波长275 nm；流速1.0 ml/min。
2.5.2 对照品溶液的制备橙皮苷 精密称取橙皮苷对照品2.57 mg，置于25 ml容量瓶中。精密量取3 ml置10 ml容量瓶中，50%甲醇定容，备用。
辛弗林、N甲基酪胺 取对照品适量，加30%甲醇，配成辛弗林、N-甲基酪胺浓度均为0.02 mg/ml，备用。
2.5.3 供试品溶液制备橙皮苷 ：取不同产地，不同品种青皮样品粉末(过80目)约30 mg，精密称定，置50 ml锥形瓶中，精密加甲醇25 ml，超声处理30 min。放冷，过滤，精密量取续滤液3 ml，置于10 ml容量瓶中，50%甲醇稀释至刻度，摇匀，用微膜（0.45 μm）滤过。测量不同产地青皮生品、炮制品中橙皮苷的含量。
辛弗林、N-甲基酪胺 ：取样品约0.1 g，精密称定。准确加30%的甲醇溶液25 ml，称定，超声30 min，补至原重，混匀，过滤（0.45 μm），取续滤液即得。
2.5.4 测定
分别精密吸取上述对照品溶液与供试品溶液各20 μl注入液相色谱仪，测定峰面积，计算含量，测定结果见表4～5。表4 中试青皮生饮片中各成分的含量（略）
表5 中试醋青皮中各成分的含量（略）
3 讨论
青皮炮制前后在饮片性状和粉末显微特征方面的主要区别在于，炮制后醋青皮饮片色泽加深，呈微黄色，有焦斑，并微有醋香。炮制后醋青皮粉末颜色较生品加深，呈灰棕褐色，部分表皮细胞壁呈棕色。
四花青皮与个青皮饮片差异在于，个青皮饮片可见瓤囊（心皮室隔组织）；显微镜观察粉末个青皮果皮表皮细胞壁较薄。
四个成分含量测定表明，青皮醋制品中挥发油比生品下降10%左右，其它成分，生制品含量基本变化不大。
本研究新建立的两个成分含测方法，具简便、准确、重复性好的特点，可为制定青皮、醋青皮质量标准提供依据。
参考文献
微生物方法学研究范文5
【关键词】 检验医学;医学实验室;认可
检验医学[1] (Laboratory Medicine)是现代实验室科学技术与临床在高层次上的结合,是一门多学科交叉,相互渗透的新兴学科,目前正朝着高理论、高科技、高水平方向发展。在全球一体化的背景下,中国检验医学必须加速前进的步伐,卫生部临床检验中心主任申子瑜说,最重要的是加强管理和发展技术,管理要实现标准化和规范化。
2003年2月,ISO了ISO15189《医学实验室质量和能力的专用要求》,成为医学实验室认可的专用准则, “医学实验室”在ISO 15189国际标准中的定义为:以为诊断、预防、治疗人体疾病或评估人体健康提供信息为目的,对来自人体的材料进行生物学、微生物学、免疫学、化学、血液免疫学、血液学、生物物理学、细胞学、病理学或其他检验的实验室。
1 实验室认可对检验医学的推进作用
ISO15189对医学实验室的定义,从技术和管理要求两大方面提出了要求。在技术方面,对人员、设备、设施等要素以及检验程序和结果报告等要点做出了规定;在管理上,描述了实验室组织和管理、质量管理、服务意识要素等方面的要求。本院的各级医学实验室(临床实验室)也就是检验科都应按照ISO15189所要求的去执行。
1.1 技术方面
1.1.1 人员的变化 ISO15189对检验工作者有了更高的要求,检验工作不仅仅是接受标本发出报告这样简单的内容,还要对患者的诊断、治疗起的重要作用,显示出从医学检验到检验医学上对工作人员的要求的变化。这就要求检验科有高素质的人才。2003年10月,中国医师协会检验医师分会的正式成立标志着检验医师的诞生。检验医师是检验与临床的桥梁,既懂临床又懂检验的医师才是适应现代医学发展要求的人才。检验医师会更密切接近健康和亚健康状况人群,通过对人体营养物质代谢现场检验途经,对人们保健、预防、康复做出保健营养方面的指导。
