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动物行为学的研究范文1
关键词人参皂苷Rb2； 药代动力学； 代谢产物； 液相色谱四极杆飞行时间质谱
1引 言
人参皂苷Rb2为人参（Panax ginseng C. A. Mey.）的主要活性成分之一， 含量约为6.7 mg/g[1]。研究表明， 人参皂苷Rb2能抑制地塞米松引起的细胞凋亡作用[2]， 对于小鼠在辐照诱导的造血系统损伤具有保护作用[3]。人参皂苷Rb2能够降低在高胆固醇或脂肪酸培养下的3T3L1脂肪细胞的胆固醇和三酰甘油的含量[4]。另外， 人参皂苷Rb2对物质代谢亦有一定的影响， 能够通过AMPK介导抑制糖原异生作用[5]； 能明显增加大鼠骨髓细胞DNA、蛋白质的合成， 促进血清蛋白质合成等活性[6～10]。人参皂苷在胃肠道中和酸性条件下会产生多种代谢和转化产物， 包括人参皂苷Rg3和CK等具有活性的化合物[11～13]。因此人参皂苷的药代动力学、生物和化学转化产物研究也一直备受关注， 对于揭示人参皂苷的药理作用和物质基础有重要意义， 并且直接影响人参的开发应用。Karikura等[14，15]对于人参皂苷Rb2在大鼠大肠和胃中的代谢情况进行了研究， 鉴定了氧化和去糖基化代谢产物。有文献针对口服后复方中人参皂苷Rb1、柚皮苷和人参皂苷Rb2进行了药代动力学研究[16]。但对于人参皂苷Rb2单体的大鼠体内代谢动力学和代谢产物未见报道。为了获得人参皂苷Rb2在生物体内药代动力学参数， 更好地理解其在生物体内的生物转化和排泄途径， 本研究将利用RRLCQTOF MS联用技术对大鼠静脉注射和口服人参皂苷Rb2后的血浆、尿液、粪便进行检测， 计算静脉注射后相关的药代动力学参数并分析鉴定其代谢产物。为深入研究开发人参皂苷Rb2提供理论基础， 对进一步阐明人参皂苷Rb2的生物活性提供依据。
2实验部分
2.1仪器与试剂
6520RRLCQTOF质谱仪（美国安捷伦公司）； 5804R台式高速大容量冷冻离心机（德国Eppendorf公司）； ULT13863V41超低温冰箱（美国Thermo公司）； 超纯水机（美国Millipore公司）。人参皂苷Rb2， Rf， F2， CK固体对照品（吉林大学， 纯度95%）； 甲醇、乙腈和甲酸（色谱纯， 美国TEDIA公司）； Wistar大鼠（体重（200 ± 10）g， 雄性， 购自吉林大学）。
2.2实验条件
2.2.1色谱条件Agilent SBC18色谱柱（100 mm× 3.0 mm， 1.8 μm， 600 bar）， 柱温25℃； 采用二元线性梯度洗脱： 流动相A为0.1%甲酸溶液， B为乙腈。梯度洗脱： 0～13 min， 25%～46% B； 13～19 min， 46%～50% B； 19～22 min， 50%～90% B； 22～25 min， 90% B。进样量为5 μL。
2.2.2质谱条件采用电喷雾负离子模式； 质量扫描范围m/z 100～2200； 干燥气流速（N2）为8.0 L/min； 干燥气温度为350℃； 雾化气压力为255 kPa； 碰撞电压为3500 V， 裂解电压为175 V， 锥孔电压65 V。实验数据采用安捷伦Masshunter软件（B.03.01版本）进行分析。
2.3样品的配制及样品处理
以甲醇为溶剂将Rb2和Rf（内标）标准品分别配制为100和10 μg/mL的对照品母液。4℃冷藏备用， 实验时用甲醇稀释。将不同浓度的Rb2对照品母液和Rf工作液各100 μL， 加入100 μL 空白大鼠血浆中混匀， 再加入200 μL甲醇， 涡旋1 min沉淀血浆中蛋白， 离心5 min， 取上清放入另一试管中， 最终配制成相当于Rb2浓度为0.08， 0.1， 0.2， 0.4， 0.6， 0.8， 1.0和1.3 μg/mL的血浆标准液。
2.4验方法
选取6只大鼠分别用于Rb2静脉注射给药， 给药方式为尾静脉注射， 给药剂量为2mg/kg。分别于给药前（0时）和给药后2， 5， 10， 15， 20， 30， 40， 60和90 min和2， 4， 6， 8， 12及24 h目内眦取血， 每个时间点取血0.5 mL， 血液冷却后3000 r/min离心10 min， 取上清血浆100 μL， 测定前加入100 μL Rf内标液和300 μL甲醇， 涡旋30 s， 静置5 min， 离心10 min。取上清液， 装瓶， 待测。
选取6只大鼠， 随机分为Rb2静脉注射组和口服组， 每组3只， 静脉注射剂量为2 mg/kg， 口服剂量为50 mg/kg， 制备方法同上。以上动物给药后均放入代谢笼中收集尿液（0～24 h）和粪便（0～24 h）， 尿液样本收集后， 经氮气吹干浓缩， 水饱和正丁醇萃取， 萃取液再用氮气吹干， 经过80%甲醇提取后， 用0.45 μm微孔滤膜过滤， 最后用80%甲醇定容至1 mL， 待测； 粪便样本收集后进行研磨粉碎， 加入50 mL水溶解， 再用100 mL水饱和正丁醇分3次萃取， 萃取液放置蒸发皿中， 置水浴锅上蒸干， 然后用80%甲醇溶解并定容至1 mL， 待测。
3Y果与讨论
3.1RRLCQTOFMS和MS/MS方法的优化
利用人参皂苷Rb2进行RRLCQTOFMS和MS/MS的检测方法优化。Rb2是二醇型人参皂苷（图1）， 在苷元的C3位和C20位分别为葡萄糖葡萄糖和葡萄糖阿拉伯糖取代。分别在RRLCQTOFMS正离子和负离子模式下进行测定。测定的准分子离子和碎片离子的误差小于10 ppm（图2A）， 在下文中讨论的离子的m/z数值均用整数表示。在0.1%甲酸水溶液作为流动相的条件下， Rb2在负离子模式下分别给出[M-H]
3.2方法学考察
3.2.1专属性通过比较空白与加入Rb2和内标的血浆样本的LCMS色谱考察本实验的专属性。人参皂苷Rb2和内标Rf的选择性良好， 生物基质的干扰较小， Rb2和内标Rf的保留时间分别为10.08 min和10.57 min。
3.2.2线性关系用Rb2/内标Rf的峰面积比值（Y）与Rb2含量（X）进行最小二乘线性回归， 得到标准曲线回归方程为Y=3.5174X+0.117， R2=0.9937。结果显示在0.10～1.26 μg/mL的浓度范围内线性关系良好， 检出限（S/N=3）和定量限（S/N=10）分别为0.08和0.10 μg/mL。
3.2.3精密度与准确度采用高、中、低3个浓度的Rb2血浆QC样本， 每个浓度进行6个样本分析， 连续测定3天。计算日内和日间精密度和准确度。日内和日间精密度的相对标准偏差别（RSD）均小于5%， 表明本方法的精密度和准确度良好。
3.2.4提取回收率分别取Rb2高、中、低3个浓度的QC样本， 将空白血浆中先加入Rb2， 处理后计算所测得峰面积， 与空白血浆处理后加入相同量Rb2所测得峰面积比值的百分率进行比较， 考察样品的提取回收率。结果表明， Rb2提取回收率范围为92.6%～93.4%， RSD小于15%。
4结 论
本研究建立了人参皂苷Rb2的RRLCQTOFMS 和MS/MS药代动力学和代谢产物研究方法。药代动力学研究表明人参皂苷Rb2体内分布代谢符合二室模型， 血药浓度半衰期的α相（t1/2α）和β相（t1/2β）分别为（23.576±1.103）min和（1306.545±147.226）min， 在体内有较高的血浆蛋白结合率。α相分布较快， 而β相的消除较缓慢。运用优化后的RRLCQTOFMS/MS方法， 对静脉注射和口服后人参皂苷Rb2的代谢产物进行了系统研究。结果表明， 去糖基化是人参皂苷Rb2在大鼠体内主要的代谢方式。鉴定了代谢产物M6、M2（CY）、F2和CK， 总结了大鼠在静脉注射和口服给药后Rb2尿液和粪便的代谢路径， 分别为Rb2M6M2和Rb2M6M2（CY）/F2CK代谢途径。人参皂苷Rb2的药代动力学研究和体内代谢转化研究结果为更好地理解和开发人参皂苷Rb2的应用价值提供了理论基础。
动物行为学的研究范文2
1 神经行为学在药理评价中的应用
1.1 抗脑卒中药物的评价
一般用运动行为实验对脑栓塞动物模型（如大鼠）进行卒中后运动和协调能力的评价，从而判定药物是否对脑卒中后神经损伤恢复有效。运动整合及协调能力实验主要包括：平衡木实验、转棒实验、肌力实验、网屏实验、肢体对称实验、肢体放置实验、前肢放置检测、平行杠实验、爬绳实验、爬梯实验、前爪伸屈实验、步态分析实验等。然而，大脑尾状核、皮层和纹状区对运动 - 感觉信息的处理和整合起一定作用，这些区域在大脑中动脉梗死后很容易受损，并累及周围区域如肢体的皮层、额叶和颞叶。因此，目前认为缺血损伤后动物模型的神经行为学评价除了评估一般感觉运动功能，还应该将认知实验加入评估中。有证据表明，卒中后认知缺陷可持续超过一般的感觉运动缺陷。认知实验主要包括 Morris 水迷宫、放射状迷宫和 T 迷宫。
脑卒中动物模型在不同时期的行为学表现不同，因此行为学评价抗脑卒中药物，相关行为学指标表现出的敏感性，同时也存在着广泛的偏差，组织学检查结果和行为学实验相关，另一些则无关或相反。因此，当前的评价方法尚不能全面的反映脑卒中的生理病理状态，这就需要对模型生理病理指标与行为学指标相关性进行研究，综合多种方法进行评估，寻找最敏感稳定的行为学指标。
1.2 抗精神病药物的评价
焦虑模型主要分为 2 类：非条件反射模型和条件反射模型。其中比较经典的研究方法基于动物有畏惧空旷场地的天性和其活动具有趋避性而建立的旷场实验、避暗实验、高架十字迷宫和 Vogels 饮水冲突模型。
目前抑郁症行为学评价方法主要包括强迫游泳实验、悬尾实验、空场实验、获得性无助实验、新奇抑制摄食实验、糖水偏爱实验、间断性行为实验、睡眠干扰实验等。其中，动物强迫性游泳和悬尾测试是评价抗抑郁药作用最常用的方法，因其快速、方便、对多种抗抑郁药物有效，被广为接受和应用。然而，也有学者认为动物漂浮既可以是抑郁的表现，也可以是一种适应机制，动物以此节约能量，漂浮更长的时间，以维持更长的存活时间。
