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动物行为学研究范文1
关键词人参皂苷Rb2； 药代动力学； 代谢产物； 液相色谱四极杆飞行时间质谱
1引 言
人参皂苷Rb2为人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的主要活性成分之一， 含量约为6.7 mg/g[1]。研究表明， 人参皂苷Rb2能抑制地塞米松引起的细胞凋亡作用[2]， 对于小鼠在辐照诱导的造血系统损伤具有保护作用[3]。人参皂苷Rb2能够降低在高胆固醇或脂肪酸培养下的3T3L1脂肪细胞的胆固醇和三酰甘油的含量[4]。另外， 人参皂苷Rb2对物质代谢亦有一定的影响， 能够通过AMPK介导抑制糖原异生作用[5]； 能明显增加大鼠骨髓细胞DNA、蛋白质的合成， 促进血清蛋白质合成等活性[6～10]。人参皂苷在胃肠道中和酸性条件下会产生多种代谢和转化产物， 包括人参皂苷Rg3和CK等具有活性的化合物[11～13]。因此人参皂苷的药代动力学、生物和化学转化产物研究也一直备受关注， 对于揭示人参皂苷的药理作用和物质基础有重要意义， 并且直接影响人参的开发应用。Karikura等[14，15]对于人参皂苷Rb2在大鼠大肠和胃中的代谢情况进行了研究， 鉴定了氧化和去糖基化代谢产物。有文献针对口服后复方中人参皂苷Rb1、柚皮苷和人参皂苷Rb2进行了药代动力学研究[16]。但对于人参皂苷Rb2单体的大鼠体内代谢动力学和代谢产物未见报道。为了获得人参皂苷Rb2在生物体内药代动力学参数， 更好地理解其在生物体内的生物转化和排泄途径， 本研究将利用RRLCQTOF MS联用技术对大鼠静脉注射和口服人参皂苷Rb2后的血浆、尿液、粪便进行检测， 计算静脉注射后相关的药代动力学参数并分析鉴定其代谢产物。为深入研究开发人参皂苷Rb2提供理论基础， 对进一步阐明人参皂苷Rb2的生物活性提供依据。
2实验部分
2.1仪器与试剂
6520RRLCQTOF质谱仪（美国安捷伦公司）； 5804R台式高速大容量冷冻离心机（德国Eppendorf公司）； ULT13863V41超低温冰箱（美国Thermo公司）； 超纯水机（美国Millipore公司）。人参皂苷Rb2， Rf， F2， CK固体对照品（吉林大学， 纯度95%）； 甲醇、乙腈和甲酸（色谱纯， 美国TEDIA公司）； Wistar大鼠（体重（200 ± 10）g， 雄性， 购自吉林大学）。
2.2实验条件
2.2.1色谱条件Agilent SBC18色谱柱（100 mm× 3.0 mm， 1.8 μm， 600 bar）， 柱温25℃； 采用二元线性梯度洗脱： 流动相A为0.1%甲酸溶液， B为乙腈。梯度洗脱： 0～13 min， 25%～46% B； 13～19 min， 46%～50% B； 19～22 min， 50%～90% B； 22～25 min， 90% B。进样量为5 μL。
2.2.2质谱条件采用电喷雾负离子模式； 质量扫描范围m/z 100～2200； 干燥气流速（N2）为8.0 L/min； 干燥气温度为350℃； 雾化气压力为255 kPa； 碰撞电压为3500 V， 裂解电压为175 V， 锥孔电压65 V。实验数据采用安捷伦Masshunter软件（B.03.01版本）进行分析。
2.3样品的配制及样品处理
以甲醇为溶剂将Rb2和Rf（内标）标准品分别配制为100和10 μg/mL的对照品母液。4℃冷藏备用， 实验时用甲醇稀释。将不同浓度的Rb2对照品母液和Rf工作液各100 μL， 加入100 μL 空白大鼠血浆中混匀， 再加入200 μL甲醇， 涡旋1 min沉淀血浆中蛋白， 离心5 min， 取上清放入另一试管中， 最终配制成相当于Rb2浓度为0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和1.3 μg/mL的血浆标准液。
2.4验方法
选取6只大鼠分别用于Rb2静脉注射给药， 给药方式为尾静脉注射， 给药剂量为2mg/kg。分别于给药前（0时）和给药后2， 5， 10， 15， 20， 30， 40， 60和90 min和2， 4， 6， 8， 12及24 h目内眦取血， 每个时间点取血0.5 mL， 血液冷却后3000 r/min离心10 min， 取上清血浆100 μL， 测定前加入100 μL Rf内标液和300 μL甲醇， 涡旋30 s， 静置5 min， 离心10 min。取上清液， 装瓶， 待测。
选取6只大鼠， 随机分为Rb2静脉注射组和口服组， 每组3只， 静脉注射剂量为2 mg/kg， 口服剂量为50 mg/kg， 制备方法同上。以上动物给药后均放入代谢笼中收集尿液（0～24 h）和粪便（0～24 h）， 尿液样本收集后， 经氮气吹干浓缩， 水饱和正丁醇萃取， 萃取液再用氮气吹干， 经过80%甲醇提取后， 用0.45 μm微孔滤膜过滤， 最后用80%甲醇定容至1 mL， 待测； 粪便样本收集后进行研磨粉碎， 加入50 mL水溶解， 再用100 mL水饱和正丁醇分3次萃取， 萃取液放置蒸发皿中， 置水浴锅上蒸干， 然后用80%甲醇溶解并定容至1 mL， 待测。
3Y果与讨论
