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动物行为学研究方法范文1
摘 要:目的:以慢性焦虑应激大鼠为载体,探讨其焦虑状态及行为学的变化,旨在探索能较好模拟广泛性焦虑障碍的动物模型。方法:采用慢性情绪应激的方法建立焦虑大鼠模型,以国际公认的高架十字迷宫试验对其行为学进行评价。结果:应激后大鼠处于易激惹的状态,表现出频繁的修饰和攻击行为,经高架十字迷宫测试发现大鼠较少进入并停留于开放臂中,倾向于探究封闭臂,且在封闭臂的停留时间延长。结论:不确定性空瓶刺激作为一种慢性心理应激模型,从病因学上较好模拟了广泛性焦虑障碍的发病状态和行为学表现。
关键词:焦虑模型;行为学;慢性情绪应激;高架十字迷宫
中图分类号:R332 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0711-03
The Changes in Behaviour of Rats with Chronic Stress-induced Anxiety and
Behavioural Evaluation of The Elevated Plus-maze Test System
LI Ning 1,TANG Qisheng2,ZHAO Ruizhen2 , GOU Shengle1
(1. Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China;
2. The Third Hospital Affiliated to Beijing University of Chinese Medicine, Beijing 100029,China)
Abstract:Objective:To study the changes in behaviour of rats model with chronic stress-induced anxiety and to explore a appropriate animal model for GAD. Methods:Rats model was established by using chronic emotional stress-induced anxiety method, then researchers observed behavioural changes of model rats and evaluation of elevated plus-maze test system. Results:Rats resceiving emotional stress was in a state of great agitation,who manifested obvious grooming and attacking behaviour.Fewer rats entered and remained in the open arm,and tended to explore and stay in the closed arm.Conclusion:Unpredictable bottle stimulation as a methd of chronic emotional stress better simulated the incidence and manifestation of generalized anxiety disorder from etiology.
Key words:anxiety model; behaviour;chronic emotional stress; elevated plusmaze
收稿日期:2009-11-21
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772804)
作者简介:李宁(1980-),女,河南许昌人,博士研究生,研究方向:中医药防治脑血管疾病。
通讯作者:唐启盛(1956-),男,黑龙江人,教授,博士研究生导师,研究方向:中医药防治脑血管。
广泛性焦虑障碍(generalized anxiety disorder,GAD)是以过度和持续性焦虑或反复发作的惊恐不安为主要特征的神经症,常伴有植物神经系统症状和运动性紧张。随着临床和基础实验研究的不断深入与完善,人们对于本病也有了较为系统而全面的认识。现代医学研究表明,其发病涉及生物、心理、社会等诸多方面的因素,但确切的病因和发病机制至今尚未彻底阐明。焦虑动物模型作为基础实验研究的平台与载体,在探索焦虑障碍的病因、发病机制以及新药研发等方面发挥着重要作用。因此,选择公认、稳定、重复性好、能反映复杂发病状态的动物模型是深入开展该疾病研究的关键环节。本研究采用慢性情绪应激的方法建立焦虑大鼠模型,观察应激前后自身行为学的变化,且通过国际公认的高架十字迷宫试验对其焦虑状态进行测试与评价,旨在为广泛性焦虑障碍的研究提供较好的动物模型。
1 材 料
1.1 实验动物
健康Wistar雄性大鼠20只,SPF级,2～3月龄,体重(200±10)g。由中国医学科学院实验动物研究所购买,合格证号:SCXK(京)2005-0013。动物购进后预养1周内自由摄食饮水。光照节律12L/12D(6∶00～18∶00),室温(20±2)℃,相对湿度为50%～60%,保持安静。
1.2 行为学测试仪器
高架十字迷宫采用国际通用的方法制作[1],由安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司生产。
2 方 法
2.1 动物分组和焦虑模型的建立
大鼠经1周适应期后随机分为正常组、模型组,每组10只。除正常组外,模型组单笼饲养且接受不确定性空瓶饮水刺激建立焦虑应激模型[2] 。具体方法如下:定时喂水训练7天,即每天早9∶00～9∶10和晚21∶00～21∶10给动物饮水10min,其余时间撤去水瓶不给水。定时喂水期结束后开始应激实验,在上述两个时间段内给予不确定空瓶刺激,维持1天1次或1天2次,持续2周。正常组不接受任何处理,自由饮水和摄食。所有动物在应激结束后进行高架十字迷宫行为学测定,两组交叉进行。动物均提前2h进入测试实验室适应环境。
2.2 行为学观察
行为学观察包括攻击(咬或攻击空瓶和笼子)、探究(前后左右运动和光顾水瓶所在位置)及修饰行为(梳理皮毛和洗脸)。具体方法是将空瓶应激的10min等分10个时间段,在每个时间段内记录每只大鼠上述3种行为,行为出现即为1,否则为0.10min内观察的总分为0～10之间。得分基于2 名观察者的观察结果平均而得,其中一人为双盲控制。14个观察日的前3天和最后3天的平均分用于统计分析。
2.3 行为学测试
实验室内光线昏暗(以1.5m 距离处能区分大鼠细微活动的最低亮度为准)并保持恒亮,室温21℃,安静。测试箱放置于实验室一角,周围布以2m 高黑色单调背景。实验过程中只有一名参与日常处理的人员搬运动物。