由于应激是导致焦虑和抑郁发生的重要原因之一，应激对心理情感、认知功能及反应判断能力等行为活动均产生影响，研究应激致动物行为方法主要有社会交互实验，动物可出现社会逃避及兴趣缺失的抑郁样行为，此外还有动物束缚实验、糖水偏爱实验、条件性防御掩埋实验、听觉惊跳实验等。
1.3 抗衰老药物的评价
神经退行性病变是由于神经元进行性变性死亡导致的以中枢神经系统损害为主的神经系统疾病，与年龄相关的大脑退行性变化是大脑中枢神经系统在生长、发育、成熟之后走向衰老过程中而表现的生物老化的正常生理现象。其最突出的临床表现是记忆和学习能力下降，因此抗衰老药物行为学评价主要考察对学习记忆障碍的作用。主要研究方法包括空间记忆和非空间记忆，在空间学习记忆中，采用 Morris 水迷宫、八臂迷宫、T 型迷宫、辐射式迷宫等方法。近年来新的认知方法出现，可以对空间学习记忆和非空间学习记忆进行测试，如物体认知测试系统，包含新物体的识别、新物置识别以及情景记忆和时序记忆。其中新物体的识别、情景记忆和时序记忆属于空间记忆；新物置识别属于非空间记忆。在条件反射方法中，非条件刺激可以是惩罚性的也可以是奖励性的。使用惩罚性条件刺激的行为检测方法如穿梭、跳台、避暗等已被广泛应用于学习记忆和巩固相关行为研究。但这些方法检测的学习记忆能力大多是基于对环境刺激的被动反应，而且需要给予惩罚性 / 伤害性刺激使动物完成学习记忆，对动物的生理及心理影响较大，同时影响神经递质的释放。而利用奖励物质的奖赏效应，大脑会向负责决策的区域发送奖赏信号，形成好的记忆。奖赏效应能使机体的认知能力进一步提升，形成良性循环，易化条件反射的形成。
1.4 其他药物的评价
神经行为学方法除了主要用于以上药物的评价，还用于抗疲劳药物、促进睡眠药物以及镇痛药物的评价中，抗疲劳药物大多具有兴奋中枢神经系统的作用，行为学检测主要采用游泳实验、转棒实验。促进睡眠药物主要采用阈下催眠实验。镇痛药物根据作用部位不同可分为中枢镇痛药和外周镇痛药，用于评价外周药物镇痛作用的方法主要有小鼠醋酸扭体实验；评价中枢镇痛药物的方法热板法、热辐射甩尾实验以及福尔马林测痛实验，目前新的研究方法有步态行为测试，通过研究动物运动的步态及足底压力评价药物的治疗作用。
2 神经行为学在药物安全性评价的应用
2.1 在一般毒性评价中的应用
神经行为学实验可以发现一些神经毒性的相关终点，长期毒性实验中增加对特异性终点的评价，可以提高实验动物的利用率，缩短危险评价所用的时间，并获得额外的数据。如评价抗抑郁药物的长期毒性实验可增加对动物自主活性的观察指标。而在一些不确定是否有神经毒性的创新药物评价中，神经毒性筛查也可与长期毒性实验相组合，筛查的目的在于确定是否需要进行附加的更加深入的神经毒理学实验，如步态异常有助于毒性部位的确定，例如下运动神经元疾病可致跨越步态；剪形步态和僵硬步态说明上运动神经元损害；小脑功能不良可致共济失调及步态蹒跚。关于神经系统的毒性特征，犹如靶器官毒性一样，能随染毒期限的长短表现不同。神经毒性作用的意义取决于它的可逆性，一般来说，不可逆作用较可逆作用严重，神经系统的区域对生理功能影响较其他系统更为重要。
2.2 在安全性药理评价中的应用
由于毒物对神经系统的作用范围很广，一般采用功能组合实验来评价药物对神经系统的安全性。目前动物神经行为测试还没有一套标准模式的神经行为功能测试组合，只是经济合作与发展组织（OECD）在感觉、运动、认知等方面推荐了一些测试方法，综合评价被测化学物质的神经行为毒性。国家食品药品监督管理总局（CFDA）规定中枢神经系统药物安全性评价可定性和定量评价给药后动物的运动功能、行为改变、协调功能、感觉 / 运动反射和体温的变化等，以确定药物对中枢神经系统的影响。当核心组合实验及文献报道提示药物存在潜在的与人体安全性有关的不良反应时，应进行追加和 /或补充的安全药理学研究。追加的安全药理实验是除了核心组合实验外，反映受试物对中枢神经系统、心血管系统和呼吸系统的深入研究。如追加的安全药理学实验对中枢神经系统的影响包括对行为、学习记忆、神经生化、视觉、听觉和 / 或电生理等指标的检测。
2.3 药物依赖性的评价
几乎所有的依赖性药物，如阿片、酒精、可卡因、苯丙胺、尼古丁等都会使滥用成瘾者戒断后出现情绪问题，包括抑郁、焦虑、缺乏等，是药物依赖患者急性或慢性戒断期常见的特征，也是引起药物依赖者对药物产生心理依赖和复吸的重要原因。药物依赖与冲动行为有着密切的联系，药物依赖能够使冲动行为发生变化；同时可以诱导动机奖赏系统及学习记忆相关脑区内神经元结构发生可塑性改变，该变化在停药后仍可长期存在。对于精神依赖性由于是机体对药物内在的感知综合体现，如动物心理满足感、欣，同时，本身冲动性不同的个体对依赖药物的易感性存在个体差异。实验评价难度较大，目前评价方法主要结合抑郁、焦虑、学习记忆等神经行为学方法进行研究，其中应用较多的是操作式行为实验方法，如奖赏实验及采用自身给药模拟人的觅药行为和药物辨别行为，因该方法需要仪器设备复杂，实验周期较长。目前广泛用于药物精神依赖的评价方法是条件位置偏爱实验，该方法经济简便。
2.4 在发育神经毒性评价中的应用
发育神经毒性（DONT）评价是药物临床前安全性评价的重要组成部分，是指个体在发育过程中暴露于某些神经毒性物质后引起的神经系统结构和功能的异常改变，进而引起个体的感觉、运动及各种认知功能改变，表现为个体发育产生某些缺陷。常见的有行为改变、智力低下、精神失常、孤僻症等。神经毒性药物评价通常与生殖发育毒性研究相结合，以母体染毒对仔代或在仔代实验中进行神经行为学测试。目前常用的研究动物为大鼠。但是，非人灵长类因与人的行为活动最为相似，是研究发育神经毒性最适合的动物。非人灵长类神经行为学的测试方法包括学习能力、记忆能力、计划控制行为、情绪行为能力、信息处理能力、社会行为、感知功能、视动协调能力以及视觉空间定位能力等测试。其中使用照片、幻灯片、计算机化图象及视频学习行为被越来越多地用在非人灵长类动物发育研究中。然而，由于这些介质都被设计来模拟自然色彩，鉴于人类与非灵长类动物不同物种之间和内部存在的色彩感觉的差异，有必要考虑识别这些介质的适用性变化，使用的摄影和录像的刺激应该在复制自然的颜色接近该物种的视觉感官。研究药物对灵长类动物的发育毒性行为变化可以为人类精神发育病理学提供独特的见解。
动物行为学的研究范文3
【关键词】针刺治疗；抑郁症；疾病模型；大鼠；行为学；5-HT；NE
Effects of acupuncture on serotonin and norepinephrine in hippocampus of depressed model rats 【Abstract】Objective To observe how acupuncture affects the mechanism of depression model rats.Methods Using Open-Field method to randomly select 40 adult SD male rats into normal control， model group， drug treatment and acupuncture treatment group， 10 rats per group. Separation， long term unpredictability， medium stimulation techniques were applied to modify rats behavior. Then using Open-Field method to reflect changes in depressed model rats behavior between groups treated with acupuncture and control. And the concentration of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus of rat brain were determined by HPLC-ECD. Results Compared with normal control， acupuncture treatment group’s behavior was not different （P＞0.05）on the 7th day after treatment. On the 21th day after treatment， acupuncture treatment group’s behavior was not different （P＞0.05）with drug treatment group， and was more different with model group（P＜0.01）. Compared with normal group on the 21th day of treatment， the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus of acupuncture treatment group was not different （P＞0.05）， whereas was more different with model group （P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion This experiment proved that acupuncture treatment could change the behavior abnormality of depressive model rats. The curative effects is comparable to flouxetine. The changes of the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus are one of the mechanism.
