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微生物的多样性范文1
关键词 人工湿地;桐花;海桑;木榄;微生物;种类;数量
中图分类号[TE99] 文献标识码A 文章编号 1674-6708(2010)26-0097-02
0 引言
人工湿地是由人工基质和生长在其上的植物组成,形成一个独特的基质――植物――微生物生态系统,将微生物和植物的净化能力结合在一起,成为一个高效的净化系统,它在保护生态环境和节约能源及投资方面具有传统二级生化处理技术难以比拟的优点,作为一项低投资、低能耗、低运行费、高生态环境效益的治理工程技术,它越来越多地受到社会的关注和欢迎。本文通过对人工湿地基质微生物类群数目进行了研究,为进一步深入研究人工湿地净化污水的机制提供了可能。
1 材料和方法
1.1 人工湿地概况
红树林人工湿地污水处理系统位于学校生物园,湿地池容积为3m×3m×0.6m(长×宽×高)。基质为石头,上层石头的直径为2cm,下层石头的直径为1cm,厚度皆为30cm。此人工湿地为潜流型人工湿地,尚未进行污水处理。
1.2 样品采集
采用五点采样法,分别在人工湿地的4个角以及其中心位置采样,深度为15cm,每个样点取5个大小相近的小石头,共25个。装入无菌塑料瓶中,立即带回实验室,在无菌条件下加入50ml无菌水,在摇床上摇匀,制备悬液。
1.3 微生物计数
所有微生物均采用28℃恒温培养。
1.3.1 细菌数量测定
利用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基进行培养,取稀释度为10-5的悬液接种,2次重复,每一平板滴加0.05ml悬液,培养2d~3d。
1.3.2 真菌数量测定
采用马丁氏培养基平板表面涂布法,取原液接种,2次重复,每一平板滴加0.1ml悬液,培养5d。
1.3.3 放线菌数量测定
采用改良高氏1号合成培养基平板表面涂布法,倒平板时在无菌条件下每300ml培养基加另外灭菌的3%重铬酸钾溶液0.5ml。取原液接种,2次重复,每一平板滴加0.05ml悬液,培养5d。
1.3.4 硝化细菌、亚硝化细菌、反硝化细菌数量测定
悬液配置成5个梯度,分别为103、104、105、106、107,3次重复,每一试管接种1ml悬液。培养7d。采用MPN法,进行显色测定。测定方法如下:
硝化细菌:先用格利斯试剂测定,若不呈红色,再用二苯胺试剂测试;若呈蓝色,表明有硝化作用。
亚硝化细菌:用格利斯试剂测定,若有亚硝酸存在呈红色,证明有亚硝化作用。
反硝化细菌:用格利斯试剂及奈氏试剂测定有无亚硝酸和氨存在,若其中之一或二者均呈正反应,均表示有反硝化作用。若格利斯试剂为负反应,再用二苯胺测试,亦为负反应时,表示有较强的反硝化作用。
2 结论
2.1 树植物中三大菌群的数量特征
试验条件下,处理污水前的人工湿地中红树植物基质中微生物三大种类构成为细菌、放线菌、真菌。细菌是土壤微生物中数量最多的一个类群。他们共同协作构成互利共生的系统,发挥整体作用净化污水。
从表1可以看出,细菌在数量上占绝对优势,桐花、海桑、木榄人工湿地污水处理系统细菌数量分别为2.05×108cfu/g(基质)、2.63×108cfu/g(基质)、2.06×108cfu/g(基质);放线菌数量分别为9.30×102cfu /g(基质)、14.8×102cfu /g(基质)、8.20×102cfu /g(基质);真菌分别为1.20×102cfu /g(基质)、2.15×102cfu /g(基质)、3.65×102cfu /g(基质)。可以推断, 桐花、海桑、木榄对微生物的种类和数量具有某种选择作用。
出现此类现象的原因如下:
1)微生物的生态分布与各类微生物的生物学特性有关。一般情况下,细菌喜欢湿润,能耐受低氧水平;真菌耐干,不能耐受低氧水平;放线菌具有喜热耐旱的特性,只有当各类微生物竞争的压力减少时才出现,因而处于厌氧条件下的人工湿地中的微生物主要由细菌组成。
2)在红树林生态系统中也有出现放线菌、真菌数量稀少的现象,这也可能是其中一个原因,但对其机制尚未弄清,而且红树林生态系统处于潮间带,其土壤生境兼有海洋与陆地的性质而又不同于它们,与人工湿地的生境不相同,因此,对于两种系统会出现相似现象的原因尚待进一步研究和探索。
2.2 硝化细菌、反硝化细菌的数量特征
从表2可以看出,桐花、海桑、木榄人工湿地污水处理系统中反硝化细菌数量分别为1.65×104MPN/g(基质)、9.1×104MPN/g(基质)、77.90×104MPN/g(基质);硝化细菌数量分别为2.75×102MPN /g(基质)、5.0×102MPN /g(基质)、10.79×102 MPN/g(基质);亚硝化细菌数量为0.75×102MPN /g(基质)、2.82×102MPN/g(基质) 、1.30×102MPN /g(基质)。反硝化细菌数量多于硝化细菌和亚硝化细菌。其原因如下:1)通常硝化细菌是自养型好氧微生物,依靠NH4+-N 和NO-2的氧化获得能量生长,需要氧气作为呼吸的最终电子受体。反硝化细菌在缺氧和低溶解氧条件下利用有机物的氧化作为能量来源,以NO-3和NO-2作为无氧呼吸时的电子受体。所以,厌氧条件下的人工湿地中反硝化细菌繁殖快,生长迅速,硝化细菌繁殖慢,生长缓慢;2)硝化自养菌是专性化能自养细菌,它包括硝化细菌和亚硝化细菌两个亚群,硝化作用由两个阶段组成(阶段一:2NH4++3O2NO2-+2H2O+4H+,阶段二: 2NO2-+O22NO3-):在亚硝化细菌的作用下,将NH4+-N转化成NO-2-N;在硝化细菌的作用下,将NO-2-N转化成NO-3-N。正是由于这种生态学上的偏利互生关系的存在,使得硝化细菌的生长总要晚于亚硝化细菌。
参考文献
[1]靖元孝,杨丹菁,陈章和,陈兆平.两栖榕在人工湿地的 生长特性及其对污水的净化效果[J].生态学报,2003(3).