迷宫测试前将每只大鼠放入一个60cm×60cm×35cm塑料盒中,任其自由探究5min后迅速置于EPM 的中央平台处使其头部正对其中一个开放臂,释放后即开始记录下述指标: ①进入开放臂次数(open arm entry,OE):进入到任一开放臂的次数,以大鼠4个爪子均进入到臂内为准,中途一个爪子从该臂中完全退出则为该次进入活动完成; ②进入开放臂时间(open arm time,OT):进入开放臂的时间,单位:秒; ③进入封闭臂次数(close arm entry,CE):进入任一封闭臂的次数,以大鼠4个爪子均进入到臂内为准;④进入封闭臂时间(close arm time,CT):进入封闭臂的时间,单位:秒;⑤向下探究次数(head-dipping,HD):大鼠置身于中央平台或开放臂时,一边用前爪握住迷宫边缘一边把头部和肩部伸出开放臂的边缘向迷宫下面探究的行为次数; ⑥封闭臂后腿直立次数(rearing,RR):大鼠在封闭臂前腿抬起以后腿支持使身体竖立的次数。
由①～④分别计算出:①进入开放臂和封闭臂的总次数(OE+CE):表示大鼠的运动活力;②进入开放臂次数比例(OE%):即开放臂进入次数/(OE+CE)×100%;③开放臂停留时间比例(OT%),即开放臂停留时间/(OT+CT)×100%,每只大鼠测试5min。
2.4 数据的统计分析
各组数据用均数±标准差(±s)表示。数据处理采用SPSS 15.0统计软件分析处理,两组间均数比较采用独立样本t检验。以P
3 结 果
3.1 模型组大鼠行为学的变化
如表1所示,空瓶应激期间,模型组大鼠14个观察日的前3天和最后3天相比,探究行为无明显差异(P>005),修饰行为增多(P
表1 模型组14个观察日前3天和最后
3天空瓶应激时行为变化的比较(n=10,±s)
组别探究行为修饰行为攻击行为
起始3天5.22±0.973.22±1.121.29±0.96
最后3天4.64±1.065.58±1.076.08±1.35注:n为动物只数;与起始3天比较,P
3.2 大鼠EPM测试结果
如表2所示,因正常组不施加任何干预因素,故与模型组相比OE+CE、OE%、OT%、head-dipping明显减少,差异明显(P
表2 各组大鼠EPM测试行为学的比较( n=10,±s)
组别OE+CE/次 OE/%OT/%HD/次RR/次
正常组 11.70±1.4934.78±5.89 35.19±4.1514.70±1.9412.50±1.81
模型组8.40±1.7814.42±4.2817.17±6.799.10±1.7913.40±2.17注:n为动物只数;与正常组比较,P
4 讨 论
现代研究发现,应激和焦虑是密切相关的现象,大多数焦虑症患者都曾经历过严重的心理应激事件,因此应激事件可以成为焦虑症发病的原因和诱因[3]。本研究采用不确定性空瓶刺激建立慢性应激焦虑大鼠模型,发现经过几次固定时间的饮水学习之后,在饮水期间给予动物空瓶,能够诱发动物出现攻击,撕咬瓶子和笼子,频繁修饰等焦虑行为。此外,模型组大鼠表现出易激惹的状态,与临床中焦虑症患者的易激惹表现相似。
高架十字迷宫试验(EPM)既可以建立焦虑应激的模型也是国际上公认的经典测量焦虑反应的方法[1-4]。其原理是利用动物对新异环境的探究特性和对高悬敞开臂的恐惧心理,形成动物的矛盾冲突来考察大鼠的焦虑状态。EPM测试的项目中,焦虑动物的OE%和OT%会明显降低,经典抗焦虑药物则使两者升高,OE+CE反映了动物的运动活性。本研究发现模型组大鼠的OE%和OT%显著下降,运动活性也降低。HD反映了动物在非保护区内的探索行为,代表动物对陌生环境的好奇探究或因恐惧而寻求逃避,与焦虑程度有一定相关性,本研究中空瓶应激后的大鼠HD行为减少;RR可用来观察药物有无镇静作用及镇静强度。上述结果证实,慢性应激后的大鼠明显处于焦虑状态,说明慢性焦虑应激大鼠模型的制备成功,且通过量化的标准客观反映出大鼠的焦虑程度。
GAD作为焦虑症的临床亚型,多呈慢性病程且易复发,症状反复迁延,并与许多躯体疾病相关联,相当比例的患者还共病抑郁和其他精神障碍类疾病,患者不仅存在难以忍受而又无法摆脱的精神痛苦,严重者可导致社会功能受损,甚至出现自杀,给个人家庭和社会造成严重的经济和精神负担。焦虑动物模型作为焦虑症基础研究的载体,在探索其发病机制、新药研发及临床前评估的研究中发挥着重要作用,但目前尚缺乏针对GAD的动物模型。基于此,本研究从病因学的角度出发,建立慢性焦虑情绪应激的动物模型,通过其自身行为学的变化和EPM测试即横向和纵向的比较来评价该模型的可行性和有效性。虽然动物的情绪变化远不如人类丰富,动物身上也较难准确模拟人类发病的心境。但是,他们也存在并非单一的情绪变化,有些情绪变化如焦虑、愤怒、恐惧等与人类存在相似性,在情绪变化时同样也存在行为学和复杂的神经内分泌变化[5-6]。本研究结果提示:不确定性空瓶刺激作为一种慢性心理应激模型,能诱导动物出现明显的焦虑行为,从病因学上较好模拟了GAD的发病状态,与现有的焦虑应激模型相比,该模型在很大程度上避免了掺杂物理(躯体)性应激成分,是一种相对“纯粹”的心理应激模型。本课题组将在此行为学研究的基础上,进一步开展焦虑症神经生物学方面的探索性研究。
参考文献
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动物行为学研究方法范文2
【关键词】 脑缺血;脑损伤;动物模型;大鼠
[ABSTRACT] Objective: To investigate the application of three kinds of cerebral ischemiareperfusion animal model according to the degree of injury. Methods:The bilateral common carotid artery occlusion(BCCO)， cerebral middle cerebral artery occlusion (MCAO) by stringfastening method， global ischemia(GI) by fourartery occlusion were used to establish cerebral ischemiareperfusion animal model. The degree of brain injury was evaluated through the expression of MAP2 in hippocampal CA1 region and the Morris water maze. Results: The result of the expression of MAP2 indicated the injury of GI group was the most severe， and the damage of BCCO group was the most mild.Compared with the normal group，the behavior change of reperfusion was the significant in the MCAO and GI groups. Conclusion:The three animal models should be applied in different researches. The BCCO model could be used in prevention of mild ischemia. The MCAO model could be used in the change of cerebral function and the drug evaluation. The GI model could be used in recovery after cerebral ischemia.
