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细胞的生物学特性范文1
1 成纤维细胞的来源及其生物学特性
成纤维细胞(fibroblast)是结缔组织中最常见的细胞，由胚胎时期的间充质细胞(mesenchymal cell)分化而来。在结缔组织中，成纤维细胞还以其成熟状态—纤维细胞(fibrocyte)的形式存在，二者在一定条件下可以互相转变。
不同类型的结缔组织含成纤维细胞的数量不同。通常，疏松结缔组织中成纤维细胞的数量比同样体积的致密结缔组织中所含成纤维细胞的数量要少，故分离培养成纤维细胞多以真皮等致密结缔组织为取材部位［2，3］。
成纤维细胞形态多样，常见的有梭形、大多角形和扁平星形等，其形态尚可依细胞的功能变化及其附着处的物理性状不同而发生改变。成纤维细胞胞体较大，胞质弱嗜碱性，胞核较大呈椭圆形，染色质疏松着色浅，核仁明显。电镜下，其胞质可见丰富的粗面内质网、游离核糖体和发达的高尔基复合体，表明它具有合成和分泌蛋白质的功能。成纤维细胞尚可合成和分泌胶原纤维、弹性纤维、网状纤维及有机基质。它合成的前胶原蛋白分子经内切酶作用，聚合和重排，可形成与成骨细胞合成分泌的胶原原纤维一样具有64nm(640?)周期横纹的胶原原纤维，胶原原纤维经互相粘合形成胶原纤维。经检测，这
两种细胞合成分泌的胶原纤维均是Ⅰ型胶原纤维，在形态和生化结构上完全相同［4，5］。
处于成熟期或称静止状态的成纤维细胞，胞体变小，呈长梭形，粗面内质网和高尔基复合体均不发达，被称为纤维细胞。在外伤等因素刺激下，部分纤维细胞可重新转变为幼稚的成纤维细胞，其功能活动也得以恢复，参与组织损伤后的修复。另外，在结缔组织中，仍保留着少量具有分化潜能的间充质细胞，它们在创伤修复等情况下可增殖分化为成纤维细胞。
2 成纤维细胞在一般创伤修复中的表现
各种创伤均会造成不同程度的细胞变性、坏死和组织缺损，必须通过细胞增生和细胞间基质的形成来进行组织修复。在此修复过程中，成纤维细胞起着十分重要的作用。以伤口愈合过程为例，成纤维细胞通过有丝分裂大量增殖，并从4～5天或6天开始合成和分泌大量的胶原纤维和基质成分，与新生毛细血管等共同形成肉芽组织，填补伤口组织缺损，为表皮细胞的覆盖创造条件。在伤口愈合中，成纤维细胞主要来源于真皮层的局部成纤维细胞和未分化的间充质细胞，以及血管周围的成纤维细胞和周细胞。内脏损伤时，参与修复过程的成纤维细胞多来自间质和包膜，以及粘膜下或浆膜下层的结缔组织。有人认为创伤愈合过程中伤处聚集的大量成纤维细胞，一方面是由成纤维细胞通过分裂增殖而来，另一方面，更多地是由邻近的间充质细胞、纤维细胞和毛细血管周细胞等演变或游走到伤处。在创伤修复的后期，成纤维细胞通过分泌胶原酶参与修复后组织的改建。在某些病理条件下，以成纤维细胞为主要细胞成分的肉芽组织或增生组织块还可以在非骨组织内发生钙化，引起异位骨化(ectopic ossification)。但对于异位骨化的参与细胞及其机制尚不十分清楚，未分化间充质细胞、成纤维细胞、内皮细胞和毛细血管周细胞等可划归为诱导性骨祖细胞的细胞都有可能参与这一过程［6，8］。
3 成纤维细胞在骨创伤修复过程中的表现
最简单和常见的骨创伤即是骨折，其愈合过程须经过炎性反应、清扫、纤维骨痂和骨性骨痂4个阶段［4］。不同阶段参与的细胞主体不同。成纤维细胞从骨折第3天起就出现于骨折局部血肿中［6］，骨折后5天即在机化血肿及骨折断端的间隙及其周围大量存在，是参与纤维骨痂阶段的主要细胞成分［4，5］。在此阶段成纤维细胞一方面大量分裂增殖，一方面又合成和分泌大量Ⅰ型胶原，使肉芽组织逐步变成疏松的结缔组织，将骨断端包围起来，形成接合两骨折断端的巨大的纤维骨痂。然而，这种由无数成纤维细胞和丰富的肉芽组织为主体构成的纤维结缔组织却不会演变为在其它组织创伤修复时常见的瘢痕组织，而是通过钙盐结晶在其内部不断沉积，逐渐演变为骨性骨痂，使骨折局部的修复达到骨性愈合，恢复骨组织的结构。此时，骨折愈合部只有骨组织而不再存在成纤维细胞［4，5，9～11］。
4 成纤维细胞的成骨作用
成纤维细胞在骨折愈合过程中不同于其它组织创伤修复的表现，以及在某些病理条件下可以参与异位骨化［6，7］，使人们对成纤维细胞的分化能力、钙化骨化能力以及在成骨过程中其成骨能力如何发挥、细胞演变的最终归宿如何等等问题产生了浓厚的兴趣。对成纤维细胞成骨能力的研究也正是开始于对骨折愈合过程中成纤维细胞表现的观察。
对骨折局部骨形成区的电镜观察显示，除了成骨细胞在此发挥成骨作用外，成纤维细胞确实也存在着类似的成骨表现［4，5，9～13］。例如，在其线粒体内可清晰见到钙盐颗粒，部分内质网腔内可见成熟的胶原纤维，分泌到其四周的胶原纤维内可见高密度的钙盐结晶沉积。不仅如此，成纤维细胞还能象成骨细胞一样产生基质小泡并引起小泡内的钙盐沉积。钙化的基质小泡形成丛毛球状的钙球，钙球随后合并、融合为骨组织。以上种种现象表明，成纤维细胞与成骨细胞一样具备提供钙盐沉积及骨形成所必需的条件。在从纤维性骨痂到骨性骨痂的演变过程中，成纤维细胞也随之演变为骨细胞，与成骨细胞的归宿相一致。但二者在演变过程中的
表现又不尽相同，主要有以下几点可资鉴别［9，13］：①成纤维细胞及其细胞核均呈不规则的椭圆形或长方形，而成骨细胞及其细胞核则为边缘比较光整的椭圆形；②成纤维细胞均单独存在，细胞之间有众多的胶原纤维相隔，成骨细胞则以连续排列的形式出现；③成纤维细胞的细胞质内溶酶体少见，而成骨细胞的细胞质内则常有溶酶体可见；④成纤维细胞四周的骨组织都由丛毛球状钙球或针状钙盐结晶组成，成骨细胞则都有一面紧贴比较成熟与致密的骨组织；⑤成骨细胞是一个一个地被骨组织(类骨质)包围变为骨细胞，而成纤维细胞则可以是两个或两个以上同时被骨组织包围在一个陷窝内，然后再随着细胞之间基质的钙化而分隔为各占一个骨陷窝。
对成纤维细胞的成骨作用，有学者认为这是成纤维细胞的固有特性在骨折这一特定情况下得以表达的结果［9，11］。骨折局部活的和失活的骨组织及软骨组织，以及骨基质中的某些大分子都有可能诱导成纤维细胞表达其成骨作用进而演变为骨细胞［14，15］。较早在骨基质中发现的骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein， BMP)即对成纤维细胞有一定的诱导作用。对骨折愈合中BMP作用的研究［16，17］，表明创伤使内源性BMP呈阶段性合成与释放，并诱导周围软组织中的间充质细胞或/和成纤维细胞等向成骨方向转化。应用PAP法发现［16］，骨折后第3、5天局部纤维肉芽组织中的成纤维细胞样间充质细胞内以及第14天新生骨小梁间纤维组织中的成纤维细胞样间充质细胞内，都与成骨细胞、软骨细胞和骨基质一样存在BMP，表明这些成纤维细胞样间充质细胞已被诱导为可合成分泌BMP、具有成骨作用的细胞。而Sampath［15］从牛骨基质中分离提纯得到的成骨素对成纤维细胞的骨诱导能力更是超过了BMP和当时已知的其它骨生长因子。
成纤维细胞在其成骨作用得以表达后，可能通过两种方式成骨：①膜内成骨；②在环绕软骨的纤维层内成骨。开始分泌胶原纤维后，参与成骨的成纤维细胞只有两个归宿［4，5，9，13］：①变性、死亡、碎裂直至消失，这种演变发生早、范围广，故从纤维性骨痂形成开始，就逐渐有基质成分发生钙化，进而转变为骨基质；②演变为骨细胞，这一过程出现较晚，并穿插在前一过程之中，故在形成骨组织的细胞成分的同时，还使丰富的纤维骨痂演变为骨性骨痂，形成骨组织。但这种由成纤维细胞演变成的骨细胞，其结局如何、其生物学特性与由成骨细胞演化而来的骨细胞是否相同仍不清楚。例如，骨细胞从骨陷窝脱离后，可恢复为功能活跃的成骨细胞，再次参与骨组织的形成；而由成纤维细胞演变成的骨细胞在脱离骨陷窝后，是成为成骨细胞还是恢复为成纤维细胞、此时是否还具备成骨作用等一系列问题尚缺乏研究。