微生物的多样性范文2
[关键词] 确定依据 自然保护区 保护范围 外来物种引进 措施 法律制度
1992年将生物多样性定义为:指所有来源的活的生物体中的变异型,这些来源除其他外包括陆地,海洋和其他水生生态系统及其构成的生态综合体;这包括物种内,物种之间和生态系统的多样性。自此,各种关于生物多样性保护的思想和活动应运而生,其中,确定生物多样性保护对象的范围及其依据已经是当今理论界研究的一个热点问题,并且成为我国生物多样性保护立法的基础和首要任务。
一、我国生物多样性保护的依据
1.生物多样性的决定因素及保护生物多样性的目的
生物多样性，取决于生态系统中生物链的稳定性。而生物链的稳定性又是由环境决定的, 因此,生物多样性的状况最终由其生存环境和整个生态系统决定。关于生物多样性保护的目的,使物种在自然系统中充分发挥各自的作用,结构性和功能性得以保证,从而维持整个生态系统的稳定和丰富多彩。
2.生物多样性与生态系统
(1)生物多样性与生态系统的理论关系
目前,我国生物多样性保护主要集中在濒危物种上,而事实证明,我们未来的工作必然转向生态系统功能上。保护生物多样性的目的是为了整个生态系统的平衡和人类的可持续发展，生物多样性的价值不仅体现在濒危物种上，更重要的体现在生态系统和与人类的关系上。人们关心生物多样性的丧失对人类生存的威胁，首先会注意到最易灭绝的物种上, 越是濒危越重要,这一点是非常合理的, 然而,随着实践的发展,人们便会认识到物种与森林保护、湿地保护和生物圈等有着更为重要的关系生物多样性与生态系统的平衡才是最终目标。
(2)自然保护区在生物多样性保护中的有效性分析
自然保护区是指为了保护珍贵和濒危动、植物以及各种典型的生态系统，保护珍贵的地质剖面，为进行自然保护教育、科研和宣传活动提供场所，并在指定的区域内开展旅游和生产活动而划定的特殊区域的总称。世界各国划出一定的范围来保护珍贵的动、植物及其栖息地已有很长的历史渊源，一般都把1872年经美国政府批准建立的第一个国家公园――黄石公园看作是世界上最早的自然保护区。20世纪以来自然保护区事业发展很快,目前全世界自然保护区的数量和面积不断增加，并成为一个国家文明与进步的象征之一。截止2007年,中国也已建立各级自然保护区900多处，大家普遍认为,自然保护区在涵养水源、保持水土、改善环境和保持生态平衡等方面发挥了重要作用,特别是对濒危,珍稀物种的繁殖、驯化贡献尤为重大.而我认为,看到自然保护区效果的同时其负面影响也值得探讨:这种保护技术虽然在短期内起到了保护物种生存的目的,但它将动物与其自然栖息地隔离开来,不同程度的干扰了生态进程, 物种与环境,物种与物种之间的演化过程就此消失,是目前生物多样性保护的一个严峻挑战.以大熊猫保护为例,建立专门的保护区使其在一定程度上回归了自然生态环境,在人工帮助下繁衍生息,但本质仍是被保护而非自然生存状态,它作为生态系统元素的一部分,功能并没有得到发挥,其野性和生存能力不是加强了,而是大大减弱了,长远看来,反而不利于其未来的发展.此外,自然保护区的经营和管理也已出现问题,主管部门较多 ,各自为政,影响了整体规划;许多保护区由于国家和地方政府没有提供足够的经费，而不得不面对现实，通过各种途径增加收入, 把开发利用保护区的旅游资源与其他生物资源作为保护区增加收入的主要途径;部分地区由于资源紧张,还出现了居民和保护区争夺资源使用权的现象，这些因素都影响了保护生态环境,保护物种目的的发挥,因此, 自然保护区的有效性问题至得认真商榷。
3.生物多样性的区域性
(1)生物多样性的区域性理论
不同的物种适应不同的地理和气候条件,生物多样性保护并不意味着地球上每一个角落的生物都一样多,结构都完全相同。不同地区都有适合其条件而生长的物种,该物种在此地数量多起积极作用,在另一地方则可能相反。例如外来物种入侵问题,由于人们对物种特性的不了解,致使某个物种的引进对当地生态。系统造成了极为严重的破坏。由此可见,物种的区域性本身就是生物多样性保护的一个重要方面。
(2)外来物种引进在生物多样性保护中的有效性分析
为了生物多样性保护工作的开展,一段时间内我们便将引进外来物种作为快速增加物种数量的重要手段,这种方法短期内看似有效,却带来了一个长远和影响深刻的大问题,即外来物种入侵: 生态系统是经过长期进化形成的，系统中的物种经过上百年、上千年的竞争和适应，才形成了现在相互依赖又互相制约的密切关系。一个外来物种引入后，有可能因不能适应新环境而被排斥在系统之外，必须要有人的帮助才能勉强生存；也有可能因新的环境中没有相抗衡或制约它的生物而成为真正的入侵者，打破平衡，改变或破坏当地的生态环境。以“紫色恶魔”的凤眼莲即俗称的“水葫芦”为例,1884年，原产于南美洲委内瑞拉的凤眼莲被送到了美国新奥尔良的博览会上，来自世界各国的人见其花朵艳丽无比，便将其作为观赏植物带回了各自的国家，殊不知繁殖能力极强的凤眼莲便从此成为各国大伤脑筋的头号有害植物。在非洲，凤眼莲遍布尼罗河；在泰国，凤眼莲布满湄南河；而美国南部沿墨西哥湾内陆河流水道，也被密密层层的凤眼莲堵得水泄不通，不仅导致船只无法通行，还导致鱼虾绝迹，河水臭气熏天；而我国的云南滇池，也曾因为水葫芦疯狂蔓延而被专家指称患上了“生态癌症”。由此可见,盲目引进外来物种,不仅不能促进生物多样性保护工作的开展,严重的情况下还可能发展为一场生态灾难。
二、我国生物多样性保护的范围
生物多样性保护对象的范围包括哪些,主要有两种观点:一种认为,保护生物多样性就是要采取措施保护濒危及珍稀物种,减小物种灭绝速度.另一种则认为, 保护生物多样性，那就是保护所有生物,任何物种都不应从生态系统中消失.这两种观点都是片面的,确定生物多样性的保护对象必须有科学的依据,以下两个问题值得大家商榷:
1.是否每一个物种都应受到保护