1.1.2 新的仪器及新的技术的应用 当前,临床医学对于检验数据的依赖越来越强,检验医学的发展是临床快速诊断的重要保障。全实验室自动化(total laboratory automation, TLA),大大提高了工作的效率,节省了工作时间,缩短了结果报告的时间。实验向快速、简便的方向发展,尤其以床边检测大大方便了患者。分子生物学技术(基因克隆技术、生物芯片、飞行质谱)免疫标记技术,生物传感器,流式细胞术等技术的应用也给检验医学带来了新的方向,为学科的发展提供机遇。
1.2 管理方面
1.2.1 科室正确的组织和管理是科室良性惯性运行的重要保证 科室的管理要求科主任必须在检验科建设中起带头作用,在日常工作、学科建设、人才培养上不断的进步,创新,而且新医改提出把工作重点从治病救人向预防疾病转移,这样检验医学、体外诊断的重要性就越发凸显,这样就对实验室的管理提出了更高的要求,贯彻ISO15189有助于检验科达到这些要求。
1.2.2 质量管理 质量是科室的生命。ISO15189文件的核心是医学实验室全面质量管理体系,强调医学检验的分析前、中、后全过程的管理。适当的标本收集与运送以保证分析前质量控制;如何从临床那里获得患者资料、病情变化、治疗方案,保证分析后的质量评估,并对临床的诊治工作提出建议是检验医学的重要内容[2]。尤其是分析前的质控,数据显示2006 年国外医院实验室出现错误结果,分析前产生的误差占总误差的46%～68.2%。ISO15189 中有很好的流程管理方法,可以做好与临床医师、护士的沟通,减少误差,确保结果的准确。
1.2.3 服务意识 一生从事检验医学研究的法国著名学者克洛德•贝尔纳[3] (Claude Bernard)说过:医学只有依靠实验分析这条唯一的道路,才能认识现象的确定性。第四届中国检验医师大会上也提出“检验与临床结合是检验医学发展的必由之路”。检验科不再是微不足道的辅助科室,临床检验的各项数据都为临床诊断治疗提供了可靠的依据。随着分子生物诊断的应用,越来越多的检测成为临床诊断的“金标准”,2009年的H1NI甲流病毒出现后,用病毒分离鉴定及核酸诊断技术成为确诊甲流金标法。检验医学越来越来越凸显起在临床上的作用,向ISO15189所描述的“以为诊断、预防、治疗人体疾病或评估人体健康提供信息为目的”更好的为患者服务,同时也为健康人群的体检做出正确的评估。
循证检验医学就是按照循证医学“以当前最好的证据为基础”的原则,用临床流行病学的方法学规范检验医学的研究设计和文献评价、用当前最好的检测技术和质量控制体系对检测结果进行严格的质量控制和评价,其任务是向临床医师提供反映患者真实情况的证据[4]。丛玉隆也提到:“组合不合理是老百姓看病难、看病贵的突出问题。所以要对实验项目方法学研究、临床意义探讨,与临床共同寻求、制订最有效、最合理、最经济的检验项目组合”。要发展循证检验医学,检验工作者要更多的关注检验方法的评估,检验与临床的沟通以及检验结果对健康的影响,更好的为患者和临床服务。
2 医学实验室认可的必要性
在ISO/IEC 17011:2004《合格评定-对认可合格评定机构的认可机构的通用要求》中对认可给出了最新的定义:“正式表明合格评定机构具备实施特定合格评定工作的能力的第三方证明”。2005年6月,中国实验室国家认可委员会(CNAL)消息,《医学实验室-质量和能力的专用要求》(ISO15189)认可活动已被纳入《国际实验室认可合作组织相互承认协议》(ILAC-MRA)中,这就是说我国的临床实验室如果采用ISO15189实施质量和能力的管理,并且能够通过CNAL的认可,就表明的我国的医学实验室和国外的医学实验室在管理上处在同一水平,而且能被国际认可。