3.1RRLCQTOFMS和MS/MS方法的优化
利用人参皂苷Rb2进行RRLCQTOFMS和MS/MS的检测方法优化。Rb2是二醇型人参皂苷（图1）， 在苷元的C3位和C20位分别为葡萄糖葡萄糖和葡萄糖阿拉伯糖取代。分别在RRLCQTOFMS正离子和负离子模式下进行测定。测定的准分子离子和碎片离子的误差小于10 ppm（图2A）， 在下文中讨论的离子的m/z数值均用整数表示。在0.1%甲酸水溶液作为流动相的条件下， Rb2在负离子模式下分别给出[M-H]
3.2方法学考察
3.2.1专属性通过比较空白与加入Rb2和内标的血浆样本的LCMS色谱考察本实验的专属性。人参皂苷Rb2和内标Rf的选择性良好， 生物基质的干扰较小， Rb2和内标Rf的保留时间分别为10.08 min和10.57 min。
3.2.2线性关系用Rb2/内标Rf的峰面积比值（Y）与Rb2含量（X）进行最小二乘线性回归， 得到标准曲线回归方程为Y=3.5174X+0.117， R2=0.9937。结果显示在0.10～1.26 μg/mL的浓度范围内线性关系良好， 检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.08和0.10 μg/mL。
3.2.3精密度与准确度采用高、中、低3个浓度的Rb2血浆QC样本， 每个浓度进行6个样本分析， 连续测定3天。计算日内和日间精密度和准确度。日内和日间精密度的相对标准偏差别（RSD）均小于5%， 表明本方法的精密度和准确度良好。
3.2.4提取回收率分别取Rb2高、中、低3个浓度的QC样本， 将空白血浆中先加入Rb2， 处理后计算所测得峰面积， 与空白血浆处理后加入相同量Rb2所测得峰面积比值的百分率进行比较， 考察样品的提取回收率。结果表明， Rb2提取回收率范围为92.6%～93.4%， RSD小于15%。
4结 论
本研究建立了人参皂苷Rb2的RRLCQTOFMS 和MS/MS药代动力学和代谢产物研究方法。药代动力学研究表明人参皂苷Rb2体内分布代谢符合二室模型， 血药浓度半衰期的α相（t1/2α）和β相（t1/2β）分别为（23.576±1.103）min和（1306.545±147.226）min， 在体内有较高的血浆蛋白结合率。α相分布较快， 而β相的消除较缓慢。运用优化后的RRLCQTOFMS/MS方法， 对静脉注射和口服后人参皂苷Rb2的代谢产物进行了系统研究。结果表明， 去糖基化是人参皂苷Rb2在大鼠体内主要的代谢方式。鉴定了代谢产物M6、M2（CY）、F2和CK， 总结了大鼠在静脉注射和口服给药后Rb2尿液和粪便的代谢路径， 分别为Rb2M6M2和Rb2M6M2（CY）/F2CK代谢途径。人参皂苷Rb2的药代动力学研究和体内代谢转化研究结果为更好地理解和开发人参皂苷Rb2的应用价值提供了理论基础。
动物行为学研究范文2
【关键词】 灯盏花素 再灌注损伤 行为
［ABSTRACT］Objective To investigate the effect of breviscapine on the ethological index after cerebral ischemia/reperfusion in gerbils. Methods A cerebralischemiareperfusion model of gerbils was established， ischemia time being 10 minutes. Gerbils were randomised to shamgroup， control group and breviscapine group. They were further pided into four subgroups， eight in each group. Reperfusion was carried out in the latter two groups， which lasted for 1， 2， 4， and 7 d， respectively. The ethological index of gerbils was counted by the open field method after reperfusion. The brain temperature in all gerbils was kept at(37.2±0.2) ℃ during the experiment. Results After different time of reperfusion， the score of ethological index in control group was higher than that in shamgroup， that in breviscapine group was higher than shamgroup， but was lower than control group. Conclusion Breviscapine could reduce cerebral ischemia/reperfusion injury in gerbils by attenuating the changes of the behavioral marks.
