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动物行为学分析方法范文1
关键词：有氧运动；慢性脑缺血；PI3K；Akt；信号通路
慢性脑缺血是指各种原因引发的长期脑血流灌注不足，为临床上常见的脑损伤之一，可导致持久或进展性的认知与神经功能障碍[1]。
细胞凋亡又称程序性细胞死亡，是细胞在某些生理或病理条件下发生的有序的主动性非炎症性死亡。研究认为，脑缺血后与细胞凋亡有关的信号转导通路主要有有丝分裂原蛋白激酶（MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路[2]。Akt又名蛋白激酶B（PKB），为分子量大约为60 kD的蛋白激酶。Akt能使丝氨酸/苏氨酸（Ser/Thr）磷酸化，故又称为丝氨酸/苏氨酸激酶。Akt能介导多种生物学效应，是重要的抗凋亡调节因子。因子PI32K激活的Akt可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长，能经多种途径促进细胞存活[3]。
本研究采用结扎右颈动脉的方法构建了小鼠酒精性肝损伤模型，采用跑台和游泳两种不同的有氧运动方式干预，通过神经行为学、显微结构形态学观察以上干预对脑缺血损伤小鼠的影响；采用免疫组化实验技术，检测PI3K/Akt信号通路上下游相关因子的差表达，探讨其神经保护作用的机制。
1.研究方法
（1）动物模型的构建：成年健康雄性KM小鼠以10%水合氯醛腹腔注射麻醉小鼠（0.3ml/100g体重），参考Yoshizaki的方法结扎小鼠右颈动脉构建慢性脑缺血损伤小鼠动物模型。
（2）实验动物分组以及运动方案：建模成功后，将小鼠随机分为四组：假手术组（SO）、模型对照组（M）、游泳组（SW）、跑台组（TM），每组10只，建模后3―4天对其进行干预。
（3）组织形态学观察：实验结束后，取小鼠脑组织进行石蜡包埋，尼氏染色，解剖形态学观察。
（4）神经行为学评估：Clark神经功能评分方法，根据症状表现程度分0、1、2、3、4递增等级，对小鼠步态、攀爬能力、转圈、胡须反应、眼睛、耳朵、毛发等的情况进行综合评分。
（5）免疫组织化学分析：检测缺血脑组织中的PI3K、Akt、mTOR的表达，采用SABC法的免疫组织化学法进行以上因子的定位和半定量表达检测。在10×20倍光学显微镜下，观察并计算PI3K、AKT、mTOR的阳性表达面积百分比[4]（阳性反应面积/测量面积）。
2.结果与分析
（1）小鼠神经行为学评估：分别记录建模后无干预和建模后进行有氧干预的得分（三次评分取平均值）。
（2）解剖形态学观察：组小鼠尼氏体排列紧密，大且数量较多，神经元受损程度小；M组排列疏、欠规整，且数量较少；与M组相比，SW、TM组中尼氏体数量较多，排列紧密，仅次于SO组，TM排列有规则较集中，效果优于SW组。
（3）免疫组织化学分析。图2显示：小鼠脑细胞PI3K、Akt主要表达于细胞浆。PI3K表达强弱依次为SO>TM>SW>M组；Akt表达强到弱依次为SO>TM>SW>M组。
表2可见：小鼠脑组织中PI3K、Akt免疫组化中SO组阳性表达最高，SW组、TM组表达均高于M组（P
3.讨论
（1）小鼠脑缺血模型。脑缺血理想的实验动物模型是实验研究取得进展的关键性因素之一。由于本实验需要进行长时间的有氧游泳和跑台的运动训练，我们对所选小鼠的右颈动脉进行结扎以构模。术后我们跟踪观察小鼠的情况，发现小鼠右眼半闭或全闭。这说明小鼠建模成功，且其成功率达90%，应用此模型可以顺利完成本研究。
（2）有氧运动对小鼠脑缺血干预的效果。近年来，大量有关有氧运动康复训练治疗急性缺血性脑血管疾病的动物实验取得了一定的成果。适当的运动训练能够促使脑血管新生，增强抗氧化能力，减轻脑细胞凋亡，促进神经元生长等。从本实验结果可见，对小鼠建模前、后以及有氧运动干预后神经功能的评分，除M组外，各干预组都有明显的变化。脑组织尼氏染色显示，相比于M组，有氧运动组尼氏小体相对清楚有规律，TM组尤为显著，这说明有氧运动对小鼠脑部神经元细胞的再生以及保护有着重要的作用，其能促进神经干细胞增殖以及分化，促进轴突及树突的生长。
（3）有氧运动干预与PI3K/Akt信号通路表达影响。脑缺血后与细胞凋亡有关的信号转导通路主要有有丝分裂原蛋白激酶（ MAPK）和磷脂酰肌醇-3激酶（PI3K） /丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（Akt）信号通路。PI3K是一种可使肌醇环第三位羟基磷酸化的磷脂酰肌醇激酶。PI3K被激活后生成的磷脂产物进一步激活Akt及其下游的信号的级联反应， 参与生长、发育、分化和细胞的存活。PI3K激活的Akt可以介导胰岛素、多种生长因子、凝血酶等诱发的细胞生长，能经多种途径促进细胞存活。从小鼠脑组织免疫组织化学结果的分析可见，PI3K/Akt的表达情况在游泳组和跑台组的表达面积远高于模型对照组、低于假手术组，且跑台组表达面积更佳。由此可知，有氧运动对该模型中的鼠脑组织发挥着保护作用，能抑制细胞的凋亡过程。其抗损伤作用机理可能通过激活PI32K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥脑组织保护的作用。
4.结论
（1）两种有氧运动均能对本慢性脑缺血小鼠模型的脑细胞发挥抗损伤作用，且其效果跑台组优于游泳组。
（2）两种有氧运动可能均通过调节PI32K /Akt信号通路的表达，达到抑制细胞凋亡，发挥抗脑组织伤害作用。
参考文献：
[1]杨运华.运动对胰岛素抵抗状态下胰岛素PI3K/Akt/GSK-3信号传导通路影响的研究进展[J].长江大学学报（自然科学版），2013（21）：142-145.