医学实验室认可是实验室认可发展的必然结果,是检验医学进步的标志。医学实验室认可也是社会发展、进步的必然趋势,医学实验室的质量、能力和安全直接影响社会的稳定与和谐。医学实验室是疾病诊断和防治的技术平台,其对疾病防控的意义不可估量。医学实验室认可是全球化进程的结果,经认可的医学实验室可以进行结果互认,避免了对患者的重复检测。
3 医学实验室认可的发展
3.1 首个国家认可机构 1947 年,第一个国家实验室认可机构澳大利亚国家检测机构协会 (NATA), 英国、美国、新西兰、中国等相继成立了国家实验室认可机构;1999 年 12 月, ISO 和 IEC 共同发表了 ISO/ IEC17025 《检测和校准实验室能力的通用要求》作为《实验室认可准则》,包括医学实验室在内的各行业的实验室开始了实验室的认可工作;2003 年 2 月, ISO 又了 ISO15189 《医学实验室质量和能力的专用要求》,成为医学实验室认可的专用准则。
3.2 我国的概况 2006年3月31日,中国合格评定国家认可委员会(CNAS)在京成立,可以对医学实验室认可工作。CNAL 从 2004 年 7 月 1 日 起开始受理依据 ISO15189 的认可申请,总医院( 301 医院)临床检验科经过 3 年多的积极准备, 2005年6月通过了由CNAL组织的专家现场评审,成为我国第一家依据ISO15189为准则申请认可的医学实验室。ISO15189已经转化为我国的国家标准GB/T22576,将于2010年2月正式开始实施,ISO15189转化为国家标准将是《医学实验室质量和能力的专用要求》在中国推行的一次里程碑。
4 结论
我国的医学实验室众多,彼此之间的技术能力和经济能力差距大,地区间发展不平衡。在我国现阶段,实施强制认可的条件还不完全具备。但是没有能力和条件进行认可的实验室,也要按照ISO15189的要求去执行,促进检验医学的良好发展。
参 考 文 献
[1] 苑凤君.检验医学与临床医学紧密结合的重要性和必要性. 中华现代临床医学杂志,2004,2(8b).
[2] 丛玉隆,朱士俊. 检验医学面临的挑战与学科建设和管理.
微生物方法学研究范文6
【关键词】 广藿香油；藿香油；综述
广藿香油又称百秋李油，是从唇形科刺蕊草属植物广藿香Pogostemon cablin(Blanco)Benth.中提取的挥发油，是广藿香的主要药用成分。藿香油是从唇形科藿香属植物(土)藿香Agastache rugosa (Fisch.et Meyer)O.ktze中提取的挥发油，是常见的天然香料。两者来源不同，但目前在应用上有人不加以区分。这一做法是否合理？两者是否可以混用？为此，笔者将从历史沿革、成分研究、药理研究和安全性研究进行简要综述，以期为广藿香油及藿香油的合理运用提供依据。
1 历史沿革
目前，广藿香油与藿香油出现混用的状况与历史上广藿香与(土)藿香的混用有很大关系，因此，有必要弄清楚中药材发展史上广藿香与藿香的关系。中医处方中的藿香，均以藿香名之，更未明确规定其品种[1-2]。一般认为，广藿香和(土)藿香是中药材藿香的2个不同品种。自宋金元以来，本草著作中记载的藿香均为广藿香，而明代以来一些本草著作中记载的藿香则为(土)藿香[3]。有学者则认为广藿香与(土)藿香混用是因为地方用药习惯不同而混淆药名[4]。目前，广藿香多以其挥发油或全草配合其他中草药组成复方使用。从历年版《中华人民共和国药典》(以下简称“《药典》”)收载情况来看，只有1977版《药典》同时收载(土)藿香和广藿香[5]，以后各版《药典》均只收载广藿香，而2005版《药典》更是将广藿香油列入植物油脂和提取物项下单独收载[6]。由此可见，广藿香才是药用藿香的正品。实际上，藿香在我国历史上最初并非作为药物，而是作为香料为人们所应用[3]。直至现代，广藿香油和藿香油作为天然香料亦受到国内外香精香料研究工作者的重视。为进一步开发广藿香油和藿香油，必须对两者加以深入研究。