从各类研究数字可以看出,生物多样性保护的现状是不容乐观的,过去60万年间10万种左右的物种才消失,而现在每一个小时就会消失一种生物,物种灭绝的速度是相当惊人，自1600年以来， 人类已经导致75%的物种灭绝。由此,许多人提出,保护生物多样性就是要保护地球上所有存在的物种,使物种的数量保持在最大数目.我认为这一点是需要认真考虑的:从进化论而言，每一个物种在长期进化过程中能保存下来，都有它的合理性.但同时,自然界也遵循自然选择的规律,随时淘汰那些不符合环境,地理状况及气候物种,达到自然状态的最优化.生态系统中所有物种都是彼此联系的，但它们的作用并不完全相同,某一个物种灭绝、或者濒危，并不足以使生态系统发生根本性的改变，关键还要看灭绝或濒危的是什么样的物种,因此,保护生物多样性并不是简单的保护所有物种,而是要尽可能的减少人类活动对自然和环境的影响,使不该灭绝的物种降低灭绝的危险。
2.物种的保护应注重量和质的结合
目前,我国已经采取许多措施开展生物多样性保护工作,取得了明显效果,所建的自然保护区涵盖了我国70%的陆地生物系统、80%的野生动物和60%的高等植物，使绝大多数珍稀濒危野生动植物得到保护.我们在保护物种上做出的成绩值得肯定,另一方面,还应该充分认识到物种质量的重要性.保护生物多样性不单单是盲目的维持和增加物种的绝对数量,还要考虑物种的未来发展,其年龄结构必须合理,性别结构必须稳定,优势基因必须发扬,从整体上提高物种的质量,才能适应环境的变化和生态系统本身的需求。
三 我国生物多样性保护应采取的措施
保护生物多样性是我国目前的一个重要任务,确定好生物多样性保护的对象及其依据,完善相关法律制度首当其冲,我认为,实践中应该对各个物种的情况具体分析,采取不同的保护措施:
1.就地保护:为了保护生物多样性，把包含保护对象在内的一定面积的陆地或水体划分出来，进行保护和管理。就地保护的对象，主要包括有代表性的自然生态系统和珍稀濒危动植物的天然集中分布区等. 目前，全世界的生态专家已经得到一个共识，如果你要去保护野生动物，那么最好的理念就是在野生动物的家乡、原始栖息地去保护它。比如说保护大熊猫，不是将其放在动物园里,而是将它放到保护区内更为合理。当然,待情况转好后,大熊猫的最后归宿不是被人们养起来,而是被放归大自然自由生存.就地保护是现今我国最重要,涉及面最广的一项保护措施。
2.迁地保护:为了保护生物多样性，把因生存条件不复存在，物种数量极少或难以找到配偶等原因，而生存和繁衍受到严重威胁的物种迁出原地，移入到动物园、植物园、水族馆和濒危动物繁育中心，进行特殊的保护和管理。迁地保护为行将灭绝的生物提供了生存的最后机会,然而,将物种放进动物园,植物园是不是就达到最终目的了,答案是否定的,迁地保护目的是使即将灭绝的物种找到一个暂时生存的空间,待其元气得到恢复,具备自然生存能力的时候,重新回到生态系统中,发挥应有的作用。迁地保护是就地保护的一个重要补充。
3.建立基因库
为了保护生物多样性,人们已经开始了一项新的计划,建立基因库,来实现保存物种的愿望。科技高速发展的今天，我们把各种珍稀动物的胚胎、基因冰冻起阿种措施听起来可以解决一切问题,实践中必须予以严格控制。因为它一定能够程度上挑战了大自然的生存规律,一旦滥用会对人类和生态系统造成无法弥补的后果。
4.为了保证生物多样性保护工作的顺利高效开展,我们必须运用法律手段,完善相关法律制度:第一,补充自然保护区制度,明确保护区的设立和管理体制。第二,建立严格的控制外来物种入侵制度。从维护国家和地区生态安全的角度出发,加强对外来物种引入的评估和审批,实现统一监督管理.如加强生物引种,交通运输,国际货物贸易等分方面的监督,建立生物引进风险评价等。第三,建立基金制度。要有效的保护生物多样性就要有强大的经济基础.有关部门应建立完善的基金制度,保证国家专门拨款,争取个人,社会和国际组织的捐款和援助,为实践工作的开展提供强有力的财力支持。
参考文献:
[1]孙儒泳:《生物多样性的启迪》[M].上海,上海科技教育出版社,2000
[2]胡嘉滨:论我国生物多样性保护和可持续利用法律体系的重构[J].国土与自然资源研究,2006(2)
[3]陈晗霖:我国生物多样性法律保护制度的建立和完善[J].安徽农业科学,2006(3)
微生物的多样性范文3
【关键词】环境工程;DGGE技术;废水生物处理
1.新技术在环境工程生物处理研究中的应用
由于PCR-DGGE技术克服了传统微生物学方法的局限性，自Muvzer等开辟了DGGE在微生物生态领域研究的先河以来，该技术迅速发展成为环境微生物群落结构分析研究的主要手段之一。近年来，DGGE 用于环境微生物种群的研究越来越多，涉及的领域也越来越广泛，在国外DGGE技术已经被广泛用于活性污泥、生物膜等生物处理系统中的微生物多样性检测、微生物鉴定以及种群演替等方面的研究，在国内这方面的应用虽然处于起步阶段，但也成为研究的热点。
1．1在废水生物处理研究中的应用
PCR-DGGE技术在废水生物处理研究中的应用使人们对废水处理过程中微生物群落的变化产生了新的认识。
Lapara等研究了升高温度对废水好氧生物处理过程中细菌群落结构和功能的影响，DGGE分析细菌群落的结果表示不同温度下有不同的细菌群落。
应用PCR-DGGE方法，对在相同的操作条件下分别用低温菌和常温菌接种的两套活性污泥系统中的微生物群落结构的动态变化进行了追踪。由于工艺相同，使得接种的低温菌群和常温菌群在相同的操作条件下，产生了相似的微生物群落结构。随着运行时间的增加，其菌群结构相似程度也越来越高。
硝化作用是废水处理系统中实现氨氮去除的关键步骤。而氨氧化细菌在硝化作用过程中负责将氨氧化为亚硝酸盐，实现亚硝化作用，是硝化过程中必不可少的步骤。但由于氨氧化细菌的生长速率相当低，生物量很少，采用传统的细菌分离培养分析法研究氨氧化细菌相当费时、繁琐。许玫英等采用PCR扩增16SrDNA、扩增功能基因、随机克隆测序等技术，分析处理含高浓度氨氮废水处理系统不同驯化时期的4个活性污泥样品氨氧化细菌的种类和氨单加氧酶的活性，并在国内首次采用PCR-DGGE相结合的技术对样品中总的细菌类群的差异进行研究。结果表明采用PCR-DGGE技术有利于更全面地了解氨氧化细菌的类群和功能，进而改善废水处理系统的处理效果。
应用PCR-DGGE技术对城市污水化学一生物絮凝强化一级处理工艺与传统的完全混合式处理工艺反应池活性污泥样品微生物种群结构进行了对比研究，对同一反应器不同位置微生物分布以及不同工况下的微生物种群结构进行了初步探讨。结果表明两种城市污水处理工艺中微生物种群多样性都相当丰富，但是种群结构相差很大。说明化学生物絮凝处理工艺的微生物作用与成分相近的城市污水处理工艺中微生物作用机理可能存在相当大的差别。