[2]黄秀兰，崔国辉，周克元.PI3K/Akt信号通路与肿瘤细胞凋亡关系的研究进展[J].癌症，2008，27（3）：331-336.
[3]朱裕华，袁红花，吴连连，等.IGF-1通过PI3K/Akt信号诱导神经干细胞向神经元分化[J].山东大学学报（医学版），2014，52（3）： 11-15.
动物行为学分析方法范文2
[关键词] SOD；Ca2+-ATP酶；复方地黄
[中图分类号] R285.5[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）10（b）-008-02
Effect of Compound Dihuang on SOD and ATP enzyme in SAM-P/8 mice brain
SUN Li-hui, HOU Jin-cai, HOU Kui-yuan, FEI Hong-xin*
(Qiqihar Medical University, Qiqihar 161042, China)
[Abstract] Objective: To observe the influence of Compound Dihuang on SOD and ATP enzyme in the brain of SAM-P/8 dementia mice. Methods: SAM-P/8 mice were divided randomly into model group, pisacetam group and Compound Dihuang group, and then the changes of SOD, Na+-K+-ATP enzyme, Ca2+-ATP enzyme and coordinated motion function of each group were observed. Results: Compound Dihuang changed the coordinated motion function of SAM-P/8 dementia mice and enhanced the activities of SOD, Na+-K+-ATP enzyme as well as Ca2+-ATP enzyme. Conclusion: Compound Dihuang can change the activities of SOD, Na+-K+-ATP enzyme and Ca2+-ATP enzyme of SAM-P/8 dementia mice, which indicates that Compound Dihuang shows a protective and therapeutical effect on Alzheimer disease(AD).
[Key words] SOD; Ca2+-ATP enzyme; Compound Dihuang
阿尔茨海默病(AD)是成年痴呆中最常见的一种类型，其病因十分复杂，发病机制至今不清。基于中医理论、已有的研究成果及诊治AD的经验，祖国医学认为AD的发病机制为肾精亏虚、痰浊阻窍、淤血阻滞。复方地黄有益肾健脾、祛痰清瘀、滋阴养血的作用，研究报道应用此药物防治AD，已取得较好的效果[1-3]。在此基础上，继续选用SAM-P/8小鼠，对复方地黄的疗效作进一步观察，为临床用药提供理论依据。
1材料与方法
1.1 材料与试剂
超纯水仪系Purelab plus公司产品；日本快速老化痴呆小鼠SAM-P/8，天津中医学院第一附属医院实验动物中心提供；健康昆明种雄性小鼠由齐齐哈尔医学院实验动物中心及哈尔滨医科大学实验动物中心提供；SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶、考马斯亮蓝测定试剂盒均由南京生物工程公司提供。
1.2 小鼠分组
将30只SAM-P/8小鼠随机分为模型组(M)、脑复康组(N)、复方地黄组(F)，并随机选取10只7个月健康小鼠作为老年对照组(L)，10只2个月龄小鼠作为青年对照组(Q)。复方地黄灌胃液2 ml/(只・d)(生药475 mg/ml)；脑复康水溶液2 ml/(只・d)，青年组及老年组以等量水灌胃。3周后处死小鼠。
1.3 行为学测试
处死小鼠前先进行行为学测试，采用爬杆法：使用一根光滑的金属棒垂直倒立，将小鼠置于棒的顶端，头向下使其自然向下爬行，观察小鼠的协调运动情况。协调运动的标准可分为：0级，一步一步向下爬；1级，向下爬行；2级，不能抓住棒；3级，翻正反射消失。在0~3级又设0.5级、1.5级和2.5级。小鼠的正常分值范围为0~0.5级。
1.4 检测SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性
小鼠测试行为学后，断头处死，进行脑组织称重，加入4倍体积冷生理盐水匀浆, 3 000 r/min离心10 min，弃沉淀，得去核上清。将此上清10 000 r/min离心10 min，得去膜上清，沉淀为破碎细胞膜和线粒体等。用10 mmol/L Tris缓冲液洗2次,10 000 r/min离心10 min，弃上清，沉淀用Tris缓冲液悬浮，供膜SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶测定用。SOD测定采用黄嘌呤氧化酶法，Na+-K+-ATP酶测定采用定磷法，蛋白测定采用考马斯亮蓝蛋白定量法，测定步骤按考马斯亮蓝试剂盒说明进行。
1.5 统计学方法
数据以均数±标准差(x±s)表示，以SPSS 10.0统计软件分析，计量资料采用t检验分析，P＜0.05表示差异有统计学意义。
2 结果
2.1 小鼠协调运动水平分析结果(表1)
由表1可知，F组与M组比较，小鼠协调运动能力有显著差异(P
2.2小鼠脑组织SOD测定分析(表2)
由表2可知，F组与M组比较，SOD活性明显增强(P
2.3 小鼠脑组织Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性水平(表3)
由表3可知，F组与M组比较，ATP酶活性均明显增强(P
3 讨论
AD的模型有很多种，如转基因动物模型、兴奋性毒素损害模型、淀粉样蛋白诱发动物模型、化学损伤模型及老年动物等。在这些模型中，转基因动物模型最明显的优点是模拟了AD的神经病理学改变，包括细胞淀粉样蛋白沉积、老年斑的形成、神经胶质细胞增生以及与AD相似的脑区特异性突触密度丧失等。当前公认的AD动物模型首推SAM-P/8小鼠。
SAM为快速老化小鼠，是日本京都大学竹田俊男教授开发的一种较理想的快速老化动物模型，具有寿命短、老化快、老化病理改变典型等优点。SAM-P/8为SAM中的一个品系，以痴呆为主要特征，其组织病理学基础是部分脑区神经元及神经纤维坏死，脑皮质萎缩。
祖国医学认为，老年性痴呆以本虚为主，兼有标实之证，本虚肾精亏虚，心脾两虚、标实则为痰浊阻窍，气滞血淤中，气血不足是形成痰浊淤血的病因，痰浊淤血又使脏腑功能紊乱，加速气血亏损。复方地黄组行为学分值分数为(1.250±0.463)分，与模型组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，提示复方地黄可以改善老年痴呆模型小鼠的痴呆状态。另外，复方地黄组SOD活性较高，为(240.213±8.635)分，与对照组比较有显著差异(P＜0.05)，提示复方地黄可以增强SOD的活性，SOD 作为体内重要的抗氧化酶，在氧化防御体系中起着重要作用，可以延缓衰老。复方地黄还可以增强Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，对机体的能量供应起到重要作用[4,5]。
综上所述，复方地黄能够改变SAM-P/8痴呆小鼠的协调运动功能，增强SOD、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶的活性，表明复方地黄对AD有保护和治疗作用。
[参考文献]
[1]Goate A, Chartier-Harlin MC, Mullan M, et al. Segregation of amissense mutation in theamyloid precursor protein gene with familial Alzheimer's disease [J].Nature,1991,349:704-706.