2 成分研究
2.1 广藿香油
对广藿香油成分的研究分析开展较早，且随着气相色谱(GC)、气-质联用(GC-MS)技术的普及，挥发油的分析越发简便。张氏等[7]运用GC-MS法从广藿香挥发油中分出了55个成分，鉴定了其中24个，其中广藿香醇含量达31.86%。王氏等[8]运用GC-MS从高产广藿香挥发油中分出64个化学成分，并鉴定了其中31个，其中广藿香醇含量为31.66%，广藿香酮含量为23.58%。
随着研究的不断深入，研究者们分别对不同产地、不同采收期的广藿香挥发油进行了研究。罗氏等[9]运用GC-MS联用技术比较了不同产地、不同采收期的广藿香挥发油的主要成分含量，并根据挥发油成分的不同，将不同产地的广藿香分为2个化学型，即广藿香酮型和广藿香醇型。在广藿香挥发油质量控制方面也有相关报道，魏氏等[10]通过GC-MS法对不同采集期石牌广藿香及其他产地的广藿香挥发油进行比较分析，建立了石牌广藿香挥发油的指纹图谱。
以上文献及大量相关的研究表明，广藿香油的主要成分有2个，分别是广藿香醇(Pachouli alcohol)和广藿香酮(Pogostone)。两者在广藿香挥发油中的相对含量按品种和产地不同有一定的差异。其结构式如下：
2.2 藿香油
目前国内对藿香油的研究较少，而国外对藿香属植物的挥发油成分研究较多。Fujita等[11]对日本境内的藿香进行研究，发现在大阪、兵库县附近生长的藿香A.rugosa var.hypoleuca Kudo的挥发油成分主要为甲基胡椒酚(Estragole，占总量的90%)，在北海道采集的藿香A.rugosa var. methyleugenolifera Fujita挥发油的主要成分则为丁香酚甲醚(占总量的80%以上)。王氏等[12]采用GC-MS联用技术，分别对采自湖北巴东县、河南郑州郊区与河南栾川县的藿香A.rugosa挥发油进行研究，发现产自巴东及郑州的藿香挥发油主要成分均为甲基胡椒酚，而产自栾川的藿香挥发油主要成分则为丁香酚甲醚。通过研读国内外关于藿香挥发油研究的文献，可以认为，绝大多数藿香挥发油的主要成分均为甲基胡椒酚。其结构式见图3。
3 药理研究
3.1 广藿香油
国内对广藿香油的药理研究较为广泛，赵氏等[13]研究了广藿香油对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响和对醋酸引起扭体实验的影响，研究了广藿香油的抗炎、镇痛作用。有学者研究认为，藿胆丸中广藿香油具有抗炎、抗过敏的作用[14-15]。苏氏等[16]对11种真菌和5种细菌进行了体外抗菌实验，结果表明，广藿香油对黄曲霉和黑曲霉的抑制能力较差，但对新型隐球菌、球毛壳霉和短柄帚霉的生长抑制比较显著，其最低抑菌浓度(MIC)低于0.11 mL/L，预示其具有治疗艾滋病患者(AIDS)并发隐球菌感染及新型隐球菌引起的肺炎、慢性脑膜炎的前景；对能感染身体任何部位的白色念珠菌的抑制能力也比较好(MIC为0.14 mL/L)；而对小孢子菌的抑制有助于治疗表皮癣菌病。
在抗细菌实验中，除大肠杆菌外对4种细菌都较为敏感，表明广藿香油具有较强的抗菌活性。刘氏等[17]对以广藿香油为主要成分的藿香正气水进行的药理研究表明，广藿香油对豚鼠离体十二指肠自动收缩及对组胺、乙酰胆碱(Ach)、氯化钡所致的回肠收缩均有良好的抑制作用，也能对抗垂体后叶素引起的子宫平滑肌收缩。国外对广藿香油的研究也散见于相关文献。Osawa等[18]报道，广藿香油可抑制放线杆菌属、梭杆菌属、噬二氧化碳细胞菌属、埃肯菌族及类杆菌属等多种牙周病菌。Pattnaik S等[19]发现，广藿香油对20种细菌和12种真菌具有抑制作用。Wei A等[20]报道广藿香油中的百秋李醇具有显著的抗氧化活性。Yang Y等[21]研究发现广藿香油具有止吐作用。