5 成纤维细胞体外培养的生物学特性［18］
成纤维细胞的分离培养一开始并不涉及成骨作用，而主要是用于研究细胞的老化、各种外来因子对细胞的损伤、细胞在体外条件下的恶性转化、以及某些先天性代谢异常、酶缺陷等。由于皮肤成纤维细胞易于获取，又易于在体外生长，故目前皮肤成纤维细胞培养已在基础医学和临床医学研究中得到较广泛的运用，其分离培养技术已相对成熟，对其体外生长规律也有了较全面的认识。
成纤维细胞的原代培养可用酶消化法或组织块法，其中组织块法又因其操作简便、条件易于控制而应用更为普遍。通常，以酶消化法获得的成纤维细胞悬液在接种后5～10min即可见细胞以伪足初期附着，与底物形成一些接触点；然后细胞逐渐呈放射状伸展，胞体的中心部分亦随之变扁平；最快者大约在接种后30min，细胞贴附底物即较为完全，呈现成纤维细胞的形态。采用组织块法则大约在接种后2～3天［2，3］到1周左右，在接种的皮肤组织块周围长出细胞。待细胞融合成片，铺满培养容器底壁大部分时即可进行传代。一般都采用胰蛋白酶(trypsin)，将成纤维细胞从底壁消化下来后分瓶作传代培养。成纤维细胞在体外培养条件下能保持良好的分裂增殖能力。细胞分裂时变为球形；分裂后又平铺在附着物的表面成为有突起的扁平细胞。体外培养的成纤维细胞，其生命期限与物种等因素有关。例如：人胚成纤维细胞约可培养50代；恒河猴皮肤成纤维细胞能传代超过40代；鸡胚成纤维细胞则只有少数能培养30代；而小鼠成纤维细胞多数只能生长8代左右。另外，从老年个体取得的成纤维细胞的寿命要比取自年轻者短。由于在细胞传代和进行体外培养时，细胞的生物学特性会逐渐发生一些不同于体内的改变，故通常只将前10代视这正常细胞，可在此时将生长旺盛的成纤维细胞冻存起来，以备将来复苏使用，这在将培养的细胞由动物实验向人体实验过渡的过程中必须给予足够的重视。
6 成纤维细胞在体外培养中的成骨作用
徐荣辉［2］等通过体外培养家兔皮肤成纤维细胞发现，经传代培养的成纤维细胞至第8天时，其细胞集落中有不透光的骨小结节形成；到37天时，小结节扩大、延伸，形成骨小梁样结构。经活体四环素标记显示，所形成的结构为新生骨组织。他们还注意到，成纤维细胞在参与骨形成的过程中并无分化为成软骨细胞或成骨细胞的明确迹象，故推测并未发生此种分化，而成纤维细胞之所以能发挥成骨作用，很可能是受某些诱导因素作用的缘故。他们认为用以培养成纤维细胞的中厚皮片中混杂存在的上皮细胞(或/与内皮细胞)，可能是诱导成纤维细胞形成骨组织的一种诱导因素。而Friedenstein［6，19］较早的实验则认为，属于诱导性骨祖细胞之一种的成纤维细胞，在上皮细胞(如膀胱上皮)或脱钙骨基质等诱导因子作用下，可以分化为成骨细胞进而形成骨组织。邓廉夫［20］等分离培养取自关节内的损伤性和晚期骨关节炎性的滑膜细胞，发现其中的成纤维细胞样细胞增殖迅速，呈束状或交叉铺展并可形成多层结构，细胞表面有其分泌物形成的不透光结节，经四环素标记、ARS(Alizarinred s)和甲苯胺蓝(Toluidine blue)染色，显示结节为新生骨组织。在缺乏常规的诱导因子——上皮细胞的作用下，取自滑膜的成纤维细胞样细胞也能发生成骨作用，他们推测是在关节损伤后或骨关节炎的发生与发展过程中，改变的关节微环境(如TNF样活性物质增多等)可能会触发滑膜的成纤维细胞与骨形成相关的多基因表达，使其向成骨型细胞分化，这样，滑膜成纤维细胞样细胞在体内时即已具备成骨性能，故在培养条件下可发挥成骨作用。Dodda［21］等的研究则
指出，变性滑膜细胞多种细胞因子和生长因子的表达、关节液内多种细胞因子的出现，可能是滑膜成纤维细胞样细胞成骨表型表达的重要始动因素。这些相关的研究表明成纤维细胞成骨表型的表达可能存在着较复杂的调控机制，而其诱导因素也是多样的。
为获取大量具有成骨表型的成纤维细胞并了解其转化机制，邓廉夫［22］等将分离纯化的人皮肤成纤维细胞置于加有不同浓度EGF、IL-6、TNF-α、BMP-2的培养液中进行体外培养，采用生物化学、组织化学和电镜观察等方法检测成纤维细胞成骨性标记物的形成状况，发现TNF-α和BMP-2联合应用，可使成纤维细胞分泌碱性磷酸酶、骨钙素及胶原纤维的量增加；成纤维细胞可由梭形向圆形或多突形转化，蛋白分泌旺盛；细胞外基质中，丰富的胶原纤维定向或杂乱排列，其间散在较多的钙颗粒；细胞可重叠交织形成多层结构，其表面有分泌颗粒和钙盐结晶堆积，并不断融合扩大成骨结节，表明TNF-α和BMP-2可以诱导成纤维细胞成骨。但这种完全由成纤维细胞经诱导而形成的骨组织，在缺乏典型的成骨细胞参与下是否能在体外或植入体内后经改建成为成熟的板层骨及其改建过程如何?仍有待进一步研究。
7 展望
尽管成纤维细胞受哪些因素诱导可以产生成骨作用、这些因素的诱导方式及其机制如何以及成纤维细胞在骨形成中是否分化为成骨细胞等等问题尚未完全解决，但成纤维细胞经诱导可以形成骨组织这一现象已逐渐为广大科学工作者所接受。由于成纤维细胞直接参与了骨折愈合过程中纤维性骨痂的形成，其自身又具备被诱导成骨的能力，可以设想，利用成纤维细胞分布广泛、取材方便、对机体损伤较小、体外培养容易成活、增生繁殖较快等较其它具有成骨作用的细胞(如骨膜成骨细胞、骨髓基质细胞等)优越之处，在体外大量培养扩增成纤维细胞，并施以有效的诱导因素(如上皮细胞、TNG-α和BMP等)使其具备成骨效能，然后与合适的生物材料载体复合，同时使该复合体在体外或体内保持良好的成骨能力并进行一定程度的成骨，则有望获得具有一定的生物力学支撑强度而成骨作用又保持活跃的“活骨”复合体，用以替代自体骨或异体骨回植体内治疗难以自身修复的较大的骨缺损，这无疑将为骨缺损的修复治疗开辟一条新的有辉煌前景的道路。在组织工程技术和生物材料科学已有较大发展的今天，这一设想是极有可能实现的。当然，从目前所处的实验阶段过渡到临床应用尚有很大一段距离，需要解决的问题还很多，而且随着研究的展开和深入，问题可能还会越来越多，但这确实是一项很有临床应用价值和社会、经济效益的重大课题，值得广大基础医学工作者和临床科研人员为之而努力。
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细胞的生物学特性范文2
【关键词】间充质干细胞；脐带；生物学特性
Influence of different mediums on biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cellBAI Shang-xing.Shenyang Sixth People's Hospital, Shenyang 110000, China
