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微生物多样性分析方法范文1
【摘要】16S rRNA分析的实验技术为微生物生态学的研究提供了新的研究方法，因此越来越多的学者利用16S rRNA进行各种实验的研究并取得了骄人的成绩。本文对16S rRNA基因的获得做一简单介绍，重点介绍16S rRNA基因的应用。16S rRNA在细菌菌种鉴定、环境保护、疾病诊断等方面都取得了很好的研究进展，不久的将来16S rRNA基因将会为人类做出更大的贡献。
【关键词】16S rRNA；菌种鉴定；疾病诊断；环境保护
前 言
随着遗传学、分子生物学、细胞生物学等学科的迅速发展，越来越多的新方法和新技术被应用于分子水平研究领域。在这样的背景下，16S rRNA基因的研究无论在广度和深度上都取得了显著的成就，16S rRNA基因技术的应用在微生物多样性、微生物种群分析、重要基因的发现、以及遗传物质在微生物之间或微生物与非生物环境之间相互关系等方面均做出了巨大的贡献，并开辟了微生物生态学研究新的领域。关于16S rRNA基因方面的综合性论述尚未见报道，本文将为该领域的进一步研究提供必要的综合信息。
1 16S rRNA基因的简介:细菌rRNA按沉降系数分为3种，分别为5S、16S和23S rRNA。其中位于原核细胞核糖体小亚基上的16S rRNA长约1540bp，结构和碱基排列复杂度适中，较易于进行序列测定和分析比较。16S rDNA是细菌染色体上编码16S rRNA相对应的DNA序列，存在于所有细菌染色体基因中，它的内部结构由保守区及可变区两部分组成，因此可用PCR扩增其相应的rDN断，来快速、灵敏地检测样品中是否存在某些细菌或致病菌，或进行细菌多样性分析。
2 16S rRNA基因在细菌菌种鉴定中的应用:1977年C.Woese通过对各种生物的rRNA进行分析，认为16S rRNA基因及其类似的rRNA基因序列作为生物系统发育指标最为合适，提出了可将自然界的生命分为细菌、古菌和真核生物三域（domain），揭示了各生物之间的系统发育关系，使微生物学进入到成熟时期，因此许多研究采用测16S rRNA基因部分序列的方法进行多样性分析。Funke等测定从人体分离到的棒杆菌依赖补体细胞毒性Ⅰ组及其类似棒杆菌的16S rRNA序列，通过对这些序列的比较发现这两个棒杆菌组都属于放线菌属，再结合其它的分子实验结果及以前的生化试验结果，提出其为放线菌一个新种，即钮氏放线菌。Gaydos等通过对肺炎衣原体的1554bp 16S rRNA序列与鹦鹉热衣原体及砂眼衣原体的16S rRNA序列进行同源性比较并绘制了系统进化树，发现肺炎衣原体与后二者的同源性分别为96%和94%，证实了以前根据其它方法研究所得出的结论，同时说明从遗传进化角度来看，肺炎衣原体与鹦鹉热衣原体的进化关系比与砂眼衣原体的关系更近。
随着大部分细菌的16S rRNA序列的获得以及核酸扩增16S rRNA序列测定自动化分析系统的问世，必将引起细菌分类的一次重大变革，它可以使人们进一步了解细菌的进化关系，从而产生以16S rRNA序列分析为主体的所有细菌的系统发育树。
3 16S rRNA基因在疾病的诊断方面的应用:目前，几乎所有病原菌的16S rRNA基因测序均已完成，因此被选为细菌病原体PCR扩增部分或全部序列的目标。16S rRNA序列分析为基础的细菌检测法在目前识别异常细菌引起的疾病上扮演着重要的角色。Relman等利用16S rRNA 序列中的保守区段设计了寡核苷酸引物，用来扩增杆菌性血管瘤病人的靶DNA序列。他们还发现现在具有一定病症的病人的组织污染物中已发现有细菌形成，但并没有培养出致病菌。近几年，人欧利希氏病、肠原性脂肪代谢障和少菌性骨髓炎的致病因子也是通过PCR扩增 16S rRNA 进行序列分析发现的；同样，疏螺旋体的不同区域分离物根据此法也已被鉴定。
由于细菌种间16S rRNA基因序列间隔区在长度、序列上具有相对多变性，所以利用保守区的基因作为引物，对间隔区进行克隆和分析，就能为病原微生物的各菌株、种、属的鉴定、分型提供依据。该检测技术目前已被成功的运用到了病原菌的种、属以及家族种类的鉴定中。
4 16S rRNA基因在环境的保护中的应用:16S rRNA序列分析随着微生物核糖体数据库日益完善已应用于海洋、湖泊、土壤、大气等环境微生物多样性分析。不少学者利用16S rRNA基因序列分析技术研究了多种环境的微生物多样性，并得到了一些有意义的结果。如Glovanoni等研究了Sargasso海洋中浮游细菌的遗传多样性，因此提高了海洋微生物中致病菌的检测速度，对于提高海产品质量，维护人类身体健康有重要的实际意义；Tanner等发现不同污染物对细菌群落多样性有显著的作用；Oureas等发现农业土壤微生物群落显著生理活性差异及其多样性；Nuble等发现氧化光能利用菌群落16S rRNA基因的丰度与其形态型显著相关。吴春笃教授等对镇江城市污水中微生物的16S rRNA进行检测，发现污水中细菌16S rRNA基因主要来自变形细菌(proteobacte-ria)的各亚族，占总检序列的86.3%，还有脱铁杆菌门(Deferribacteres)、厚壁菌门(Firmicutes)和拟杆菌门(Bacteroidetes)等类群，该发现为制定治理城市污水生物性污染的措施提供了科学依据。随着各种学科的不断发展和学科间的交叉应用16S rRNA基因将会在环境保护中发挥更大的作用。
参考文献
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微生物多样性分析方法范文2
Abstract: At present,with the rapid development of China's economy,the current extensive economic growth mode has the low utilization of water resources,resulting in shortage of water resources. China's economy is not yet developed,due to inadequate sewage treatment facilities and higher operating costs,many cities discharged the majority of untreated urban sewage into water bodies,causing pollution of water environment. Water pollution has become one of the main factors that restrict China's urban construction and economic development. In the author's opinion,sewage treatment technology is desperately needed.