[2]Li YC, Bao YM, Jiang B,et al. Catalpol protects primary cultured astrocytes from in vitro ischemia-induced damage[J]. Int J Dev Neurosci,2008, 26(3-4):309-317.
[3]魏昌秀,李庆明,蒙荣森.中药复方脑还丹对快速老化鼠SAM-P/8海马CA1区超微结构的影响[J].贵州医药,2005,29(9):790.
[4]Tan W, Song CS, Tan HL,et al. Hematopoietic effect of siwu decoction in the mice with blood deficiency induced by compound method of bleeding, starved feeding and exhausting[J].Zhongguo Zhong Yao Za Zhi,2005,30(12):926-929.
[5]孙丽慧,陆佰荣,孙广惠.脑健胶囊防治老年性痴呆神经递质改变实验研究[J].医学研究通讯,2002,31(8):38.
动物行为学分析方法范文3
关键词:运动生理学;运动医学;慢性应激抑郁模型;行为学;体重;动物实验
中图分类号:G804.2文献标识码:A文章编号:1006-7116(2010)11-0100-06
Effects of exercising on the ethological expressions and body weight of
chronic stress induced depression model rats
WEI Hong-wen1,JIAO Wei1,ZHANG You-zhi2,ZHAO Nan2,XUE Rui2
(1.Sports Rehabilitation Depatrment,Beijing Sport University,Beijing 100084,China;2.Institute of
Pharmacology and Toxicology,Academy of Military Medical Sciencet,Beijing 100850,China)
Abstract: In order to observe the effects of exercising on the ethological expressions and body weight of chronic stress induced depression model rats, the authors replicated depression model rats by means of chronic unpredictable stress (CUS), used fluoxetine (Flu, a classical antidepressant) as a control, observed the effects of medium intensity treadmill running (MIR) and low intensity treadmill running (LIR) on the ethological expressions and body weight of depression model rats in chocolate milk anhedonia experiment, start experiment and novelty inhibition ingestion experiment, and revealed the following findings: 1) ethological study: CUS could significantly lower the degree of addiction of the rats to chocolate milk, reduce their spontaneous activity, and prolong their ingestion latent period in a novel environment; fluoxetine could significant counteract the said changes; with the continuance of exercising, chronic stress had fluoxetine consistent anti depression like behavior functions; 2) body weight change: CUS significantly inhibited the increase of body weight of the rats, Flu, Flu+MIR and Flu+LIR were all unable to improve the slow increase of body weight of CUS rats; MIR and LIR can improve the condition of slow increase of body weight of CUS rats; their weekly body weight had no significant difference as compared with the rats in the CUS group. The said findings proved the followings: depression model rats showed body symptoms of slow body weight increase and depression like ethological expressions such as anhedonia, spontaneous activity slowdown and ingestion latent period prolongation; exercising has fluoxetine consistent anti depression ethological effects on CUS rats.
Key words: sports psychology;sports medicine;chronic stress induced depression model;ethology;body weight;animal experiment