【Abstract】Objective To investigate the differences of biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells(hUC-MSCs) in different mediums, and to optimize the purify methods. Methods Mesenchymal stem cells were separated from healthy full-termed delivery fetus using tissue-adherent culture method. These cells were cultured and amplified in DMEM/F12 and Mesen PRORSTM Medium in vitro. The growth curve was drawn.Their surface markers were detected by flow cytometry. Results Mesenchymal stem cells derived from human umbilical cord were spindle-shaped adherent cells.They have strong proliferation ability. The results of growth curve showed that compared with two medium, hUC-MSCs in Mesen PRORSTM Medium grew quickly at every time point. They were strongly positive expression for CD44 and CD29, but negative expression for CD34, CD45 and HLA-DR. Conclusion Cell doubling time in the Mesen PRORSTM Medium was shorter than in DMEM/F12.
【Key words】Mesenchymal stem cell; Umbilical cord; Biological charateristics间充质干细胞(mesenchymal stem cell, MSC)来源于发育早期的中胚层, 是具有高度自我更新能力, 高度增殖能力和多向分化潜能的多能干细胞［1, 2］, 广泛存在于骨髓、脂肪、脐血、脐带等多种组织中［3］。脐带为分娩废弃物, MSC含量丰富, 无需有创穿刺即可获得, 且较骨髓来源的MSC扩增能力更强, 成为近年来MSC研究的重要来源之一［4］。本研究采用两种不同培养基培养hUC-MSCs, 并对其进行生物学特性的观察、细胞免疫表型的鉴定, 以期建立一种稳定、高效、快速、经济的hUC-MSCs富集方法, 为临床细胞移植提供实验支持。
1材料
1. 1脐带选择足月胎儿的脐带, 产妇身体健康, 肝功能正常, 无传染性疾病, 签署知情同意书。脐带4℃无菌保存, 4 h内完成实验操作。
1. 2主要试剂DMEM/F12, Mesen PRORSTM Medium和胰蛋白酶购自GibCO；胎牛血清(FBS)购自HyClone；鼠抗人抗体CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC、HLA-DR-FITC购自BD。
2方法
2. 1人脐带MSCs 的分离、培养及扩增 脐带剪成3~5 cm小段取出脐带放入培养皿中, 用0.9%氯化钠注射液冲洗, 洗尽血液。用手术剪剔除血管和外膜, 剪成2~3 mm小块, 用0.9%氯化钠注射液清洗一次, 用DMEM/F12培养基清洗一次, 分成两组：A组加入培养基(含50%Mesen PRORSTM Medium, 48% DMEM/F12和2%胎牛血清), B组加入培养基(DMEM/F12含 10%胎牛血清)放入250 ml培养瓶中, 组织块密度要适中, 每瓶20 ml, 放置于37℃, 体积分数5%CO2, 饱和湿度培养箱内培养。倒置显微镜下观察, 有少量成纤维状细胞贴壁生长, 倒掉培养基和组织块。添加培养基继续培养, 每3天换液, 细胞生长达80%以上时, 用胰酶消化, 按1：3传代。
2. 2细胞生长曲线制作取生长良好的3代细胞, 按2×104/ml浓度接种24孔板, 每孔1 ml, 3 d换液一次, 以第2 d起每隔24小时计数3个孔细胞数, 取其平均值, 绘制7 d的生长曲线。
2. 3hUC-MSCs表面标记的检测取3代细胞, 用0.25%胰酶消化, 用PBS洗涤2次, 制成l×106的细胞悬液, 每管加入100 μl, 设置阴性对照, 加入IgG1-FITC, 其它管加入20 μl鼠抗人HLA-DR-FITC、CD45-FITC、CD34-FITC、CD29-FITC、CD44-FITC, 室温避光孵育30 min, 流式细胞仪计数5000~10000个细胞。
3结果
3. 1hUC-MSCs的分离、培养和纯化两组培养基原代脐带间充质干细胞接种6~7 d, 除去组织块, 倒置显微镜下可见有少量纤维状的贴壁细胞, 2 d后形成散在的细胞集落, 大部分是长梭形的成纤维样细胞, 细胞折光性好, 14~18 d细胞集落增多, 细胞融合80%以上。(见图lA-B)用0.25%胰酶消化传代, 3代后可得到较为纯化的间充质干细胞, 传代后的细胞增殖速度快, 约3~4 d可传代1次。传代后细胞形态较原代均一, 以平行排列生长或漩涡状生长。两组培养基培养的间充质细胞形态相似, 无明显差别。A组贴壁细胞较多, 细胞生长较快。
细胞的生物学特性范文3
【摘要】 目的 观察不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞(hMSCs)成骨分化、增殖能力及凋亡率的影响。方法 以梯度密度分离法获取人骨髓间充质干细胞进行体外培养，以1×10-9、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L 4种不同浓度地塞米松分别处理细胞。检测各组细胞的碱性磷酸酶（ALP）活性；RTPCR法检测骨桥蛋白(OPN)基因的表达；四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定各组细胞的增殖率；流式细胞仪分析细胞凋亡率。结果 低浓度(1×10-9mol/L)地塞米松对ALP的表达无显著作用(P>0.05)，而1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显增加ALP的活性(P0.05)，1×10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可明显抑制细胞的增殖(P
【关键词】 间充质干细胞；地塞米松；碱性磷酸酶；骨桥蛋白；细胞增殖；凋亡
Abstract： Objective To observe the effect of dexamethasone on the biological characteristics of human mesenchymal stem cells (hMSCs) derived from bone marrow in vitro.Methods The primary hMSCs were isolated and cultured in vitro．In subcultures，hMSCs were respectively treated with four different concentrations of dexamethasone(1×10-9，1×10-8，1×10-7 and 1×10-6mo1/L)．The alkaline phosphatase(ALP) activity was measured；mRNA of osteopontin was observed by reverse transcriptase polymerase chain reaction(RTPCR);the proliferation of hMSCs was evaluated by MTT assay；apoptosis was examined with flow cytometer.Results Treatment of cells with high concentration of dexamethasone(1×10-8，1×10-7 and 1×10-6mo1/L) for 8 days led to a significant increase in ALP activity(P