【Key words】acupuncture treatment；depression；disease model；rat；behavior；5 hydroxytryptamine (5-HT);NE
自1984年，针灸开始介入抑郁症的治疗以来，取得了确切的临床疗效，但是对于针刺作用的过程和机制研究尚不深入。为了探讨针刺在抑郁症治疗中的应用规律，我们观察了针刺对抑郁症模型大鼠海马区内单胺类神经递质的影响，并与氟西汀（选择性5-羟色胺再摄取抑制剂）作对照。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
成年SD大鼠，体重180～220g，雄性，南京中医药大学动物中心提供。首先用Open-Field法作行为学评分，选择得分相近的40只大鼠进行实验分组。将大鼠随机分为正常组、模型组、药物组、针刺组，共4组，每组10只；正常组每笼饲养5只，模型组及针刺组每笼饲养1只（分养）。
1.2 实验方法
1.2.1 复制模型
参考文献［1］复制抑郁症模型：模型组、药物组、针刺组大鼠，共接受21天各种不同的应激，包括冰水游泳（4℃，5min）、热应激（45℃，5min）、禁水（24h）、夹尾（1min）、电击足底（电压50mV，每隔15s刺激1次，每次持续10s，共15次）、摇晃（1次/s，5min）、禁食（24h）和昼夜颠倒等刺激，平均每种刺激各4次。正常组，常规饲养，不接受任何应激性刺激。
于实验第1、21天测定各大鼠行为学（水平运动和垂直运动）。
1.2.2 治疗方法（实验第21天，进入治疗阶段）
正常组，继续常规饲养，每笼饲养5只。模型组，继续分养，每笼饲养1只；常规饲料喂养，不予应激性刺激，也不予任何治疗措施。药物组，继续分养，每笼饲养1只；常规饲料喂养，不与应激性刺激，按照1.8mg/kg给予氟西汀，将药物溶解于生理盐水中灌胃。1日1次治疗，连续21天。针刺组，根据《实验针灸学》［2］大鼠穴位定位方法，选择百会、内关、三阴交，并参照人和动物的穴位解剖结构特点，在华兴邦研制的大鼠针灸穴位图谱基础上，在大鼠前正中线上，额顶骨缝交界线前方处定位神庭穴。针刺方法：常规穴位消毒，选用苏州医疗用品厂生产的“华佗”牌32号1.0寸针灸针进行治疗。百会穴向前斜刺，神庭穴向上斜刺，进针深度约为2mm，内关直刺1mm，三阴交直刺5mm，每穴行均匀捻转刺激30s，留针10min。1日1次治疗，连续21天。
分别于实验第28、35、42天测定各鼠行为学的变化。
1.3 行为学测定
Open-Field法［3］测定大鼠行为学。本实验所用敞箱为正方形，长、宽各80cm，高40cm，底面由面积相等，边长16cm的正方形25块组成，白色内面，以动物穿越底面的块数为水平活动（crossing）得分，以直立次数为垂直活动（rearing）得分，每次3min。
1.4 高效液相-电化学（HPLC-EC）技术与单胺类神经递质的检测
1.4.1 试剂
去甲肾上腺素酒石酸盐（NE）、5-羟色胺盐酸盐（5-HT）、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）（以上为SIGMA公司产品），乙二胺－四乙酸二钠（EDTA）（分析纯，汕头金砂化工厂，批号：010304）、辛烷基磺酸钠（东京化成工业株式会社，批号：A87509A）、无水乙酸钠（分析纯，南京化学试剂厂，批号：971142）、柠檬酸（分析纯，上海荣润化工有限公司，批号：20010630）、二正丁胺（化学纯，中国常州市光明生物化学研究所，批号：960308）、高氯酸（分析纯，上海桃浦化工厂，批号：0710）、甲醇（一级品，高效液相色谱专用，江苏淮阴塑料制品厂精细化工研究所，批号：980512），实验用水为重蒸馏水。
1.4.2 仪器
高效液相色谱仪由岛津LC-10A系列组成，LC-10AD泵，SIL-10A自动进样器，进针深度35mm，样品注射速度5μl/s，CTO-10AVP柱温箱，温度18℃，压力为160Kgf/cm2。L-ECD-6A电化学检测器，CLASS-LC10 VER 1.63工作站。色谱柱为Lichrospher C18， 4.6mm×250mm，江苏汉邦科技有限公司生产。
1.4.3 流动相的配备［4］
流动相为乙酸钠(100mmol/L)－柠檬酸(85mmol/L)缓冲液，pH 3.7，内含0.4mmol/L二正丁胺，1.09mmol/L辛烷磺酸钠，0.2mmol/L EDTA，及18%甲醇，真空抽滤，超声脱气15min后使用。流速为0.5ml/min。
1.4.4 样品制备及测定
实验第42天（治疗21天）后，断头处死大鼠，快速取大脑组织，并置于冰皿上，按Glowinski法分离下丘脑［5］，称重后加入0℃～4℃高氯酸提取液330μl（含0.01%半胱氨酸和0.5mmol/L EDTA）以及内标溶液（DHBA0.006mg/ml）20μl，冰浴中匀浆，4℃高速离心(10000r/min)，取上清液注入HPLC-EC检测系统测定单胺类神经递质及其主要代谢产物的含量，进样量为20μl。用内标法定量，峰面积计算含量。共检测出2种单胺类神经递质，其洗脱顺序依次为：(1)去甲肾上腺素(NE)；(2) 5-羟色胺(5-HT)。
1.5 统计学方法
以均数加减标准误(x±s)表示，统计分析用SPSS12．0统计软件处理。
2 结果与分析
2.1 各组大鼠Open-Field法行为学测定结果
Open-Field法是测定抑郁症大鼠行为学的经典方法，分水平运动和垂直运动两个观察面，以观察得分为评分计算单位。各组大鼠的水平运动评分见表1，垂直运动评分见表2。表1 各组大鼠Open-Field法行为测定水平运动评分结果（略） 注：与正常对照组比，P＜0.05，P＜0.01；与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01表2 各组大鼠Open-Field法行为测定垂直运动评分结果（略） 注：与正常对照组比，P＜0.05，P＜0.01；与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：（1）在造模结束时（实验第21天），与正常对照组比较，模型对照组以及各治疗组大鼠的水平和垂直运动明显降低（P＜0.01）；模型对照组与各治疗组大鼠的水平活动和垂直运动差异无显著性。（2）在治疗第7天（实验第28天）后，针刺组大鼠的行为学评分明显升高，与正常对照组已经无明显差异（P＞0.05）；药物治疗组与正常组大鼠行为学评分相比，尚存在明显差异（P＜0.01），与模型组行为学评分差异无显著性（P＞0.05）。（3）在治疗21天（实验第42天）后，针刺组和药物治疗组行为学评分与正常组大鼠已经差异无显著性（P＞0.05）；与模型对照组比较，水平运动和垂直运动差异有显著性（P＜0.01）。（4）在治疗21天后，针刺治疗组大鼠与氟西汀药物治疗组大鼠的行为学评分差异无显著性。
2.2 各组大鼠海马区单胺类神经递质的测定结果
应用高效液相电化学方法测定各组大鼠海马区内单胺类神经递质及其代谢产物的含量。我们在实验第42天，处死大鼠去大脑海马组织进行高效液相电化学检测，仅检测到海马区内5-HT和去甲肾上腺素的含量；5-HT的代谢产物5-HIAA和NE的代谢产物MHPG以及DA和它的代谢产物DOPAC，均没有检测到。5-HT和NE的含量见表3。表3 各组大鼠海马区单胺类神经递质的测定结果（略）注：与正常对照组比较，P＜0.05，P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：（1）与正常对照组相比，模型对照组大鼠海马5-HT和NE降低（P＜0.01）。（2）经过21天治疗，与模型对照组相比，药物氟西汀治疗组和针刺治疗组大鼠海马内5-HT和NE含量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与正常对照组差异无显著性（P＞0.05）。（3）各组大鼠海马区内5-HT和NE的比值，差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨论