抑郁症(depression)属于情感性精神障碍(mood disorders),是一种以明显而持久的心境低落为主要特征的综合征,其高发病率、高复发率和高自杀率对社会造成了极大危害。世界卫生组织(WHO)预计,到2020年,抑郁症将在全球疾病负担排名中居第2位[1]。目前治疗抑郁症的药物普遍起效较慢,有效率也只有60%~70%,且部分难治性抑郁症更是目前治疗的难点[2]。
研究显示,抑郁症发生与长期缺乏健身锻炼有关,不参加运动本身就是导致抑郁症的重要因素[3]。经常从事体力活动的人患精神疾病的比率明显低于很少进行体力活动的人[4]。近年来临床在治疗精神类疾病的过程中发现,运动疗法用于精神疾病和脑疾病的治疗与康复显现出良好的效果[5],而且运动与抗抑郁病药物相结合对治疗抑郁病比单一药物疗法有效[6-7]。但这些研究仍停留在一般的问卷调查或诊疗观察上,缺乏运动抗抑郁作用的机制研究。
慢性不可预知性应激(Chronic Unpredictable Stress,CUS)是近年来国内外应用最为广泛的抑郁动物模型之一,它可模拟抑郁的核心症状――缺乏(anhedonia),目前被广泛运用于抑郁症的病理生理机制、抗抑郁药物研发及作用机制的研究[8]。本研究通过复制CUS大鼠模型,观察运动对CUS模型大鼠行为学表现和体重的影响,以经典抗抑郁剂氟西汀(Fluoxetine,Flu)作为对照,旨在探讨运动的抗抑郁样的作用。
1材料与方法
1.1实验动物
65只成年SD雄性大鼠,SPF级,购入时体重150~160 g,购自维通利华实验动物有限公司,许可证编号:SCXK(京)2007-0001。大鼠每笼4只群养,自由摄食饮水,室温22~24℃,相对湿度(50±10)%,自然昼夜节律光照。
1.2主要仪器设备
DSPT-202动物跑台(杭州段氏,中国),VIDEOMEX-V 图像运动解析系统(Columbus Instruments,美国),大鼠穿梭箱反应仪(Med Associate,美国),噪声仪(中国)。
1.3实验设计
1)实验流程。
大鼠购入后安静饲养3 d后,进行1周跑台适应性训练,接着进行为期4周的慢性不可预知性应激。期间针对不同的组别,分别伴随给予氟西汀、跑台训练干预措施,每周测定体重,并在慢性应激结束后进行开场实验[9]、巧克力牛奶缺失实验[10]、新奇抑制摄食实验[11]。
2)动物筛选及分组。
适应性跑台训练负荷安排:坡度=0,跑速=5~10~15 m/min,10~15~20 min/次,1次/d×6 d。训练期间不使用电击装置驱赶大鼠,以避免对大鼠施加不良应激[11]。
将筛选出来的大鼠,根据体重均衡分为7组,每组8只。各组之间体重差异没有显著性(P>0.05)。各组具体情况见表1。
3)大鼠慢性应激模型的建立。
参考文献[9,11,13]方法,并尽量使应激程序符合不可预知性的特点,连续4周每天下午时间给予大鼠采用1~2种如下刺激:禁食24 h、禁水24 h、潮湿饲养(200 mL水加150 g垫料)+孤养24 h、鼠笼45°倾斜24 h、夹尾1 min、电击(0.8 mA,电击每分钟间隔15 s,共30 min)、通宵照明12 h、白噪音(110 dB)1 h、10℃冰水游泳6 min、制动1~2 h。
4)药物干预。
Flu组、Flu+LIR组、Flu+MIR组每次应激前1 h给予氟西汀(Fluoxetine Hydrochloride,批号000530,白色粉末,纯度>99%,由常州第四制药厂惠赠),灌胃给药(10 mg/kg),给药体积2 mL/kg,1次/d。其余组大鼠灌胃给予相应体积的生理盐水。
5)跑台训练。
每天08:30~12:30进行跑台运动。具体训练负荷安排见表2。
1.4统计学分析
所有数据以“平均数标准差”( s)表示。统计分析用Windows SAS 6.12软件完成。SAS引导程序引自文献[14]。
2结果及分析
2.1跑台训练筛选情况
大约至少有10%的大鼠天生不会跑动或者不愿意跑动[12]。所以,在大鼠购入后安静饲养3 d后进行1周的跑台适应性训练,剔除了9只不愿意跑动的大鼠。
2.2巧克力牛奶缺失实验
由于液体摄入量与体重大小有关,所以各液体摄入量以每kg体重计算。实验日从2000开始进行测试,测定2 h内大鼠摄入液体的相对质量。结果显示(表3):各组大鼠液体摄入总量没有显著性差异(P>0.05);除CUS组外,其他各组大鼠巧克力牛奶摄入量均显著多于水摄入量(P
2.3自发活动
将大鼠放入不同于饲养环境的新环境时,首先表现为对新异环境的探究行为,经过l5 s对新异环境的适应和熟悉,然后开始自发活动测试。
采用Videomex-V图像运动解析系统测定大鼠自发活动,结果显示(见表4),与Control组相比,CUS组大鼠自发活动减少,表现为测定时间内的活动总路程显著减少(P
2.4摄食潜伏期
结果显示(见表4),与Control相比,CUS组大鼠在新奇环境中的摄食潜伏期明显延长(P
2.5体重
结果显示(见表5):CUS开始前各组大鼠体重差异无显著性(P>0.05),符合实验的基本要求。慢性应激对大鼠体重有明显影响,CUS组大鼠在2周后体重开始显著低于Control组(P
3讨论
在应激致抑郁的动物模型中,开场实验、糖水消耗量、体重变化是经典的反映动物抑郁行为学及躯体症状的指标[14]。根据文献,并结合本实验室的以往研究成果[9,11,13]和实验条件,本研究选取巧克力牛奶缺乏实验、开场实验、新奇抑制摄食实验这3个行为学测验,结合大鼠体重的变化,来综合评价造模的效果。
3.1巧克力牛奶缺乏实验
CUS抑郁模型脑内奖赏系统一些神经元结构受损,导致快乐体验能力的缺乏[15]。动物对甜觉奖赏的反应性下降是最简单、最易于观察的指标,因此目前国外大多数学者采用液体消耗实验中糖水消耗量和糖水偏爱百分比来作为测量缺乏的有效客观指标[8-9,11,13,15],也有研究用巧克力牛奶缺乏实验(chocolate milk anhedonia test,CMAT)[10]、甜味食物摄取量(sweet food intake)或甜味食物摄取比值(rate of sweet food intake)、美味食物摄取(palatable food intake)、颅内自我刺激(brain stimulation reward)、位置偏爱实验(place preference conditioning procedure)等实验来测量[16]。