关键词:污水治理;水源保护;生态学分析
Key words: sewage treatment;water conservation;ecological analysis
中图分类号:TU992文献标识码:A文章编号:1006-4311(2010)15-0170-01
0引言
水是人类社会生产和生活必不可少的宝贵自然资源,也是生物赖以生存的环境资源。工业革命以来,随着科技进步和社会生产力的极大提高,人类创造出前所未有的物质财富,加速推进了文明发展的进程。与此同时,人类的生产生活活动产生的污染也造成了水环境质量不断恶化和水资源危机的加剧,水环境污染与水资源短缺已演变成备受全世界关注的资源环境问题,严重地阻碍着经济的发展和人民生活质量的提高,继而威胁着人类的未来生存和发展。
1我国污水治理的技术环境
在污水治理设备方面,总体技术也落后于国际先进水平,仅为国际20世纪70-80年代的水平。这些污水治理设备仅仅可以满足一般工业废水和生活污水的处理需求。由于处理设备单机产品多,系列化程度低,成套装置生产不足,严重缺乏生产高新生物技术处理设备的能力。我国生产的用于城市污水治理的动力设备,如鼓风机、水泵等,普遍存在能耗较大的问题,造成我国城市污水治理设施的运营费用居高不下,在一定程度上也制约了我国城市污水治理产业的发展。[1]
2我国的污水治理技术
2.1 厌氧生物处理技术厌氧生物处理技术的能耗较低,可以回收生物能(如:沼气),污泥产量较低。厌氧微生物可以对好氧微生物所不能降解的有机物进行降解或部分降解;对温度、pH等环境因素要求较高。但整体来说,经厌氧生物处理的出水,水质较差,需要进一步利用好氧法进行处理,伴随气味较大,对氨氮的去除效果不理想。
2.2 好氧生物处理技术常用的好氧生物处理工艺有三大类:活性污泥法、生物膜法、膜生物反应器工艺。
①活性污泥法工艺。活性污泥法主要包括传统性污泥法污水处理技术、氧化沟技术、间歇式活性污泥处理技术(SBR,Sequencing Batch Reactor)和AB法污水处理技术。SBR法的工艺流程简单,且造价低,主体设备只有序批式间歇反应器,无需二沉池和污泥回流系统,初沉池也可省略。具有布置紧凑,占地面积小的特点,可根据水质和水量情况灵活运行,具有良好的脱氮除磷效果。[2]②生物膜法工艺。污水的生物膜处理技术既是传统的,又是发展中的污水生物处理技术。迄今为止,属于生物膜处理法的工艺有生物滤池(普通生物滤池、高负荷生物滤池、塔式生物滤池)、生物转盘、生物流化床、曝气生物滤池(BAF)、生物接触氧化、纯氧生化处理等。生物滤池是早期出现、至今仍在研究、发展中的污水生物处理技术,而后三种则是近几十年来开发的新工艺。③膜生物反应器工艺。膜生物反应器MBR是二十世纪未发展起来的新技术,它是膜分离技术和活性污泥生物技术的结合。它不同于活性污泥法,不使用沉淀池进行固液分离,而是使用中空纤维膜替代沉淀池,因此具有高效固液分离性能,同时利用膜的特性,使活性污泥不随出水流失,在生化池中形成超高浓度的活性污泥浓度,使污染物分解彻底,因此出水水质良好、稳定,出水细菌、悬浮物和浊度接近于零。生活污水处理后可直接回用,在污水处理方面具有传统工艺所不具备的优点。
2.3 污水的自然处理技术污水的自然生物处理方法主要是利用自然的生态系统如土地、湿地等,通过生态系统中的动物、植物与微生物协同作用,去除污水中污染物的一种方法。我国在“七五”期间就已经对废水土地处理技术进行了广泛的研究,解决了许多技术上的问题,“八五”期间又列入了国家攻关重点项目,这也为我国推广应用土地处理系统创造了条件。[3]
3PLFA方法分析曝气生物滤池微生物的研究
3.1 PLFA方法在水体微生物群落结构和生物多样性分析中应用在现有的关于水中微生物群落的研究中,PLFA一般只能定性的、粗略的区别革兰氏阳性、阴性、好氧细菌、厌氧细菌、放线菌、真菌等,很少能用来定性的测量指定种属的微生物。目前,只有少数几种PLFA生物标志物可以指示某些种属的细菌,如硫酸盐还原细菌等。地下水中原生动物的PLFA标志物的发现有助于了解深层含水层中微生物食物链结构和微生物的活性,在地下水的微生物修复方面具有重要意义。[4]
3.2 PLFA方法在沉积物微生物群落结构和生物多样性分析中应用江、海等沉积物的微生物区是由复杂的微生物群落组成,它能够完成主要的矿化反应,这对营养元素的循环和大部分深海食物链的形成具有重要作用。使用PLFA谱图分析方法能够获得有关沉积物中微生物生物量和群落结构的信息,沉积物样品可以不进行处理,也可以是冷冻或冻干的。PLFA法在沉积物微生物群落结构和生物多样性分析中的应用,对污水治理技术的提高有着重要的现实意义。
4结语
水是人类赖以生存的三大生命要素之一。在我国,经过几十年的改革开放,经济得到了迅猛发展,同时也带来了诸多环境问题,尤其是水污染十分突出,严重制约着社会经济和环境的可持续发展。随着我国工业、农业的迅速发展和人们生活水平的提高,水体污染现象越来越严重,直接威胁着人类的生命健康和整个生态系统的稳定性。严峻的水形势迫切要求我们必须大力进行污水处理及其资源化,同时由于我国经济水平尚不发达,更迫切需要我们研究、推广和应用处理高效、投资节省、运行低耗的污水处理新技术。
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微生物多样性分析方法范文3
关键词：基因芯片；土壤微生态；功能基因；微生物群落
中图分类号：X172文献标识码：A文章编号：1672-1683（2013）01-0093-04
在自然微生态系统中，微生物群落在各项物质循环与能量循环中发挥着重要作用。庞大的微生物数量及其错综复杂的功能网络使得微生物资源的研究和有效利用具有很大的挑战性。在实验室条件中很难模拟微生物群落的自然生境，无法为微生物群落提供理想的生长环境，传统培养富集技术只能提供有限的微生物群落信息，而且实验周期较长。分子生物学技术则直接检测微生物的遗传物质基础――核酸，极大地减轻了对培养方法的依赖，由此显著促进了自然生境中微生物的监测和定性描述。功能基因芯片是新一代分子生物学检测技术，通过成千上万密集排列的核酸探针能够在短时间内分析大量的核酸分子。大部分以核酸为检测对象的技术仅提供微生物的系统发育学信息，而功能基因芯片的检测对象为微生物群落的功能基因。基因芯片技术作为无需培养的高通量检测技术，解决了传统分子生物学的低效率问题，以特异性和高度灵敏性来保证检测结果的准确性，而且可以定量检测目的基因。近十年来，功能基因芯片的发展很大地促进了有关土壤微生态的活动和多样性的研究[1]。土壤微生物有类群繁多、数量巨大、分布复杂、功能多样等特征[2]，而且现今，气候变化、工业化、城市化以及农业的发展对土壤生态系统产生不同程度的压力，土壤微生物的分布和功能在不断地发生变化，然而人们对此的了解还远远不足以预测微生物的演替充分利用微生物的功能，因此功能基因芯片在土壤微生态的研究中也得到越来越广泛的关注。
1功能基因芯片（微阵列）技术简介
1.1功能基因芯片原理
基因芯片技术作为新一代的核酸杂交技术，具有高密度、平行分析、双色测定和低背景值等优势，非常适合于检测自然环境中的微生物[3]。在此技术中，将大量核酸片段（寡核苷酸、cDNA、基因组DNA）以预先设计的方式固定在载玻片、尼龙膜等载体上组成密集分子排列，再根据核酸互补杂交原理，与标记样品进行杂交；通过检测杂交信号的强弱，判断样品中靶分子的数量及组成[4]。功能基因芯片是包含有功能基因序列的微阵列，这些功能基因编码微生物的生物化学功能的相关蛋白质。