Key words：mesenchymal stem cells；dexamethasone；alkaline phosphatase；osteopontin；cell proliferation；apoptosis
骨髓间充质干细胞(human mesenchymal stem cells，hMSCs)是近年来骨组织工程和干细胞研究的热点种子细胞之一。目前已知，地塞米松可以诱导骨髓间充质干细胞向成骨细胞方向分化，但是地塞米松对骨髓间充质干细胞影响的系统性研究较为鲜见。本文探讨不同浓度地塞米松对体外培养人骨髓间充质干细胞成骨分化、增殖能力及凋亡率等方面的作用，旨在更深入地了解地塞米松对hMSCs生物学特性的影响。
材料与方法
1 主要试剂
DMEM培养基（Hyclone公司）、地塞米松（Sigma公司）、碱性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）定量检测试剂盒（Sigma公司）、Annexin V凋亡检测试剂盒（Bender公司）、TRIzol（Sigma公司）。
2 人hMSCs的体外培养与观察
骨髓标本均取自无血液疾病或骨病的成年人，事先征得所有献髓者的同意。将抽取的红骨髓以磷酸缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）稀释制成悬液，小心叠加至淋巴细胞分离液之上，离心，收集呈云雾状的有核细胞层，接种于10%胎牛血清的DMEM培养液中，置于37℃，5%CO2及饱和湿度条件下孵育定期换液，待细胞生长至90%融合时，消化传代。随机抽取生长良好的细胞分5组：1×10-9 、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L地塞米松组和不含地塞米松的对照组，实验组分别称为1×10-9 、1×10-8、1×10-7、1×10-6mol/L组。利用倒置相差显微镜逐日观察细胞形态和生长情况。
3 四甲基偶氮唑蓝（MTT）比色法测定hMSCs的增殖率
取hMSCs以2000/孔接种于96孔板培养，随机分组后加入指定浓度的地塞米松，对照组则不加地塞米松。6天后加无血清DMEM培养液100μl，MTT 10μl，置37℃孵育4小时，加入十二烷基磺酸钠（SDS）100μl，37℃放置2小时，经酶标仪测定吸光度OD。依次测定各实验组和对照组细胞的相对增殖率ODMTT，每组测定14孔。
4 ALP活性的测定
hMSCs以2000/孔接种于96孔板培养，实验组加入不同浓度的地塞米松。培养8天后加入100μl二已胺醇，50μl 3mmol/L PNPP，37℃孵育30分钟，加入50μl 0.2 mmol/L NaOH终止反应，经酶标仪405nm波长测ODALP值。每组样本量为14孔，分别除以对应的ODMTT均数，得出ALP相对活性比值。
5 hMSCs凋亡率的检测
将hMSCs以5×103/cm2的密度接种于培养皿，分组用地塞米松处理，每组6皿细胞。地塞米松干预8天后，采用Annexin V/PI双染色法对hMSCs进行凋亡率检测。取沉淀细胞490μl，先后加入Annexin V和PI工作液，暗处冰浴10分钟上机检测。每组样本量为6个，每个样本至少检测10000个细胞。
6 逆转录聚合酶链反应（RTPCR）法检测细胞骨桥蛋白(osteopontin，OPN)基因表达
6.1 逆转录（RT）反应 取hMSCs，分组用不同浓度的地塞米松干预12天，TRIzol法抽提细胞总RNA，反转录反应合成cDNA。将配制好的反应混合物加灭菌纯水至20μl，37℃水浴60分钟，进行反转录反应；97℃水浴5分钟，然后迅速置于冰上。
6.2 聚合酶链反应（PCR）扩增 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。OPN引物的上游序列为：5'CTAGGCATCACCTGTGCCATACC3'，下游序列：5'CTACTTAGACTACTTGACCAGTGAC3'，扩增片段长度为330bp。以βactin作为内参照，上游序列为：5'TGACGGGGTCACCCACACTGTGCCCATCTA3'，下游序列：5'CTAGAAGCATTTGCGGTGGACGATGGAGGG3' ，扩增片段长度为660bp。PCR条件设置如下：94℃预变性5分钟，94℃变性45秒，57℃退火60秒，72℃延伸90秒，共循环28次，最后72℃延伸10分钟，终止反应。
6.3 RTPCR产物电泳 取PCR产物5μl，置于1.5%琼脂糖上，80V电压下电泳1小时，观察并拍照。
7 统计学分析
采用完全随机方差分析，均数间比较采用LSD法。处理软件：SPSS v11.00。
结 果
1 hMSCs的形态学观察
原代接种24小时后即可观察到部分细胞贴壁，大多呈圆形或椭圆形；48～72小时后大多数细胞贴壁，呈现梭形、纺锤形。传代培养时hMSCs贴壁速度快，绝大部分可在24小时之内贴壁，为成纤维细胞状，伴有突起，核较大，呈椭圆形，核仁清晰(图1)。在早期培养，以5×103/cm2接种的hMSCs培养5天可达90%汇合。
hMSCs经地塞米松诱导后，形态上由长梭形逐渐转变为立方型、多角型，胞浆色深，含粗大颗粒，胞核明显(图2)。观察发现，10-8mol/L及以上浓度地塞米松处理的hMSCs增殖速度比对照组慢。
2 不同浓度地塞米松对hMSCs增殖的影响
MTT法显示，10-9mol/L地塞米松组ODMTT与对照组相比无统计学差异(P>0.05)。10-8、10-7和10-6mol/L组的ODMTT值分别为0.994±0.073、0.725±0.085和0.503±0.056，与对照组相比均有显著下降，降幅分别达30.1%、49.0%和64.6%，说明这些浓度的地塞米松可明显抑制体外培养hMSCs的增殖(P
3 地塞米松对hMSCs ALP活性的影响
hMSCs用不同浓度地塞米松分别处理8天，然后检测各组细胞的ALP活性，结果如图4所示。与对照组相比，低浓度(10-9mol/L)地塞米松对ALP表达的影响无统计学意义(P>0.05)，而10-8mol/L及以上的浓度地塞米松可明显增强ALP的活性(P
4 地塞米松作用下hMSCs凋亡情况的检测
凋亡检测结果显示（如图5），体外常规培养8天的hMSCs凋亡率（%）为3.68±0.21，实验组的凋亡率（%）分别为5.71±0.10（10-9mol/L组）、7.7±0.09（10-8mol/L组）、8.33±0.21（10-7mol/L组）和12.24±0.19（10-6mol/L组）。由此可见，体外培养的hMSCs凋亡率随地塞米松浓度的增加而升高。与对照组相比，各种浓度地塞米松实验组凋亡率的增加均有高度统计学意义(P
5 地塞米松对hMSCs OPN基因表达的影响
hMSCs经10-9、10-8、10-7、10-6mol/L地塞米松作用12天后，均有OPN mRNA表达，其表达强度随着地塞米松浓度增加而增强，对照组则无相应的条带出现（图6）。
讨 论
hMSCs是一种源自骨髓基质的干细胞，具有多向分化潜能，经不同条件诱导，可以分化为包括骨、软骨、脂肪和神经等多种组织细胞。hMSCs经地塞米松诱导后可以分化为成骨系细胞，外形呈立方形，细胞器丰富，合成并分泌特异性ALP、Ⅰ型胶原、骨钙素和OPN等［1］。笔者的前期研究亦证实，MSCs经10-8mol/L地塞米松诱导后，细胞形态由成纤维细胞状转化为立方形或多角形，ALP染色、Ⅰ型胶原和骨钙素的免疫组化染色及钙化结节Von Kossa染色呈阳性，具备了成骨细胞的特性［2］。本文在此基础之上，深入研究10-9、10-8、10-7和10-6mol/L 4种不同浓度地塞米松对MSCs成骨能力、增殖能力和凋亡率的影响。