传统的糖水消耗实验由于存在许多繁琐的步骤[8],如:需要进行糖水基线训练和测试,大约有10%~15%的动物不能获得稳定的糖水摄入基线,而且还有同样比例的应激动物经过3周应激后糖水摄入量并没有清晰和稳定的减少,这些动物需要淘汰;在实验时要进行控制饮食等复杂的工作。还有文献报道,大鼠糖水摄入量(或糖水偏嗜度)在慢性应激后没有下降,有的抗抑郁药也不能恢复慢性应激动物下降的糖水摄入量[17]。尽管上述局限性可能与研究者所采用的动物品系、应激程序和糖水实验方法的不同有关,但从另一方面提示了糖水消耗实验的方法不够稳定和敏感,这在很大程度上限制了该实验在抑郁症研究领域的应用。
CMAT是另外一种反映动物缺乏的实验,该方法不需要事先进行液体消耗的训练,只需要进行一次性测试,具有快速、简便的特点[10]。
本研究结果表明,在液体摄入总量没有差异的情况下,CUS大鼠摄入了较多的水,而Control组大鼠摄入了较多的巧克力牛奶,相对于Control组大鼠而言,CUS组大鼠对对巧克力牛奶“没有兴趣”,提示其出现了“缺乏”。大鼠巧克力牛奶饮用量的下降不能单纯地解释为液体饮用的下降(即渴觉的下降),因为动物总液体消耗量并无明显改变,而巧克力牛奶摄入量、巧克力牛奶偏嗜度显著下降,提示本研究的CUS模型表现出了动物对幸福事件反应能力的下降。
结果还表明,CUS伴随给予氟西汀,进行中、小强度运动跑台训练,以及氟西汀分别联合中、小强度运动跑台训练,均能够显著提升CUS大鼠对巧克力牛奶的“兴趣”,“缺乏”显著减少。表明CUS大鼠出现了抑郁症的核心症状――缺乏,而运动、氟西汀均能够改善此核心症状。
3.2开场实验
本实验采用Videomex-V图像运动解析系统测定动物的自发活动(spontaneous motor activity),该系统能够自动识别动物的运动轨迹,减少了实验工作量,更重要的是提高了实验数据的精度和可靠性。结果显示,CUS使大鼠自发活动减少,表现为测定时间内的活动总路程显著减少,与本研究室[8,10,12]以及国外文献报道一致[17]。CUS伴随给予氟西汀、进行中等强度跑台训练、氟西汀分别联合中、小强度跑台训练均能够显著增加CUS大鼠活动距离。表明跑台运动能够使CUS大鼠维持一定的自发活动,减少抑郁样行为。
3.3新奇抑制摄食实验
新奇抑制摄食实验(novelty-suppressed feeding,NSF)是动物禁食后在饥饿状态下新奇的环境中产生摄食和对新环境恐惧的矛盾冲突,长期给予抗抑郁药物可使动物的冲突反应降低,表现为开始摄食的潜伏期缩短,该模型目前被广泛应用于抗抑郁剂以及抗焦虑药物的长期效应评价[11]。
本研究结果表明,与Control相比,CUS组大鼠在新奇环境中的摄食潜伏期明显延长,慢性应激伴随给予氟西汀能够显著缩短CUS大鼠摄食潜伏期,这与本研究室以往研究结果[9,11]一致。
运动对NSF实验影响的报道较少。自由转轮运动显著缩短了正常小鼠摄食潜伏期,但对LID小鼠(一种以血清IGF-1较低为特点的突变小鼠)摄食潜伏期没有显著影响[19]。目前尚未见运动对CUS大鼠NSF影响的文献。
本研究显示,CUS伴随进行中、小强度跑台训练,氟西汀分别联合中、小强度跑台训练,均能够显著缩短CUS大鼠摄食潜伏期。表明运动,以及抗抑郁药联合运动,均能够缩短抑郁模型大鼠摄食潜伏期,运动在该模型上显示出较好的抗抑郁样作用,而且运动进一步加强了氟西汀在新奇抑制摄食模型上的抗抑郁作用。
3.4体重
体重的变化可以看作是抑郁大鼠模型量化的躯体症状和体征,抑郁大鼠体重增长缓慢,这与抑郁症患者的食欲降低、消瘦相类似[8]。
本研究对大鼠每周测定一次体重,结果发现,CUS对大鼠体重有明显影响,CUS组大鼠在2周后体重开始显著低于Control组,并且一直延续到慢性应激的第3周和第4周;慢性应激伴随给予氟西汀,未能改善CUS大鼠体重的增长缓慢,表现为从慢性应激2周后开始到慢性应激结束后,每周体重均显著低于CUS组;CUS伴随进行中、小等强度跑台运动,能够改善CUS大鼠体重增长缓慢的情况,而且对抗CUS抑制体重增长的情况优于慢性应激伴随给予氟西汀,表现为LIR组、MIR组与CUS组相比,在整个实验期体重差异均没有显著性,LIR组体重在4周后,MIR组在3周、4周后体重还显著高于Flu组;CUS伴随给予氟西汀并分别联合中、小强度跑台训练,也未能明显改善CUS大鼠体重增长缓慢的情况,表现为从慢性应激2周后开始到慢性应激结束后,每周体重均显著低于CUS组;Flu+LIR组、Flu+MIR组在慢性应激3周后开始到慢性应激结束,体重均分别显著低于LIR组、MIR组。
由于本实验对大鼠进行群养(4只/笼),群养大鼠进食过程中经常有食料遗撒现象,而且慢性应激程序中有禁食、禁水的项目,故无法精确计量每只大鼠的进食量。因此,慢性应激导致大鼠体重增长缓慢,本研究分析可能与HPA轴有关:下丘脑分泌的CHR不但可以刺激垂体释放ACTH,而且是调节能量平衡和体重的重要因子。慢性应激导致大鼠体重增长缓慢,可能是HPA轴被激活,下丘脑分泌的CHR引起食欲减退,以及在应激条件下能量消耗增加,两种因素双重作用的结果[20]。而慢性应激伴随给予氟西汀进一步降低大鼠体重的原因,与氟西汀的药理作用有关。氟西汀属于择性5-HT再摄取抑制剂,其主要药理作用在于选择性地抑制CNS突触前细胞对5-HT的再摄取,可以通过增加大脑自身的5-HT供给来纠正这种神经递质的缺乏,从而能够有效控制抑郁症的症状。动物实验表明增加突触间隙5-HT或直接刺激5-HT2C受体可减少进食,反之则增加进食[21]。因此,氟西汀通过升高突触间隙的5-HT水平,减少了大鼠的进食,进而导致体重下降。
我们也发现与本研究结果类似的报道[11,22],即:抗抑郁药物能够有效改善甚至逆转CUS大鼠抑郁样行为,但是不能改善其体重的缓慢增长。因此,我们存在这样的疑惑:尽管抑郁模型大鼠表现出体重增长幅度减少或体重下降已经得到许多研究的验证,但是当氟西汀能够有效改善抑郁模型大鼠的行为学异常时,为何不能逆转其体重下降?是因为本研究的大鼠在总共为期5周(1周适应期,4周慢性应激期)的实验后(已达10周龄)已错过了生长发育的最佳时期,慢性应激对其生长发育造成不可逆的抑制,从而使抗抑郁药物不能恢复其体重增长,还是抗抑郁药物在发挥抗抑郁作用的同时,也作用于神经内分泌系统的某个靶点,对大鼠体重增长产生抑制作用?这有待于后续工作的深入研究。
本研究结果还说明,慢性应激伴随进行跑台训练,对于大鼠体重增长缓慢有一定的改善作用,对于保持动物的体重有一定的效益。原因可能是适量运动部分平衡了HPA轴的功能,还有可能是运动促进机体新陈代谢,增加了大鼠的食欲,后者引起体重的增长。这有待于今后进一步的验证。