[KEY WORDS] Cerebral ischemia; Cerebral injury; Animal ; Rat
脑血管疾病是世界上严重危害人类健康的三大疾病之一， 发病率已达到104. 53/10万。缺血性脑血管疾病( ICVD ) 发病率有逐年增高趋势， 死亡率可达56. 6%～80% ， 即使存活， 也留有严重的后遗症影响生活质量。因此， 建立合适的动物脑缺血及缺血再灌注模型来模拟人类脑血管疾病并对之进行研究， 是深入研究其病变发生、发展和预后的基础，也是当前神经科学的热门课题之一。
大鼠具有脑血管解剖结构和功能与人类相近似、品种品系相对标准、良好的种内纯合性等特点，目前大多利用大鼠建立脑缺血再灌模型，但是对各种模型的制作效果未见文献报道。本文采用双侧颈总动脉阻断再灌模型(BCCO)、线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型(MCAO)、四血管法全脑缺血再灌模型(GI)等3种常用的局灶性脑缺血再灌动物模型，观察不同脑损伤情况下的形态学改变，并评价其行为学，旨在探讨不同模型的适应性。
1 材料与方法
1.1 实验动物及分组
健康雄性Wistar大鼠，6月龄，体重(200±50) g，经Morris水迷宫筛选后，分为正常对照组(Normal)，双侧颈总动脉结扎20 min再灌注组(BCCO)，线栓法大脑中动脉脑缺血再灌模型组(MCAO)，四血管法全脑缺血再灌模型组(GI)，每组6只。
1.2 Morris水迷宫测试
Morris水迷宫测试程序采用定位航行试验：每天4次，共3 d，均在10:00am～5:00pm之间完成。将大鼠头朝池壁轻轻放入水中，计时动物自入水至找到平台时间为潜伏期，同时观察搜索站台的轨迹。记录大鼠后8次测试的潜伏期，以平均潜伏期的90%区间作为筛选学习记忆功能正常大鼠的标准。
1.3 动物模型制备
BCCO模型：大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，颈正中切口逐层切开皮肤及皮下组织，分离胸锁乳突肌，切断二腹肌前腹，暴露颈总动脉(common carotidartery， CCA)，颈内动脉(internal carotid artery， ICA)和颈外动脉(external carotid artery，ECA)，分离双侧颈总动脉约1 cm，用动脉夹夹闭20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。
MCAO模型：参照Longa等[1]和罗勇等[2]报道的方法，采用经颈内动脉线栓法制备大鼠右侧MCAO致局灶性永久性脑缺血模型。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露右侧CCA、ICA和ECA，探查ECA在颈部发出第1分支(甲状颈干)处，在其远心端约0.2 cm处结扎并切断ECA，确保ECA残端长度不少于0.5 cm;结扎并切断ECA与ICA之间的交通支。用动脉夹暂时阻断CCA及ICA血流，用眼科剪于ECA 残端作一纵行小切口，用直径约0.2 mm的尼龙线，烧灼头端使其成为直径约为0.25 mm的线栓，将线栓从右侧ECA残端插入ICA;轻轻牵拉ECA残端，使其与ICA成一条直线，调整线栓角度，使线栓弧度水平向外，与颈前正中线呈45度水平向外的夹角，移去夹闭ICA的动脉夹，轻轻将线栓送入颅内。从CCA分叉处送入ICA约1.9～2.1 cm时通常可遇阻力，大鼠呼吸、心跳突然加快，部分大鼠尿失禁，据此作为大脑中动脉起始处栓塞成功的标志。栓塞成功后，用丝线结扎ECA残端，移去夹闭CCA的蛙心夹，观察无活动性出血后关闭切口。缺血20 min后，将栓线抽至颈内动脉起始部恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。
GI模型：参考Pulsinelli方法，采用改良的四血管夹闭方法制备四血管阻塞全脑缺血模型[3，4]。大鼠用2%的戊巴比妥(0.2 mL/100 g)麻醉，仰卧位固定，颈正中切口，暴露CCA和与之伴行的神经，钝性分离出CCA，用棉线环CCA成1cm的线环。两侧线环相互交叉埋于皮下，缝合切口。大鼠转移到立体定位仪上， 俯卧。头向下倾斜30 度固定。剪去头颈部的毛， 消毒。在枕骨下沿背正中切口，分离肌肉， 找到第1颈椎后弓上的横突孔， 用电凝针插入2～3 mm，灼断孔中的椎动脉， 使之永久性阻塞。电凝完毕， 缝合切口，大鼠放回饲养笼中， 让其自然苏醒， 禁食过夜， 自由饮水。以上手术24 h 后， 大鼠在清醒状态下仰卧固定， 重新打开颈部切口， 用动脉夹夹闭双侧颈总动脉， 使大鼠脑部供血完全阻断， 大鼠挣扎数秒后于30～60 s 内昏迷， 解除固定， 可见大鼠四肢上举， 翻正反射消失， 痛觉反应消失， 双侧瞳孔散大， 眼球呈灰白色， 身体可呈角弓反张。缺血20 min后，解除动脉夹，恢复脑血流，再灌7 d，在处死前做Morris水迷宫测试。
1.4 组织制备
用2%戊巴比妥钠(0.12 mL/50 g体重)腹腔注射麻醉后，迅速开胸暴露心脏，灌注固定后取脑，后固定2～4 h后，分别置于15%和30%蔗糖梯度溶液中直至标本沉底。冰冻切片机作连续冠状切片，取海马和齿状回互包平面，片厚30μm，用小鼠抗MAP2单克隆抗体作ABC免疫组织化学染色，用正常羊血清代替一抗作阴性对照。
1.5 统计学处理
用HPIAS高清晰度彩色病理图像测量系统测定海马CA1区神经元胞浆MAP2反应产物的OD值，并减去同一张切片的背底OD值，即矫正的OD值(COD值)，每例标本检测3张切片，每张切片检测3个视野。实验数据用SPSS 13.0统计软件分析，采用单因素方差分析比较样本均数。
2 结果
2.1 水迷宫检测
正常大鼠定位航行试验潜伏期稳定，在5 s左右可找到平台。BCCO组大鼠搜索策略以直线式搜索策略为主，其潜伏期与正常组比较略有增加，且波动较大，但是无统计学意义(P >0.05)。MCAO组和GI组均有潜伏期增加，与正常对照组有统计学意义(P
2.2 海马MAP2免疫组织化学染色
正常组海马CA1区MAP2主要在神经元树突表达，突起平滑而且完整(图1A);而核周质弱表达。BCCO组可观察到海马CA1区神经元树突MAP2的表达增加，突起断裂不完整，粗细不一致(图1B);GI组突起表达更加紊乱，可观察到螺旋样变(图1C);MCAO组突起表达有断裂，不完整(图1D)。统计分析表明，MAP2表达COD值在各组之间差异有显著性(F=354.906，P
3 讨论
缺血性脑血管病的实验动物模型是研究缺血性脑损伤和脑保护必不可少的工具，有关大鼠局灶性脑缺血再灌注模型已建立多种方法。De Reuck等[5]的研究提示，脑血管储备功能的下降导致全脑代谢储备消耗是血管性痴呆发生的可能机制;动物空间记忆能力下降，是由于血管结扎导致局部脑血流下降而影响与学习记忆有关的结构。孙莉等[6]采用双侧颈总动脉结扎模型发现，结扎导致实验动物水迷宫测试成绩下降，并且这种下降随结扎天数的延长而加大。赵宪林等[7]用这种方法结扎时间长达4月，结果发现30只结扎鼠中有25只痴呆鼠，呈轻、中度痴呆分别是9只、13只。本实验也表明，在双侧颈总动脉结扎再灌后，形态学和行为学方面有所改变。
大鼠全脑缺血再灌注模型，它的解剖学基础在于大鼠腹侧的脊髓动脉有一定向脑干的返支，四血管闭塞期间可以维持脑干的血液供应，使得大鼠在一定时间内能够存活下来。由于全脑缺血对大鼠的脑组织损伤严重，而再灌注，不仅没有使损伤的脑组织得以恢复，反而由于细胞内Ca2+超载、一氧化氮以及氧自由基等作用使损伤程度进一步加深[8]。本实验也证实全脑缺血后引起脑形态学和学习记忆能力的严重损伤，是研究血管性痴呆的良好模型。