R0wan等采用生物滴滤反应器和生物滤池处理同种废水，运用PCR-DGGE考察了不同反应器中的氨氧化细菌菌群的组成。虽然不同形式反应器或是同一反应器的不同位置中的氨氧化细菌菌群组成不同，但是主要种群是不依赖反应器的形式或是在反应器中所处的位置不同而改变的，也正是这些主要种群在整个处理过程中发挥着重要的作用。
采用PcR-DGGE技术对处理采油废水的水解酸化一缺氧法不同生物反应器中污泥样品进行研究，确定了微生物的优势菌种，并进行了多样性分析，结果显示了在不同环境条件下微生物群落结构的连续动态变化过程。
1．2 在废气生物处理研究中的应用
生物过滤是一种能有效处理恶臭和挥发性有机废气的气体污染控制技术。生物滤池和生物滤塔作为生物处理恶臭气体的简单有效的方法，得到了快速的发展。
采用PCR-DGGE技术研究除臭生物滤池中试装置中分别一处于较强酸性和中性的两种不同运行环境下微生物种群的多样性和生物种群的结构变化。通过扩增细菌16SrRNA基因的V3可变区，结合应用DGGE技术分析除臭生物滤池的生物种群的结构变化，并回收主要的DN段，结合PCR测序及T载体克隆测序，明确优势菌群的系统发育地位。结果表明，除臭生物滤池在不同的口H条件下，微生物的多样性及其丰度存在较大差别，强酸性对微生物具有较高的选择作用，与中性条件相比 微生物种群多样性相对较低。同时在滤池的不同层次上也表现出明显的空间分布多样性差异，序列比对结果显示硫氧化细菌在除臭过程中占有优势地位。为更好地处理恶臭气体提供可靠的科学依据，同时也为生物除臭的应用提供一定的理论基础。
生物滤塔中微生物的种群结构以及微生物多样性对于恶臭气体的处理效率以及反应器的稳定运行至关重要。殷峻等应用DGGE技术对处理含氨废气的生物滤塔中微生物多样性随时间的变化进行了研究，通过比较反应器不同填料、不同时期微生物多样性得出结论：填料中微生物的多样性都随着反应器运行时间的延长而有所减少；与污泥填料和混合填料相比，堆肥填料的微生物多样性程度最高，反应器的去除能力也最好。
1．3 在污泥生物处理研究中的应用
在污泥处理过程中，污泥的稳定化是…个相当重要的过程。微生物的稳定化过程对于系统达到稳定状态具有更直接的指导意义。傅以钢等用DGGE指纹图谱技术对污泥堆肥工艺中的细菌种群动态变化及多样性进行了研究。结果表明，生物法污泥堆肥周期小于8d。对污泥堆肥各工艺环节样品进行DGGE指纹图谱和相似性系数Cs值分析，发现随着反应的持续进行，微生态结构的Cs值越来越高，说明微生物种群结构愈趋稳定。证实污泥微生态能迅速进行优胜劣汰的筛选，调整内部细菌种群结构，从而达至 适应环境的目的，在发酵过程中形成的优势细菌种群能长时间保持稳定。
2.技术的原理
微生物的多样性范文4
关键词：重金属污染；土壤微生物；微生物多样性；研究方法
中图分类号 X172 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）13-0036-03
Study on Soil Microbial Diversity in Heavy Metal Contaminated Soil
Li Yan1 et al.
（1Anhui Huajing Resources and Environment Technology Co.，Ltd.，Hefei 230094，China）
Abstract：In this paper，the research methods of microbial diversity of heavy metal contaminated soils in recent years are summarized，and their advantages and disadvantages and their application are analyzed. The research methods of microbes are also discussed.
Key words：Heavy metal pollution；Soil microbes；Microbial diversity；Research methods
近年来，由于农药、化肥的大量使用，以及冶金、采矿业的迅猛发展，土壤重金属污染日趋严重[1]。重金属污染不仅会严重影响农产品以及农作物的品质，而且会通过食物链进入人体，危害人体健康。土壤是微生物栖息的最重要环境之一，提供了微生物生长所必要的营养物质。土壤微生物种类十分丰富，主要分为细菌、真菌、古菌以及放线菌等。土壤微生物是土壤有机质以及土壤养分C、N、P、S等循环转化的动力，参与土壤中有机质的分解、腐殖质的形成、土壤养分的转化循环等[2]。土壤微生物在土壤生态系统中扮演者十分重要的角色[3]，对环境的变化反应灵敏[4]，其群落多样性和相对组成，是评价环境质量的重要参数[5]。一旦土壤生态系统受到污染，土壤微生物就会发生相应的变化[6]。有研究报告指出，土壤重金属污染能明显影响土壤微生物的活性及结构[7]，李晶等[8]研究也表明，土壤微生物对重金属胁迫特别敏感，可通过微生物群落结构的变化来反映土壤质量和健康状况[9]。因此，研究土壤微生物具有十分重要的意义。本文对研究微生物传统以及各种新型研究方法进行了分类介绍，并对各种方法的优缺点以及适用场合进行说明。
1 土壤微生物研究方法
1.1 传统的分离纯培养和稀释平板计数 在固体琼脂培养基上接种培养微生物，可利用微生物的表面特征差异，在固体培养基上对微生物进行分离纯化，也可利用该方法对微生物在平板上进行简单的计数[10]。同时可以通过配制不同成分的培养基对微生物进行筛选驯化，从而得到我们需要的菌种。此种方法的优点是成本低，便于对微生物的状况做出初步的判断。缺点是由于自然界中存在大量的不可培养的微生物，且存在很多对温度要求苛刻并微生物，如嗜低温菌和嗜高温菌，传统的固体培养基的培养温度并不能满足这些微生物的生存所需温度。