本研究选取ALP活性和OPN mRNA的表达分别作为评价细胞成骨能力的早、晚期指标。ALP是成骨细胞及其分化的早期标志性酶，能水解有机磷酸盐释放出无机磷，并启动钙化进程。ALP的活性在一定程度上反映了细胞的成骨能力。本研究数据显示，高浓度（≥10-8mol/L）地塞米松可显著增强hMSCs的ALP活性，且活性随着地塞米松浓度的升高而增强，可达到对照组的2～ 3.5倍，但10-7与10-6mol/L浓度组之间无显著差异，提示10-8mol/L及以上浓度的地塞米松可促进hMSCs成骨分化，但过高的浓度（10-6mol/L）并不能提供更强的成骨诱导功效，即存在“天花板效应”。OPN是由成骨细胞分泌的一种高度磷酸化的糖蛋白，在类骨质的矿化过程起重要作用［3，4］。在成骨细胞分化晚期(基质矿化期)，OPN与骨钙素等一起分泌至细胞外基质中，与钙、磷及胶原分子结合，形成羟基磷灰石结晶。本研究的RTPCR结果显示，不同浓度的地塞米松组均有OPN mRNA表达，其表达强度随着地塞米松浓度增加而增强。本研究结果证实地塞米松可促进体外hMSCs的成骨分化［5-7］，并提示地塞米松对hMSCs的成骨诱导能力上，10-7、10-6mol/L浓度较10-8mol/L更强。
有研究表明，地塞米松在促进hMSCs成骨分化的同时，抑制细胞的增殖［1，8］。本研究进一步发现，在10-9至10-6mol/L的浓度范围内，地塞米松对hMSCs增殖的抑制作用呈剂量相关性，地塞米松浓度越高抑制作用越明显。但Walsh等［9］的实验表明10-8mol/L地塞米松对MSCs增殖影响存在不确定因素，促进、抑制或无影响都有可能。本文的凋亡检测结果显示，4种浓度的地塞米松均可增加体外培养hMSCs的凋亡率，且凋亡率随地塞米松浓度的升高而增高。Oshina等［10］研究亦证实地塞米松能有选择性地促进分化能力差的hMSCs凋亡。
在以MSCs为种子细胞的骨组织工程中，应处理好地塞米松促进成骨分化与抑制增殖和增加凋亡之间的关系。地塞米松的工作浓度以10-8mol/L为佳，此浓度可显著增强MSCs的ALP活性，同时对细胞增殖的抑制作用较小，凋亡率也不高，可以获得代谢活跃、分化功能良好的有活力的种子细胞。
此外我们认为，高浓度的地塞米松虽能促进MSCs的成骨分化，但明显地抑制细胞增殖，并导致细胞凋亡的增加，从而使得具有成骨分化能力的有效骨祖细胞数量大量减少，最终对成骨作用在总体水平上起负面效应。另有研究表明，地塞米松可以促进MSCs成脂分化［11，12］。这两方面因素协同作用，使得成骨与破骨作用之间的动态平衡遭到破坏，处于负平衡状态，骨量不断丢失，最终导致骨质疏松。这可能是临床上大量应用糖皮质激素导致骨质疏松和（或）股骨头无菌性坏死的发病机制之一［13-15 ］。
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细胞的生物学特性范文4
[关键词] 温敏脐带间充质干细胞；聚丙烯酰胺水凝胶；弹性模量；生物力学
[中图分类号] R651.15 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2016）12（c）-0014-04
[Abstract] Objective To manufacture two-dimensional culture medium of brain tissue elastic modulus， and to compare the differentiate property of temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells （tsUC） under mild hypothermia treatment （MHT） and umbilical cord mesenchymal stem cells （UC） under normal temperature （NT）. Methods Acrylamide and bis-acrylamide were applied to synthesise polyacrylamide hydrogel of 0.5 kPa in elasticity modulus. UC were isolated from umbilical cord of the newborn， and then the tsUC were obtained through the infection of temperature-sensitive Simian 40 Large T-antigen （ts-SV40LT） retrovirus. There were three experiment groups in this study， including UC+NT+glass （group A）， UC+NT+0.5 kPa PA （group B）， and tsUC+MHT+0.5 kPa PA （group C）. Cell growth and morphological changes in each group were given dynamic observation. 7 days later， cell immunofluorescence were implemented， with the differentiation level of each group estimated and the axon length of the differentiated neurons calculated by using Image J software. Results The elasticity modulus of PA gels was （0.50±0.03） kPa. A small amount of cells resembling the neurons were presented in group B and C， with small soma and long， slender protuberances. Cell immunofluorescence statistics demonstrated that the cells differentiated into neurons expressing beta-tubulin Ⅲ. The neuron differentiation rate and axon length were significantly higher than that of group A， which have no beta-tubulin Ⅲ expressing. However， there was no obvious difference between group B and C （P > 0.05）. Conclusion tsUC can differentiate to neurons in the environment mimicking the elastic modulus of brain tissue， which can be applied into cell transplantation of brain injury under MHT.