大鼠中动脉(MCA)阻塞为临床上缺血性脑血管病的多发部位，故MCA阻断模型被广泛应用于脑梗塞的研究。其中，血管内直接插线闭塞法建立大鼠局灶性脑缺血/再灌注模型具有不开颅、损伤小、操作简便、不需特殊设备、缺血区部位较恒定、可准确控制缺血和再灌注时间、易控制局部条件、全身影响小等优点，被广泛用于脑缺血/再灌注的研究中。目前对该模型有较多的研究，刘亢丁等[9]认为该模型大鼠体重应控制在250～300 g ;马常升等[10]发现，当大鼠体重为190～239 g 时，宜选择插线的直径为0.185 mm ，体重为239～300 g 时，插线直径宜为0.200 mm;徐佳等[11]研究模型栓线插入的深度认为，要得到成动的模型栓线插入深度最少要达到1. 65 cm。与全脑缺血模型相比， MCAO模型可形成特定部位的脑梗死并进行再灌注， 对全身影响较小， 与人脑梗死的发病情况更相似， 所以目前应用更为广泛。其中， 栓线法因其缺血部位恒定、能准确控制缺血后再灌注时间等优点， 适用于脑缺血及再灌注多方面的研究。
通过对各组再灌后的行为学检测，分析发现3组之间行为学有明显区别，对于在行为学的基础上结合MAP2染色来评价脑缺血再灌注模型的脑损伤程度。观察发现，不同模型缺血坏死程度不同，结合行为学评分我们认为，不同的缺血再灌模型的应用范围应有所侧重，不同的脑缺血模型的应用不同，双侧缺血模型可用于轻微缺血的预防，线栓法应用于局部损伤后脑功能改变及治疗药物评价，全脑缺血再灌注动物模型是研究缺血损伤后恢复相对理想的模型，对于慢性脑缺血、脑缺血的药物及一些特殊领域的研究具有较高的价值。
各种脑缺血动物模型的制备方法各有优缺点，研究者应根据实验目的及研究方向做出相应的选择。目前， 脑缺血动物模型的研究在制备方法、实验条件的控制等方面都取得了很大进展， 而且转基因小鼠的出现， 超声、MR、MRA、介入等新技术的发展及其在模型制备中的应用， 在很大程度上促进了脑缺血模型的研究。但还有很多问题尚待解决， 如怎样更好地控制脑梗死灶的部位和范围， 更准确地控制缺血和再灌注时间等。脑缺血动物模型的日趋完善， 将为人们更深刻认识ICVD 发病机制， 研究新的治疗对策等提供更准确的信息。
参考文献
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动物行为学研究方法范文3
【关键词】 脊髓损伤；疾病模型，动物；大鼠；病理学
【Abstract】 AIM: To observe the functional consequence and pathological changes of spinal cord tissues in acute contusive spinal cord injury model so as to provide theoretical evidence for the clinical therapy of the impaired spinal cord. METHODS: In female adult Sprague Dawley rats， after the T10 spinous process and the corresponding vertebral lamina were removed， moderate spinal cord contusive injuries were produced by using modified Allens method in the experiment group. In control group， rats received only T10 laminectomies .The behavioral scores and the pathological alterations were recorded at different time points. RESULTS: In control group， the rats could walk after reviving， and the microstructure of spinal cord was normal.The behavioral scores of the expreriment group were lower as compared with those of the control group at different time points. The pathological alterations were very apparent in the damaged spinal cord area. When time went on， the spinal cord could be in partial functional recovery. The experimental group showed marked differences from control group. CONCLUSION: The model established in this article will contribute to understanding pathophysiological changes and screening effective therapeutic measures for this injury.
【Keywords】 spinal cord injuries; disease models， animal; rats; pathology
0引言
急性脊髓损伤是一种致残率很高的的疾病. 随着交通业和建筑业的迅速发展，这样的患者呈逐年上升趋势. 脊髓损伤后的病理生理机制非常复杂，人们对此认识还很不全面及深入. 由于无法依靠临床开展系统的病理学研究，通过建立动物模型进行实验研究尤为重要. 近年来， 脊髓损伤动物模型研究是热点课题， 许多学者进行了大量的研究，以求制备可靠性高、重复性好的可检测病理变化的动物模型. 本实验我们利用Allen法制备急性挫伤型动物模型，模拟临床上外伤所致的脊髓损伤，观察其行为学变化和病理改变，为后期的脊髓搜索治疗提供实验信息.
1材料和方法
1.1材料
成年雌性SD大鼠40只，体质量200~250 g， 由安徽医科大学动物实验中心提供. 动物按体质量从小到大编号，按随机数字法将这些动物等分为实验组和对照组.
1.2方法
所以动物用20 g/L戊巴比妥钠(40 mg/kg)腹腔麻醉后，俯卧位固定于解剖显微镜台板上，胸背部剃毛备皮，常规消毒，定位于T10棘突位置，以此为中心作后背部正中切口，长约3 cm，切开皮肤和皮下组织，分离两侧椎旁肌肉，用直蚊式有齿血管钳轻轻咬除T10棘突和两侧椎板至关节突，充分暴露硬脊膜，长约5 mm， T9和T11棘突分别用蚊式血管钳钳住并向两侧牵拉来固定脊髓，以T10相应区域为损伤区，后正中血管为中心，用自制改良的Allen装置制备脊髓急性挫伤动物模型.损伤力度为(10 g×2.5 cm) 25势能克厘米力(gramcm force， gcf)，然后冲洗创口，创面撒少量青霉素粉，用30号线逐层缝合椎旁肌肉和皮肤，对照组同法暴露脊髓，但不损伤脊髓. 伤后大鼠单笼饲养，自然光照，周期定时添足饲料，饮水不加限制，.每天早晚两次人工按摩膀胱排尿，直至膀胱恢复自动排尿.每2~3 d更换一次垫料，保持干燥.
1.3观察指标
1.3.1BBB运动功能评分评分采用双盲，观察者为熟悉评分标准的非本组实验人员，双人独立观察记录，最后取平均值为准. 实验动物分别在术前，术后1，2，3，4 wk进行BBB评分［1］，BBB(Basso Beattie Bresnahan)评分均在上午进行，评价前膀胱排空，观察期为4 min.BBB评分是观察动物的臀、膝、踝关节行走，躯干运动及其协调情况.
1.3.2组织学观察分别在伤后24 h，3 ，7 ，14 和28 d处死等量动物(n=2). 腹腔麻醉后，仰卧固定，剪开胸腔，暴露心脏，自左心室通过静脉导管快速灌注生理盐水冲洗血管，待右心耳留出液体基本无色，随即用冷的40 g/L多聚甲醛固定液灌注，量约250 mL，先快后慢，30 min后取出脊髓组织，取损伤节段和相邻节段长约0.8 cm的脊髓，4℃下将脊髓移入40 g/L多聚甲醛固定6 h，依次移入200 和300 g/L的蔗糖溶液中直至沉底，然后脱水、透明、浸蜡、石蜡包埋，水平面连续切片，片厚5 μm，行HE染色，光镜下观察. 另在伤后2 ，4 wk处死等量动物 (n=2)，灌注固定方法同上，将损伤节段脊髓取出后，分成1 mm×1 mm×1 mm大小组织块固定于25 mL/L的戊二醛中，按常规制作步骤进行，将环氧树脂包埋的组织进行超薄切片，片厚70 nm，入枸橼酸铅染液后，在透射电镜下观察摄片.