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动物行为学分析方法范文4
摘要：【目的】观察复聪香液对血管性痴呆大鼠海马CA1区神经元形态结构的影响。【方法】SD大鼠40只随机分为4组，分别为假手术组、模型组、脑复康对照组和复聪香液组，经反复脑缺血再灌流加降血压法造模后，分别给予生理盐水、复聪香液及脑复康溶液，连续15?d后脑部取材，苏木素伊红（HE）染色观察海马CA1区组织形态变化。【结果】与假手术组比较，模型组可见大量神经细胞损伤、变性，甚至坏死；而复聪香液及脑复康均能不同程度地减轻神经细胞损伤。【结论】复聪香液对血管性痴呆模型大鼠大脑海马CA1神经元损伤具有一定的保护作用。
关键词：复聪香液／治疗应用； 痴呆，血管性／中药疗法； 痴呆，血管性／病理学；疾病模型，动物； 大鼠
痴呆的发病机制涉及多个方面，其中最主要的是老年退行性变与血管性痴呆。血管性痴呆（vascular dementia，VD）是由于缺血性或出血性脑血管病以及全脑性缺血、低氧而引起的认知障碍，是以记忆减退、表情淡漠、呆滞，或人格改变为主要临床表现的一组神志异常综合征［1］。本实验观察了复聪香液对血管性痴呆模型大鼠海马CA1区神经元组织的影响，现报导如下。
1 材料与方法
11 材料
111 动物 成年雄性SD大鼠40只，清洁级，体质量180～220?g，由第一军医大学动物实验中心提供（合格证号：2002A041号）。动物分组情况：按照水迷宫训练成绩随机分为4组：
（1）假手术组；（2）模型组；（3）脑复康阳性对照组；（4）复聪香液组。
112 药品与试剂 复聪香液，由银杏叶、石菖蒲、麝香、冰片等加工制成，广东江门市五邑中医院制剂室提供，批号020919，分为A液及B液（B液为原方水提浓缩液，A液则为原方挥发油部分的提取液）；脑复康由广东华南制药厂生产，批号为020803，临用时蒸馏水溶解；硝普钠由北京双鹤药业股份有限公司加工生产，批号为0206211。
12 方法
121 模型制备
参照王蕊［2］等造模方法，将大鼠麻醉后，分离暴露双侧颈总动脉；硝普钠按25?mg/kg腹腔注射后即刻用无创动脉夹夹闭双侧颈总动脉10?min，然后复通10?min，再次夹闭10?min，再通后缝合。实验过程中使大鼠肛温保持在（375±03）℃，以防止低温对脑缺血损伤的保护作用，术后保温饲养。
122 给药方法
待动物造模清醒后即开始给药。复聪香液组按425?μL・kg－1・d－1随氧吸入A液1?h，495?g・kg－1・d－1剂量灌胃B液；阳性对照组给予脑复康，按4?g・kg－1・d－1灌胃，模型组和假手术组给予等容量的生理盐水灌胃，连续灌胃15?d后，进行行为学测试，然后取脑组织。
123 病理学检查
大鼠断头处死后，迅速取大脑，用体积分数为10%的市售福尔马林固定，在前囟后17?mm处切取脑组织，石蜡切片，苏木素伊红（HE）染色，光镜下观察海马CA1区的病理变化。
2 结果
假手术组可见海马CA1区锥体细胞排列整齐、密集，形态正常，结构完整，无变性，胶质细胞无增生；模型组见锥体细胞排列紊乱，胞体肿胀，胞膜溶解，有空泡产生，出现核固缩，核裂解，胶质细胞增生形成多处结节；复聪香液组和脑复康组仅见少数细胞变性坏死，锥体细胞排列较模型组整齐，正常细胞数目增多。结果见图1。
假手术组（pseudooperation group，10×10）
假手术组（pseudooperation group，10×40）
模型组（model group，10×10）
模型组（model group，10×40）
脑复康组（Naofukang group，10×10）
脑复康组（Naofukang group，10×40）
复聪香液组（FL group，10×10）
复聪香液组（FL group，10×40）
图1 各组海马CA1区神经元形态学比较（略）
Figure 1 Histological features of hippocampal CA1 neurons in different groups 3 讨论
中医认为血管性痴呆病位在脑，涉及肝肾心脾诸脏，尤与肾中精气的盛衰密切相关；多因年高正损、情志内伤等因素引起脏腑阴阳气血失调，以致痰瘀浊毒阻络窒窍，造成脑络闭塞、神机失用而发病；本病病性为本虚标实，其本为精气亏虚，其标为痰瘀浊毒内阻。故治疗上应采用化浊豁痰开窍，益气祛瘀醒神之法。复聪香液是经过长期的临床实践针对本病的病因病机所拟的标本兼顾之剂。方中运用石菖蒲、麝香、冰片、薄荷脑等芳香化浊，祛痰开窍；川芎、郁金、丹参、银杏叶等活血化瘀；黄芪、羊藿等益气补阳，标本兼治，虚实兼顾，使得实邪得以祛，正气得以复。从现代药理学角度来看，近年来中医药治疗本病研究的重点在于改善神经递质传导，改善自由基代谢，改善微循环，抗细胞凋亡等，而本方中运用的药物如丹参、川芎、银杏叶、石菖蒲、冰片等，均有报道显示其所含的成分具有以上作用。
石菖蒲挥发油不仅能降低凋亡细胞的积分光密度，也能降低凋亡细胞数，对脑神经细胞具有保护作用［3］；川芎嗪能在某种程度消除超氧阴离子，阻止自由基反应造成的脂质过氧化，从而减轻缺氧缺血后再灌注损伤，达到治疗目的［4］；银杏叶提取物可以明显改善反复脑缺血再灌注小鼠的学习和记忆功能，同时可不同程度地抑制脑组织中异常升高的丙二醛（MDA）、一氧化氮（NO）和前列腺E2（PGE2）的含量，明显增强脑组织中降低的超氧化物歧化酶（SOD）［5］活性；黄芪、丹参、川芎等可明显改善脑缺血再灌注动物的脑组织血氧代谢，增加脑组织血液容量［6］；冰片能促进某些药物透过血脑屏障，促进其他药物透皮吸收，提高其他药物的血药浓度和生物利用度［7］。
病理学检查是评价脑缺血损伤和治疗效果的一个比较客观的指标。海马是脑组织中对缺血、缺氧最敏感的区域之一，而其中的CA1区又是海马中最易受损的部位。从本实验结果可以看出，假手术组大鼠海马CA1区结构完整，锥体细胞排列整齐，而模型组结构不完整，锥体细胞排列紊乱，细胞脱失严重，证实了缺血对海马的损伤。复聪香液组海马CA1区的细胞脱失明显少于模型组，表明本方对血管性痴呆模型大鼠海马CA1区神经元的缺血性损伤具有保护作用。复聪香液对血管性痴呆模型行为学的研究表明，与对照组比较，模型组大鼠游完全程时间延长，错误次数增多，学习记忆能力下降，复聪香液能使上述情况改善，统计学分析差异有显著性［8］。