关于抑郁症的病因和发病机制尚不确切。一般认为，本病的发生除了与心理－社会因素和遗传因素有关外，主要还由于患者脑内单胺类神经递质减少、相应受体的敏感性改变以及递质系统间失衡等因素有关。许多研究报告发现，抑郁症患者存在生物胺水平和(或)生物胺神经通路功能乃至结构的异常，而NE和5-HT被认为与情感障碍的发生关系最为密切；另一方面，NE和(或)5-HT再摄取抑制剂至今仍然是抗抑郁药的主体。其中，氟西汀是第一个选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，也是至今应用最广的抗抑郁药。研究资料表明［6］氟西汀有抑制神经元从突触间隙摄取5-HT、增加间隙中可供实际利用的5-HT，从而改善5-HT能神经元的功能状态而改善情感症状；同时，可以通过5-HT和NE能神经元之间的交互作用，影响和调节NE神经元功能、增加突触间隙NE含量而发挥抗抑郁作用。而另一方面，大脑内不同区域的功能存在差异，其中海马是边缘系统的重要组成部分，和情绪及动机的产生以及和脑的高级神经活动——学习记忆有关。海马还与额叶皮质、皮层下杏仁复合体、纹状核及下丘脑后部等有复杂的纤维联系；也是Papez情绪动机回路的一个重要环节［7］。应用核磁共振技术发现，与正常人相比，正在患抑郁症的患者左、右两个海马区的体积明显减小，直接提示了抑郁症与海马区的关系［8］。
针灸对抑郁症的治疗有确切的疗效。从我们的实验结果来看，针刺治疗可以显著地改善抑郁症模型大鼠的行为学异常，治疗21天时达到正常组大鼠的水平（P＞0.05），与氟西汀治疗相当（P＞0.05），而与模型对照组的水平运动和垂直运动评分存在明显的差异（P＜0.01）。但是从治疗过程来分析，针刺组大鼠的行为学评分首先得到改善，而且在治疗的第1周就已经与正常组大鼠差异无显著性。显现了针刺治疗抑郁症存在某种独特的机制，提示针刺治疗与药物（氟西汀）治疗在机制上可能存在明显的差异，针刺治疗有起效快的特点。本研究还提示，在深入探索针刺治疗抑郁症的神经生物学机制时，可能需要考虑观察的时间窗等因素，尤其是在治疗的早期和超早期。
我们的研究发现抑郁症模型大鼠海马区NE和5-HT含量降低，而通过21天治疗后，针刺组和氟西汀组海马区NE和5-HT的含量都升高，与模型对照组存在明显差异（P＜0.05，P＜0.01），而与正常对照组差异无显著性（P＞0.05），提示了针刺抗抑郁的作用与海马区、尤其是海马区NE和5-HT神经元功能改善有关。但是进一步的研究，还需要考虑海马区5-HT和NE等单胺类神经递质的动态变化规律，以及递质对应的受体功能和结构改变、受体之间交互作用等变化。
【参考文献】
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动物行为学的研究范文4
关键词 噪鹛属；蓝冠噪鹛；研究现状
中图分类号 Q958 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2016）03-0294-02
Abstract The blue-crowned laughingthrush（Garrulax courtoisi）is a critically endangered bird and its wild population is now known only could be found in Wuyuan，SE China.The blue-crowned laughingthrush is considered to be yellow-throated laughingthrush south China subspecies，after upgraded to separate species.At present，the part of the zoo in Europe and the United States have captive population，in the domestic，Hong Kong Ocean Park and Nanchang Zoo have captive population，synthesize domestic and international research experience of captive population and research situation of wild condition，refer to the literature，from the study on blue crowned laughingthrush and blue crowned laughingthrush congeneric species，the current situation of the development trend on the blue crowned laughingthrush research study was comprehensive reviewed.At present，laughingthrush research of the birds is already relatively deep，in macro and micro research，and analysis was comprehensive，the blue crowned laughingthrush studies only stay in the study habitat，it isn′t related to reproductive ecology and micro research.
Key words laughingthrush；bule crowned laughingthrush；research status
1 研究目的和意义
蓝冠噪鹛（Garrulax courtoisi）属雀形目画眉科噪鹛属，为中国特有物种，分布于江西婺源一带，极度濒危。迄今已知的野生种群仅现于江西婺源。基于传统的形态学、声学、动物地理学等分类方法，蓝冠噪鹛曾经被视为黄喉噪鹛华南亚种（Garrulax galbanus courtoisi），后升格为独立种，何芬奇将其更名为“靛冠噪鹛”[1]，而目前鸟类学界比较通用的中文名为“蓝冠噪鹛”。
20世纪80年代，由于国际与国内对野生动物贸易立法的缺失，中国有大量蓝冠噪鹛经由香港被贩卖到欧洲和北美。目前在一些欧美动物园以及香港海洋公园其人工饲养历史已超过20年，全球圈养持有的数量超过200只，接近野外种群数量，但是总体上面临近亲及老龄化，加上球虫的困扰、雏鸟成活率低等问题，前景不容乐观[2]。2007年黄喉噪鹛被列入世界急危物种名录，列入《世界自然保护联盟》（IUCN）国际鸟类红皮书。
2 研究综述
2.1 鹛类及噪鹛属鸟类的分类
鹛类主要分布在欧亚大陆东部、南部以及非洲，由于其形态及生态习性多样，一直以来分类方式较为混乱。其中分布于中国的鹛类共计142种，占世界鹛类记录总数284种的50%，中国因此而被称为鹛类王国。相关研究学者对于中国分布的鹛类的分类同样存在许多不同观点，有代表性的大致有3类[3]。第1类的代表学者为Cheng和郑作新，其将鹛类分类为l科、画眉亚科，并认为包含了所有的鹛类、鸦雀类以及山鹛属；第2类的代表学者为Mickinnon和Phillipps，其将鹛类分类为莺科 、噪鹛亚科、莺亚科 、族鹛，并将山鹛属并入扇尾莺科，噪鹛属和P鹛属归入噪鹛亚科，棕胸鸦鹛属并入幽鹛属，与鸦雀类等同归鹛族；第3类的代表学者为郑光美，其将鹛类分类为画眉科，并将文须雀属、红嘴鸦雀属、鸦雀属合为鸦雀科，山雀属并入扇尾莺科，白腹凤鹛单立为画眉科下一属。