统计学处理： 采用SPSS11.5统计软件包对实验数据进行组间t检验分析，数据以均数加减标准差表示，P
2结果
2.1伤后动物基本情况观察大鼠造模苏醒后，出现双后肢不能自主活动，并明显尿潴留，肌张力低，肌力0级，显示造模成功.术后3 d内，大鼠活动较少，饮食少，体质量有所减轻，平均下降18 g左右，此后饮食逐渐恢复正常，体质量增加，活动增多.有3只大鼠术后第1日出现血尿，经过及时按压排空膀胱后，有2只大鼠小便颜色转为正常，1只大鼠(实验组)因血尿于术后第3日死亡.所有大鼠切口干燥，未见感染迹象.由于定时更换垫料，SD大鼠双后肢未见褥疮现象.经过人工按摩膀胱，5~7 d后所有大鼠基本恢复自主排尿，实验过程中，对照组1只大鼠因麻醉意外死亡.
2.2伤后动物行为学观察伤后动物单笼饲养4 wk，按BBB运动评分，两组受试动物各阶段评分结果见表1.表1实验组、对照组各阶段BBB运动功能评分（略）
2.3病理观察
2.3.1光镜观察假手术组组织结构致密，细胞核圆而大、染色浅、核仁清晰(图1A).实验组损伤后24 h神经元和胶质细胞几乎全部消失，白质坏死崩解，呈现“一片荒凉”景象(图1B);损伤后3 d，脊髓内斑片状出血，灰质神经元肿胀，细胞间质水肿，白质神经纤维肿胀(图1C);受伤后7 d，可出现灰质神经元肿胀，胶质细胞增生明显，间质水肿，有少量炎细胞浸润(图1D);损伤后14 d，神经纤维排列稀疏、断裂，胶质细胞增生，瘢痕形成(图1E);损伤后28 d，灰质内神经元有所恢复，间质可见大量胶质细胞形成，白质神经纤维形态逐渐恢复正常(图1F).
2.3.2电镜观察假手术对照组神经纤维结构正常，髓鞘完整，无分层现象(图2A).实验组，术后2 wk，髓鞘扭曲、分层和崩解，轴突内线粒体嵴突消失，空泡样变性(图2B)，神经元细胞核固缩，内质网扩张，线粒体空泡样变性，细胞膜消失(图2C);术后4 wk， 髓鞘壁变薄，部分松解，稍肿胀(图2D)，细胞膜破坏，内质网和线粒体稍肿胀(图2E)， 但较术后2 wk有明显好转.
3讨论
3.1关于模型制备本实验我们通过改良Allen法制成急性挫伤型动物模型是一种比较成熟、研究中使用最为广泛的脊髓损伤造模方法.该造模与人类脊髓损伤的性质非常相近，两者均属一定力量撞击后造成脊髓水肿、缺血，并继发一系列损伤反应脊髓损伤的典型表现.同时，该法保持了硬脊膜的完整性，可有效的防止结缔组织、组织间液、细菌或其他外源浸入脊髓损伤区.此外，该法脊髓损伤节段可以限定，撞击量可以通过重物的重量或重物下落的高度进行调控，因而有较强的可重复性. 当然，人为地造成完全等同于疾病病理过程的模型几乎是不可能的.运用A: 对照；B~F: 实验（造模后24 h，3，7，14和28 d）.
Allen法［2］制备良好的稳定性和可重复性急性挫伤型脊髓损伤模型，应注意: ① 动物体质量应尽量一致. ② 脊髓损伤节段及暴露范围要一致.③ 稳定脊髓以防重物撞击时引起脊髓侧向移位，导致脊髓损伤不对称.④ 撞击锤下落挫伤脊髓后，应及时移走，避免持续性压迫脊髓或多次撞击引起“反弹”损伤.
3.2行为学检测脊髓损伤后的运动能力评估是确定脊髓损伤程度，观察脊髓修复与再生情况及评价药物疗效的最基本的要求，所以产生了很多脊髓损伤后行为学评价方法.行为学检测是一项重要的评价措施，可以用来评价脊髓损伤后的功能变化，功能自然恢复的程度以及干预治疗的效果［1］.目前最常用的运动功能评价方法是分级为21级的较为精细详尽的BBB评分，常用来评价大鼠的运动功能.BBB评分是一种相对可靠的评价运动功能及损伤程度的方法，有利于不同机构之间学术交流及结果比较.不过，此法在实际运用中，易主观评分，导致结果失真.故常采用双盲、双人独立观察记录，最后取较低值或均值为准，或不同人分别观察两个不同后肢、最后取均值为准，致使该标准比较客观. 此外，其他常用的神经功能评定方法有Tarlov法［4］和Gale联合评分法(combine behavioral score， CBS)等［5］. Tarlov法评分跨度大，只能用于脊髓损伤后损伤程度的初步判定.CBS法虽然敏感性大为提高，但所需设备较复杂，人为因素较多，不利于推广.
3.3脊髓损伤后功能自行恢复虽然与周围神经系统轴突损伤后拥有良好的再生能力相比，成年哺乳动物脊髓再生能力很有限［6］. 然而，很多最近的观察发现成年哺乳动物脊髓损伤后通过内在的自我修复能力可以恢复部分功能. 这些研究认为脊髓损伤后剩余的或再生的脊髓功能归因于椎管内循环回路的自发形成或重排，这样可以部分的补偿脊髓损伤后的功能丧失［7］. 神经回路的重建的基础可能包括残存的神经元，向外生长的突起，以及脊髓损区域或附近神经回路的组织再生，不仅包括神经元，而且包括胶质细胞，特别是在中枢神经系统中调节突触发生和突触传递的星型胶质细胞［8-9］. You等［10］认为残留的4.8%的腹侧角的白质神经纤维便能对脊髓运动功能恢复发挥一定的作用. Shibuya等［11］研究发现，脊髓损伤后1 wk，胶质细胞大量增生，可能通过胶质细胞形成支架或分泌神经营养因子，促进脊髓损伤的修复.也有学者研究发现脊髓损伤能诱导内源性神经干细胞增生和分化，而促进脊髓功能的恢复［12］. 本实验发现，实验组大鼠后肢功能可以部分自行恢复，BBB评分由伤后0.47±0.70到伤后4 wk的9.92±1.12，HE染色发现伤后2 wk胶质细胞增生明显，伤后4 wk，白质神经纤维逐渐恢复正常，灰质神经元结构明显好转. 超微病理观察，术后4 wk较伤后2 wk，髓鞘结构明显好转.