功能基因芯片可分为功能分类基因芯片和基因表达芯片，前者的目的主要是研究菌群是否具有一些涉及特定反应过程的基因，可知微生物群落的潜在功能，杂交靶标是菌群DNA的PCR产物；而后者用于研究这些特定功能基因的生理活性及其基因真实表达的情况，需提取环境样品的mRNA，其杂交靶标是菌群cDNA的PCR产物[5]。
1.2功能基因芯片探针、杂交及数据分析
制作功能基因阵列的基因探针必须根据具体所要研究的问题进行认真选择。制备功能基因探针的方法有3种：（1）用专一性引物从纯培养物的基因组DNA中扩增所需的基因片段或以载体特异性引物从含所需基因的载体质粒上扩增；（2）通过PCR从自然环境中获取所需基因片段；（3）使用寡核苷酸探针，根据数据库中的功能序列信息设计并合成较长的（50～70个碱基）寡核苷酸探针，固化在阵列上。
为了与固定的探针杂交，待测基因（DNA或mRNA）要经PCR、逆转录、末端标记等操作，成为标记有荧光染料或同位素的核酸分子。杂交后每个斑点信号强度通过计算机进行处理得到大量信息，并进行后续的数据分析工作。数据分析一般遵循的技术路线为生物多样性分析、群落组成和结构分析、与环境因子的相关性分析，以分子生态网络的建立。在生物多样性分析中，要根据检测到的基因数量计算出各项多样性指数，如丰度、均匀度，多样性等等，同时要把不同样品殊的、唯一的以及共有的基因找出来；在群落组成和结构分析中，可利用的方法有方差分析、聚类分析、除趋势对应分析（Detrended Correspondence Analysis，DCA）、响应比分析等多种方法；群落及环境之间的关系分析中，可通过典范对应分析、矩阵相关分析、方差分解分析（VPA）等方法进行研究；建立分子生态网络目的是为了更清楚地揭示微生物功能基因和相关群落之间的关系[6]。
1.3功能基因芯片发展
最初，功能基因芯片由89个PCR扩增探针组成，可以检测到纯培养物的nirS，nirK，amoA和pmoA等四种功能基因。后来出现的多种功能基因芯片则以关乎微生物特定功能过程的基因为目标，如氮循环[7-9]，甲烷氧化菌[10]等等。近几年功能基因芯片已发展成为有数千个甚至数万个探针的综合性芯片，可同时检测数万个功能基因，涉及到碳、氮等各个循环、金属还原和有机物降解等各种微生态功能。其中最具代表性的功能基因芯片是美国俄克拉荷马大学环境基因组学研究院Zhou等[11-13]开发出的Geochip，这种综合性高通量功能基因芯片通过数万个探针提供有关功能基因的超大量信息，目前发展到了Geochip 4.0版本[13]。Geochip系列芯片被用于包括土壤、水生态系统等各种环境的微生态研究中，已充分证明此技术的适用性和发展前景。然而，功能基因芯片也存在有待进一步解决的问题：（1）要发展强有力的软件工具来设计特异性探针，以应对测序技术得到的大量序列信息；（2）面对环境样品中复杂多样的微生物资源，需要新方法、新策略来不断改善基因芯片的敏感性和定量准确性。
2功能基因芯片在土壤微生态研究中的应用
功能基因芯片从功能基因的视角探索土壤微生物在不同生态类型中和不同环境压力下的分布及规律，以及土壤微生物在污染物处理、降解和土壤修复等方面的作用和机理，并深入了解碳、氮等营养物质在土壤微生态系统中循环、转化作用机理。由此可见，功能基因芯片为土壤微生态研究提供了全新的强有力的技术分析工具，有助于更高效地利用土壤微生物对污染环境进行综合治理，或利用生物技术改选微生物，增强对外源污染物的降解和转化，同时为开发利用微生物资源维持陆地生态系统的稳定性提供了理念基础。
2.1利用功能基因芯片探讨不同生态系统中土壤的
微生态过程
功能基因芯片在森林生态系统、草地生态系统，农业生态系统等各种不同生态系统的土壤微生态研究中都得到了应用。He等[14]结合功能基因芯片和焦磷酸测序技术检测二氧化碳增加压力下的草地土壤微生物群落变化，发现在二氧化碳增加压力下有关活性碳降解、固碳、固氮以及磷释放的基因数量都有所增加，而对有关甲烷代谢和难降解性碳降解的基因没有显著影响，而且土壤微生物群落结构和代谢潜力与土壤的碳氮含量、植物生产力密切相关。这样的结果表明二氧化碳的增加改变了微生物群落的结构和组成，微生物群落的结构和功能的改变会进一步对碳的流动产生影响。Zhang等[15]研究了四川亚高山带森林中土地利用和覆盖对土壤微生物有机碳降解基因多样性的影响，其中所用的功能基因阵列包含代表123个功能基因的1 961个探针。研究结果表明，在一些土地利用类型场地中功能基因数量与基因多样性指数与土壤有机碳的增加呈正相关。Berthrong等[16]用功能基因芯片Geochip2.0（>24 000个探针，可以同时检测数千个基因，包括炭循环的相关基因）来比较土壤微生物和生物地理化学功能如何响应不同的土地利用类型，结果表明，草地向森林的转变使土壤的碳氮储存量发生了变化：桉树的种植减少了与氨化和固氮作用相关的功能基因、碳聚合物降解相关的基因和几丁质酶功能基因的丰度。另外，Zhou等[17]同样利用Geochip 2.0研究了森林土壤的微生物群落空间分布模式，结果证明了物种-区域关系适用于微生物群落的分布。Reeve等[18]收集了不同管理措施下农业生态系统的土壤样品，利用功能基因芯片探讨土壤功能和微生物群落多样性之间的关系。这些工作都把环境压力、土壤特性，植被等相关因素与土壤微生物群落的分布和功能紧密地联系了起来。还有涉及到极端生态系统的研究，Yergeau等[19]首次利用包含24 243个寡核苷酸探针（10 000多个与氮、碳、硫和磷循环和有机污染物降解相关的功能基因）的功能基因芯片研究了不同纬度上的南极土壤微生物群落变化，探讨了生态系统中影响碳氮循环的环境因素。
大部分的研究都是检测从土壤样品提取的DNA，但还有一些研究把目标转向了mRNA。Bodrossy等[20]用甲烷氧化菌的功能基因芯片对垃圾堆肥土壤进行了DNA以及mRNA的基因检测，发现一些从mRNA中检测到的基因在DNA的检测中却未出现，这说明基于mRNA的基因诊断检测可以为微生物群落结构和功能补充更多信息。McGrath等[21]构建了一个基于mRNA的环境功能基因芯片（Environmental functional gene microarray，E-FGA），用于检测不同的N2O通量条件下农田土壤中的微生物群落活动状态。检测结果显示，109个基因表达状况在高产N2O和低产N2O的条件下有明显的不同，证明功能基因芯片在环境微生物基因表达检测方面的适用性，其应用有助于利用微生物使N2O释放最少，以便最大程度地为农作物保留土壤中的氮素。
此外，大多数的微生物多样性研究集中在种群水平上的丰度和数量，少数学者关注了微生物群落之间的相互关系。对于数量巨大，多样的微生物群落，定义其复杂的网络结构是一项非常具有挑战性的任务，而高通量功能基因芯片的应用可以使这一领域的研究成为可能。Zhou等[22]通过研究提供了一个基于随机矩阵理论（random matrix theory，RMT）的概念框架，利用功能基因芯片获取了不同二氧化碳浓度下土壤样品中的数据，通过RMT方法从数据中自动识别分子网络，结果表明功能基因的分子生态网络在不同二氮化碳浓度下有明显的不同，功能基因网络的拓扑结构与土壤的地理化学参数有关。
2.2利用功能基因芯片探讨污染压力下的土壤微生态
应用功能基因分类芯片研究污染土壤的生物降解、生物修复等过程，在群落和基因的水平上对微生物进行动态检测，为提高修复降解效率提供可借鉴的理论基础。