我国分布有38种噪鹛属的鸟类，占世界分布噪鹛属种类的70%以上，其中7种为我国特有种。Cibois基于线粒体基因的联合分析指出，噪鹛属的单系性被Bootstrap Probability test、Shimodaira-Hasegawa test以及Swoford-Olsen-Waddel1-HiUis test 3种检验所拒绝，建议做进一步分析验证。Luo 等在基于Cyt b和RAG-1联合分析构建的画眉科鸟类系统发育树中，也否定了噪鹛属的单系性，其中斑背噪鹛（Garrulax lunutus）、灰翅噪鹛（Garrulax cineraceus）、山噪鹛（Garrulax davadi）、白喉噪鹛（Garrulax albogularis）、棕噪鹛（Garrulax poecilorhynchus）、黑脸噪鹛（Garrulax perspicillatus）、白颊噪鹛（Garrulax sannio）（7种）属于噪鹛类Ⅰ，黑顶噪鹛（Garrulax affinis）、橙翅噪鹛（Garrulax elliotii）、赤尾噪鹛（Garrulax milnei）、红头噪鹛（Garrulax erythrocephalus）、红翅噪鹛（Garrulax formosus）（5种）属于噪鹛类Ⅱ，并且2支噪鹛与丽鹛之间的关系也没有得到解决[4]。
2.2 DNA测序技术在鸟类系统发育研究中的应用
传统的鸟类系统学研究以形态学为主，研究争议较多。近年来逐渐开始利用鸟类鸣声进行鸟类系统学研究。同时利用分子遗传学理论与技术进行鸟类系统学问题研究是未来的发展趋势。线粒体DNA是分子系统发育学研究重要的分子标记，具有易分离、进化速度快、母系遗传、缺乏重组和无内含子等特点。Cibois基于线粒体Cytochrome b、12s和16s 3个基因构建了画眉科的系统发育树，对于画眉科鸟类系统发育重建工作意义显著[5]。由于当研究类群的分歧大于10%时，线粒体控制区、ND2以及细胞色素b基因都可能出现替代饱和，因此在科级水平上研究高级分类阶元的系统发育关系时不能仅依靠线粒体基因的序列信息[6]。
与此同时，越来越多的学者建议在重建系统发育关系时增加核基因作为分子标记。Irestedt 等通过线粒体基因cytb和核基因c-myc、RAG-1和myoglobin分析探讨了亚鸣禽中的系统发育关系；Lee等运用线粒体的3个基因（16s rRNA、tRNA-Leu和nad1）研究了全球的鹊属内部的系统发育关系；Slikas等通过线粒体的2个基因（cox2基因、atp8基因）序列分析研究了绣眼鸟属内部物种之间的系统发育关系；Yuri等采用线粒体基因12S rRNA、nad2、atp8、atp6、部分cox2以及6个tRNA基因探讨了燕雀科的系统发育关系[7]；Zuccon 等通过线粒体基因nad2和2个核基因RAG-1和myoglobin分析了椋鸟科的系统发育关系并探讨了椋鸟科在l总科中的位置，2008年又通过3个核基因标记（myoglobin的内含子2，ODC的内含子6和7，以及GAPDH的内含子11）联合线粒体基因nad2和cox2探讨了椋鸟科中的椋鸟属、八哥属、长冠八哥属、肉垂椋鸟属和Fregilupus属之间的系统发育关系[8]。
2.3 蓝冠噪鹛行为学研究
2.3.1 噪鹛属鸟类的行为学研究。噪鹛属鸟类的行为学研究对蓝冠噪鹛行为学研究具有一定的参考意义，鸟类行为的研究主要是从其行为节律分布情况，各种行为谱在整个行为中占有的比重，进一步又将行为分为繁殖期行为和非繁殖期行为。
噪鹛属鸟类行为的研究国内外都比较常见，其行为学研究也得出了一定的结论。朱 峰等在四川省南充市市郊观察了白颊噪鹛（Garrulax sannio）的繁殖行为。结果显示，白颊噪鹛的营巢成功率为73.3%，影响其巢址选择的主要因素依次为巢位及巢的稳固因素、隐蔽因素、食物因素；孵化期亲鸟的离巢时间随着孵化天数的增加而减少，离巢次数随着孵化天数的增加而增加；育雏期亲鸟喂食频次随着雏鸟日龄增加而增加，在7：01―10：00和17：01―19：00时喂食频次最高，在6：30―7：00和10：01―14：00时最低[9]。
柴璐艳等对四川大学望江校区白颊噪鹛（Garrulax sannio）在非繁殖季节时的行为节律及时间分配进行观察和研究。结果表明：白颊噪鹛在非繁殖季节集5～14只的群体，6～8只最多（58.82%），在日出前（25.69±8.17）min苏醒开始活动，日落后（40.23±4.16）min进入树上夜栖；在行为节律上，白颊噪鹛的觅食、运动、警戒、保养、社会行为等5种行为均具有极显著的节律性变化；时间分配方面，白颊噪鹛的觅食时间占52.04%±6.10%，运动时间占13.43%±1.84%，保养时间占13.11%±3.00%[10]。
柯坫华等分析研究了江西省吉安市境内的黑脸噪鹛家族群的夏季分布格局。研究发现，黑脸噪鹛主要分布在市郊疏林灌丛环境，而在城市居民区未见分布。同时测量了家族群相互之间的最近距离，其家族群之间的最小距离平均为600 m，最小的家族群间距为230 m[11]。
吴丽荣在山西芦芽山国家级自然保护区对山噪鹛的生态进行了观察。结果表明：该鸟多在山地疏林灌丛间栖息，在本区种群遇见率为2.35只/km。巢多筑在阳坡灌木、小乔木横枝上，每窝产卵3～5枚，卵由雌鸟孵化，孵化期13～14 d，孵化率为97.44%，巢内育雏12～13 d[12]。
2.3.2 野生蓝冠噪鹛行为学研究。由于蓝冠噪鹛地理分布及数量稀少的原因，对其野外行为观察有一定的局限性，目前对野生状态下蓝冠噪鹛行为研究的文章数量有限。刘智勇等进行了江西省婺源县黄喉噪鹛调查初报，其深入婺源县兵林营自然保护小区，对分布的60余只黄喉噪鹛繁殖群体进行观察。首次记录了自然生境、鸟巢、鸣声、活动与觅食等[13]。洪元华等对黄喉噪鹛华南亚种（Garrulax galbanus courtoisi）4个繁殖地开展了生境调查，并对其繁殖期的活动情况地进行了比较分析。结果表明：黄喉噪鹛华南亚种对天然常绿阔叶林适应性很强，应着手保护天然常绿阔叶林，以维护黄喉噪鹛的自然生境[14]。廖为明等通过研究婺源黄喉噪鹛华南亚种的分布种群、繁殖生态，并分析其栖息地的植物物种，揭示该鸟类与村落环境的依赖关系，对于维持生态平衡意义显著[15]。
2.3.3 人工种群蓝冠噪鹛行为学研究。由于历史的原因，2010年之前人工饲养的蓝冠噪鹛只存在于香港及欧美地区的动物园或鸟类公园，对其圈养环境下的研究多集中于一般的日常管理。虽然这些机构饲养蓝冠噪鹛逾20年，但是一直以来雏鸟第1年的成活率都不足50%，除了疾病和近亲繁殖等因素外，人们还试图研究亲鸟的育雏行为与环境、种群等的内在关系。Anais Tritto研究了法国牟罗兹动物园4个靛冠噪鹛的繁殖行为，以此分析可能导致雏鸟过早死亡的原因。最初员工提出的假设是亲鸟未能担负起育雏的责任，但研究显示事实并非如此，而与之有关可能包括喂食的频率、营养，或者也可能存在的病原体[16]。此外改善饲养环境，如植被的疏密、高低等，不仅会影响亲鸟的一般日常行为，同时也可能有利于繁殖季节里的配对行为的正常表达，而地面的垫料以及是否提供巢材都会影响亲鸟的筑巢行为。
3 结语
目前虽然国际鸟类保护联盟已经将蓝冠噪鹛列入世界急危物种名录，但我国尚未将这一濒危物种明确保护级别，所以加强对蓝冠噪鹛的研究已经迫在眉睫，对蓝冠噪鹛的研究包括栖息地的研究、行为学的研究、遗传基因等多方位的研究，只有深入的研究才能了解其濒危的根源所在，因此才为蓝冠噪鹛的保护提供理论和实践基础。
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动物行为学的研究范文5
摘要：