本方的制作工艺及临床用药方法有独到之处。在制作上，是将处方中诸药煎煮后，收集药物的挥发油部分加工制成A液，并将剩余药液去除杂质后浓缩加工成B液。在临床用药上，口服B液的同时，还将A液混合于低流量氧气中，使药液的挥发油部分随氧气吸入，透过鼻粘膜下丰富的血管吸收入血液，促使脑细胞功能更快地恢复。经鼻腔给药是近年来一种较新颖的给药途径，而中药药氧吸入法治疗血管性痴呆目前也较为少见。国内外的一些研究显示，鼻腔给药疗效优于口服给药，而与静脉给药近似［9］。但本研究中复聪香液的给药途径疗效是否确实比其他途径要好，有待进一步证实。
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动物行为学分析方法范文5
关键词：焦虑， 抑郁， 神经环路， 分子机制，光学成像， 电生理，钙成像，昼夜节律
Neural circuits and molecular mechanisms underlying anxiety and depression
Abstract：Anxiety and depression are common human emotion and mood disorders， and their underlying neural mechanisms remain largely unknown. In this project， we plan to use mouse as the model system to study the neural circuits and molecular mechanisms of anxiety and depression， at the levels ranging from molecules to animal behaviors. The first team carries out the cellular physiological studies of animal anxiety and depression. The malfunctions of the serotonin （5-HT） system are related to anxiety， anhedonia， and depression. We examined the behavioral effects of activating 5-HT neurons in the dorsal raphe nucleus （DRN）， the major source of 5-HT in the forebrain. By combining optogenetics， single-unit recordings， pharmacology， mouse genetic， and behavioral assays， we find that the activation of DRN 5-HT neurons produces strong reward signals that are mediated through the release of 5-HT and glutamate. Our results demonstrate that the DRN directly mediates reward， provides new insights into the intervention of depression and schizophrenia， which often manifest as the disorders of emotion and mood. The second team mainly focus on the interactions between circadian/circannual rhythms and the mood regulation. Here we present some substantial progresses on three aspects. First， we discovered that the C3H mouse strain is particularly suitable for studying seasonal affective disorders （SAD）， highlighting the light-entrainment， or seasonal-mimicking， in mood regulation. Second， we found that the deletion of Bmal1 or Clock gene in the brain VTA area developed a counter-depression effect in mice， suggesting the engagement of the circadian clock in mood regulation. Finally， we have developed a cell-based high-throughput screen assay to identify clock modifier drugs， which are potentially useful to cure or relieve the mood disorders such as depression in humans. The third team is tasked to perform optical imaging studies of the neural circuits. We have established the optical methods and platforms to study the neural circuits underlying anxiety and depression， carried out the preliminary experiments of studying the whole-brain projection patterns as well as calcium imaging of NE/E neurons in the brain. In addition， we have completed the study of the behavioral functions of POMC neurons in thebrain. In summary， we are smoothly on the track of our research schedules， and are well-positioned to make more exciting findings in the future years.
