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动物行为学方法范文1
作者简介：陈婷(1990-)，女，湖北人，硕士，研究方向：术后认知功能障碍的动物模型行为学研究。作者简介：张宗泽
光遗传学被《Naturemethods》评为2010年度生物技术［1］。光遗传学技术是将光学和遗传学技术相结合，利用病毒载体，将微生物视蛋白基因引入到载体动物的脑组织，采用不同波长和频率的光进行照射，通过刺激光敏感蛋白开启或关闭特定细胞类群或特定神经元的活动进而调控其功能，从而控制动物行为［2］。本文就光遗传学技术的基本方法及应用，以及其在神经-精神疾病动物模型中如何调控神经回路作一综述。
一、光遗传学技术
近来，研究者一直致力于不同行为的神经回路研究，探讨其投射连接，观察通过调控某一类神经元活动后的相应行为学表现。而电刺激和药理学的方法可能导致实验结果不准确，光遗传学技术具有目的性强、低损伤性、高时空分辨率和遗传特异性等特点，近年来在神经科学领域的生物学机制的研究中得到了广泛应用。光遗传学技术可包括下述几部分，对此作简单介绍。
1光敏感蛋白
生物体内存在着一类可以感受不同波长光的刺激，并对该光学刺激产生一系列效应的膜蛋白，即视蛋白。
目前，Ⅰ型视蛋白包括：细菌视紫红质(Bacteriorhodopsin，BR)，盐视紫红质(Halorhodopsin，HR)，通道视紫红质(Channelrhodopsin，ChR)。ChR在莱茵衣藻(Chlammydomonasreinhardti)中发现，为蓝光激活的阳离子通道蛋白，作用为阳离子内流，使细胞膜去极化。2005年，ChR2首次应用于光控制神经元活动的实验中。Ⅱ型视蛋白OptoXR，为视紫红质G蛋白偶联受体的嵌合体。是一种光敏感与G蛋白偶联的膜受体，G蛋白又称鸟苷酸结合蛋白，与G蛋白偶联的膜受体有很多种，如M胆碱能受体、多巴胺能受体等，可参与细胞内信号转导，还可调控如谷氨酸等神经递质的信号传递功能［3］。
2光敏感蛋白的表达
光敏感蛋白，是光遗传学的一种关键工具，在脑内诸多神经元中稳定表达。随着生物工程技术的发展，现在已经研发出许多将光敏感基因运载至细胞或神经元，并有效表达成光敏感蛋白的病毒载体。如腺相关病毒AVV、慢病毒、Cre-Loxp重组酶系统和各种转基因小鼠等。
3光刺激和信号记录
光刺激系统有光列二极管(LED)等。体外实验中，脑片电生理-全细胞膜片钳技术记录神经元放电信号，观察其光电流特征；在体实验中，在体立体定向注射病毒载体，经过10-14天待其充分表达后，构建光神经界面，植入光纤并固定，行在体光刺激，细胞膜内外离子差产生，膜电位发生变化，记录神经元的放电情况［4］。与光调控相匹配的解读体系包括电生理记录，功能磁共振成像或定量的动物行为学分析等。
二、光遗传学技术在神经科学研究中的应用
通过光遗传学技术可将光敏感通道蛋白表达在特定的细胞，用于突触可塑性、神经系统的疾病治疗、动物行为学、神经回路研究等多方面。
1突触可塑性的研究
树突棘是大脑神经元接受和传递信息的重要结构，是形成突触的关键部位，在突触可塑性中发挥重要作用。90%以上的兴奋性突触存在于树突棘头部中，应用光遗传学技术可以同时检测多个树突棘的信号，突破了停留在单个突触水平的研究。Takahashi等［5］通过对啮齿类动物海马区锥体细胞的上百个树突棘进行研究，发现临近的树突棘在自发活动中会趋于同步化，使得输入信号整合，成为动作电位输出。
也有研究应用光照激活星型胶质细胞上表达的ChR2能促发谷氨酸递质释放，可激活神经元的AMPA受体［6］，而AMPA受体与突触可塑性有关。这些研究表明通过选择性调节特异性神经元或神经细胞数量，光遗传学技术在突触可塑性研究中有较大应用前景。
2神经系统疾病的治疗研究
光遗传学技术除了检测大脑中癫痫发作的起始点外，还用于研究严重癫痫持续状态的持续或中止［7］。Sukhotinsky等［8］利用光遗传学技术揭示了海马兴奋型神经元在氯化锂-匹罗卡品诱导大鼠急性癫痫中的作用。
Alilain等［9］利用光遗传学技术将ChR2表达于膈肌运动细胞群，光照刺激下，颈部脊髓损伤的动物可以恢复呼吸运动。光遗传学技术也为帕金森症的神经机制提供了新的见解和思路。
3动物行为学和神经回路研究
动物交际行为学测试中，通过光遗传学技术可明确下丘脑泌素/进食素在特定情境中扮演的角色［10］。Huber等［11］利用光遗传学技术将ChR2表达在小鼠初级感觉皮层-桶状皮层神经元中，利用蓝光照射并结合奖励进行行为学训练的方式，蓝光照射时，小鼠向左转，给予水喝，作为正确识别的奖励，研究小鼠行为与光照之间的关系，证实小鼠奖赏记忆行为准确率与蓝光照射有较强的相关性。