目的对比研究改工艺后消栓通络片与市售消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用差异。方法采用颈内动脉插入尼龙线栓的方法建立大鼠左侧大脑中动脉栓塞模型。观察给药后各组大鼠行为学评分、测定脑梗死面积及血清超氧化物歧化酶（SOD）、NFκB、caspase3含量的差异。结果改工艺后的消栓通络片高、中剂量组均能有效缓解4h，24h时MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分；高、中、低剂量组均能升高MCAO引起的SOD降低；高、低剂量组能明显降低MCAO引起的血清NFκB的升高；中、低剂量组对MCAO引起的Caspase3的显著升高有一定抑制作用。与市售消栓通络片比较，改工艺消栓通络片从大鼠行为学评分的降低，血清SOD活性的增加，血清Caspase3、NFκB的表达效果均有优于市售消栓通络片的趋势。结论改工艺消栓通络片各剂量组对脑缺血进展期大鼠均有一定的恢复作用，其药效略优于市售消栓通络片。
关键词：
中药工艺改进；黄芪；三七；槐花；丹参；缺氧缺血，脑；大鼠
消栓通络片是治疗中风恢复期的有效验方，有活血化瘀，温经通络的作用。临床常用于脑血栓引起的半身不遂，肢体麻木的治疗。我们对该方的传统制剂工艺进行了改进，将黄芪、三七、槐花、丹参四味药材由原工艺的水提改为60％醇提。制剂改进后规格由原来的1．8g生药／片可增加为2．5g生药／片，服药量将明显减少，增加病患用药依从性。本实验采用MCAO法制作大鼠脑缺血再灌注模型对比观察改工艺后消栓通络片与市售消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用差异及其作用机制。
1实验材料
1．1药物与试剂
1．1．1供试品
改工艺消栓通络片浸膏粉由康缘现代中药研究院提供，规格：12．27g生药／g提取物，批号130926。供试品制备方法：将川芎、桂枝、木香、山楂、泽泻、郁金六味药材水煎，合并煎液，滤过、浓缩，加乙醇调至70％，静置，取上清液浓缩、干燥。黄芪、三七、槐花、丹参四味药材60％醇提，合并醇提液，滤过。大孔树脂纯化，浓缩，干燥。将两次所得干浸膏粉碎，加入适量辅料，混匀，加入冰片，混匀，制成颗粒，干燥，压制成片，包衣，制成2．5g生药／片的药物。
1．1．2对照药
依达拉奉注射液：20mL：30g，2支装，吉林省辉南长龙生化药业股份有限公司，批号2013051002；消栓通络片（市售）：1．8g生药／片，某公司，批号：130301。
1．1．3试剂
水合氯醛，批号：20130426；羧甲基纤维素钠，批号：20120330；磷酸氢二钠，批号：20131125，均为国药集团化学试剂有限公司试剂。氯化钠，南京化学试剂有限公司，核因子κB放免药盒，批号：20140401；活化半胱氨酸蛋白酶蛋白3放免试剂盒，批号：20140410；超氧化物歧化酶检测试剂盒，批号：20140101，均为北京华英生物技术研究所试剂。
1．2主要仪器
电子天平，赛多利斯科学仪器（北京）有限公司；CENTRFUGE5840型冷冻离心机，Eppendorf；DKS26恒温水浴锅，上海精宏实验设备有限公司；DHG9076A电热恒温鼓风干燥箱，上海精宏实验设备有限公司。
1．3实验动物
SD大鼠，雄性，体重280～330g，SPF（无特定病原体）级，上海西普尔－必凯实验动物有限公司，许可证号码：SCXK（沪）2013－0016。
2实验方法
2．1动物分组
取体重280～330g的雄性大鼠，随机分为7组。分组如下：假手术组（等容积5‰CMC－Na）、模型组（等容积5‰CMC－Na）、阳性药依达拉奉组（1．13mg•kg－1大鼠）、市售消栓通络片组（2．7g生药•kg－1大鼠）、消栓通络片高剂量组（0．44g提取物•kg－1大鼠）、消栓通络片中剂量组（0．22g提取物•kg－1大鼠）、消栓通络片低剂量组（0．11g提取物•kg－1大鼠）阳性药腹腔注射给药，1．13mg•kg－1大鼠，其它各给药组大鼠于术前0．5h灌胃给药1次，10mL•kg－1大鼠。1次／d，连续3日，假手术组、模型组给予等容积5‰CMC－Na溶液。
2．2造模方法
采用颈内动脉线栓法复制左侧大脑中动脉栓塞（MCAO）模型。参照文献方法加以改进［1］，分离出颈总动脉，继续向下分离并结扎颈外动脉，分离出颈内动脉，在ECA距ICA2mm处剪一小口，将一尼龙栓子插入ECA并进入CCA，轻扎备线，防止出血。剪断ECA，松开ICA的动脉夹，牵引ECA，使其进入ICA，继续向下推进直至尼龙线插入深度约为18mm停止。此时松开CCA动脉夹，扎紧备线，外留1cm长线头，缝合皮肤，回笼饲养。于缺血2h后再灌注，再灌注时轻拉尼龙线，使尼龙线拔出ICA，进入ECA残端，血流再通，修剪尼龙线栓尾部，回笼自然喂养。
2．3评价指标
2．3．1对大鼠神经行为学的影响［1］见表1。
2．3．2对缺血梗死面积的影响
［2］TTC染色：大鼠于造模后72h取脑，去除嗅球、小脑和低位脑干，置－20℃冰箱冰冻20min，沿冠状面切成5片，每片约2mm，置5mL含有1％TTC的磷酸缓冲溶液中避光温孵10min染色，4～5min翻动一次。经染色后，正常脑组织呈玫瑰红色，而梗死组织呈白色。用图象测量软件Imagepro－Plus分析脑片面积，分别计算出5个脑片共10个面的总面积和梗死区域的面积，求出梗死区面积占总面积的百分比，即梗死率。
2．3．3对血清超氧化物歧化酶（SOD）
NFκB、caspase3含量的影响造模后72h，于最后一次给药后0．5h，麻醉大鼠，劲总动脉插管取血，3000r•min－1离心10min，分离血清，用生化法检测血清SOD活性，用放免法检测血清NFκB、caspase3含量。
2．4统计学方法
应用SPSS13．0数理统计软件进行相关数据统计分析，实验的计量数据资料采用x±s表示，各组间的比较采用t检验。当P＜0．05时，差异有统计学意义。
3实验结果
3．1消栓通络片与市售消栓通络片对缺血性脑损伤模型大鼠行为学评分及梗塞率的影响
脑缺血后4h，各给药组行为学评分均有降低，与模型组相比，依达拉奉组、消栓通络片高、中剂量组行为学评分均下降（P＜0．01）。其余各组差异无统计学意义（P＞0．05）。24h，市售消栓通络组和消栓通络片高中剂量组大鼠行为学评分下降明显，与模型组相比差异有统计学意义（P＜0．05），其余各给药组分值也有下降，但与模型组相比差异无统计学意义（P＞0．05）。造模后72h，大鼠脑梗死明显（P＜0．01），除改工艺低剂量组，其余各给药组大鼠脑梗塞率均有下降，依达拉奉组下降明显，与模型组相比差异有显著性（P＜0．01）。结果见表2。
3．2消栓通络片与市售消栓通络片对血清超氧化物歧化酶SOD、NFκB、caspase－3含量的影响
造模后72h，大鼠血清NFκB的含量较假手术组增高（P＜0．05），给予消栓通络片高、低剂量后，能明显降低大鼠血清NFκB含量（P＜0．05），其余各组血清NFκB含量与模型组比较差异无统计学意义（P＞0．05）。大鼠血清caspase3含量较假手术组增高（P＜0．05），给予消栓通络片中、高剂量后，能明显降低大鼠血清caspase3含量（P＜0．01），其余各组血清caspase3含量与模型组比较差异有统计学意义（P＞0．05）。各组大鼠血清SOD含量在给予市售消栓通络片和消栓通络片各剂量组后与模型组比较均有明显上升（P＞0．01）。结果见表3。
4讨论
消栓通络片由川芎、丹参、黄芪、泽泻、三七、槐花、桂枝、郁金、木香、冰片、山楂十一味中药组成，君药川芎、丹参、郁金中含有水溶性酚酸类化合物［3～4］，其中原儿茶醛和咖啡酸具有广泛的抑菌、抗病毒、扩张心脑血管、抗血小板凝集作用，原儿茶醛等有强烈的清除氧自由基作用。还含有人参皂苷Rg1、Rb1、三七皂苷R1、黄芪甲苷、丹参酮等。脂溶性成分芦丁［5］属于黄酮类化合物，有明显的扩张冠脉的作用，还有抗炎、抗菌、抗病毒等作用，可用于治疗毛细血管脆性引起的出血症等。该方传统制剂工艺中黄芪、三七、槐花、丹参四味药材为水提，我们将水提工艺改为用60％醇提。制剂改进后每片含药量明显增加，服药量明显减少，增加病患用药依从性：