［KEY WORDS］ Breriscapine; Reperfusion injury; Behavior
脑缺血再灌注损伤及其防治的研究一直为国内外学者所关注，至今未获得重大进展。低温具有确切的脑保护作用，但其本身存在诸如增加血黏度、干扰微循环、引起心律失常等副作用。灯盏花素注射液是一种中成药，具有蛋白激酶C（PKC）抑制作用，同时具有降低血黏度、改善微循环之功效。有研究表明，灯盏花素可减轻脑缺血再灌注损伤。本研究就灯盏花素对沙土鼠脑缺血再灌注后相关行为学指标的影响做进一步探讨。
1 材料与方法
1.1 动物模型制作
沙土鼠24只，体质量(50～70)g，雌雄不拘。戊巴比妥钠40 mg/kg腹腔注射麻醉后，将动物俯卧于手术台上，自头顶部切开皮肤，于矢状缝外2 mm、前囟后2 mm处，用细钻钻洞（不钻透脑膜），置入自制电极，用牙托粉固定。电极接多功能脑电监护仪监测脑电图，以判断是否造成沙土鼠前脑缺血。然后将动物仰卧于实验台上，切开颈部正中皮肤，仔细分离双侧颈总动脉，用无创动脉夹阻断颈总动脉造成前脑缺血，松开动脉夹恢复脑血流即为再灌注[1，2]。脑缺血时间10 min。假手术组仅游离双侧颈总动脉但不予阻断。各组动物在脑缺血再灌注期间均将其放入恒温箱中，以使脑温控制在（37.2±0.2）℃。
1.2 动物分组
将动物随机分为假手术组、对照组和灯盏花素组，每组8只动物，后两组再根据再灌注时间分为再灌注1、2、4、7 d等4个亚组。灯盏花素组于脑缺血前30 min和再灌注后6 h时腹腔注射灯盏花素注射液90 mg/kg（云南省生物制药厂），假手术组和对照组动物在相同时间点注射等容量的生理盐水。
1.3 相关行为学指标检查
沙土鼠脑缺血再灌注后1、2、4和7 d应用开阔法观察其行为学变化，开阔法检查所用的迷宫尺寸为76 cm×72 cm×57 cm，划分为25个方格。检查时将沙土鼠放于正中格中，记数其10 min内爬过的格子数。每次检查时保持房间安静和室内灯光强度一致。
1.4 统计学处理
数据均以±s表示，组间比较采用t检验。
2 结 果
沙土鼠脑缺血再灌注后1、2、4和7 d，假手术组行为学评分为244±51，对照组行为学评分明显高于假手术组（t=5.399～11.372，P
3 讨 论
沙土鼠因缺乏Willis动脉环，阻断双侧颈总动脉可造成前脑缺血，故被广泛应用于脑缺血的实验研究。但近来的研究发现，部分沙土鼠存在解剖学变异，阻断双侧颈总动脉不易造成前脑缺血[3]。
灯盏花素注射液是从云南灯盏花全草中分离所得，其主要成分是黄芩素甙。有研究表明，灯盏花素具有PKC抑制作用[3]，同时其还可降低血黏度、改善微循环。另有研究表明，灯盏花素可减小大脑中动脉阻断后皮质梗死灶的体积，减轻脑缺血再灌注损伤[4～6]。
开阔法是检查沙土鼠脑缺血后神经功能障碍的常用方法之一。海马在维持动物的学习、记忆和空间定位能力等方面发挥着重要作用，当海马功能受损时，表现为探索活动活跃。海马对脑缺血特别敏感，短暂的脑缺血即可造成海马神经元死亡。本实验结果显示，沙土鼠脑缺血10 min再灌注1、2、4和7 d后，对照组的行为学评分明显高于假手术组，提示脑缺血引起海马神经元功能受损，导致沙土鼠探索活动次数增加。而缺血前应用灯盏花素沙土鼠行为学评分尽管高于假手术组，但明显低于对照组，证实灯盏花素可减轻脑缺血再灌注损伤。
【参考文献】
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动物行为学研究范文3
[关键词] 感染性脑损伤；橙皮苷；强迫游泳
[中图分类号] R-33 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）11（c）-0031-02
Influce of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by LPS
WU Jian1 LIU Hong-zhi1 WEN Xiang-ru2 FU Yan-yan1 ZHANG Lei3 SUN Ying3 ZHANG Fang1 LIU Yong-min2 DONG Hong-yan1 LIU Yong-hai3 SONG Yuan-jian1
1.Neurobiology Research Center， Basic Courses School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；2.Teaching and Research Section of Chemistry， Public Education School of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China；3.Department of Neurology， Affiliated Hospital of Xuzhou Medical College in Jiangsu Province， Xuzhou 221004， China
[Abstract] Objective To investigate the influence of hesperidin on forced swimming test of mice with cerebral injury induced by lipopolysaccharide （LPS）. Methods 45 ICR mice at 3 weeks were evenly divided into saline group， LPS group and LPS + hesperidin group （Hesp） in random. Mice from 3 groups in accumulative distance and cumulative time within 5 minutes′ swimming were tested by ZH-QPT forced swimming test video analysis system. Results Compared with saline group， the accumulative distance of swimming in LPS group was obviously shorter， but there was no significant change in cumulative time in the two groups. In comparison with the LPS group， the accumulative distance of swimming in LPS+Hesp group became longer， but without obvious changes in cumulative time. Conclusion Hesperidin can remarkably prolong the distance in forced swimming test in mice with infectious cerebral injury.