Liang等[23]利用功能基因芯片对位于中国东北的油田土壤进行原位检测，考察不同石油污染压力下的土壤微生物群落多样性。研究结果反映了不同污染压力下的功能基因的响应关系，功能基因的丰度和多样性随着污染浓度的增加下降，含油量和土壤有效氮对微生物功能基因影响最大。钟毅等[24]以中国大庆油田典型污染场地土壤为研究对象，利用基因芯片技术分析在石油污染、调节氮磷营养、种植植物（紫花苜蓿、高羊茅和羊草）等不同微生态环境下的土壤微生物群落结构特征。此外，Rhee等[25]为了有效地监测生物降解微生物种群，开发了基于50-mer寡核苷酸探针的功能基因微阵列，应用到多环芳烃和苯-甲苯-乙苯-二甲苯污染土壤和未污染土壤分析，证明此技术具有望成为专一、灵敏和可定量的工具来揭示污染环境样品中微生物群落和生物降解基因的动态，但其检测灵敏度仍需进一步改善。Zhang等[26]通过功能基因芯片Geochip进行了多环芳烃污染土壤中微生物功能基因的研究，微生物的多环芳烃相关基因与多环芳烃的浓度之间的关系有助于阐明不同污染浓度下功能基因的动态机理。研究结果表明，虽然污染浓度对整体的微生物群落产生负面压力，但个别的多环方烃相关降解基因随着污染浓度的增加活动更加活跃，说明一些特定的微生物群落在相应的环境压力下存活率更高。
功能基因芯片应用于污染土壤研究的优势在于：可以提供生物修复降解相关的关键基因和其他生理功能基因的动态信息，在找出引起这种动态变化的驱动力的同时，微观地把微生物在降解修复中所发挥的功能与其他生物化学功能相联系，从而描绘在污染压力下的微生物功能网络。
3前景展望
功能基因芯片是将生物学、物理学、化学及计算机科学汇集于一体的新型高通量微阵列技术，因其对功能基因的针对性而得到越来越多的关注。从功能基因角度探讨微生物群落，可以深入了解微生物在各个营养物质循环与能量循环中所发挥的功能，探讨在不同宏观环境和污染压力下微生物功能的改变，追查致使微生物群落的功能和分布发生变化的关键因子，为更有效地利用微生物资源提供支持。未来，在利用功能基因芯片进行土壤微生态的研究中，应在以下两个方面深入。
（1）给合mRNA的检测，研究微生物群落的状态及真实的生理活动。因为检测DNA得到的信息中包括来自无活性细胞的功能基因，因此要结合对mRNA的检测，得到功能基因真实得到表达的信息来补充。土壤样品中的核酸提取及纯化本身就需要较高的要求，对样品前处理的技术也要越加完善。对DNA和mRNA的共同关注有利于得到土壤微生态系统的更加全面真实的信息。
（2）重视微生态细节过程，预测微生态在环境压力下的响应。现今的生态模型只是把微生物群落看作是一个黑匣子，假定生物地理化学变化与微生物群落的丰度和功能没有显著的相关性，因此一般会忽视微生态的细节过程。通过功能基因芯片获取的微生物群落结构和功能的信息可以打开这个黑匣子，将信息整合为看得见的微生物群落生态网络，用于预测各种环境压力下的微生态响应。
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微生物多样性分析方法范文4
双生子研究是一种经典的流行病学研究方法，主要通过对双生子群体的研究，即比较同卵双生子和异卵双生子性状的相似性来判断遗传和环境哪种对于疾病或性状更为主要的一种方法。同卵双生子（monozygotic twins）具有基本相同的遗传物质，表型特征极为相似。同卵双生子之间的差异可以排除遗传因素的作用，可用以研究不同环境因素对表型的影响。异卵双生子（dizygotic twins）具有50%相同的遗传物质，其在特点上无异于两次不同妊娠的同胞，但双生子同胞之间具有相同的年龄，进行比较时可以避免年龄的混杂，同时也可以排除不同子宫环境对胎儿发育及疾病所带来的影响。通过比较同卵及异卵双生子性状的差异，可以分析遗传和环境两个方面对个体性状的影响。本研究拟通过双生子法，以聚合酶链反应-变性梯度[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]凝胶电泳（polyme-rase chain reaction-denaturing gradient gel electropho-resis，PCR-DGGE）分析双生子儿童口腔微生物群组结构构成的差异，从而观察遗传及环境因素对人口腔微生物群组结构构成的影响。
1 材料和方法
1.1 试验对象
随机选取2011年8月—2012年3月于四川大学华西口腔医院儿童口腔科就诊的双生子儿童20对，年龄3～11岁，根据WHO口腔健康调查基本方法第三版龋病诊断标准，记录龋失补牙面（dmfs/DMFS）指数。其中有龋者17人，无龋者23人。
所有入选双生子儿童为共同生活背景，无全身系统性疾病史，3个月内无全身使用抗生素史，未使用激素类药物及免疫抑制剂，1周内口腔局部未使用抗生素。儿童及其法定监护人知情同意。
根据儿童牙列情况分为乳牙列组以及混合牙列组。乳牙列组双生子共10对，年龄3～6岁，其中无龋（caries free）儿童13人，有龋（caries）儿童7人，dmfs指数为2.29±1.38。混合牙列组双生子共10对，年龄6～11岁，其中无龋儿童10人，有龋儿童10人，dmfs/DMFS指数为7.20±4.42。
1.2 卵形鉴定
用无菌棉签采集儿童口腔黏膜样本，鉴定双生子儿童卵形。采用16个多态标记（D3S1358，vWA，FGA，AMEL，D8S1179，D21S11，D18S51，D5S818，D13S317，D7S820，TH01，PE，D16S539，CSF1P0，PD，TPOX）的基因分型对所有双生子进行卵形鉴定。20对双生子中，同卵双生子10对，异卵双生子10对；乳牙列组中同卵双生子3对，异卵双生子7对；混合牙列组中同卵双生子7对，异卵双生子3对。
1.3 唾液样本采集
进食后2 h取样，清水漱口后采集非刺激性唾液，直接用加样枪从受试者口底采集，采集量为5 mL。采集的唾液放入离心管内，冰浴下2 h内放入-80 ℃冰箱冻存。
1.4 DNA提取
将临床采集的唾液样本在室温下解冻，将唾液样本混合，2 600×g离心10 min，沉淀样本中的残渣及真核细胞，取上清，14 000×g离心5 min，弃上清，收集细菌沉淀用于提取DNA和PCR-DGGE分析，以获得原始唾液细菌谱。利用QIAamp DNA Micro Kit提取全基因组DNA，提取产物使用Pigogreen荧光定量法测定浓度，A260/A280测定DNA纯度。
1.5 16s rRNA基因扩增及PCR-DGGE分析
使用通用引物bal 1（5’-CGC CCG CCG CGC CCC GCG CCC GTC CCG CCG CCC CCG CCC GAC TAC GTG CCA GCA GCC-3’）、bal 2（5’-GGA CTA CCA GGG TAT CTA ATC C-3’）扩增DNA样本16s rRNA基因，扩增产物长度约300 bp。PCR反应体系：PCR master mix预混液25 μL，25 mmol·L-1引物各1 μL，100 ng纯化基因组DNA，加去离子水补足50 μL。循环条件：起始步骤94 ℃变性3 min；94 ℃变性1 mi[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]n，56 ℃退火1 min，72 ℃延长2 min，30个循环；72 ℃延长5 min。取PCR扩增产物5 μL进行1%琼脂糖凝胶电泳验证，0.5 μg·mL-1溴化乙锭染色后置长波紫外光下观察。