3.2 藿香油
国内比较少见对藿香油的单独研究。Shin S等[22]对藿香油及其中的主要成分Estragole进行了相关研究，发现藿香油及甲基胡椒酚都对真菌表现出明显的抑制作用；另一项研究则发现，甲基胡椒酚对念珠菌有抑制作用。Friedman M等[23]在一项抗菌物质筛选实验中发现，甲基胡椒酚对空肠弯曲杆菌、大肠杆菌、单核细胞增多性李司忒(氏)菌和沙门氏菌都表现出明显的抑制作用。
3.3 广藿香油与藿香油抗菌作用比较
杨氏等[24-25]通过研究广藿香油与藿香油对16种皮肤细菌的体外抑制作用发现，藿香油抗菌作用很弱，干燥棒杆菌、固着微球菌和莫拉氏菌3种最敏感的菌种在油浓度高达1500 μL/L时仍表现出与对照组细菌几乎相同的生长速度和菌落特征；而广藿香油在药物培养基小于400 μL/L时仍可完全抑制16种供试菌当中的13种。结果更显示，广藿香挥发油在某种浓度下能抑制异源或负责菌的生长繁殖，而不破坏正常微生物的生态平衡。在另一项研究广藿香油与藿香油对12种皮肤癣菌和条件致病真菌的体外抑制作用中，发现2种油都可以选择性地完全抑制皮肤癣菌的生长繁殖，而对条件致病菌的生长繁殖几乎没有影响，其中广藿香油表现出对皮肤癣菌很好的特异选择性抑制作用(MIC为50～400 μL/L)。而藿香油对皮肤癣菌抑制作用较弱(MIC为700～1000 μL/L)。
4 安全性研究
4.1 广藿香油安全性研究
迄今尚未发现广藿香油或其主要成分广藿香酮及广藿香醇的相关安全性研究报道。2005版《药典》并未明确规定其用量，只是要求按具体处方量添加[7]。在常用的藿香正气制剂中，包括藿香正气口服液、藿香正气水、藿香正气软胶囊，在2005版《药典》中均以广藿香油替代[26]。
4.2 藿香油安全性研究
目前，国内关于藿香油安全性研究的报道多为翻译或参考国外资料。国外报道较多的主要为藿香油中主要成分Estragole的安全性数据。在致癌性研究中显示，长期饲服甲基胡椒酚或皮下注射、腹腔内注射甲基胡椒酚均证实其具有致癌性，且多为肝脏肿瘤；研究还发现，甲基胡椒酚的1-羟基代谢物具有更强的致肝癌性[27-28]。在致突变性研究中显示，Ames试验中对大多数菌株均有致突变性[29-30]。其他研究发现，甲基胡椒酚的代谢产物(1-羟基甲基胡椒酚等)可在体内及体外形成肝脏DNA加合物[31-32]。在药物动力学及药物代谢学研究中则发现，甲基胡椒酚的代谢途径有2种：一种是以CO2为最终代谢产物排泄；另一种是以1-羟基甲基胡椒酚为最终代谢产物排泄[33-34]。两种代谢途径同时存在，并与给药剂量有关。
5 小结
上述研究表明，广藿香油与藿香油来源于同科不同属植物的提取物，化学成分和药理作用明显不一样。广藿香油主要含广藿香醇及广藿香酮(总量占40%以上)，不含甲基胡椒酚，具有抗炎、抗过敏、提高免疫、抗菌、镇痛、抗痉挛、抗氧化、止吐等作用，且无不良反应报道，在中成药中大量应用；藿香油主要含甲基胡椒酚(占80%以上)，不含广藿香醇及广藿香酮，虽有抗菌作用，但逊于广藿香油；具有抗菌、解痉、镇静及升高白细胞的作用，但存在致癌和致突变的安全性问题，目前未见在药品中应用。特别值得关注的是，广藿香和藿香在中药处方中曾有混用的历史，现在仍在混用；而广藿香油及藿香油应用范围涵盖了药品、食品、香料等领域，在使用过程中必须对两者的安全性加以考虑，区分运用。目前，国内常用广藿香油替代广藿香和藿香用于中成药生产，而非用藿香油替代广藿香和藿香，正是基于药效和安全性的考虑。
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