综上所述，利用改良WD法可制备急性挫伤型脊髓损伤模型，为进一步深入了解脊髓损伤的机理及早期的干预治疗和后期的临床治疗奠定了基础，但在评价脊髓功能恢复时，应设立严格的对照，以区分脊髓再生引起的功能恢复和残留的神经纤维代偿性功能恢复.
基金项目：国家自然科学基金资助项目（30571881）；安徽省自然科学基金资助项目（050430713）
参考文献
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动物行为学研究方法范文4
关键词：帕金森病；止颤汤；干细胞移植；DA代谢；大鼠
中图分类号：R742.5 R285.5 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）08-0975-02
帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是由于多种原因导致脑内黑质多巴胺（Dopamine，DA）能神经元退行性病变从而DA分泌减少引起的。干细胞移植是PD的理想治疗方法［1］，通过干细胞中最适合于中枢神经系统细胞替代治疗的神经干细胞（neural stem cell，NSC）移植以期重建PD患者DA能神经元的功能。因此如何促使移植入脑内的NSC存活且定向分化为DA能神经元，并发挥功能成为亟得解决的问题。本实验观察了中药复方止颤汤对NSC移植后PD大鼠尿液中DA及其代谢产物含量的影响，以期为解决NSC移植治疗PD中的疑难问题提供中医药实验依据。
1 材料与方法
1.1 实验动物 Wistar大鼠48只，均为雄性，体重260 g±20 g，由上海斯莱克实验动物中心提供，动物编号：SCXK（沪）2007-0005。
1.2 药品与试剂 止颤汤主要由黄芪、丹参、白芍、升麻、知母、钩藤等8味中药组成。诸药均经鉴定符合药典规定的质量标准。高效液相所用的标准品DA、DOPAC、HVA：美国Sigma公司。
1.3 主要仪器 鼠脑立体定位仪：上海江湾Ⅱ型，液相色谱仪：HPLC Agilent 1200，Agilent Zorbax oligo 80 mm×6.2 mm,5 μm column。
1.4 方法
1.4.1 模型制备 采用大鼠脑立体定位MPTP注射法制模［2］。术后14 d，颈部皮下注射诱导剂阿扑吗啡（Apo）后，测量大鼠30 min内向损毁侧旋转总次数，若大鼠旋转圈数>210 r/30 min（>7 r/min），视为成功PD大鼠模型。
1.4.2 NSC的分离培养及鉴定 参照文献［3］，选取孕14 d的Wistar大鼠胚胎，分离出中脑组织，机械消化成单细胞悬液，种植于塑料培养瓶中，5%二氧化碳，37 ℃环境中培养，待原代克隆出现后（7 d～10 d），离心收集神经球，胰酶消化，吹打成单细胞悬液，1×105 /mL浓度种植于新培液中，每7 d换液传代1次，离心收集形成的神经球，经甩片到多聚赖氨酸包被的玻片上，固定后进行免疫细胞染色，检测NSC特异性蛋白Nestin的表达，鉴定所培养细胞中NSC细胞数量及传代后生长情况。
1.4.3 动物分组及给药 将48只大鼠随机分为4组。NSC移植组：大鼠PD模型制作后，将NSC注射入PD大鼠损毁侧黑质纹状体内，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。正常组：正常大鼠，脑内同一位置注射等量培养基，同时用生理盐水4 mL，每天分2次灌胃。模型组：模型制作后，同正常组处理。止颤汤组：同样方法将NSC移植入PD大鼠模型，同时将止颤汤1.2 mL/100 g用生理盐水稀释为4 mL，每天分2次灌胃。
1.4.4 行为学测试 分别于处理后7 d、14 d、28 d颈部皮下注射阿扑吗啡，诱发其旋转行为，动物旋转时以患侧后肢为支点、身体环曲、首尾相接的原地旋转，伴觅食样动作，旋转360°为一转，30 min内记录大鼠的旋转圈数。
1.4.5 取材及材料处理 动物在处理后第28天末次灌胃后进行行为学测试，次日晨收集尿液置入-80 ℃超低温冰箱保存备用。测样时，室温下解冻，每次进样10 μL。高效液相色谱法检测DA、DOPAC及HVA含量［4］。
1.5 统计学处理 数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较用t检验，采用统计软件中One-Way ANOVA进行单因素方差分析。
2 结 果
2.1 大鼠行为学测试结果（见表1）
表1 各组大鼠行为学测试结果比较（x±s）r/30 min
2.2 PD大鼠尿液中DA、DOPAC、HVA含量及DA/DOPAC、DA/HVA比值比较（见表2）
3 讨 论
止颤汤是本科室李如奎教授多年治疗PD的经验效方，主要有黄芪、当归、丹参等药组成，有益气养阴、清热祛瘀、熄风通络作用，在临床研究中取得较好疗效［5］，实验研究中有发现天麻、当归等中药可以诱导骨髓间质干细胞分化为神经元样细胞［6］，黄芪和丹参不仅有诱导间质干细胞定向分化为神经元样细胞的作用，且可能对脑内NSC的增殖及向多巴胺能神经元分化有促进的作用［7,8］。本实验结果显示，止颤汤组行为学转数随时间延长较模型组明显减少（P
但是，本实验不能排除中药对脑内损毁DA能神经元本身的修复和残存DA能神经元功能以及内源性NSC分化为DA能神经元的促进作用，对此尚需进一步研究。
参考文献:
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作者简介：宋杰（1985―），男，现为上海中医药大学2009级中医内科学硕士研究生（邮编:200071）；施慧芬（通讯作者），工作于上海中医药大学附属上海市中医医院（邮编:200071）。
动物行为学研究方法范文5
【关键词】 围绝经期综合征； 肝郁； 去势； 慢性束缚应激； 行为学
围绝经期综合征指妇女绝经前后由于性激素波动或减少所致的一系列躯体及精神心理症状，其中雌激素水平下降是引起该病的主要原因[1-2]。随着生活水平提高，工作压力加大，人口老龄化加剧，围绝经期综合征的发病率逐年增高。肝气郁结证是其主要中医证型，中医药治疗已经取得较好的疗效，而且副作用小[3-4]。目前比较认可的围绝经期综合征肝郁模型是运用自然衰老的大鼠进行造模，然而由于其饲养周期长，成本高，来源非常稀少，因此相关的研究报道相对较少，中医药对其作用机制的了解受到很大的局限[5-6]。而去势大鼠也是公认的围绝经期综合征模型，其阴道脱落细胞涂片及血清性激素水平均和围绝经期发生的改变相似[7-8]。因此本研究拟用去势大鼠模型，联合慢性束缚应激与孤养法进行造模，从外观特征及行为学水平来探讨该模型的有效性，为进一步探讨中医药治疗围绝经期综合征肝郁的科学内涵提供基础。