以8%的聚丙烯酰胺凝胶形成40%（含2.8 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）至60%（含4.2 mol·L-1尿素及24%甲酰胺）的线性浓度梯度。每个加样孔中加入约300 ng的PCR产物。将凝胶浸没于装有1×TAE缓冲液（40 mmol·L-1 Tris base，40 mmol·L-1冰醋酸，1 mmol·L-1乙二胺四乙酸）的电泳槽中，使用Bio-Rad Dcode系统恒定60 V电压，58 ℃下电泳17 h。电泳完成后，TAE缓冲液漂洗凝胶，含0.5 μg·mL-1溴化乙锭的1×TAE缓冲液染色15 min后用1×TAE漂洗15 min洗去多余染料。使用Molecular Imager Gel Documentation system获取并记录PCR-DGGE凝胶的数码图像[3]。
1.6 数据分析
使用Quantity one软件标记PCR-DGGE图谱条带，并使用非加权组平均法（unweighted pair-group method with arithmetic means，UPGMA）构建系统发育树，得到相似性矩阵（similarity matrix）。使用Quantity one软件导出实验数据后，计算多样性指数（Shannon index）及PCR-DGGE条带数。
采用SPSS 16.0软件进行统计分析。数据服从正态分布者采用独立样本t检验，不服从者采用独立样本t’检验。
2 结果
2.1 PCR-DGGE图谱分析
乳牙列组PCR-DGGE图谱见图1。泳道2～6、8、11为有龋者，7、9、10、12～21为无龋者。
2.2 UPGMA系统发育树
乳牙列组UPGMA系统发育树见图3。2-3、4-5、6-7、10-11、14-15、16-17、18-19为异卵双生子，8-9、12-13、20-21为同卵双生子。除6-7这对双生子外，其余9对双生子之间均出现明显聚类（90%），但同卵双生子和异卵双生子间无统计学差异（P>0.05）。混合牙列组UPGMA系统发育树见图4。1-2、3-4、7-8、9-10、11-12、13-14、19-20为同卵双生子，5-6、15-16、17-18为异卵双生子。6对双生子之间有明显聚类（60%），但同卵双生子和异卵双生子之间无统计学差异（P>0.05）。
在乳牙列组中，同卵双生子的相似性 为75.70±1.70，异卵双生子的相似性为71.83±6.69，两者间无统计学差异（P=0.21）；混合牙列组中，同卵双生子的相似性为58.53±10.37，异卵双生子的相似性为57.87±21.51，两者间无统计学差异（P=0.86）。这说明在乳牙列及混合牙列同卵及异卵双生子中，口腔微生物组成的相似性无明显差异，遗传因素对口腔菌群微生物构成的作用可能小于环境因素。
2.3 口腔微生物多样性分析
双生子儿童口腔微生物PCR-DGGE条带数及多样性指数分析见表1。乳牙列组中，有龋儿童的PCR-
DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，且两者间均具有统计学差异（P<0.05）。混合牙列组中，有龋儿童的PCR-DGGE条带数及多样性指数低于无龋儿童，但两者间均无统计学差异（P>0.05）。
3 讨论
PCR-DGGE[专业提供写作论文和论文写作服务，欢迎您的光临dylw.net]是一种非培养指纹图谱方法，通过PCR-DGGE方法可以在同一块胶上观察不同的细菌种类。利用细菌16S rRNA基因进行PCR特异性扩增结合DGGE分析已成为研究微生物群落多样性的常规方法。本研究发现乳牙列组有龋儿童中，唾液细菌的多样性较低，而无龋儿童唾液细菌的多样性较高。在混合牙列双生子中，虽然无龋与有龋儿童的细菌多样性无统计学差异，但仍能看出患龋后微生物多样性减少的趋势。推测其可能的原因是：有龋儿童口腔内可能有更高比例的产酸菌及耐酸菌[4-5]，且其口腔微环境可能更适合致龋菌的生存，所以致龋菌的比例升高，从而导致细菌整体丰度下降[6-7]。
在本研究中，通过PCR-DGGE聚类分析可以发现，大多数双生子出现明显聚类，其中，乳牙列双生子中有9对出现明显聚类（90%），混合牙列双生子中有6对出现明显聚类（60%），这证明在大部分双生子之间，口腔菌群微生物构成的相似性非常高。但同时可以看到，无论是乳牙列还是混合牙列，同卵双生子和异卵双生子之间的口腔菌群相似性均没有明显差异，说明在口腔微生物菌群构成中，环境因素（共同生活等）的影响可能更大于遗传因素。同时，乳牙列儿童双生子的口腔菌群构成相似程度（90%）与混合牙列双生子的菌群构成相似程度（60%）不同，这与其他学者[8]的研究结果相吻合。
Corby等[9]的研究显示，遗传因素对唾液中的细菌定植有显著影响。其他学者[10]的研究也证实遗传因素对人及动物模型中唾液变异链球菌的定植及龋易感性均有明显影响。本研究结果也显示，有龋儿童及无龋儿童唾液微生物的种类有所不同，有龋儿童的唾液微生物种类减少。在同卵及异卵双生子中，均发现有较高的口腔微生物菌群相似性，而这种相似性在同卵双生子及异卵双生子之间没有发现差异。混合牙列双生子中口腔微生物的相似性低于乳牙列双生子，可以由此推测，在口腔微生物菌群构成中，环境的作用可能大于遗传的作用。
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微生物多样性分析方法范文5
关键词：小白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino var. communis Tsen et Lee）；轮作；连作；有机肥；土壤微生物特性
中图分类号：S634.3/.1+5 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2016）24-6498-06
DOI：10.14088/ki.issn0439-8114.2016.24.044
连作障碍是指在同一土壤中连续种植同一种或科的植物时，即便给予正常的栽培管理也会出现植物生长势变弱、产量和品质下降的现象[1]；一般作物在连作5 a以后连作障碍会比较严重。连作障碍主要表现为幼苗死亡率高、植株生长不良、发病率增加、产量下降等[2]。研究表明，轮作是有效修复连作土壤、缓解连作障碍的措施之一[3]，但是轮作有效缓解连作障碍需要3～5 a的时间[4]。在种植业已经日益产业化、规模化的今天，长时间的轮作并不能完全实现，尤其是在设施蔬菜种植区，由于经济利益的驱动和种植习惯的原因，有效轮作受到限制，因此必须寻找一种在短时间内可以调控连作障碍的措施来替代轮作。研究表明，连作会引起土壤微生物多样性降低、细菌数量减少、真菌数量增加，土壤线虫的结构也会趋向于不利于土壤质量的方向发展；而长期轮作有助于提高土壤微生物多样性、增加细菌数量、减少真菌数量，使土壤线虫结构得到改善[5]，土壤生物学特性的改善将改进连作土壤物理特性和化学性状。分析轮作改善连作土壤性状的机理可以看出，轮作与连作的区别是轮作对土壤输入了轮作作物的根系分泌物和残茬，而连作输入的连作作物根系分泌物和残茬；轮作提供了多样性植物、有机物质，对微生物群落及其功能产生了良性影响，提高了微生物群体多样性和功能多样性[6]，更多能源物质的投入也增加了微生物数量[7]，进而增加了土壤酶活性，催化了土壤中生化反应。嫁接、间作、套作等栽培方式也是通过改变土壤中有机物的组成来提高土壤微生物群体活性和酶活性[8，9]。对连作土壤投入有机物料也可以改变土壤有机物组成、微生物活性、土壤酶活性[10]；然而怎样投入有机物料才能达到轮作的效果，其对土壤的改变关键是什么鲜有研究。试验以蔬菜连作土壤为对照，比较轮作模式、不同有机物投入方式对连作土壤及其作物的影响，试图揭示有效的有机物投入模式及其对连作土壤微生物的影响机理，从而为蔬菜生产提供更加有效的连作障碍缓解措施。