[Key words] Infectious cerebral injury； Hesperidin； Forced swimming
脑部细菌或病毒感染是导致新生儿、幼儿脑损伤的重要原因之一。脑损伤后常遗留运动功能障碍、认知行为障碍等神经系统后遗症[1]。因此，探究感染性脑损伤后行为学指标的改变有重要意义。脂多糖（lipopolysaccharide，LPS）是革兰氏阴性细菌细胞壁的主要成分，为脂质和多糖的复合物，属内毒素，具有神经毒性。幼年小鼠的血-脑脊液屏障（blood brain barrier，BBB）尚不健全，LPS会造成小鼠感染性脑损伤。可应用LPS建立小鼠的感染性脑损伤模型，并借助这一模型研究感染性脑损伤后行为学指标的改变。橙皮苷（hesperidin，Hesp）在柑桔类植物的果实中广泛存在，具有多种功能，如抗炎、镇痛、抗氧化、抗癌等[2-3]，另有很好的神经保护作用[4]。它是否会影响感染性脑损伤动物的行为，目前未见报道。
强迫游泳行为学实验可用于初步研究神经或精神类药物的作用，也可初步筛选相关药物[5]。通过强迫游泳实验，考察LPS诱导的感染性脑损伤小鼠的行为学变化，以及橙皮苷对该行为学变化的影响，有助于认识和理解脑损伤导致的行为变化规律，为感染性脑损伤的诊断、治疗和康复提供新的思路和方法。
1 材料与方法
1.1 仪器和试剂
LPS购自Sigma公司，Hesp购自郑州荔诺生物科技有限公司；强迫游泳实验设备采用淮北正华公司的ZH-QPT型强迫游泳实验视频分析系统，硬件系统尺寸为直径10 cm，高30 cm；记录分析软件采用Stoelting公司的Any-maze system，版本为4.72版。
1.2动物及分组
3周龄、雄性健康ICR小鼠45只，体重为8～11 g，由徐州医学院实验动物中心提供。将小鼠随机分为3组，每组15只：生理盐水（saline）组，腹腔注射生理盐水；LPS组，腹腔注射LPS；Hesp组，即先用LPS处理，后给予Hesp。
1.3方法
1.3.1 动物模型制备 saline组小鼠腹腔注射生理盐水；LPS组腹腔注射LPS生理盐水溶液，剂量为5 mg/kg；LPS+Hesp组先腹腔注射LPS（5 mg/kg），0.5 h后Hesp（剂量为200 mg/kg，混悬于0.5%羟甲基纤维素钠水溶液中）灌胃。将以上各组小鼠6 h后置于ZH-QPT型强迫游泳实验视频分析系统中观察并记录其行为学指标。
1.3.2 强迫游泳实验行为研究 实验环境的水温20～25℃，首先将小鼠置于水中适应2 min，再记录随后5 min的行为，用Any-maze system软件记录分析活动指标，包括活动路程、累积活动时间及累积静止时间。
1.3.3统计学方法 采用SPSS 13.0统计软件，计量资料以x±s表示，组间比较采用方差分析，以P
2结果
saline组小鼠在5 min内游动了（14.49±4.08）m，LPS处理后，小鼠游动路程大幅缩短，仅（6.96±1.74）m，差异有统计学意义（P
表1 各组小鼠在强迫游泳实验视频分析系统中的活动路程、累积游动时间和累积静止时间的比较（x±s）
与saline组比较，aP
图1 小鼠强迫游泳实验视频分析系统中的状态图
A.静止状态；B.活动状态
3 讨论
脑损伤中，除创伤性损伤外，感染性脑损伤、渐进性脑损伤的发生、进展的机制多样而复杂。感染性脑损伤常见于新生儿和幼儿，脑损伤可能导致幼儿精神神经异常和行为障碍，治疗困难[6]，康复往往采用高压氧等方法[7]，常会导致患儿认知障碍、精神神经行为异常。幼年小鼠的血-脑脊液屏障不健全，本研究用LPS处理雄性ICR小鼠，建立了感染性脑损伤模型。
除强迫游泳实验外，研究动物的行为变化还可采用旷场实验、水迷宫实验、悬尾实验等，强迫游泳实验是最早用于研究抑郁类行为的方法[8]，结果可靠性强。不同性别小鼠的强迫游泳行为不同[9]，本研究讨论雄性ICR小鼠的强迫游泳行为。温度等理化因素对实验动物的强迫游泳行为也有影响，本研究控制实验水温为20～25℃。结果表明感染性脑损伤小鼠在强迫游泳实验中行为异常，虽然累积静止时间没有变化，但是活动路程显著降低。