1.2 Biolog微平板法 Biolog微平板原理是基于测定微生物对单一碳源利用程度的差异来表征微生物的生理特性[11]。Biolog微平板由对照孔和95种不同单一碳源孔组成并在其中添加染料，当接种纯培养的菌液时，其中一些孔的营养物质被利用，使各孔呈现出不同的颜色，从而形成微生物特有的代谢指纹，可通过与标准菌种的数据库做对比，从而可鉴定出被测菌种。与传统培养方法相比，此方法可以估算微生物群落代谢多样性和功能多样性。同时可根据各孔的颜色差异来反映出微生物群落的均匀度，从而可以反映出群落的稳定性[12]。该方法的缺点是当环境差异不大时，这些指数并不能较敏感地区分菌群之间的差异[13]。同时由于不同的生长和竞争的结果，菌种之间会相互影响导致种群发生变化，影响测定结果[14]。
1.3 磷酸脂肪酸分析法（PLFA） 磷酸脂肪酸存在于活细胞的细胞膜中，具有属的特异性，不同属的微生物通过不同生化途径而形成不同的磷酸脂肪酸（PLFAs）[15]。因此，土壤中的PLFAs组成和含量变化在一定程度上可反映土壤中微生物量和群落的动态变化。通过对微生物的磷酸脂肪酸进行提取，并依据其中的特征脂肪酸指示的微生物种类[16]，可对土壤中微生物群落特征进行表征。此种方法具有对试验条件要求低、无需对微生物进行培养、测试功能多和稳定性好等优点[17]。但PLFA法也具有一定的局限性。该方法只能鉴定到属，PLFA图谱并不能给出一个实际的微生物种类组成，仅能反映微生物群落的概图[18]；另外，该方法容易受微生物生理状态影响[19-20]；古菌不能使用PLFA图谱进行分析，因为它的极性脂质是以醚而不是以酯键的形式出现[21]。同时由于目前尚未建立土样中所有微生物的特征脂肪酸，并且在很多情况下，还无法确定土样中某些脂肪酸与特定微生物或微生物群落的对应关系[22]。
1.4 变性梯度凝胶电泳技术（PCR-DGGE） 该技术是以复杂的环境样品如土壤为研究对象，直接提取微生物DNA，利用通用引物进一步对提取的DNA进行PCR扩增。将扩增产物开展DGGE凝胶电泳分析[23]。DGGE不是将分子量不同的DNA分开，而是通过聚丙烯酰胺凝胶中变性剂浓度梯度的不同，将序列不同的DNA分开[24]。该方法的原理是根据DNA的解链特性，不同碱基组成的DNA双螺旋发生变性所需要的变性剂浓度不同。在普通的聚丙烯酰胺凝胶基础上加入变性剂，根据其迁移行为决定于其分子大小和电荷的原理能够将长度相同但序列不同的DN段区分开[25]。该方法具有可靠性高、重现性强、方便快捷、分辨率高等优点[26]，但同时也存在一定的局限性。DGGE还不能全面分析土壤中全部微生物，该方法只能检测出土壤中相对丰度大于1%的微生物[27]；同时DGGE对实验要求较高，凝胶浓度、温度、电压等电泳条件选择不当时，就会发生共迁现象[26]，即同一条带不止包含一种微生物，微生物的种类被低估。
1.5 高通量测序技术 高通量测序技术也称“下一代”测序技术，1次并行能对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定。以Illumina公司的Solexa，ABI公司的SOLiD，和Roche公司的454技术为代表[28-29]。该技术对于研究土壤微生物具有极大的意义。该技术极大地降低了微生物测序成本，实验了大规模土壤微生物直接测序[30]；同时该方法极大地提高了测序通量，丰富了研究的信息量，便于研究者更加深入地了解所研究课题。但同时该方法也存在一定的局限性，主要局限性如下：海量数据分析难的问题，该测序方法所测数据之深，所获信息之大，都极大地加大了实验研究者分析数据的难度；数据去伪存真难的问题，在土壤微生物高通量测序中，存在物种丰富度被高估的情况[30]，对高通量测序结果去伪存真，探索新的统计学方法成为研究者面临的一大难题[31]。
1.6 基因芯片技术（GeoChip） 基因芯片（GeoChip）是研究土壤微生物非常有效的技术手段，作为新一代的核酸杂交技术，可用于检测环境微生物参与物质循环、污染物降解等过程中参与的功能基因[32]。该方法是在芯片上含有编码各种与生态学和生物功能过程或生物降解作用有关酶的基因[33]。由此可见，功能基因芯片为土壤微生物研究提供了全新有力的技术分析工具，有利于更加有效地利用微生物对污染土壤进行修复[34]。基因芯片技术具有高密度、高灵敏度、自动化和低背景水平等显著优点[35]。但是任何技术都存在一定的局限性，基因芯片技术也不例外。该技术虽能检测出微生物在生物学过程中所发挥作用的功能基因，但是却不能直接表征微生物的群落多样性组成和丰富度。应结合DNA与mRNA测序，可以更加真实全面地反映土壤微生物群落结构信息及其生理活动[34]。同时该方法在取样、标记、杂交条件、图像处理、数据归一化以及所得数据的质量评估等都会带来很多误差[36]。
2 不同方法在重金属污染土壤中的应用
刘云国等[37]在湖南临乡桃林矿区土壤中采用稀释涂布法在马丁固体培养基上筛选出一株高抗铜、锌菌株；张秀等[38]利用Biolog微平板法来分析生物质炭对镉污染土壤微生物多样性的影响；孙婷婷等[39]利用磷酸脂肪酸分析法来分析羟基磷灰石-植物联合修复对Cu/Cd污染植物根际土壤微生物群落的影响；郑涵等[40]利用PCR-DGGE分析方法对锌胁迫对土壤中微生物群落变化的影响进行了评价分析；江玉梅等[41]利用Illumina平台高通量测序技术分析重金属污染对鄱阳湖底泥微生物群落结构的影响；路桃香对植物非根际土壤微生物进行454高通量测序。
目前对于微生物研究方法有很多种，有最先进的技术，也有传统的实验方法，每种方法都各有优缺点，因此，在研究土壤微生物时，应结合土壤特征以及研究目的合理选择研究方法。如条件允许的情况下，可以结合多种技术方法同时使用，可以更好地研究土壤微生物的群落特征。
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微生物的多样性范文5
关键词：土壤；真菌；DNA提取；ITS-PCR；T-RFLP
中图分类号：Q938.1+1 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）06-1443-04