1 材料与方法
1.1 试验设计
试验于2011～2015年在武汉市农业科学技术研究院北部园区蔬菜科学研究所基地进行。供试土壤为砂壤土，小白菜（Brassica campestris L. ssp. chinensis Makino var. communis Tsen et Lee）在其中连作6 a，试验地pH为5.8，有机质含量15.64 g/kg、碱解氮含量122.79 mg/kg、速效磷含量62.53 mg/kg、速效钾含量87.92 mg/kg。
试验设6个处理，处理A，小白菜连作6 a土壤，在6 a里全年种植小白菜；处理B，玉米轮作1 a，小白菜连作5 a后玉米轮作1 a；处理C，玉米、黄瓜、生菜、辣椒轮作3 a，小白菜连作3 a后种植其他作物（玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米）；处理D，小白菜连作土壤施商品有机肥100 kg/667 m2；处理E，秸秆还田，小白菜连作土壤加入玉米秸秆4 500 kg/667 m2；处理F，施发酵生物有机肥，小白菜连作土壤施用自制生物发酵有机肥，其制作方法为用新鲜的牛粪，玉米秸秆和微生物制成[11]，用量为4 500 kg/667 m2。
采取露地试验，每个处理3次重复，小区面积1.2 m×10.0 m，条播种植；于种植年的10月28日播种。小白菜播种前，D、E、F处理分别施相应的商品有机肥、秸秆和发酵生物有机肥；田间除草和防治病虫害等栽培管理措施同正常大田生产。
1.2 样品采集与处理
试验于2015年11月2日采集土壤和植株样品，土壤样品按5点取样法，每小区随机采取0～20 cm层土样，剔出大的植株残体和石粒等杂物，混合均匀后带回武汉市蔬菜科学研究所实验室，风干，研磨，过100目筛后直接装入密封袋，放入4 ℃冰箱备用；植株从子叶节处剪断，并取作物根系，将其冲洗干净后，置于低温取样盒内带回实验室。
1.3 测定方法
土壤微生物生物量碳含量（MBC）采用氯仿熏蒸-K2SO4浸提法测定，参考熏蒸提取-容量分析法[12]；土壤有机质含量采用重铬酸钾容量法-外加热法[13]测定；小白菜干物质重测定于105 ℃下烘干后称重；小白菜根系活力用氯化三苯基四氮唑（TTC）法[13]测定，根系质膜P-H+-ATPase水解活性采用文献[14]的方法测定；根系MDA含量用文献[15]的方法测定，土壤脲酶活性测定用比色法，以1 g土中NH3-N的含量表示；土壤转化酶活性测定用3，5-二硝基水杨酸比色法，以1 g土样（24 h）所产生葡萄糖的质量来表示；土壤磷酸酶活性测定用磷酸苯二钠比色法，以1 g风干土壤中的酚含量来表示[16，17]；光合速率（Net photosynthetic rate，Pn）测定采用Li-6400便携式全自动光合测定系统（美国LI-COR公司），于晴天无风上午9：00～11：00进行测定；土壤碳源利用AWCD值采用Biolog Eco微平板对土壤微生物功能进行测定[18]，首先称取10 g新鲜土壤，加入90 mL的去离子水，180次/min振荡10 min，然后在4 ℃条件下静置30 min；再吸取1 mL土壤悬浮液到999 mL去离子水中，摇匀，配成浓度10-3的稀释液体；将稀释液倒入灭菌的培养皿中，接种于Biolog Eco微平板，每孔125 μL样品；每24 h利用读板仪在590 nm下读数1次，连续读数7 d。
1.4 数据分析
试验数据采用Microsoft Office Excel 2003程序处理并绘图，应用SAS 8.1系统软件进行差异显著性比较；对连作小白菜的根系活力与小白菜种植地的土壤酶活性、土壤微生物生物量碳含量（MBC）、土壤碳源利用AWCD值进行相关分析。
2 结果与分析
2.1 不同处理对小白菜干物质重与光合速率的影响
6个处理对小白菜干物质重的影响情况见图1，对小白菜光合速率的影响情况见图2。从图1、图2可以看出，各处理不同程度地提高了小白菜的干物质重和光合速率。与处理A小白菜连作6 a相比，其他处理的干物质重分别比处理A增加了32.0%、83.5%、4.1%、55.7%、92.8%，光合速率分别增加了28.9%、76.3%、6.3%、52.7%、88.6%；其中添加发酵生物肥处理和玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米轮作3 a处理对小白菜干物质的积累及光合作用的影响最大。这表明长期连作抑制了小白菜干物质的累积以及光合作用；而采用轮作或施发酵生物肥能有效提高其干物质重和光合速率。
2.2 不同处理对小白菜根系活力、根系质膜P-H+-ATPase活性、MDA含量的影响
6个处理对小白菜根系活力的影响情况见图3，对小白菜根系质膜P-H+-ATPase活性。的影响情况见图4。从图3、图4可以看出，各处理不同程度地提高了小白菜的根系活力及根系质膜P-H+-ATPase活性，与处理A相比，根系活力分别增加了23.0%、66.1%、6.2%、50.6%、75.9%；根系质膜P-H+-ATPase活性分别增加了29.1%、84.0%、3.4%、53.8%、78.2%；这表明长期连作显著降低了作物自身的根系活力和根系质膜P-H+-ATPase活性。根系MDA含量可反映细胞膜的伤害程度，6个处理对小白菜根系MDA含量的影响情况见图5。从图5可以看出，各处理不同程度地降低了根系的MDA含量，与处理A相比，根系的MDA含量分别降低了21.8%、46.2%、10.2%、36.7%、48.4%。这表明长期连作后导致土壤环境恶化，作物积累了大量自由基，造成一定的氧胁迫，加重了根系质膜的伤害，使根系MDA含量增加；而添加发酵生物肥处理和玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米轮作3 a处理对小白菜根系活力、根系质膜P-H+-ATPase活性、根系MDA含量产生了积极的影响。
2.3 不同处理对小白菜种植地土壤酶活性的影响
6个处理对小白菜种植地土壤酶活性的影响情况分别见图6、图7、图8。从图6、图7、图8可以看出，多数处理增加了土壤酶活性，其中玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米轮作3 a处理的土壤脲酶活性较小白菜连作6 a处理增加了1.05倍；土壤酸性磷酸酶活性各处理较小白菜连作6 a处理分别增加了33.8%、30.8%、2.3%、60.9%、48.9%；添加发酵生物肥处理和玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米轮作3 a处理的转化酶活性较小白菜连作6 a处理分别增加了107%、111%。这表明长期连作使土壤微生物生态恶化，理化性质变劣，土壤营养水平下降；而采用轮作或施发酵生物肥能有效改善土壤理化性质，促进土壤微生物生长，产生更多土壤酶，使营养元素有效性提高。
2.4 不同处理对小白菜种植地土壤有机质、MBC含量和碳源利用AWCD值的影
6个处理对小白菜种植地土壤有机质含量的影响情况见图9。从图9可以看出，各处理的有机质含量具有一定的差异，与小白菜连作6 a处理相比，其他处理的土壤有机质含量分别增加了10.7%、32.1%、0.9%、21.4%、33.0%，其中玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米轮作3 a处理与添加发酵生物肥处理的效果显著。