Hesp是治疗心血管病的药物，是多效药物，有研究表明其有神经保护作用，但作用机制不明，对动物的行为学有何影响，目前未见报道。本研究通过强迫游泳实验发现Hesp可以逆转LPS对小鼠游泳行为的影响，在维持累积静止时间不变的同时，显著增加活动路程。
因此，从强迫游泳实验结果看，Hesp可以有效减轻LPS诱导的小鼠游泳行为障碍，其中所涉及的分子机制，本实验室正在进一步研究。
[参考文献]
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动物行为学研究范文4
关键词：酯；高级醇；醒酒小鼠；小鼠行为学
中图分类号：TS262.5 文献标识码：A 文章编号：1674－0432(2011)－05－0085－1
1 材料与方法
1.1材料
1.1.1实验动物普通昆明种小鼠，雌雄各半，20+2g，标准环境喂养(北京大学医学部动物实验中心提供)。
1.1.2实验试剂乙醇(北京化工厂，分析纯)；异戊醇(天津津科精细化工研究所，分析纯)；异丁醇(东京化工株式会社，分析醇)；正丙醇、正丁醇(德国FLUKA公司，分析纯)；甲酸、乙酯、乙酸乙酯、已酸乙酯、乙酸异戊酯、乙酸异丁酯
1.1.3实验仪器滚筒运动测试仪(RB－200B型)；1 ml针筒注射器(国营常州注射器厂)
1.2方法
1.2.1灌胃高级醇、酯类配比高级醇成分配比：异戊醇50％，异丁醇30％，正丙醇15％，正丁醇5％。酯类成分配比：甲酸乙酯25％，乙酸乙酯50％，已酸乙酯5％，乙酸异戊酯10％7,酸异丁酯10％。
1.2.2滚筒实验昆明小白鼠，20±2g，雌雄各半，随机分为对照组，3个灌胃酯溶液组和3个灌胃高级醇溶液组，剂量分别为0.5ml／20g，1.0ml／20g，2.0ml／20g。每组15只，通电后，小鼠在滚筒中滚动，记录10分钟内掉筒及爬筒次数。
1.2.3统计学分析结果用iS表示，并采用excell进行统计分析。
2 结果与讨论
2.1酯类对小鼠行为学的影响
啤酒在发酵过程会产生大量酯类并在贮存过程酯类会有所增加。表1可以看出，每组剂量下，小鼠的掉筒次数会随着酯类浓度的增加而增加，但经统计学分析，不同含量酯类物质在不同给药剂量下对小鼠掉筒次数影响并不显著，说明酯类对小鼠行为有一定的兴奋作用，但这种刺激作用不强烈。
2.2高级醇对小鼠行为学的影响
经实验表明对小鼠进行高级醇灌胃后有头晕感，当高级醇含量超过100ppm，这种影响非常显著。由表2分析，正常小鼠灌胃空白2ml后，意识清醒。在5分钟内，平均掉筒次数1.73±0.75，
掉筒后在电击作用下重新爬上滚筒。灌胃高级醇30ppm，随剂量增加掉筒次数增加不明显。
灌胃高级醇70ppm，1ml，掉筒显著(P
由此表还可以看出，随着高级醇浓度的增加，灌胃剂量对小鼠的影响越来越大。灌胃剂量由1.0ml增至2.0ml时，在30ppm掉筒次数由1.13±0.11增至1.73±0.75，而在150ppm时掉筒次数由17.66±7.46增至46.36±11.81。
动物行为学研究范文5
关键词：自体血注入法；脑出血；模型；大鼠
中图分类号：R743.34 文献识别号：A
出血性脑卒中是原发于脑实质内的非外伤性出血，致残及致死率高较高，该病严重危害着人类的健康。对脑出血的实验研究一直受到广泛重视，脑出血造模的稳定性、同患者发病表现的接近性直接关系到实验研究的科学性和实用性。本实验研究通过鼠尾动脉血分次回注自体大鼠脑组织内，建立脑出血的大树模型。
1资料与方法
1.1实验仪器 脑立体定向仪 （日本）；100 μL微量注射器，涡轮牙钻机；手术相关器械
1.2一般资料 近交成年雌性SD大鼠90只，体重（300±20）g。由河北医科大学实验动物中心提供，标准普通饲料喂养和自由饮水，昼夜自然节律，饲养环境为河北大学医学部动物实验中心多层层流架。