神经回路是神经细胞、分子活动和脑整体活动的连接桥梁。运用光遗传学技术，在动物中实现了对神经元和突触的高时间分辨率、高精确度的光学调控，为动物行为学的神经回路的研究提供较好的一个方法学技术。
三、光遗传学技术在动物行为学中的应用研究
光遗传学技术在动物行为学应用中有良好前景，尤其适用于探索特定类型神经元活动范式与动物行为改变之间因果关系的研究。光遗传学技术在动物交际行为、恐惧记忆行为、奖赏记忆行为、焦虑样行为等行为学的神经回路进行深入研究，不仅可以记录活体动物的脑整体活动，也可记录拟研究神经回路活动的细胞、分子的活动表现，是研究动物行为学的神经回路的一个重要事件，推动了神经回路研究的进步。
然而，涉及神经回路和脑功能的研究，不能直接在人体上进行，动物模型成了重要选择。能否在动物身上建立精神性疾病模型存在争议。例如，精神性疾病的一些诊断特点，如悲伤，内疚，妄想和思维混乱，这些症状在动物模型中难以确定［12］。目前，已成功建立了能概括精神性疾病重要特征，如恐惧记忆、焦虑症、抑郁症等动物模型。同时，应用光遗传学阐明啮齿动物模型中有关精神疾病许多复杂行为的相关神经通路。
1焦虑-社交障碍症候群动物行为学
根据临床资料，焦虑症和社交功能障碍之间有着显著的联系，这种联系可能为理解焦虑症和社交障碍的共同神经通路提供线索。抗焦虑药物可减少当动物被放置在易焦虑环境中的社交受损［13］。不同的自闭症小鼠模型均表现出明显的社交功能障碍以及增强的焦虑样行为［14］。这些研究均表明，焦虑症和社交功能是紧密联系的，并且可能存在一个共同的病理神经机制。
2焦虑样行为的动物行为学
焦虑鼠模型的光遗传学研究，发现特定的杏仁核突触，可快速可逆地调制焦虑水平。Tye等［15］研究发现，利用ChR2成功表达后，进行光照射，可以通过激活基底外侧杏仁核(BasolateralAmygdala，BLA)到中央杏仁核(CentralAmygdala，CeA)的突触投射，小鼠的开臂时间增多，表明产生去焦虑样行为；利用eNpHR3.0成功表达后，进行光照射，可以通过抑制突触连接，小鼠在高架十字迷宫的开臂时间减少，小鼠表现为焦虑样行为。
为了研究基底外侧杏仁核-腹侧海马(vHPC)通路，研究者［16］将感光视蛋白表达于BLA谷氨酸能神经元且视觉纤维被定位在BLA轴突终止的vHPC内，光刺激BLA中止于vHPC的胆碱能神经元诱发的焦虑样效应被vHPC的谷氨酸能神经元抑制，证实兴奋BLA-vHPC神经通路可增加焦虑，抑制BLA-vHPC的轴突将减少焦虑鼠模型中焦虑相关行为。此研究确定了BLA-vHPC为一个双向控制焦虑相关行为的神经通路。
3基底外侧杏仁核-腹侧海马(BLA-vHPC)神经回路的阐明
疾病动物模型如恐惧记忆的神经回路研究，得益于鼠听觉恐惧反射的杏仁核模型，即杏仁核恐惧条件反射。Petreanu等［17］利用光遗传学技术将ChR2表达在大鼠丘脑核和运动皮层兴奋性神经元上，通过光刺激，在活体脑进行电位记录，实现了兴奋性神经元与体感觉皮层锥体细胞间突触的精确定位。这一方法，为研究完整神经回路中发生突触联系的神经元提供了较为广阔的途径。
动物行为学方法范文2
【关键词】针刺治疗；抑郁症；疾病模型；大鼠；行为学；5-HT；NE
Effects of acupuncture on serotonin and norepinephrine in hippocampus of depressed model rats 【Abstract】Objective To observe how acupuncture affects the mechanism of depression model rats.Methods Using Open-Field method to randomly select 40 adult SD male rats into normal control， model group， drug treatment and acupuncture treatment group， 10 rats per group. Separation， long term unpredictability， medium stimulation techniques were applied to modify rats behavior. Then using Open-Field method to reflect changes in depressed model rats behavior between groups treated with acupuncture and control. And the concentration of monoamine neurotransmitters and their metabolites in hippocampus of