6个处理对小白菜种植地土壤MBC含量的影响情况见图10。从图10可以看出，各处理的MBC含量变化差异较大，与小白菜连作6 a处理相比，其他处理的土壤MBC含量分别增加了1.80倍、5.39倍、0.049倍、4.18倍、5.66倍，差异悬殊。这说明栽培方式的改变以及生物有机肥的施用为土壤微生物提供了有机营养保障，促进了微生物的活动与繁殖。
6个处理对小白菜种植地土壤碳源利用AWCD值的影响情况见图11。从图11可以看出，各处理的AWCD值在刚开始的24 h内增长很小，在24～132 h时段中增长明显，这个时间段微生物活性最高，132～168 h趋于稳定状态。对比不同处理的土壤碳源利用AWCD值可以看出，在132 h前，玉米-黄瓜-生菜-辣椒-玉米轮作3 a处理与添加发酵生物肥处理的AWCD值一直处于相对较高水平，说明这2个处理的微生物代谢旺盛；施商品有机肥处理和小白菜连作6 a处理的变化几乎一致，处于相对较低水平，说明长期连作明显影响土壤微生物活动，而商品有机肥的使用对微生物的代谢影响不明显。
2.5 连作小白菜根系活力与土壤微生物特性的相关分析
对连作小白菜的根系活力与小白菜种植地的土壤酶活性、土壤微生物生物量碳含量（MBC）、土壤碳源利用AWCD值进行相关分析，结果见表1。从表1分析可见，连作小白菜根系活力与土壤脲酶、酸性磷酸酶、转化酶活性之间存在极显著的相关关系，与MBC及AWCD之间也存在极显著的相关关系。而土壤酶活性与土壤MBC之间，MBC与AWCD之间均存在极显著的相关关系。
3 讨论
3.1 轮作及有机肥对小白菜生长及生理的影响
设施小白菜连作障碍在形态上表现为死株、植株整体生长不良、早衰，在生理上表现为根系活力下降、地上部光合速率下降；生产上调控连作障碍的措施有轮作和施用有机肥[19，20]。尽管轮作对连作障碍的缓解效果影响很大，但由于生产需求和设施不可移动的限制，通常轮作时间未能达到3～5 a的需求，甚至只有1 a的轮作时间。试验结果表明，相对于长期连作，轮作1 a处理的干物质累积及光合速率显著提高，但是显著低于轮作3年的处理，说明轮作1 a处理未能完全消除连作障碍；有机肥也是缓解连作障碍的有效措施，但是不同有机肥的施用效果并不一致。现在生产上施用的有机肥主要有商品有机肥、利用秸秆还田、发酵生物有机肥等。本试验结果表明，不同有机肥对于连作的缓解效果不一。商品有机肥处理下小白菜干物质重和光合速率与连作处理的差异不大，这个结果与万菲菲等[21]的研究结果不一致，可能原因是试验连作施肥水平不一致造成的。而秸秆还田和发酵生物有机肥的施用均显著提高了连作小白菜干物质重及光合速率，这与徐萌等[22]、邓接楼等[23]的研究结果一致。不过秸秆还田处理的效果低于相同使用量的发酵生物有机肥处理，说明不同有机肥处理方式及其水平对作物生长的影响较大。根系是植株摄取养分和水分的主要器官，其生长状况和活力水平直接影响着植株地上部分的营养状况及产量水平；根系的生理活性可以影响植株吸收水分和养分的能力，尤其是在逆境胁迫下，强壮和庞大的根系是保证植株正常生长的基础[24]。轮作和有机肥处理对连作障碍的缓解可能与其对连作植株根系活力的提高有一定的关系[25，26]，本试验轮作和有机肥处理对根系活力的提高及缓解连作对根系的伤害与干物质累积、光合速率的提高有相同的影响趋势就旁证了这一观点。
3.2 轮作及有机肥对连作土壤酶活性的影响
土壤酶来源于土壤微生物代谢、植物根系分泌物以及动植物残体的腐解过程[27]，在土壤有机物转化及养分循环中发挥着重要作用[28]。脲酶是土壤中最活跃的水解酶类之一，可以水解施入土壤中的尿素，释放供作物利用的铵离子[29]；磷酸酶是一种催化土壤中有机磷化合物的酶，活性的高低直接影响土壤中有机磷的分解转化和其生物有效性[30]；转化酶可以提高土壤生物学活性，参与碳水化合物转化为植物、微生物可以利用的营养物质过程[31]。试验中，轮作、秸秆还田、生物发酵有机肥处理均显著提高了土壤酶活性，这与杜社妮等[32]、Bastida等[33]的研究结果一致。可能是轮作和发酵有机肥处理向土壤输入了大量有机质后改善了土壤理化性质、促进了土壤微生物生长、产生出更多土壤酶的缘故。
3.3 作及有机肥对连作土壤微生物生物量及碳源利用的影响
土壤微生物活性是土壤质量的重要指标[34]。相比连作作物长期对土壤输入相对单一碳源，轮作和有机肥处理补充了大量有机碳源，更加有利于维持土壤微生物活性及多样性。试验结果表明，轮作显著提高了有机质含量及土壤微生物生物量碳含量（MBC），同时土壤碳源利用AWCD值显著提高，AWCD值反映了微生物对不同碳源代谢的总体利用能力及微生物活性强弱[35]。其中3年轮作处理土壤微生物数量及活性显著高于1年轮作处理，表明多样性增加及大量碳源的施入提高了土壤微生物活性。商品有机肥虽然含有大量活性生物菌，但是由于对土壤碳源施入得很少，其微生物活性相比连作处理提高不显著，这导致商品有机肥缓解连作障碍的效果有限。秸秆还田和发酵生物有机肥显著提高了土壤微生物数量及活性，这与它们对土壤酶活性及连作作物根系活力、光合速率的影响相一致，土壤微生物活性、酶活性、根系活力可能存在一定的联系。
3.4 土壤酶活性、根系活力、微生物活性的相关关系
试验结果表明，土壤酶活性、小白菜根系活力、土壤微生物生物量碳含量（MBC）之间存在显著正相关关系，这与李明静等[10]的研究结果一致。这是土壤肥力、土壤微生物与土壤酶协同发展的结果。土壤酶的高活性来源于土壤微生物大量繁殖[36]，土壤养分的循环依托土壤酶对底物的转化。
总的来看，采用合理轮作及适宜的有机肥施入方式，可以显著改善连作土壤酶活性及微生物活性，促进连作小白菜提高根系活力、加快生长，要是较长时间轮作和大量施入发酵有机肥，则缓解连作障碍的效果更好。
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微生物多样性分析方法范文6
关键词沉积物；放线菌；分离；抗菌活性；西岛内港
中图分类号 Q939.132 文献标识码A文章编号 1007-5739（2011）11-0017-02
StudyonSelectiveIsolationandAnti-FOC 4ActivityofActinobacteriafromSedimentofXidaoWharf
XU Xiao-xiong 1，2FENG Hui-min 1CHEN Yong-gan 1MA Hong-mei 1
（1 Qiongzhou University，Sanya Hainan 572022； 2 Hainan Key Laboratory for Herpetological Research（preparation））
AbstractAfter pretreatments of steam heat（60 ℃，10 min），the sediment suspensions collected from the wharf of Xidao island were transferred and spread onto the GA media. 44 actinobacteria including 18 Streptomyces and 26 non-Streptomyces-like were isolated according to their morphology on agar plates and under microscope. Strain 090413 revealed antagonistic effect of against Fusarium oxysporum f.sp.cubense（race 4，FOC 4）.