1.3方法 大鼠脑出血模型的制备：应用10%水合氯醛对大鼠腹腔注射量为300 mg/Kg进行麻醉，头部备皮并应用碘伏常规消毒后，俯卧位固定于定向仪上，前囟抬高1 mm，取长度约为2 cm正中纵形切口，小型扩皮器牵开切口，取前囟点中线右侧旁开3.0 mm，沿矢状面向后1.5 mm，牙钻钻透颅骨，深及骨膜。在消毒后在鼠尾腹侧正中做一纵行切口，抽取尾动脉不加抗凝剂的动脉血液约60～70 μL。将针头垂直于颅骨骨孔的方向，进针约6 mm，缓慢注入50 μL自体动脉血液，注血时间以两分钟为宜，为防止鼠血反流，将针留置10 min。缓慢退针，骨蜡封闭颅骨骨孔，缝合手术创口。
1.4行为学的分级评估 参照Longa 五级评分法[1]，对大鼠进行神经功能缺损评分：0级：无体征，记0分；Ⅰ级：动物不能完全伸直其前肢，记1分；Ⅱ级：动物一侧肢体瘫痪，有追尾现象，记2分；Ⅲ级：动物不能站立/ 打滚，记3分；Ⅳ级：无自发性活动，有意识障碍，记4分。
2结果
大鼠实验脑出血造成后，进行行为学评分，每只大鼠均采用Longa方法，反应其行为学变化。根据对实验动物的观察，在大鼠大脑注射自体鼠尾动脉血液后，动物迅速出现行为和神经功能异常，大鼠反应迟钝、皮毛无光泽、精神萎缩、进食下降，对侧肢体出现瘫痪，行走追尾，严重者动物不能站立/打滚，个别大鼠呈现意识障碍，昏迷等表现，其功能异常程度与出血的严重程度相关。脑组织标本可见明显的血肿占位，结合对大鼠造模3 d后进行行为学评分，评分2～3分得提示模型建立成功。评分1分的4只，2分的34只，3分46只，4分的6只。造模成功80只，成功率88.9%。
3讨论
脑出血动物模型的制备成为了研究脑血管病不可或缺的基础，而好动物脑出血模型是接近于人类脑出血的血肿、水肿、缺血缺氧等病生理变化，符合疾病的发展规律的，并且动物模型具有较好的稳定性、可重复性。
动物模型的应用，使脑出血过程的神经生物学基础研究得到较大进展。在过去几十年里有很多方法造脑出血的动物模型，用于模仿脑出血的发病机制，其原理各不相同，效果也不尽相同，模型的选择至关重要。常用的方法有以下几种：①胶原酶诱导脑出血模型，应用胶原酶向脑组织中注入，胶原酶刺激破坏脑内组织，破坏血管而渗血形成血肿[1]。②微球囊充胀脑出血模型，在大鼠大脑尾状核包埋微小气囊，充盈气囊造模，产生占位效应脑部伤害一致，可重复性好，但同颅内血肿产生的其他病生理改变不同。③自发性脑出血模型，用遗传方式筛选出自发性高血压大鼠，待出现高血压严重并发症脑出血后提示造模成功，本模型能够较准确的模拟高血压脑出血等病理生理变化，存在的问题是获得脑出血模型的时间不能把握，出血部位及大小各异，各模型间对比性差；④凝固自体动脉血注入脑出血模型，抽取大鼠股动脉血，静置5 min待动脉血凝固后后脑内注射。此方式可控制鲜血沿针道返流问题，但同时存在血液凝固后血肿在脑内塑形困难[2]。⑤应用立体定位技术取自体血注血脑出血模型，即本研究采用造模方法，新抽取鲜鼠尾动脉血，应用立体定位仪固定微量注射器，精确定位于尾状核，穿刺并脑内注血，注血量50 μL血相当与人35 mL的血肿，应用非肝素化自体动脉血，更接近接近人类自发性出血性卒中，适合研究脑出血病理生理特点，能够观察各种因子在血液凝固过程中对脑血流及脑组织细胞代谢的影响，本研究取SD大鼠脑内最大的核团--尾状核，是高血压脑出血最好发部位，对脑出血的研究提供可靠的依据[3]。
根据对实验动物的观察，其功能异常程度与病变严重程度一致。脑组织标本在尾状核部位可见明显的血肿形成，提示模型建立成功，本组大鼠造模成功率88.9%，本造模方式是能够较好的模拟脑出血的病理生理的改变，应用此方法保证了在对脑出血的研究过程中确保实验数据的真实性和可靠性。
参考文献：
[1]倪厚杰，刘娜，陈娟，等.神经损伤与功能重建[J].2012，7（06）：411-412.