土壤微生物是森林生态系统中最重要的组分，在凋落物分解、腐殖质合成以及养分循环等过程中起着十分重要的作用。其种类和组成不仅直接影响土壤的生物化学循环，而且是土壤生物活性的具体体现，并在森林生态系统的物质循环和能量流动中扮演着重要角色[1-3]。不同土壤分布着不同的土壤微生物，而不同的微生物多样性又影响土壤功能的多样性[4]。土壤微生物的组成和分布可以在深层次上揭示森林生态系统的物质循环和能量流动。目前测定土壤微生物多样性的方法主要有稀释平板法、磷脂脂肪酸分析（PFLA）法、Biolog微平板分析法及分子生物学方法等[5]。随着分子生物学技术在土壤微生物研究中的不断发展，土壤微生物多样性的研究有了新的突破。核糖体ITS区为非编码区，受到的选择压力较小，进化速度快。因此该区段能够提供比较丰富的变异位点和信息位点，目前已经用于种间、亚种和种群水平上的遗传多样性研究[6]。自从Innis等[7]1990年首先设计ITS引物对真菌核内核糖体RNA基因进行扩增以来，ITS序列分析技术在真菌分类、鉴定的研究中应用越来越广泛。
该研究利用分子生物学技术对长白山自然保护区不同森林类型的土壤真菌群落组成进行分析，比较不同植被类型与土壤真菌之间的关系及变化趋势，以期加深对土壤真菌变化过程和机制的认识，为长白山区域天然林保护和生态建设提供基础资料。
1 材料与方法
1.1 材料
土壤样品于2010年10月采自长白山自然保护区（表1）。按不同林型采用对角线型混合取样法采集表层的土壤，采集深度为0～5 cm，用塑料袋封装带回。-80 ℃下密封保存。
1.2 试剂与仪器
Taq DNA 聚合酶、dNTPs、限制性内切酶Hinf Ⅰ购自宝生物工程（大连）有限公司；土壤真菌基因组提取试剂盒购自MoBio Laboratories公司；DNA纯化试剂盒购自天根生化科技（北京）有限公司。Gene-9700型PCR扩增仪、上海卢湘仪台式离心机、BIO-RAD凝胶成像系统等。
1.3 方法
1.3.1 土壤样品DNA的提取与检测 土壤样品DNA的提取参照MoBio土壤真菌提取试剂盒的方法。
1.3.2 ITS-PCR扩增及产物纯化 用于ITS片段扩增的引物采用真菌ITS区通用引物ITS1-F和ITS4，由上海生工生物工程技术服务有限公司合成，具体序列如下：ITS1-F（5′3′）：CTTGGTCATTTAGAGG
AAGTAA；ITS4（5′3′）：TCCTCCGCTTATTGATAGC。
ITS扩增反应体系为：5 μL 10×PCR Buffer（50 mmol/L KCl；10 mmol/L Tris-HCl，pH 8.3；1.5 mmol/L MgCl2）、2 μL DNA模板、ITS1-F和ITS4（10 μmol/L）各2.5 μL、4 μL dNTPs（2.5 mmol/L）、0.5 μL Taq DNA聚合酶（5 U/μL），加ddH2O至50 μL。反应条件为：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性60 s，52 ℃退火60 s，72 ℃延伸60 s，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min。取5 μL ITS-PCR扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳后用凝胶成像处理系统观察拍照。
1.3.3 ITS-PCR产物的纯化 采用DNA纯化试剂盒，按照说明书进行PCR产物纯化。
1.3.4 ITS-PCR产物的限制性酶切分析 ITS-PCR产物的T-RFLP分析反应体系为30 μL：含10 μL ITS-PCR产物、2 μL Hinf I（10 U/μL）、3 μL 10× Buffer、加ddH2O至30 μL。置于37 ℃水浴中酶切反应4 h，然后65 ℃作用20 min终止反应。将酶切产物送至上海美吉生物医药有限公司测序。
1.3.5 数据分析 每个T-RFLP的丰度百分比（Ap，%）按照公式Ap=ni/N×100%计算， 其中ni代表每个可分辨的T-RFLP的峰面积， N代表所有T-RFLP峰面积的总和。种群多样性指数[8]用BIO-DAP软件计算。依据公式Cs=2N（A+B）/（NA+NB）计算样品之间Sorenson[9，10]的相似系数， 其中NA+B指两样品共有的条带数目，NA、NB指两样品各自包含的条带数目。
2 结果与分析
2.1 不同森林类型土壤真菌T-RFLP分析结果
利用限制性内切酶Hinf Ⅰ对6种不同森林类型土壤真菌ITS区进行酶切，T-RFLP分析结果见图1。从图1可以看出，酶切谱带清晰，RFLPs比较明显，酶切片段在100～600 bp之间，不同森林类型真菌群落存在明显差异。
2.2 不同森林类型土壤真菌多样性
不同森林类型土壤真菌香农多样性指数、均匀度见表2。由表2可知，1号样点的香农多样性指数最高，3号样点的最低；1、2、3、5号样点的均匀度高，4号样点的均匀度最低。一般而言，多样性越高群落稳定性大，稳定性的大小反映了多样性的大小。植物根系可为微生物栖息提供很好的场所，植被覆盖使得土壤湿度更适合于群落的发展，微生物群落的发展反过来又有利于植物群落的发展。
2.3 不同森林类型土壤真菌相似性
从不同森林类型土壤真菌群落结构相似性系数分析结果见表3。由于森林类型的不同，土壤的真菌群落也有较大差异，群落功能也有较大差异，甚至森林类型接近的土壤，真菌的相似性也比较低，森林土壤真菌的空间差异性很大。
3 小结与讨论
3.1 土壤样品DNA的提取与纯化
如何获得高质量的土壤样品总DNA是分子生物学技术的基础和关键[11]，只有获得高质量的土壤样品总DNA才能保证后续PCR扩增的准确、可靠。土样中主要污染物为多糖、腐殖酸和酚类化合物，其中腐殖酸的理化性质与核酸相似，因此在DNA提取过程中很难完全去除，而腐殖酸等杂质会影响后续的PCR反应[12]。
3.2 土壤真菌多样性指数