Key wordssediment；actinobacteria；Isolation；anti-FOC 4 activity；Xidao wharf
放线菌广泛分布于人体、土壤、污水、海洋及矿井等环境中，是一类重要的药用微生物资源[1]。海洋生物的多样性、复杂性和特殊性使源于其中的海洋天然产物也具有多样性、复杂性和特殊性，为寻找海洋生物活性物质提供了丰富的物质来源[2]。20世纪90年代末，海洋放线菌由于自身特殊的生存环境，具有复杂独特的代谢途径，产生了诸多结构新颖、生物活性显著的次级代谢产物，这些活性代谢产物为新抗生素的发现提供了丰富的先导化合物，有些已经进入临床前研究。2005―2006年，Fenical科研小组从海洋放线菌Salinispora属[3]和Marinispora属[4]的菌株中发现了一系列结构新颖的化合物，一些表现出更强的抗癌作用，一些具有新的抑菌作用靶点，它们具先导化合物或候选药物的潜力，这一切对寻找新型高效抗生素具有积极作用，同时也为抗生素的发展提供了新的方向。
1材料与方法
1.1试验材料
1.1.1土壤样品采集。土壤样品采集于西岛内港采集沉积物（地理坐标为北纬18°14.371′，东经109°22.433′）。
1.1.2供试培养基。葡萄糖天门冬素培养基（GA）：葡萄糖2 g；天门冬素1 g、K2HPO4 0.5 g、MgSO4・7H2O 0.5 g、琼脂20 g、陈海水500 mL、蒸馏水500 mL，pH值7.2～7.4。均添加了终浓度为50 mg/L的放线菌酮、制霉菌素及重铬酸钾；复合维生素（每1 L培养基添加V 0.5 mg、V0.5 mg、V 0.5 mg、烟酸0.5 mg、肌醇0.5 mg、泛酸0.5 mg、生物素0.25 mg，对-氨基苯甲酸0.5 mg）。ISP 2培养基：酵母粉4 g、葡萄糖4 g、麦芽浸提粉10 g、琼脂15 g、陈海水500 mL、蒸馏水500 mL，pH值7.2～7.4。
1.2试验方法
1.2.1预处理。土壤样品采集后置于阴凉处7 d，自然风干，湿热60 ℃，10 min；1 g土壤置于9 mL的1/4格林溶液10-1的稀释液中超声波处理10 min；然后用1/4格林溶液稀释得到10-2、10-3的溶液。
1.2.2菌株分离纯化与保藏。采用稀释平板分离法分离菌株，取10-1、10-2、10-3稀释液各100 μL涂布到GA培养基，3次重复。涂布平板置于28 ℃恒温培养28 d，根据平板上菌落的形态特征，选取平板上所有的代表性菌落，挑取到ISP 2 琼脂培养基上，采用三步划线法纯化获得单菌落[5]。纯化好的菌株保藏于20%甘油管中，置-20 ℃保藏。
1.2.3分离菌株相态分类。根据菌株在ISP 2培养基上的菌落形态及制片显微观察，通过气生菌丝、基内菌丝和孢子的生长及着生方式，初步判断其归属。
1.2.4拮抗对持试验。将ISP 2培养基平均分成2个区域，将1株分离菌株接种到其中1个区域中间，置28 ℃下培养2 d以后，将香蕉枯萎病4号生理小种（FOC 4）接种到同一培养基的另一区域中间，继续置28 ℃下培养2～4 d。以香蕉枯萎病1号种直接接种ISP 2培养基作为对照。通过肉眼观察香蕉枯萎病1号种的生长情况，初步判断分离菌株是否具有抗香蕉枯萎病活性。
2结果与分析
2.1放线菌的选择性分离效果
从分离平板上观察，基本上都是放线菌，只有少数平板上长了细菌。从GA选择培养基上一共分离得到44株放线菌。通过在ISP 2纯化培养基上的菌落观察及在显微观察孢子丝的形态，初步判断其中有18株是链霉菌，其他26株为非链霉菌。而非链霉菌中，以小单孢菌居多。结果说明该分离方案能选择性分离得到较多的放线菌。预处理中的湿热60 ℃、10 min是选择性分离小单孢菌的预处理方法，说明该法同样适用于海洋来源的小单孢菌。
2.2链霉菌抗菌活性情况
抑菌试验结果显示，大多数链霉菌中未能抑制香蕉枯萎病病原菌生长，仅有菌株090314表现出一定的抗香蕉枯萎病4号生理小种FOC 4活性（图1）。
3结论与讨论
三亚西瑁州岛地处国家级珊瑚礁自然保护区，是典型热带海洋岸礁生态系统，蕴含着丰富的海洋生物物种。区内生产力很高，微生物资源丰富，生态保护较好，是保护海洋生物多样性的重要海区。通过对其沉积物中的可培养放线菌进行选择性分离、纯化、保藏，收集该区域的微生物资源，为进一步开发利用提供基础和依据。目前18株链霉菌仅有1株显示出一定的抗菌活性，其他链霉菌将进行其他抗性模型的筛选，进一步挖掘其潜力。
香蕉枯萎病是香蕉种植产业上的毁灭性病害，该病严重危害产蕉区的安全生产，因香蕉枯萎病病原菌复杂的遗传背景，化学防治和选育抗病品种防治表现出很多困难，目前生物防治控制香蕉枯萎病是很多研究者努力探索的一条途径。吴庆菊等[6]从五指山土壤分到的45 株放线菌的发酵液对香蕉枯萎病菌具有不同程度的抑菌作用；夏启玉等[7]发现了香蕉的内生细菌可以抑制香蕉枯萎病病原菌生长；黄 瑶等[8]发现海洋源芽孢杆菌对香蕉枯萎病也有较好的作用。Getha 等[9]从海洋分离的海洋链霉菌对香蕉枯萎病有较好的防治效果。本研究通过收集西岛海域的放线菌资源，并探索其中可能成为香蕉枯萎病生防菌的菌株。目前发现菌株090314表现出一定的抗菌活性。因此，有必要深入研究其抗性的稳定性及在土壤中的定殖情况，为开发海洋放线菌、防治香蕉枯萎病奠定基础。
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