[Key words] Temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells； Polyacrylamide gels； Elastic modulus； Biomechanics
细胞生物学性能的调控机制与细胞的生物力学特性有关，包括细胞内部的收缩力、细胞与基质之间的牵张力、细胞与细胞之间的相互作用力等[1-2]。体外培养干细胞时，培养基质的弹性模量是细胞生物力学的一个重要体现，且对干细胞分化具有调节作用[3-5]。人脐带间充质干细胞（umbilical cord mesenchymal stem cells，UC）具有多向分化的潜能，在弹性模量为11～30 kPa的培养基中多向成骨细胞分化，在2.5～5.0 kPa的培养基中多向脂肪细胞分化，而在0.1～1.0 kPa的培养基中，则可能向神经元进行分化[4，6]。
本课题组前期已经建立了一种温敏脐带间充质干细胞（temperature-sensitive umbilical cord mesenchymal stem cells，tsUC）系，发现tsUC在亚低温（mild hypothermia treatment，MHT）作用下可促进创伤性脑损伤（traumatic brain injury，TBI）大鼠神经功能的恢复[7-8]，并对tsUC的增殖、温度敏感等特性进行了初步探讨[9]，但其生物力学特性尚不明确。本实验拟在体外对人UC进行扩增以及力学诱导，观察其在模拟脑组织硬度的培养基中的分化情况，从力学角度探讨MHT联合tsUC的分化特性。
1 材料与方法
1.1 材料与试剂
新生儿脐带（由武警后勤学院附属医院妇产科提供，已通过武警后勤学院附属医院伦理协会审查），携温度敏感型猿猴病毒40大T抗原（ts-SV40LT）基因的逆转录病毒（加利福尼亚大学，美国），神经元β-tubulin Ⅲ一抗及荧光标记二抗（Millipore，美国），UC流式细胞检测试剂盒（BD，美国），单丙烯酰胺（Amresco，美国），双丙烯酰胺（天津光复精细化工研究所），硝化纤维、苯基叠氮化物交联剂（sulfo-SANPAH）、3-氨基丙基三甲氧基硅烷、二氯二甲基硅烷（天津鼎国生物技术有限责任公司），I型胶原蛋白（Sigma，美国）。
1.2 聚丙烯酰胺水凝胶的制备和检测
将单、双丙烯酰胺（0.03%～0.3%）按不同比例混合[10]，加入过硫酸铵（1/200 V）和TEMED（1/2000 V）置于凹槽中后盖以玻璃板。凝结后切取2 cm×1 cm×2 mm的样本，应用力学试验机（Instron 5865，美国）进行拉伸测试，重复测量10次，筛选出弹性模量为0.5 kPa的PA水凝胶。
1.3 模拟脑组织弹性模量二维培养基的制备
根据上述检测结果，配制弹性模量为0.5 kPa所对应的单丙烯酰胺和双丙烯酰胺混合液[11]。22 mm × 22 mm盖玻片表面均匀涂抹3-氨基丙基三甲氧基硅烷后浸泡在0.5%戊二醛溶液中，30 min后清洗、晾干，并在玻片表面涂硝化纤维以增加黏性。盖玻片均匀铺被25 μL混合液后加盖经二氯二甲基硅烷预处理的18 mm×18 mm盖玻片。待聚合完成后，暴露水凝胶并紫外消毒。将200 μL sulfo-SANPAH（50 mmol/L，pH=8.5）均匀滴在水凝胶表面，于无菌罩中紫外光活化5 min。将0.2 mg/mL的I型胶原蛋白均匀铺在水凝胶表面，0.2 mg/mL的I型胶原蛋白包被玻片作为对照组。
1.4 tsUC的建立与鉴定
从健康新生儿脐带中分离出UC，进行体外培养、扩增，用流式细胞分析仪（BD，美国）测定各类抗原的阳性率[6]。细胞融合率60%时，用含4 μg/mL聚凝胺的tsSV40LT病毒悬液对细胞感染48 h，并根据前期研究方法对细胞进行鉴定[7-9]。将感染成功的tsUC置于33℃培养箱中，余培养条件同UC[12]。
1.5 实验干预及分组
实验按培养温度和培养基弹性模量分为3组：UC+NT+glass组（A组）为玻片上常温培养UC；UC+NT+0.5 kPa组（B组）为0.5 kPa的PA水凝胶上常温培养UC；tsUC+MHT+0.5 kPa组（C组）为0.5 kPa的PA水凝胶上亚低温培养tsUC。各组细胞（5×103个/mL）均加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基，置于含5% CO2的培养箱中培养，并定期在相差显微镜（Optic BD200-PH，美国）下观察细胞的生长情况和形态变化。
1.6 细胞免疫荧光
各组细胞培养7 d后进行免疫荧光染色以检测细胞分化情况。加入羊抗大鼠β-tubulin Ⅲ一抗和荧光标记的二抗，细胞核DAPI染色，于倒置荧光显微镜（Leica DMI4000B，德国）下观察。随机取10个位点计数，并计算各组阳性细胞占细胞总数的百分比，即为近似分化率。应用Image J软件测量神经元的轴突长度，计算各组神经元轴突的平均长度[13]。
1.7 统计学方法
采用GraphPad Prism 5.0软件进行统计分析，计量资料数据用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验；计数资料用率表示，组间比较采用χ2检验；以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 tsUCMSCs培养和鉴定
流式细胞分析结果显示，细胞表面标记CD90、CD105、CD73呈阳性表达，CD34、CD116、CD19、CD45、HLA-DR呈性表达。感染成功的tsUC呈漩涡状生长，类似于UC，形态多为梭形、多边形或成纤维细胞形态，大小均一（图1）。
2.2 以PA水凝胶为基础的细胞培养基
通过力学试验机的测量及筛检，最终得到弹性模量为（0.50±0.03）kPa的PA水凝胶。按相应比例于盖玻片上配制出该弹性模量的培养基。见图2。
2.3 光镜下细胞形态变化
各组细胞均贴于玻片生长，其中A组细胞在7 d内未发生明显变化，B、C组细胞的胞体大致呈圆形或椭圆形，与A组的细胞相比，胞体逐渐变小，并出现长而纤细的胞突。见图3。
2.4 细胞免疫荧光
B、C两组均有β-tubulin Ⅲ表达阳性的细胞，提示分化的神经元细胞；而A组无阳性表达。见图4。B、C组神经元总体分化率分别为11.3%和10.4%，差异无统计学意义（P > 0.05）。
2.5 轴突长度分析
B、C两组细胞均有明显突起，B和C组分化的神经元轴突平均长度分别为（262.52±36.16）μm和（229.83±33.95）μm，差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