1 资料与方法
1.1 一般资料 健康雌性SD大鼠24只，体质量（220±20）g，
清洁级，动物许可证号为SCXK （京） 2002-2009，由福建中医药大学实验动物中心提供。光/暗周期为12 h/12 h（光照时间6：00-18：00），室温（22±2）℃，相对湿度保持为30%～40%，喂常规颗粒饲料及饮用水。适应性饲养两周后，利用敞箱实验对每只大鼠进行行为学评分，水平运动和垂直运动总得分低于40分和高于160分的动物予以剔除，选择各项行为学指标得分相近的24只大鼠，按体质量分层采用随机数字表法将大鼠随机分为假手术组、去势空白组、去势模型组，每组各8只，组间体质量及旷场评分比较差异无统计学意义（P
1.2 模型的建立 （1）去势：动物分组后行去卵巢手术。手术前，两组大鼠均禁食12 h，按体质量腹腔注射2%戊巴比妥钠（40 mg/kg）麻醉，模型组从腹部正中线切口，切除双侧卵巢，假手术组不切除卵巢，只将卵巢旁与卵巢等大的一块脂肪组织切除。动物手术后自然修复两周，在慢性束缚应激前进行连续5 d阴道涂片检测，观察无成熟脱落细胞，证明卵巢切除完整，造模成功。假手术组动物的阴道脱落细胞依然呈典型的周期性变化。（2）慢性束缚：用慢性束缚应激结合孤养法建立肝郁证大鼠模型，将去势模型组大鼠置于束缚筒内，管壁有若干通风口，通风良好，大鼠能够自由呼吸，束缚应激时间为6 h（9：00-15：00），连续束缚21 d，束缚应激期间禁食禁水。假手术组和去势空白组在同一时段内也是禁食禁水。（3）孤养：去势模型组单笼饲养，假手术组和去势空白组群养，4只/笼。
1.3 体质量与行为学检测
1.3.1 外部特征及体质量 每天造模前观察并记录各组大鼠的饮食、二便、毛发色泽、情绪行为等外观方面的变化。分别于手术前1天，应激前1天，应激第7、14、21天上午8：00-9：00记录各组大鼠体质量。
1.3.2 旷场实验 于动物分组前、应激前1天和应激第21天8：00-12：00进行测试。采用自制长×宽×高
=75 cm×75 cm×40 cm的敞箱，底面划分成25个面积相等的方格。旷场的中央放一彩色瓶子激发大鼠的好奇心。拍摄并记录5 min内大鼠的水平运动格数（四爪皆进入记为1分）和垂直竖立次数（两前爪腾空或攀附箱壁记为1分）。每只大鼠均从同一角落放入，测评结束后，及时记录粪便颗粒数，并用75%酒精擦拭以消除气味的影响，待酒精晾干后再进行下一次实验。
1.3.3 糖水偏好实验 分别在分组前、造模前和造模结束后检测各组大鼠的糖水消耗率。按照文献[9]的方法进行部分修改，实验进行时，每只大鼠单笼喂养，实验前，训练实验大鼠适应含糖饮水12 h（20：00-次日8：00），10 h禁食禁水后，同时给予1%蔗糖水和纯水各1瓶，1 h后调换蔗糖水和纯水的位置，2 h后分别称量纯水消耗量及蔗糖水消耗量，计算糖水消耗率（糖水消耗率=糖水消耗量/总液体消耗量×100%）。
1.4 统计学处理 使用SPSS 19.0软件，计量资料采用（x±s）表示，对所得一般性数据做正态分布检验和组间方差齐性检验，其中体质量、糖水消耗率、旷场实验的水平得分及垂直得分符合正态分布和方差齐性，用单因素方差分析，组间比较采用LSD检验进行分析；旷场实验中的修饰得分、粪便数目不符合正态分布则采用采用非参数检验进行分析，以P
2 结果
2.1 三组外部特征及体质量变化比较 造模前，各组大鼠活泼好动，皮毛光泽好、粪便呈球形。造模结束后，大鼠毛发变得干枯、胡须下搭、行动迟缓、精神倦怠、嗜卧、进食进水量减少、大便稀软。各组大鼠在行去势手术前体质量比较差异无统计学意义（P>0.05）。去势后两周即应激前1天，与假手术组相比，两个去势组的大鼠体质量均显著增加，差异有统计学意义（P
2.2 三组对旷场行为的影响比较 手术前，各组大鼠在基线水平的水平得分和垂直得分差异均无统计学意义（P>0.05）；手术后两周，即应激造模前1天，和假手术组比较，去势空白组和去势模型组大鼠的水平活动得分均有显著下降（P
2.3 各组对糖水偏好的影响比较 手术前，各组大鼠在基线水平的糖水消耗率比较差异无统计学意义（P>0.05）；手术两周后，即应激造模前，和假手术组比较，去势空白组和去势模型组的糖水消耗率均明显下降，差异均有统计学意义（P
3 讨论
课题组前期研究结果表明，肝郁是围绝经期综合征的重要病理因素[4]。围绝经期女性常面临家庭及事业等多种问题，精神压力较大，多感所愿不遂、抑郁于内，易形成心理应激。因此，建立围绝经期综合征肝郁动物模型对于本病机理的深入研究具有一定的现实意义。本文通过手术摘除卵巢人为地造成雌激素突然下降模拟围绝经期综合征的状态，该方法周期短、简单易行，是常用的一种围绝经期综合征造模方法[8]。目前普遍认为，肝郁多表现为认知、人格等心境障碍，病理反应涉及植物神经功能紊乱，神经内分泌免疫等调节网络的失衡[10]。多数学者认为，肝主疏泄的功能与心理―应激反应有关，从心理―应激反应来研究肝郁是近几年的研究热点[11-12]。慢性束缚应激使动物自由行动受限，情绪受抑，比较接近中医“情志不遂”致郁的发病学说；孤养则模拟了人类远离社会、家庭的生存状态，运用束缚制动联合孤养法建立肝郁大鼠模型，可以制造较为纯粹的挫折应激和孤独感受，是较好的负性心理应激动物模型[13-14]。另外，因其躯体应激因素较小，对机体无损伤性刺激，与人类身心性疾病的致病过程类似，近年来在肝郁相关研究中已被广泛采用[15-16]。本研究表明，去势模型组大鼠体重增加缓慢，探究行为减少，表现出情绪低落、兴趣减退等症状，与围绝经期综合征肝郁证的形成过程相似。
围绝经期女性由于卵巢萎缩，雌激素分泌下降，糖和脂肪代谢发生紊乱，体脂分布异常，特别是腹内脂肪积聚[14]。在本研究中大鼠在去势手术后两周体质量显著增加，该现象与女性在围绝经期的体质量变化相吻合。在束缚应激条件下，肾上腺皮质醇显著升高，机体对胰岛素的敏感性增加，皮质醇还可以促进蛋白质分解，抑制其合成，同时影响糖和脂类的代谢[17]。因此本研究中去势模型组在应激开始后，体质量几乎没有增长，甚至有下降的趋势。