香农多样性指数是一种评价不同土壤的微生物群落多样性十分有效的方法，香农多样性指数越高表明微生物群落多样性越大，它由种类的丰富度及种类的均匀度两部分组成[13，14]。在不同类型的森林土壤中，真菌的群落香农多样性指数呈现出较大的差异性和复杂性，这可能是由于天然森林中的真菌的空间异质性高所致。白桦林中后期和过熟阔叶红松林，光照充足， 干扰少， 土壤结构比较稳定， 枯枝落叶积累多， 水分涵养好， 适合微生物生长， 所以土壤真菌的类群多，土壤相对较肥沃。从整体上来看， 白桦林中后期和阔叶红松林土壤质量高， 微生物种类多，土壤结构稳定，有利于植物的生长。
该研究对不同森林类型土壤真菌群落的变化规律进行研究， 探讨了真菌群落的演替规律， 但对于真菌群落的变化规律以及微生物与植物之间如何互作还需进一步研究。同时对于其他样点的森林类型土壤微生物群落的变化规律如何还有待进一步揭示。
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微生物的多样性范文6
1试验方法
1.1自然生物膜的培养采用以南京玄武湖湖水配置的BG11培养液［17］培养自然生物膜．采用聚氯乙烯材质的弹性立体填料(200mm×0.5mm)作为载体，该材料的添加对水质以及生物膜的生长没有副作用;材料使用前用0.1mol/L的HCl溶液浸泡12h，并使用去离子水反复清洗，以去除杂质．生物膜的培养在盛有30LBG11培养液的透明玻璃容器中进行，容器中添加一定长度的弹性立体填料［18］．培养过程中，在容器口处用空隙尼龙网包扎以防止昆虫以及其他杂物落入．保持水位不变，并定期观察生物膜长势情况．试验期间温度保持在20～38℃之间．
1.2自然生物膜对染料的净化试验试验先进行自然生物膜的扩大培养，即在自然光照的条件下利用BG11培养液于温室下进行静态培养．挂膜2个月左右后，弹性立体填料表面形成致密的深绿色生物膜，生物膜长势成熟，生长旺盛．剪取每段长约20cm且挂有生物膜的弹性材料，置于5L的玻璃容器中，并设立试验组和对照组．其中，试验组中ρ(RhB)为0.5mg/L，对照组不添加RhB，每组设3个重复．试验过程中，每天定时采集水样，用聚醚砜微孔滤膜(孔径0.45μm，滤头直径1.3cm)过滤，采用紫外可见分光光度计(UV2450，岛津公司，日本)测定ρ(RhB)，做好相关记录．采样测试试验共进行11d，当试验组中ρ(RhB)处于较低水平(水质较清澈)后试验结束．
1.3PLFA法测定微生物群落多样性微生物PLFA的提取参照Bligh-Dyer修正方法［19］，以酯化C19∶0为内标，提取、纯化、分析测定流程:取2g干燥生物膜，加20mL氯仿－甲醇－柠檬酸缓冲液(体积比为1∶2∶0.8)直接抽提样品的总脂肪酸，提取的总脂肪酸经硅胶柱(SPE-SI)分离为中性脂肪酸、糖脂肪酸和磷脂酸;其中磷脂酸溶于甲醇－甲苯(体积比为1∶1)溶液，加入10mL0.2mol/LKOH，37℃下酯化15min，用GC-MS(gaschromatograph-massspectrometry，sturn，Varian，美国)分析仪进行不同分子的分离;采用PLFA标准谱图(bacterialfattyacidstandards)和美国商品化的MIDI系统(microbialidentificationsystem)来识别与定量PLFA．
1.4Biolog法测定微生物功能多样性Biolog方法是通过检测样品中微生物对Biolog公司生产的微孔板中的31种不同碳源利用情况来反映微生物群落水平的生理轮廓(communitylevelphysiologicalprofiles，CLPP)，以AWCD(averagewellcolordevelopment，颜色变化率)显示微生物群落对不同碳源代谢的总体情况，其变化速率反映了微生物的代谢活性，最终的AWCD与微生物群落中能利用单一碳源的微生物的数目和种类有关［20］．Biolog法测定微生物功能多样性采用Eco微孔板(BiologHayward，CA，USA)，每块板有96个孔，分为3组，可以同时完成3个重复．每组32个孔，其中第1个孔不含任何碳源，作为对照，其余31个孔各含有1个单独的碳源和四氮唑蓝．具体操作:准确称取相当于5.00g干质量(按含水量换算)的生物膜，置于灭菌的45mL生理盐水(0.85%NaCl)中，室温下180r/min振荡30min后取出，静置5min得到生物膜悬液;在超净工作台中吸取生物膜悬液1mL置于19mL事先灭菌的生理盐水中进行稀释;将稀释后的生物膜悬液接种于Eco微孔板中，每孔150μL，每样1板(为3次重复)，置于25℃暗箱连续培养，分别于24、48、72、96、120、144h在590nm下测定OD值．每个样品的AWCD的计算方法［21］:AWCD=［∑31i=1(Ci－R)］/31式中:Ci为第i个反应孔的OD值;R为对照孔的OD值．另外，主成分分析及碳源利用分析均选用72h的OD值进行计算．
1.5数据统计方法采用MSExcel2007和Origin8.0对数据进行统计和绘图;采用SPSS16.0中的Duncan法和DateReduction程序分别对数据进行差异显著性分析和主成分分析．
2结果与讨论
2.1净化效果由图2可见，自然水体生物膜对RhB染料具有一定的去除效果．随着时间的增加，ρ(RhB)持续降低．在染料添加的第1天，RhB的去除率达到了29.2%，之后几天每d的去除率降至3.9%左右，测试期内总去除率为68.6%．第1天RhB去除率较高的原因可能是吸附在净化过程的开始阶段起到重要作用，吸附过程速率较快［3］．之后几天仍保持一定的RhB去除率可能与生物吸收降解以及光降解有一定关系［22］;但是对照试验证明，该条件下光照对RhB的降解影响较小，总去除率约7.3%，因此，在该试验的采样期间光降解作用可以忽略．WU等［10］对相关的研究报道进行了综述，指出微生物聚集体对污染物质的去除机理主要有吸收、降解和吸附作用．自然生物膜作为一种微生物聚集体，其对RhB的净化机理也可能包含了吸附作用、吸收和降解作用．康春莉等［23］研究证明，自然生物膜中的胞外聚合物的含量占总有机质的80%以上，并且自然生物膜表面存在着大量的阴离子基团(如羧基、羰基等)，这些电负基团对阳离子型污染物质具有静电吸附作用．Solis等［24］综述了近几年真菌、细菌和藻类在染料废水脱色降解中的作用和效果，并指出利用微生物进行染料脱色和降解是经济有效的方法．真菌、细菌和藻类均可以降解部分染料，特别是有些白腐真菌的脱色能力已有了大量的研究结果．Maulin等［25］分离出可以降解偶氮染料的细菌，并发现在pH为6，温度为37℃时该菌对染料的去除率达80%以上．自然生物膜作为一种典型的微生物聚集体，含有大量的真菌、细菌和藻类，其中部分微生物可能对染料具有一定的净化和降解效果;然而环境中的pH、温度、含碳量和含氮量都可能会影响净化效果，从而使得自然生物膜对RhB的去除效果仍处于较低水平．