我们根据文献的方法加以改进，采用MCAO的方法复制中动脉阻塞的脑缺血模型，观察改工艺后消栓通络片与市售消栓通络片对大鼠局灶性脑缺血的治疗作用差异及其作用机制。造模后72h，我们观察到大鼠脑梗塞率达到20．64％±4．5％，且手术大鼠出现了明显的神经行为学障碍，和文献报道相符［6～7］，说明模型复制成功。给予依达拉奉后，在急性期4h，很好缓解MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分。给予消栓通络片与市售消栓通络片后发现，市售消栓通络片能很好缓解急性期24h时MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分。消栓通络片高、中剂量组能有效缓解4h、24h时MCAO引起的行为学病变，降低行为学评分。
Caspase家族在缺血性脑损伤中发挥重要作用，其中Caspase－3是Caspase级联反应中下游最关键的凋亡蛋白酶，在各种因素启动的凋亡程序中起最后的枢纽作用。消栓通络片高、中剂量组能明显降低MCAO引起的血清Caspase－3的升高，缓解脑缺血进展期细胞凋亡的持续发生，从而达到脑保护的作用［8～10］。NFκB是细胞内最重要的活性蛋白转录调节因子，它调控大量基因的转录，包括细胞因子、生长因子、趋化因子、黏附因子、凋亡调控因子、炎症通路蛋白、细胞应激蛋白等。大量炎性蛋白质的表达对细胞损伤和修复过程至关重要［11－14］。消栓通络片中、低剂量组对MCAO引起的NFκB的明显升高有一定抑制作用，从而缓解MCAO后的炎症反应及细胞凋亡的持续发展，达到脑保护作用。
超氧化物歧化酶（简称SOD）是清除生物体内超氧阴离子自由基的一种重要抗氧化酶［2，15］，它能降低氧化应激对脑组织产生的损伤。造模后72h，在给予改工艺消栓通络片后SOD均有明显上升，提示改工艺消栓通络片各剂量组均有良好的抑制脑缺血后氧化应激的作用。
以上结果提示，改工艺后消栓通络片各剂量组对脑缺血恢复期大鼠均有一定的缓解作用。改工艺消栓通络片高剂量组在4h，减轻行为学评分的作用有优于市售消栓通络片的趋势，消栓通络片高剂量组对MCAO后大鼠血清Caspase3、NFκB的表达均有一定的抑制作用，效果有优于市售消栓通络片的趋势。其保护作用的发挥可能依赖于对炎症及神经细胞凋亡的双重抑制作用。依达拉奉对MCAO后72h大鼠脑梗塞率有明显的减小，说明其有较好抗脑缺血作用，而对72h时大鼠血清SOD活性、Caspase3、NFκB的表达无明显影响，推测其在72h时，对血清这三个因子影响较小，此时间点依达拉奉并不主要通过影响这三个因子的表达发挥抗脑缺血的作用。
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动物行为学的研究范文6
[关键词] 嗅觉; 嗅觉障碍; 评估方法; 动物实验; 文献综述
[中图分类号] R339.12 [文献标识码] A [文章编号] 1671-7562(2010)04-0434-04
doi:10.3969/j.issn.1671-7562.2010.04.041
嗅觉是人体原始的感觉功能之一,它同视觉、听觉一样,是人体捕获外界信息的特殊装置。嗅觉还可以通过中枢神经系统影响人的情绪、调节生命周期。嗅觉障碍患者对周围的事物不感兴趣,反应平淡,生活质量下降,更可以造成精神上的压抑或忧郁。王鸿等[1]报道用T&T测试法测试了1 035例慢性鼻窦炎鼻息肉患者,86.3%的患者有嗅觉功能障碍,与患者的主诉有极显著的差异,说明嗅觉功能改变没有受到患者的注意。近几年随着人们对生活质量要求的提高,对嗅觉障碍的关注程度有了很大的提高。
嗅觉评估不仅仅是要判断嗅觉功能是否正常,还需要进一步判断嗅觉障碍的程度、性质、部位等因素,如果能提示病因以及预后则更有临床、实验应用的价值。在动物实验中关于嗅觉功能的研究已经有了较长的历史,出现了多种实验方法,但是目前为止还没有一个全面、客观、高特异性的金标准方法出现,本文就目前动物实验中的常见的嗅觉评估方法进行一个概括性的介绍。
1 行为学方法
动物实验和临床试验的最大区别在于动物无法准确地和实验者交流,所以行为学方法在动物实验中就显得极为重要。嗅敏动物的学习记忆能力、寻食能力等与嗅觉有很高的相关性,可以观察、记录其行为学的改变,从而判断其嗅觉功能的变化。目前报道较多的可以评估嗅觉功能的行为学方法有以下几种。
1.1 埋藏食物小球实验(buried food pellet test,BFPT)
BFPT是目前最常用于检测动物嗅觉功能的行为学检测方法[2]。目前比较通用的方法由Nathan等[3]于2004年报道,他的实验中使用找寻食物小球等待时间作为数据进行统计分析,即从小鼠被随机放置于盒子中开始,到小鼠揭开食物小球并用它的前爪或牙齿抓住食物小球的时间,如果5 min(300 s)内小鼠未找到食物小球,即被移走。林静等[4]以300 s(5次测试的平均值)内未找到食物小球作为判定小鼠存在嗅觉功能障碍的标准,并认为以300 s作为分组标准是合理的。
1.2 嗅觉测量仪
Slotnick等[5]利用行为学原理设计出一种用于动物实验的嗅觉测量仪,可以通过改变气味的浓度后观察动物的行为学变化来评价其嗅觉。该系统经众多实验验证其对动物嗅觉的检测是有效的[6],因操作方便且可进行多种设计,此方法被广泛应用于动物嗅觉功能的评估。
1.3 双瓶实验
有研究证实小鼠、大鼠在分辨某些物质的时候主要是依赖于嗅觉而非味觉,例如盐酸、盐酸奎宁(quinine HCl, QHCl)等有一定挥发性的物质 [7]。因嗅觉障碍时动物分辨饮用水和实验溶液的能力下降,通过两种溶液被动物饮用的程度可以评估动物嗅觉障碍的程度。
1.4 幼鼠超声发声实验
新生小鼠嗅觉的产生比其他的感觉要早。新生小鼠嗅到成年鼠窝的气味时可发出一种超声作为回应,检测这种超声的出现与否可以判断其嗅觉功能是否正常[8]。Lemasson等[8]用3-甲基吲哚来破坏新生小鼠的嗅上皮,结果成功地证实了该检测方法的可行性。而且在该实验中发现由于被破坏嗅觉的小鼠无法正确识别,其生存率大大降低,证明了嗅觉对新生小鼠有极其重要的作用。
行为学方法在动物实验的嗅觉评估中有很重要的作用,历史悠久、技术成熟,实验方法较为简单,实验装置花费较少,对嗅觉功能的初步评估价值较为肯定(尤其是埋藏食物小球实验和Slotnick的嗅觉测量仪),可行性及可重复性较高。需要注意的是本类实验受个体差异影响较大,实验前应经预评估剔除先天差异比较大的个体,而且样本量不宜过小,有时候还需对动物进行预先的训练。为保证实验的客观性,需要很好地进行实验设计与控制,有时连昼夜节律等变化的影响都需要考虑在内。行为学测试结果对嗅觉功能评估只是一个综合的结果,对嗅觉障碍程度、部位等的判断较差,如果能结合嗅觉诱发电位等客观检查可以做到更加客观、可信。在过去的实验中行为学测试往往与组织学检查相结合,既增加了实验的客观性,又为进一步研究嗅觉产生机制或嗅觉障碍的原因提供了基础。
2 客观评估方法
嗅觉的感受、传导是个比较复杂的过程,气味分子通过鼻腔到达嗅黏膜后被其表面的黏液所吸附,进而在黏膜层中扩散,到达嗅细胞。达到阈浓度的气味分子可刺激嗅细胞产生嗅觉电位,这是其感受过程。产生的嗅觉电位通过嗅神经穿过筛骨筛板,到达嗅球,其内有第2级神经元,再通过嗅束传导至初级嗅皮质及皮质内侧核,而后至海马回的内嗅皮层即次级嗅皮层,神经冲动引起大脑皮层的激活才能最后引发嗅觉。嗅觉功能的客观评估方法包括了对嗅觉感受、传导通路上各种指标,例如影像学、电生理学、组织学等的测量。目前动物实验中使用较多的及可能有较大发展前景的客观评估方法包括以下几类。
2.1 组织学方法