细胞生物力学已逐渐成为医学领域研究热点。在各种内外机械因素影响下，生物学信息可通过力学信号转导作用于人体细胞，影响细胞的生长、增殖和分化[14]。干细胞原位移植后，其周围不同弹性基质可诱导其分化为更接近宿主组织的细胞[15-16]。Engler等[6]研究证实，在弹性模量为0.1～1.0 kPa的培养条件下，间充质干细胞可向神经元分化。本研究以培养基弹性模量这一力学特性为基础，探讨了在模拟正常脑组织弹性模量的培养条件下tsUC向神经元分化的水平。在培养基的制备方面，本研究借鉴了Engler等[6]和Pelham等[11]的方法，根据单、双丙烯酰胺的不同混合比例，制备模拟脑组织硬度的PA水凝胶，并应用力学试验机对其进行检测，保证了培养基弹性模量的精确性，结合细胞培养液，制备二维培养基。
光镜下可见，在弹性模量为0.5 kPa的培养基中，tsUC向神经样细胞变化，胞体变小、胞突伸长，可见典型的轴突，这与相同培养基中UC的细胞形态变化类似，而玻片上的UC无明显形态变化。免疫荧光结果显示，神经元表达只在弹性模量为0.5 kPa的培养基中出现，且tsUC和UC之间无明显差异。上述结果表明，与UC相比，tsUC在亚低温条件下的分化能力基本不受影响，可向神经元分化。由此说明在亚低温的作用下，tsUC的生物力学性能并未发生明显变化。
生物力学在神经组织方面也有重要意义，正常脑组织的软基质能够诱导间充质干细胞向神经元分化，因此模拟脑组织能保证移植干细胞的存活率和分化率。TBI后不仅脑组织的理化性质受到破坏，而且脑细胞原本的力学微环境也发生相应改变，此时脑组织硬度明显增大[19-20]，这便影响脑组织的原位细胞以及损伤处移植干细胞的生长和分化水平。本文以细胞生物力学为基础，模拟脑组织弹性模量，证实了亚低温作用下tsUC具有稳定的生物力学性能和神经元分化能力，从生物力学角度为亚低温联合tsUC移植治疗TBI的研究提供了重要依据，并推动该项研究向临床应用的转化。
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细胞的生物学特性范文5
关键词：生物学；概念教学；前概念；科学概念
中图分类号：G630文献标识码：A文章编号：1003-2851（2011）04-0127-01
当前，不重视概念教学是一个比较普遍的现象，而我们知道生物学概念一般是比较微观、抽象的，如果学生不能准确的理解生物学概念，对于以后的教学以及学生对生物学的认识、学习兴趣将会造成很大的障碍，所以对概念的掌握和运用是生物学教学过程的核心问题。这也正是本文的重点所在。
一、影响学生形成科学概念的主要因素
（一）前生物学概念
前概念是学生在日常生活中形成的，是学生对概念直观感性的认识，由于学生缺乏对复杂生物学现象的观察与思考，往往使他们对生物学形成似是而非，不够科学的概念。例如微生物，很多学生潜意识中已经认为很小的，肉眼看不见的才是微生物。这样的错误概念对我们以后学习产生很大影响，是学生接受科学概念的障碍和阻力。
（二）相似概念
在学习生物学的过程中，有很多看似相似的概念，而在这些概念上学生往往不能正确的区分，而混为一谈，这在很大的程度上影响了学生学习生物学的兴趣和耐心。如，自变量、无关变量、因变量、额外变量；真实光合速率和净光合速率等。
二、概念教学的几点策略
（一）关注学生已有概念，做到有的放矢
在我们对概念的教学中，我们首先要的做的，就是了解学生对概念已有的认识，使新概念与之建立联系，促进同化。例如在学习了无机催化剂的基础上再学习酶的概念，就很容易被无机催化剂的特性同化，混为一谈。再如个体发育是指生物体从受精卵发育成幼体，再由幼体发育成性成熟个体的过程；而很多学生的日常概念往往认为个体发育是从幼体开始的，并且这种由生活经验形成的旧观念常常又是根深蒂固的，这对概念的认识就是消极的。所以说我们在教学时，先要了解和掌握学生对概念的已有认识，在新概念学习时才能做到有的放矢，进而更好的引导学生对原有认识加以修改或重建，一步步来引导学生认识正确的概念，达成对事物本质特征的认识。
（二）从字面含义来初步认识概念
概念是通过科学家深思熟虑加工，用一些生物学的语言符号最生动、最直接的表达出来，包含了某种事物的本质特性以及与其他事物的关系，而有些概念在字面意思上就能简单的理解。例如新陈代谢―“新”，新的物质，“陈”，旧的物质，“代谢”，新旧物质的交换，即生物体从环境摄取新的营养物，同时将体内的废物排到环境中的不断更新的过程；自养―自己（合成有机物）养活自己；等等。通过字面分析，学生就能初步明白一个概念的大致含义。
（三）提取概念中的关键字词，掌握概念的内涵和外延
生物学概念的内涵是指反映的事物的本质属性的总和；外延是指一个概念所概括的思维对象的数量或范围。准确理解概念的内涵和外延是掌握概念的先决条件。而一个概念中的关键字词正是这个概念的精髓，是对事物本身最本质的特性概括，用简要的语言、图形等概括概念本质属性，是学生掌握概念的主要步骤，避免学生因复杂的文字而出现记忆错误。如酶是活细胞产生的具有生物催化作用的有机物，绝大多数是蛋白质，少数是RNA，其中
“活细胞”、“催化作用”、“有机物”这些关键词表明了酶的产生场所、作用以及化学本质，绝大多数是蛋白质，少数是RNA表明了它的外延。再如应激性是在新陈代谢的基础上，生物体对外界刺激都能产生一定的反应，比如植物的根向地生长，而茎向光生长。其本质特征是定向运动，其适用范围和条件是要有外界刺激。“定向运动”和“外界刺激”这两个关键词在学生对概念内涵和外延的准确掌握上有突出作用。
（四）正确理解概念中模糊语言的含义
在生物学的很多概念中常会有一些“一般”、“主要”、“绝大多数”、“一定条件”等模糊词语，而这些模糊词语在本质上是明确的，在表象上是模糊的，所以在分析概念时，要留给学生考虑的空间，一方面提出问题给学生思考，让学生通过讨论、询问、查询来解决问题；另一方面适时给以指导，帮助学生澄清知识的模糊点。例如在真核细胞中，细胞核是遗传物质储存和复制的主要场所，什么是“主要”；教师不急于解释，但要求学生让学生通过讨论、询问、查询。当学到细胞质遗传时，学生就会明白，在真核细胞内，除了细胞核，还有线粒体，叶绿体可以储存和复制遗传物质。
（五）比较分析概念的区别和联系，构建网络知识体系
生物学概念之间往往表现出层次性、因果关系等，有些概念之间还有相似性。在教学中，教师要正确的引导学生分析概念之间的内在联系，分清概念的本质属性，不至于混淆。例如元素化合物细胞组织器官系统个体种群群落生态系统生物圈；染色体上有DNA，DNA上有基因，基因由脱氧核苷酸组成；受精卵卵裂囊胚原肠胚幼体性成熟的个体；光合作用和呼吸作用；自养型、异养型、需氧型、厌氧型与兼性厌氧型；自变量、无关变量、因变量、额外变量；物质循环和能量流动等等。通过对相关概念的比较分析，就能准确理解它们之间的内在联系和区别，找出共同性和相关性，特殊性和差异性，使学生的知识得以系统化、网络化。
综上所述，在概念教学中，经过对概念的一步步深入认识和理解，正确认识事物的内涵和外延，构建认知网络系统，不断提高学生的科学素养，促进生物学科的发展。
参考文献
[1]张洪荣.浅谈生物学基本概念教学中的设疑方法[N].中学生物学，2002（02）.