动物行为学分析方法范文6
白城医学高等专科学校，吉林白城 137000
[摘要] 目前，关于学习记忆在脑中如何形成的机制一直受到人们的关注。经过若干年的动物实验研究，目前已经开展并提高了许多研究学习记忆机理的动物实验模型。其中最完美、最广泛应用的是惊恐条件反射模型，该模型是以条件反射为基础，将条件刺激（如电击）和非条件刺激（如声音）有机结合，观察动物对刺激的反应情况，以此来衡量动物恐惧经验获得并保存的能力。
关键词 惊恐条件反射模型
[中图分类号] R392 [文献标识码] A [文章编号] 1674-0742（2014）05（c）－0196-02
[作者简介] 高明春 （1973.3-），女 ，吉林白城人，硕士研究生，副教授，从事高职高专教学及学生管理工作。
在20世纪后期，人们对精神疾病的研究愈加深入，在神经科学家和临床科学家的研究下，建立了惊恐条件反射模型，为学习记忆机制的研究奠定了基础。惊恐条件反射，又称条件性恐惧[1]，是指动物在实验中先接受两种不同性质刺激的作用，其中一种称为条件刺激，另一种称为非条件刺激，结果动物就会出现各种害怕行为；接下来单独给予条件刺激，动物即可出现恐惧反应：如应激性心跳加强，僵直动作等。
在过去的几十年中，科学家们根据实验动物在行为学方面的改变，主要研究惊恐条件反射模型的方法及类型。在实验的研究中，常采用动物独特的惊愕反应特征和活动范围、规律的改变以及对环境的新颖性、好奇性来评价惊恐条件反射的状况，目前较成熟的实验方法有如下几种[2-5]。
1 “田”字型区域实验
该装置由一正方形围边组成基本框架，厚度为1~2 cm，距离地面高度50 cm。内部平均分为四部分，呈“十”字型的四个区域即可，其中2个为无障碍的开放区，2个为封闭区。方法如下：首先将大鼠或小鼠放入十字的中央，单位时间内观察动物的行为，分别记录进入2种区域的次数和时间。正常情况下，因鼠类喜欢黑暗、密闭的环境，因此主要活动场所为寂静、安全的封闭区。如果动物非上诉活动情况，而是进入开放区的频率增加，逗留时间加长，则标志着恐惧反应的发生。
2 Oen-field实验
该实验中，在光滑、平整、洁净的地面上，用50 cm高金属丝围成3个同心圆，直径分别为20 cm，40 cm和60 cm，并铺上黑色地毯，在圆心上方70 cm处配以白色和红色两种灯光照明作为条件刺激，同时在最合适的位置安装摄像机记录整个场地情况。实验分为两部分，首先采用白色灯光照明，2~3 d即可，目的让大鼠适应环境，接下来换用红色灯光照明，形成非条件刺激，观察2~3 d。在具体操作过程中，首先将大鼠放入中央最小的圆圈中，以单位时间内跨越每个圆圈的次数、僵滞百分比、排粪、后腿站立和梳理行为的数量为指标，观察并记录，以此为数据进行统计学分析。
3 日常行为改变实验
该研究依据实验动物群居、圈养的习性，通过改变环境，观察原有习性的变化，衡量动物的非条件刺激特点。首先将两只或多只大鼠放在一个明亮、宽敞的场所，然后观察并记录动物的日常行为，如彼此间亲吻、闻吸气味、梳理毛发、叨咬尾巴、争斗等，作为条件刺激的数据；接下来将大鼠调换置光线暗淡、狭隘的新环境，与较前的相比较而言，动物在新场地里其正常的行为将受到影响，标志着恐惧反应的发生，以此作为对照，非条件化恐惧的特点得以展现及证实。
4 “回”字格迷宫试验
小鼠或大鼠的天性喜欢黑暗、寂静的环境，回避明亮、喧闹的氛围。依据这一特点，设计一结构为“回”字形的笼子，内部宽敞、明亮、安静，外部狭窄、昏暗、嘈杂。通常情况下，老鼠在昏暗一侧活动行为正常，包括寻找性活动、彼此间吻舔、整理皮毛、后肢翘起等，随着时间的延长，对环境的陌生会减少，如果恐惧缓解时，就会在明亮的内“口”字一侧频繁出现，或在该侧多次、反复、长时间爬行、寻找、嗅吸等，进而来评估实验动物惊秫反应的程度。
5 掩埋电击触头实验
在这一模型中，以电击作为非条件刺激，观察并研究动物对刺激的反应。实验笼子内悬挂带电的金属挂钩，当大鼠碰触挂钩时便遭到电击，其会迅速地将笼子内的垫料或其他物品通过前腿堆置挂钩处将其屏蔽，以防备再次接触金属挂钩而受到电击。在一般的日常活动不减少的情况下，遮蔽金属挂钩的次数减少就作为衡量恐惧程度的指标。此后，一些学者又做了进一步改进，将不带电情况下，大鼠触及金属挂钩频率的增加，作为研究分析恐惧反应的又一指标。
6 电击导致吼叫实验
目前，在电脑相关程序的配合下，此类实验广泛开展。首先按电脑程序的安排，将大鼠置于装置内，接受反复电击，同时记录尖叫声，并经由相关软件程序处理转化成数据，作为参数提供依据。
7 恐惧诱导性惊愕试验
该实验是多种方法结合之后形成的。在装置中，既有条件刺激如电击，又配合非条件刺激如声音、光照，以此为基础，通过合理配置，研究动物的恐惧反应。首先在笼子底部配以金属栅格，并与电击发生器相连，每个大鼠所受电流强度为2.0 mA，100 ms，接下来通过电脑与高频扬声器连接，发出55~95 dB的强音，另外将光源置于笼子上方20 cm处。实验开始时先将大鼠放入不透光的一侧，此时零刺激，目的仅为适应环境。然后将噪音和电击成对作用，电击的同时，光源发光，形成条件化信息。经过以上过程处理的动物随机分为两组，一组24 h后再将大鼠重新置于装置内，只有噪音和灯光刺激，以此种情况下动物特殊、异常行为的频率和次数为数据，记录并整理；另一组只有噪音刺激，结果发现2种或2种以上条件的配合所致惊恐程度比单纯一种条件要明显增强（约80%~100%）。
8 冲突实验
冲突试验途径过程多种多样，其基本原则是将奖赏与惩戒两大内容分别组合。以威氏试验为例，将正常的大鼠禁水48 h后再给予饮水，但约束5 min左右，然后在水管或笼子底部安装电击设备，每当大鼠舔吸水管口达一定次数（如10次）就给予微弱的电流短时间刺激；而格氏实验是把经过处理的的大鼠随机分为两组，一组只有奖励，另一组奖励+惩罚，两种条件反复、交替地进行，记录舔吸行为的次数，作为评定指标。结果发现两组动物都会因电击导致动物舔吸行为减少，从而产生条件化恐惧。
研究惊恐条件反射造成的恐惧的意义在于[6-7]：①为研究学习和记忆的机制，开发大脑的潜能，寻找一条新的途径。通过动物模型实验证明：由于恐惧的经历，使得大脑中的记忆系统能够对环境的改变及时做出反馈，以确保在危险地情况下保存自己。②掌握恐惧与行为的相互关系，指导人类情绪支配行为的原因。③熟悉恐惧的有关医学原理及内涵，对于焦虑症、抑郁症等神经性疾病的诊断和治疗具有深远的影响。
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