动物行为学研究范文6
【摘要】 目的：建立新生大鼠脑白质损伤模型，探讨脑白质损伤后少突胶质细胞(OL)凋亡和远期神经行为的变化。方法：5日龄新生大鼠随机分为实验组和对照组，制作缺血性脑白质损伤动物模型；术后不同时间点观察生长发育，HE染色、免疫荧光标记观察脑组织病理形态改变、细胞变化，悬吊试验、旷场试验、拒俘反应测试神经行为学改变。结果：实验组生长发育明显慢于对照组，HE染色脑室周围白质疏松，侧脑室增大，髓鞘磷脂蛋白(MBP)免疫荧光标记实验组阳性细胞数较对照组明显减少(P
【关键词】 缺血性脑损伤； 脑室周围白质软化； 少突胶质细胞; 新生大鼠
产科和新生儿重症监护诊疗技术的发展，大大提高了早产儿的存活率，但随之而来的早产儿脑损伤也较为突出。有研究认为，早产儿脑损伤主要在白质，脑室周围白质软化(periventricular leucumalacia，PVL)是早产儿脑损伤的主要形式［1］，高发于胎龄24～32周的早产儿，发生率达26%～60%［2］。PVL可造成脑白质部位少突胶质细胞(oligodendrocyte，OL)前体的受损和丢失，致使脑白质内髓鞘不能形成，导致成活早产儿呈现痉挛性肢体瘫痪、认知障碍以及视听障碍等后遗症［3］。PVL发病机制复杂，还不完全清楚，尚须进一步研究。本研究采用双侧颈总动脉结扎法(bilateral carotidartery occlusion，BCAO)制作5日龄未成熟大鼠缺血性脑损伤模型，观察其脑室周围白质病理变化和远期神经行为改变情况。
1 材料与方法
1.1 材料
5日龄新生SD大鼠10窝，共90只，雌雄不拘，体重8.5～11.0 g，由东南大学医学院实验动物中心提供，髓鞘磷脂蛋白（MBP）单克隆抗体由上海元象医疗器械有限公司提供，山羊抗兔IgG由北京中杉生物公司提供。
1.2 方法
1.2.1 动物分组
90只大鼠随机分为实验组(n=48)和对照组(n=42)两组。观察5、7、14、21、28日龄大鼠生长发育情况，对29、30日龄大鼠进行神经行为学检测。
1.2.2 模型制作
实验组：大鼠乙醚麻醉后取仰卧位于操作台上，消毒颈部皮肤，作颈腹侧正中切口约0.5 cm长，分离皮下组织，找到血管神经束，分离出双侧颈总动脉，用50丝线完全结扎双侧颈总动脉后缝合皮肤，在37 ℃恒温水浴箱内恢复至活动正常后返回母鼠身边饲养。对照组：手术同实验组，分离双侧颈总动脉，但不结扎，缝合皮肤后回笼。手术中及术后1周内对照组大鼠死亡1只，死亡率为2.4%，实验组死亡13只，死亡率27.1%，最终进入结果分析76只。
1.2.3 HE染色及免疫荧光检测
1.2.3.1 HE染色 实验动物于7、14、21、30日龄(行为学测试后)行心脏灌注后断头取脑，4%多聚甲醛固定24 h，取视交叉水平作石蜡切片(片厚4 μm)，行常规HE染色。
1.2.3.2 荧光抗体标记 分别于7、8、14、21日龄灌注取脑，4%多聚甲醛固定，300 g·L-1蔗糖沉底后取不同冠状面作冰冻切片(10 μm)，加入MBP(1∶200) 4 ℃过夜，暗室中加入山羊抗兔IgG (1∶50) 37 ℃孵育30 min，晾干后于倒置荧光显微镜(Olympus，200倍)下观察脑室周围白质部位细胞形态变化。每个标本连续作3张切片进行标记，每张切片选取5个视野（阳性细胞数最多者）计数，并取其平均值统计。
1.2.4 神经行为学测定
动物于29日龄行悬吊试验测试肢体肌力，旷场试验、拒俘反应检测随意运动和情感行为能力，“Y”臂迷宫试验测定学习能力，30日龄时复测“Y”臂迷宫试验，检测记忆能力，如果学习训练失败，则成绩不列入统计。
1.3 统计学处理
应用SPSS 15.0进行统计学处理，两样本均数比较采用t检验，结果均以x-±s表示，P
2 结
果
2.1 生长变化
实验组大鼠术后有皮肤苍白、皮温降低、活动减少、喂养困难、睁眼时间延迟、体重增长缓慢等异常表现。术前两组大鼠体重相差不大，术后实验组体重平均增长幅度低于对照组，第7天至1个月同日龄大鼠处死前体重明显低于对照组(P
2.2 HE染色