细胞的生物学特性范文6
关键词 铜离子；生物学特性；吸收转运；调控机制
中图分类号 Q581 文献标识码 A 文章编号 1007-5739（2015）14-0158-01
1 铜离子的生物学特性
铜是生物体正常生长不可缺少的重要微量元素之一。在生物体内，铜离子以还原态的Cu+[Cu（I）]和氧化态的Cu2+[Cu（II）]2种形式存在。Cu+的生化反应活性极高，只有在极度酸性的环境下或与其他分子结合的状态下才能存在。相反，Cu2+在酸性及中性的水溶液中均可稳定存在。通过Cu+和Cu2+之间的相互转变，铜离子在生物体内参与光合作用、氧化磷酸化以及活性氧的消除等重要生物学过程。由于在生物体内参与众多的生理生化反应，铜离子在过量的情况下，会对生物体产生毒害。铜离子的毒性在很大程度上是由于在Cu（I）和Cu（II）比较容易地相互转变而导致的。此外，铜离子产生的毒性还很可能产生于Cu（I）和Cu（II）与生物大分子上的半胱氨酸、蛋氨酸和组氨酸侧链的非正确结合。这种错误结合导致正常的金属离子无法结合到正确的位点，这种非正常结合也可能导致蛋白的错误折叠，最终使蛋白等生物大分子失去活性[1]。
在细胞层面上，铜离子毒害主要表现为对细胞膜系统的破坏。在叶绿体中，过氧离子含量增加，可破坏类囊体膜，使光合系统Ⅰ（photosystem I）和光合系统II（photosystem II）之间的电子传递受到一定影响，导致光合作用的效率严重下降。最终使植物的生长受到抑制，出现叶片逐渐枯萎的现象，最终死亡。
此外，铜离子的缺乏对于植物生长也有很大影响。由于植物体内约一半的铜离子存在于叶绿体中，因此在铜离子缺乏情况下，幼嫩的叶片和生殖器官最先表现出缺铜症状，叶片褪绿，植株生长缓慢，最后枯萎死亡。
2 铜离子吸收转运的调控机制
2.1 缺铜情况下铜离子平衡的调控
在缺铜环境下，生物有机体首先保证生物代谢不可缺少的铜蛋白获取铜离子，而其他一些不必需的铜蛋白被其他金属离子的同工蛋白代替。这些可替代铜蛋白的同工蛋白多数都属于以铁离子作为辅因子的蛋白。最明显的例子是在叶绿体中，当铜离子缺乏时，FeSOD取代Cu/Zn-SOD的功能，从而为质体蓝素提供更多的铜离子。
最近研究表明，在缺乏铜离子环境下，拟南芥中参与铜离子缺乏胁迫反应的基因，如FeSOD、高亲和力铜转运蛋白COPT1和COPT2均由SPL7调控表达。进一步研究表明，在FeSOD、COPT1和COPT2基因启动子区域都存在重复的GTAC顺式作用元件。与GTAC相互作用的反式作用因子（trans factor）隶属于SBP转录因子家族[2]。
2.2 铜离子自我反馈调控途径
从整体上来看，细胞质内铜离子的平衡主要决定于铜离子的内向运输（在低铜环境下COPT家族成员的运输）和外向运输（主要通过P-type ATPase铜离子转运蛋白运输到细胞外，或者区域化到细胞内特殊的细胞器中）。前已述及，在铜离子过量时，拟南芥COPT家族的几个成员，包括COPT1和COPT2同时下调表达。铜离子不足时，它们启动子区的共同顺式作用元件GTAC在SPL7转录因子作用下可同时表达。不同铜离子状态下，这种通过COPT基因表达量的下调或上调的调控模式被认为是一种自我反馈调控。在这种调控模式下，一方面可以稳定细胞质内铜离子的稳态，另一方面由于反馈信号的延迟（COPT的转录、翻译和铜离子运输过程等）可形成一个铜离子震荡的过程。这个铜离子震荡过程可以简单地描述为低铜环境下诱导COPT转运蛋白的合成，促使铜离子从内部储藏位点进入细胞质中；一旦细胞质中的铜离子达到较高浓度，COPT转运蛋白的合成被抑制，过量的铜离子重新被转运回到储藏位点，细胞质中的铜离子浓度重新回到最初的低水平状态[3]。
虽然这种铜离子震荡循环和自我反馈的持续维持可以用数学分析的方法来证明，但还缺乏直接、准确的试验证据。假如铜离子震荡确实存在，这个假设还存在另外一个问题：在铜离子震荡过程中，铜离子在细胞内确切的储存位置在哪里？目前认为，液泡或者细胞内吞途径的运输囊泡是铜离子储存的主要场所。在这2类亚细胞结构上，外向运输的铜转运蛋白可以将细胞质中的铜离子泵出，而COPT家族的蛋白可以将铜离子重新释放回细胞质中。预测COPT2和COPT1的启动子区域存在昼夜节律调控元件。假如这些调控元件在转录水平上具有功能，那么铜离子震荡周期很可能与昼夜节律具有一致性[4]。
关于铜离子与昼夜节律的关系，除拟南芥外，在其他生物体中也有少量报道。蕨类植物小立碗藓SPL家族受到昼夜节律调控；在粗糙脉孢菌中，一个结合铜离子的金属硫因子的表达同样呈现出昼夜节律性；在哺乳动物中，一个松果体ATPase（铜转运蛋白）的表达也具有明显昼夜节律性。
3 参考文献
[1] 姚浩群.金属离子与金属颗粒生物学活性实验研究[J].南方医科大学学报，2012，41（16）：63-68.
[2] 宋明明，黄凯，朱连勤.铜吸收与代谢的研究进展[J].饲料博览，2014，19（9）：81-83.