2.2环境扫描电镜(ESEM)观察采用Quanta200环境扫描电镜对自然生物膜在处理RhB废水前后进行ESEM(environmentalscanningelectronmicroscope，环境扫描电镜)扫描摄像，结果如图3所示．由图3可见，对照组生物膜外表面比较光滑，界限分明，表面大量的丝状物主要为藻类;添加RhB10d后的生物膜边界处较为粗糙，并且呈网状结构，原本界限分明的丝状物出现了增生．究其原因，可能是RhB这种酚类化合物接触了自然生物膜上的微生物，与微生物细胞的蛋白发生化学反应，从而对微生物产生毒性胁迫，诱使其在表面分泌某种物质，进而与RhB结合，或将其隔离于细胞体外来达到自我保护的目的．杨翠云等［26］研究表明，微囊藻毒素对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌具有一定的胁迫作用，细胞通过调节细胞内可溶性蛋白和可溶性糖的含量来抵抗外界胁迫，但随着处理时间的延长，细菌逐渐适应了这种胁迫，恢复正常的生长．李淑英等［27］研究表明，Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+对大薸根际微生物的影响，随微生物区系或生理类群和重金属胁迫浓度的不同而不同，Hg2+对放线菌、细菌、真菌的毒性最强，Pb2+次之．
2.3RhB对自然生物膜微生物群落结构特征的影响PLFA法通过测定微生物膜上的脂肪酸片段结构，分析微生物群落结构和生物量在不同环境中的变化．因为不同类群微生物含有的PLFA种类和数量均不相同，即PLFA和微生物类群数量之间存在着对应的关系，因此该技术常被应用于微生物生态学的研究中，以定量描述土壤、底泥及海水等生境中微生物的群落结构［28-29］．该研究采用PLFA法对微生物生物量以及各菌群进行分析，将试验得到的生物膜微生物磷脂脂肪酸量进行统计分析，可以判断出微生物群落结构多样性．PLFA以“总碳数∶双键数ω双键距离分子末端位置”命名;前缀a和i分别表示支链的反异构和异构，cy表示环丙烷脂肪酸;后缀c表示顺式脂肪酸，t表示反式脂肪酸;10Me表示一个甲基侧链在距分子末端第10个碳原子上．不同PLF段对应的微生物群落如表1［30-31］所示．试验结果见表2。由表2可见，对照组的总PLFA含量大于试验组，说明RhB的添加对生物膜微生物的生物量有一定的影响．RhB的添加使自然生物膜微生物的总PLFA含量减少52.23%，使细菌、真菌和放线菌的数量分别减少了75.81%、67.03%、100%．其中，放线菌几乎消失，这可能是由于放线菌对染料的毒害性更受敏感所致．李淑英等［27］研究发现，微生物对Hg2+、Pb2+、Cd2+和Cr6+的敏感性表现为放线菌＞细菌＞真菌．但是，自然生物膜中的微生物并未完全被破坏，仍保持一定的数量和种类．为了获得更多可靠信息，不考虑相对含量低于1.0%的单体PLFA，对其余含量较高的PLFA进行主成分分析，提取的前2个主成分的累积贡献率达83.66%，其中PC1(第一主成分)的贡献率为61.06%，PC2(第二主成分)的贡献率为22.60%，分析结果如图4所示．由图4(a)可见，试验组与对照组对于自然生物膜微生物群落PLFA的影响区分较明显，其中，试验组微生物主要表现为与PC2相关的微生物种类，而对照组微生物主要表现为与PC1相关的微生物种类．由图4(b)可见，革兰氏阳性菌的特征脂肪酸(如i15∶0、i17∶0)及放线菌的特征脂肪酸〔如17∶0(10Me)〕在PC1上载荷值较高，说明PC1是它们的代表因子．a16∶0、14∶0是表征革兰氏阳性菌的脂肪酸，在PC2载荷值较高，可以认为PC2是它们的代表因子．综上，RhB对自然生物膜上革兰氏阳性菌和放线菌影响的差异较明显．
2.4微生物群落功能多样性添加RhB不仅影响了自然生物膜上微生物的群落结构和数量，也影响了其活性．由图5(a)可见，在0～24h内，对照组和试验组的微生物群落的AWCD均较低或只有轻微增加;24～48h内2种微生物群落的AWCD随时间表现出几何级数增加;48h至培结束(144h)，2种微生物群落的AWCD随时间的增速趋于缓慢直至达到平衡．无RhB添加的对照组AWCD始终大于试验组，表明接触了RhB的生物膜微生物利用单一碳源的能力减弱了．究其原因，生物膜上的有机质可能与RhB相互作用，降低了其生物有效性［32］．为研究生物膜微生物群落碳源利用多样性的特点，以培养72h的样品为例，对Biolog测试数据进行标准化变换后用于主成分分析，结果见图5(b)．其中，PC1的贡献率为23.59%，PC2的贡献率为18.37%．由图5(b)可见，对照组和试验组表现出了明显的分布差异．Garland等［21］认为，各样本在空间上位置的不同是和碳底物的利用能力相关联的．具体而言，各样本在主成分空间不同轴上的差异是与聚集在该轴上碳源的利用能力相联系的．因此，在RhB的影响下，自然生物膜微生物群落对31种碳源的利用表现出了差异，说明其活性受到了影响．但是这种影响是否对自然生物膜有利尚需进一步判断．另外对与PC1和PC2具有较高相关性的6个碳源进行分析，结果如表3所示．由表3可见，在PC1上载荷较高的6种碳源中，有3种氨基酸、2种碳水化合物、1种多聚物;在PC2上载荷较高的6种碳源中，有3种碳水化合物，羧酸、多聚物和酚酸类各1种，说明影响PC1和PC2的碳源以碳水化合物为主．综上，使自然生物膜微生物群落代谢多样性表现出差异的主要碳源为碳水化合物类，其次为氨基酸类．
3结论