7日龄各组大鼠大脑外观未见明显改变，实验组大鼠镜下可见脑白质部位细胞水肿，细胞周围间隙增宽，脑室周围白质内大量OL呈凋亡样变化：胞浆浓缩，核质凝集，形成蓝黑色凋亡小体，个别区域有小片的坏死区，部分神经细胞胞核碎裂溶解消失，表现为坏死。但皮质、海马等部位细胞结构基本完整，未见明显的病理改变。14、21、30日龄实验组大鼠脑室周围白质较对照组明显染色浅且疏松，脑室周围白质及内囊组织相对疏松，内囊有空腔形成，脑室进行性扩大。对照组大鼠同时间点未见以上病理变化。见图1。表1 两组大鼠不同日龄体重比较
2.3 免疫荧光标记
荧光显微镜下可见MBP标记的细胞呈黄绿色荧光(图2)。7日龄实验组术后可见阳性细胞数目较对照组减少，8日龄减少最为明显，与对照组相比，差异有统计学意义(P0.05，表2）。
2.4 神经行为学测定
29日龄实验组大鼠在悬吊试验中悬吊在玻璃棒上时间较对照组短，在旷场试验中活动及后肢站立次数较对照组少，拒俘反应试验中表现为较易捕获，试验评分均较对照组低(P
3 讨
论
PVL是指侧脑室周围白质的坏死，常在大脑半球的白质区形成囊腔。未成熟脑白质主要由OL前体细胞构成，导致脑白质损伤的关键是OL损伤，OL是中枢神经系统的成髓鞘胶质细胞，其损伤主要影响髓磷脂的产生，最终导致脑白质的缺损，脑白质容积减少，脑室扩张等［4］。缺血在PVL发病机制的学说中占了主导地位，未成熟脑血流调控机制不成熟、脑白质在发育期血供不足和OL的前体细胞对损伤有高度的敏感性是PVL主要发病因素，血流降低会导致脑室周围白质中的OL损伤、凋亡、坏死，数量减少，从而致使髓鞘合成障碍，引起远期的神经行为缺陷。
研究表明，7日龄大鼠神经系统发育相当于人类足月或近足月的新生儿，脑组织中OL已逐渐发育成熟并发生髓鞘化，该阶段的OL对损伤易感性不强。大鼠生后5 d是神经元迁移的终末阶段，Uehara等［5］采用5日龄Wistar大鼠双极电凝器切断双侧颈动脉，2 d后检查，90.9％的大鼠内囊及周围白质出现病变，包括凝固性坏死和囊性变，54.5％皮质下白质受累而仅有22％皮质受损。张龙等［6］利用5日龄新生SD大鼠脑内注射神经毒素3硝基丙酸成功建立了PVL模型。Cai等［7］利用BCAO后联合低氧建立4日龄SD大鼠脑损伤模型。研究证实，鼠类生后5 d相当于人类妊娠24～30周［8］，1～5 日龄大鼠脑白质以OL的前体细胞为主，容易受损，从而影响髓鞘的形成，最终导致脑白质的缺损［9］。故本实验选择5日龄的SD大鼠通过BCAO模拟PVL病变。
本实验显示，缺血增加大鼠的死亡率，相同日龄实验组幼鼠体重明显低于对照组，并且睁眼时间延迟，大鼠的生长发育延缓。PVL的病理特征是白质出现明显损伤，而皮质损伤轻微，本实验模型主要表现为早期脑白质部位细胞水肿，细胞周围间隙增宽，脑室周围白质内OL凋亡坏死增多，皮质下及脑室周围白质出现疏松及液化灶，后期形成囊腔和脑室扩大，而脑皮质无明显变化。本实验MBP免疫荧光标记显示，缺血性脑损伤后MBP标记的细胞减少。MBP是反映OL及髓鞘结构、功能的重要指标之一，实验组早期免疫荧光MBP抗体标记阳性细胞数减少较对照组明显，生后2周对照组MBP阳性细胞数开始减少，系大鼠OL已发育成熟，MBP表达量减少。研究证实，在早产儿PVL的好发期，晚期OL前体更易受到缺氧缺血等因素的影响，导致白质内髓鞘不能形成，临床上呈现脑瘫和智能落后等后遗症［10］。PVL患儿神经行为学障碍在幼儿期才明显固定化，通常认为大鼠1月龄约等同于人类的2～5岁，其神经行为学特征性表现已经能够充分展示［11］，因此对29、30日龄大鼠进行神经行为学检测结果较为可靠。本实验表明，BCAO实验组动物与对照组比较有明显的远期神经行为学异常，表现为随意运动受限，肌力减弱，情感行为及学习能力差，且有明显的感知障碍，实验组神经行为表现与病理改变一致。
本研究显示，5日龄新生大鼠因双侧颈总动脉结扎缺血引起脑室周围白质严重损伤，出现液化、脑室扩大，OL凋亡较对照组增多，术后出现生长迟缓和远期神经行为功能缺陷，因此，有助于理解早产儿脑白质损伤发病机制和神经病理学变化，为PVL病理学机制及干预提供理论基础。
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