在行为学研究中，旷场实验可以用来检测动物在新奇环境中的活动度、探究行为、恐惧紧张状态及警觉性，其中水平活动反映动物的活动度，垂直活动反映动物对新鲜环境的好奇程度，粪便粒数是大鼠紧张程度的表现[18]。肝气郁结证核心症状之一是“缺失”，糖水偏好实验则是用来检验动物对幸福事件反应能力的变化，糖水消耗量及偏嗜度降低，表明动物对奖励敏感度低，常作为一项反映动物愉悦体验能力的指标[19-20]。本研究表明，大鼠在去势后，水平运动得分及糖水消耗率明显下降，在慢性束缚应激结合孤养的作用下，去势模型组大鼠的行为活动进一步减少、糖水消耗率进一步降低，提示仅仅去势即会使大鼠活动度、好奇程度及奖赏反应的敏感度下降，但是肝郁造模后大鼠的各症状加剧，缺乏，兴趣丧失，可能是由于大鼠卵巢切除后，生殖内分泌功能开始衰退，对抗应激损伤的能力降低，脑内奖赏系统的一些神经元发生结构性损伤所致。
综上所述，采用去势及慢性束缚应激联合孤养三步法复合制作围绝经期综合征肝郁大鼠模型，可以有效地模仿女性围绝经期由于卵巢功能衰退引起的情感障碍、情绪低落的临床表现。但是值得注意的是，在研究过程中发现，慢性应激诱导行为改变的易感性存在较大的个体差异，该方法并不能实现百分之百的成功率，因此研究过程中，必须适当增加样本例数[21]。另外，围绝经期综合征肝郁的病理机制涉及神经内分泌免疫等调节网络，运用现代分子生物学技术进一步阐明其发生发展机制，将为围绝经期综合征肝郁的临床治疗提供理论基础。
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动物行为学研究方法范文6
【关键词】 母婴分离；开场实验；生命早期应激
临床研究表明，生命早期应激容易导致个体成年后患精神疾病的倾向。例如，幼年时有受虐待经历成年后易出现心境障碍或者易患创伤后应激障碍(post-traumatic stress disorder,PTSD)［1］。Brewin 等［2］研究证明少年时期的精神创伤和受虐待是形成PTSD重要的的危险因素。母婴分离被认为是研究人在幼年时期被忽视和受虐待有效的动物模型。大量相关动物实验研究发现，母婴分离能导致行为学和神经内分泌的异常而出现抑郁和焦虑样反应［3］。这些研究结果表明生命早期应激可能对中枢神经系统发育产生深远而持续的影响，这些影响会导致各种行为学异常和大脑内长时期的生物化学改变。本实验应用母婴分离的动物模型，旨在研究生命早期不良经历对大鼠发育过程中神经行为学的影响。
1 材料与方法
1.1 实验动物和分组
怀孕Wistar雌鼠8只(由中山大学中山医学院实验动物中心提供)。雌鼠生产后在光暗周期为12 h/12 h，光照时间8:00-20:00，温度23±2℃，湿度(52±2)%的条件下饲养。22 d后断奶后每笼4只饲养。22 d后将新生雄性大鼠分为母婴分离组和正常对照组，每组8只。
1.2 主要材料
ZH-ZFT型自发活动实验视频分析系统(安徽省淮北正华生物仪器设备有限公司)。
1.3 动物模型的复制
母婴分离组在新生鼠出生后的第2~15 d给予每天母婴分离3 h的应激刺激。将新生大鼠小心移出，放进另外准备好的鼠笼里，移至另一临近房间，保持温度在25.0℃±0.5℃，母鼠留在原笼中，仔鼠被带离母鼠3 h后放回母鼠笼中，对照组正常饲养。模型复制均在上午(8:00AM-13:00AM)进行。
1.4 自发活动检测
于仔鼠生后22(PND22)d、60 (PND60)d和90 (PND90)d的相同时间，在安静、四周由全封闭的遮光帘隔离开人及电脑干扰并杜绝参照物的环境条件下进行。观察5 min内大鼠活动情况。
1.5 数据处理
测定值用均数±标准差(Mean±SD)表示，采用SPSS 16.0统计软件分析，组间比较采用t检验。以P
2 结果
母婴分离对大鼠自发活动的影响
22日龄大鼠：
仔鼠出生后第22日龄检测其自发活动。结果显示母婴分离组大鼠自发活动总路程和周边路程较对照组显著增多(P
图1
22日龄大鼠自发活动各路程
60日龄大鼠：
仔鼠出生后第60日龄进行第二次自发活动检测。结果显示，母婴分离组中央路程较对照组明显减少(P
90日龄大鼠：
仔鼠出生后第90日龄进行第三次自发活动检测。结果显示，母婴分离组大鼠自发活动总路程、周边路程、中央时间和周边时间与对照组相比均存在显著差异(P
图2
60日龄大鼠自发活动各路程
3 讨论
人类生命早期应激，是多种精神疾病的重要风险因素，可诱发重性抑郁症、创伤后应激障碍、儿童注意缺陷症及精神分裂症等疾病。关于其致病机制的研究，目前主要采用动物模型是应用于啮齿类动物的母婴分离模型，因其符合人类生命早期母子分离的特征，得到广泛应用。
自发活动(Animal Locomotion)试验是观察实验动物在自然状态下的活动情况，在神经精神药理学、行为药理学和毒理学等各个领域得到广泛的应用。有些研究认为动物在自发活动实验中出现自发活动的减少，尤其是中央区域探索活动的减少，提示动物表现为抑郁样行为。也有研究表明，在自发活动实验中动物活动的增加，尤其是周边区域活动的增多，反映动物处于焦虑恐惧状态。Platel等研究认为，动物若重复暴露在同一环境中，会出现对该环境的习惯化，从而表现在第二次重复试验中表现为自发活动的减少，而且在第二次重复实验中动物的活动路程越少，表明其记忆能力越好。本实验结果显示，22 d母婴分离组大鼠在表现为自发活动总路程和周边路程较对照组显著增多，90 d剥夺组大鼠总路程、周边路程和周边时间明显增加，中央时间明显少于对照组。我们认为母婴分离应激诱发了大鼠的焦虑样和抑郁行为。
综上所述，出生后经历生命早期应激会影响个体的神经发育，导致发育过程中及成年后行为活动能力的受损。
参 考 文 献
［1］ Wolfe, D.A. L. Sas, and C. Wekerle, Factors associated with the development of posttraumatic stress disorder among child victims of sexual abuse. Child Abuse Negl, 1994,18(1):37-50.