这里的组织学是泛指解剖取组织后进行的所有检查,包括大体解剖学、病理学、免疫学、分子生物学等诸多学科的检查方法。嗅觉系统的改变既可以由病变本身引起也可以是因为嗅觉障碍后的退行性变引起。组织检查比结构影像检查更有评估价值,因其可以更好地提示病因,也利于更好地研究嗅觉通路和嗅觉障碍产生的机制。目前组织学方法在动物实验中有很广泛的应用,从部位选择上看整个嗅觉传导通路包括从嗅黏膜直到海马回的内嗅皮层都有报道,从实验方法上看更是复杂多样,最常用的几种方法有如下几种。
2.1.1 病理学检查
这是早期免疫学技术及分子生物学技术还不是很发达时常用的检查手段,在早期嗅觉研究中有较多的应用,在嗅觉障碍的动物标本上可以看到细胞凋亡、空泡等变化,虽然特异性较差,但是也能提供宏观的信息,现在常常和其他检查方法一起使用,例如在陈志宏等的实验中在进行其他检查之前使用了HE染色方法检查了模型小鼠的嗅上皮,发现其嗅上皮变薄,其中的感觉神经元的细胞核层数变少[9]。
2.1.2 蛋白及核酸表达的检查
对相应组织中某些标志性蛋白及核酸的检查可以间接地反映嗅觉功能及提示嗅觉障碍的原因。例如用免疫组化方法检查嗅觉通路中嗅标记蛋白(olfactory marker protein, OMP)、酪氨酸羟(tyrosine hybroxylas, TH)、一氧化氮合酶(nitric oxide synthase, NOS)、c-Fos蛋白等标记物在许多文献中都有记载。Buron等[10]在丙酮吸入诱导的嗅觉障碍实验中使用了嗅上皮组织的OMP及增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)作为观察指标,发现丙酮对于嗅上皮的损伤是有选择性的。有学者使用多巴胺及细小白蛋白作为标记物进行免疫组化检查,发现失嗅动物模型的嗅球中含多巴胺及细小白蛋白的神经元细胞数量明显减少,认为通过该失嗅动物模型可以对嗅球萎缩进行定量描述,提示多巴胺及细小白蛋白在嗅球中的表达对于失嗅的作用[11]。c-Fos蛋白可反映大脑组织活动程度,对c-Fos蛋白的观察可以一定程度上起到功能磁共振的作用[12]。
2.2 电生理学方法
2.2.1 嗅电图
将电极直接置于嗅区黏膜,当其接受嗅素刺激时记录到的一种慢相负性电位变化称为嗅电图,目前普遍认为它是单个嗅细胞电位变化的总和,嗅电图已经在动物实验中得到证实[13]。嗅电图最大的缺陷在于虽然其对嗅黏膜损伤引起的嗅觉障碍有较大的意义,但是对于黏膜后传导通路以及嗅球、海马回等中枢病变导致的嗅觉障碍没有什么评估价值。
2.2.2 嗅觉脑电图
嗅觉诱发脑电图是指在给予嗅刺激时,实验对象的脑电图可发生变化,Hirano等[14]用狗做实验时成功地获得了该变化,在他的实验中发现脑电图的快波对嗅觉功能的意义较大。嗅觉诱发脑电图又相继在大鼠等其他动物身上得到了验证[15]。嗅觉脑电图产生的机制还不是很明确,而且其特异性不是很高,故目前在动物实验中研究、应用的较少。
2.2.3 嗅觉诱发电位
又称为嗅觉事件相关电位(olfactory event-related potentials,OERP),最早是用电刺激动物嗅黏膜时在头皮特定部位记录到稳定的脑电位的变化,该方法经过一段时间的发展后认为其和自然嗅觉之间有一定的差距,故逐渐被化学气味诱导的嗅觉诱发电位所取代,目前使用的已经比较少。早期化学气味刺激除了有嗅觉刺激外还常常伴有物理刺激及对三叉神经的化学刺激,这些非嗅刺激干扰了正常嗅觉诱发电位的获得。随着仅能兴奋嗅觉系统而不兴奋三叉神经系统的化学物质如香草醛等,以及Kobal式嗅觉刺激器的出现,嗅觉诱发电位研究成为嗅觉研究领域的热点。嗅觉诱发电位仪至少包括嗅觉刺激器及脑电采集系统,测量时需要在电声屏蔽室进行,且需要给予一定的白噪声掩蔽刺激探头释放刺激时产生的干扰噪声。目前动物嗅觉诱发电位各波的具体来源以及与疾病间的相互关系还不清楚,嗅觉诱发电位的出现是否意味着动物确实产生了嗅觉还不能肯定,所以用来证明嗅觉传导通路是否畅通比较可行[16],而暂不能用于嗅性疾病的定位、定性诊断。嗅觉诱发电位应该是最可能成为动物嗅觉评估客观标准的检查方法。
3 影像学方法
3.1 嗅觉系统结构影像检查
有研究证明嗅球及嗅束等神经结构的生长与周围神经冲动的输入有关[17],所以嗅觉障碍后嗅觉系统各部位可有一定的不依赖于年龄的结构改变,通过磁共振影像检查可以发现这些改变,例如嗅球体积变小、嗅沟缺失或变浅、嗅束缺失等现象,从而间接评价嗅觉功能。
3.2 嗅觉系统功能影像检查
这是目前嗅觉研究的热点方向之一,主要技术有功能性磁共振成像(fMRI)、PET成像和脑信号的光学成像等。
3.2.1 功能磁共振检查
功能磁共振检查技术有很多,用于嗅觉系统功能的fMRI技术主要是(blood level dependent fMRI, BOLD fMRI),当氧合血红蛋白的比例增加时或去氧血红蛋白含量减少时,T2信号缩短效应减弱,表现为MR信号增强。嗅觉功能成像既能反映血流的变化,也能反映神经元活动的代谢变化,近些年在研究神经功能方面发挥着巨大的作用,特别是fMRI无放射暴露,可反复测试,且时间、空间分辨率要优于PET成像,故是目前嗅觉功能成像的主要方法。在大鼠实验中已经证实,7 T的fMRI能够显示气味刺激后大鼠嗅球的活化[11]。其空间分辨率很高,对于研究嗅觉相关皮层的定位、嗅觉功能障碍情况下嗅觉相关皮层反应的变化等有极大的应用价值。有学者拟通过信息技术将啮齿类动物嗅球的激活图像编成二维的气味图(OdorMap,OM)及气味图数据库(OdorMap Database,OMDB)以利于嗅觉工作者对嗅觉系统的研究[18]。功能磁共振应用在动物实验的嗅觉评估中需要注意的是:首先动物是不能配合磁共振检查的,故需要在麻醉下进行;其次磁共振是强磁场环境,故嗅觉刺激装置不能由金属制成。
3.2.2 脑功能光学成像
脑功能光学成像是近年来神经外科的热点研究方向,目前主要的实验技术有激光散斑衬比成像和内源信号光学成像。而应用于嗅觉功能检查的主要是内源信号光学成像,这里所指的内源信号,并不是神经元所表现出来的电信号,而是指由神经元活动所引起的有关物质组分、运动状态的改变而导致其光学特性的变化,在与某些特定波长的光量子相互作用后,得到的包含了这些特性的光信号,包括:血红蛋白信号、氧合血红蛋白信号、光散射特征信号等[19-20]。许多生理性过程如血红蛋白氧合度、细胞色素的氧合状态、神经胶质和神经元肿胀、功能性血流量改变等变化,都会影响到组织光反射特性的改变。通过探测反射光的变化量,就可以获得这种特异性的内源光学信号。内源光学信号成像在动物实验中已用于多种脑功能皮层功能的检查,比如视觉(猫、小鼠等)、躯体感觉皮层(大鼠、猫、松鼠猴等)、听觉皮层(南美栗鼠、猫、雪貂等)。Bathellier等[21]在实验中使用了内源光学信号原理和突触素荧光标记两种方法分别获得了香芹酮、苯甲酸甲酯刺激后大鼠嗅球的激活情况,在内源光学信号成像下,激活的嗅小球反光率下降,呈相对的冷色调,而在荧光标记实验中激活区域荧光反应较强。虽然内源光学信号成像的时空分辨率都较高,但是其穿透脑皮层的能力受限(大约数百微米),所以对于深层脑组织的观察就没有什么效果了。由于内源光学信号的确切生理来源至今没有定论,所以为了阐述内源光信号对应的生理意义及其与神经元电活动的关系,还需要与其他方法进行对比研究。
从其他感觉的评估方法来看,功能磁共振和诱发电位是研究的发展方向,但目前嗅觉产生、传导机制尚未完全明了,相关检查技术尚处于起步阶段,还需要进行大量的研究。目前的嗅觉研究可以根据不同的实验要求及实验条件选择不同的实验方法及实验方法的组合。嗅觉诱发电位及功能磁共振检查由于其初期投入较大,对硬件及技术条件要求较高,开展难度较大,在国内只有少数医院在从事这方面的实验。行为学方法操作简单,技术成熟,效果肯定,有很强的实用价值。组织学方法对于机理的研究十分重要,并且随着对嗅觉认知的加深,越来越多的标记物被发现,评估方法也越来越丰富。如果可以出现一种简单易行的嗅觉评估方法,那么可以极大地促进嗅觉的研究。
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