rat brain were determined by HPLC-ECD. Results Compared with normal control， acupuncture treatment group’s behavior was not different （P＞0.05）on the 7th day after treatment. On the 21th day after treatment， acupuncture treatment group’s behavior was not different （P＞0.05）with drug treatment group， and was more different with model group（P＜0.01）. Compared with normal group on the 21th day of treatment， the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus of acupuncture treatment group was not different （P＞0.05）， whereas was more different with model group （P＜0.05，P＜0.01）.Conclusion This experiment proved that acupuncture treatment could change the behavior abnormality of depressive model rats. The curative effects is comparable to flouxetine. The changes of the concentration of serotonin and norepinephrine in hippocampus are one of the mechanism.
【Key words】acupuncture treatment；depression；disease model；rat；behavior；5 hydroxytryptamine (5-HT);NE
自1984年，针灸开始介入抑郁症的治疗以来，取得了确切的临床疗效，但是对于针刺作用的过程和机制研究尚不深入。为了探讨针刺在抑郁症治疗中的应用规律，我们观察了针刺对抑郁症模型大鼠海马区内单胺类神经递质的影响，并与氟西汀（选择性5-羟色胺再摄取抑制剂）作对照。现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 动物与分组
成年SD大鼠，体重180～220g，雄性，南京中医药大学动物中心提供。首先用Open-Field法作行为学评分，选择得分相近的40只大鼠进行实验分组。将大鼠随机分为正常组、模型组、药物组、针刺组，共4组，每组10只；正常组每笼饲养5只，模型组及针刺组每笼饲养1只（分养）。
1.2 实验方法
1.2.1 复制模型
参考文献［1］复制抑郁症模型：模型组、药物组、针刺组大鼠，共接受21天各种不同的应激，包括冰水游泳（4℃，5min）、热应激（45℃，5min）、禁水（24h）、夹尾（1min）、电击足底（电压50mV，每隔15s刺激1次，每次持续10s，共15次）、摇晃（1次/s，5min）、禁食（24h）和昼夜颠倒等刺激，平均每种刺激各4次。正常组，常规饲养，不接受任何应激性刺激。
于实验第1、21天测定各大鼠行为学（水平运动和垂直运动）。
1.2.2 治疗方法（实验第21天，进入治疗阶段）
正常组，继续常规饲养，每笼饲养5只。模型组，继续分养，每笼饲养1只；常规饲料喂养，不予应激性刺激，也不予任何治疗措施。药物组，继续分养，每笼饲养1只；常规饲料喂养，不与应激性刺激，按照1.8mg/kg给予氟西汀，将药物溶解于生理盐水中灌胃。1日1次治疗，连续21天。针刺组，根据《实验针灸学》［2］大鼠穴位定位方法，选择百会、内关、三阴交，并参照人和动物的穴位解剖结构特点，在华兴邦研制的大鼠针灸穴位图谱基础上，在大鼠前正中线上，额顶骨缝交界线前方处定位神庭穴。针刺方法：常规穴位消毒，选用苏州医疗用品厂生产的“华佗”牌32号1.0寸针灸针进行治疗。百会穴向前斜刺，神庭穴向上斜刺，进针深度约为2mm，内关直刺1mm，三阴交直刺5mm，每穴行均匀捻转刺激30s，留针10min。1日1次治疗，连续21天。
分别于实验第28、35、42天测定各鼠行为学的变化。
1.3 行为学测定
Open-Field法［3］测定大鼠行为学。本实验所用敞箱为正方形，长、宽各80cm，高40cm，底面由面积相等，边长16cm的正方形25块组成，白色内面，以动物穿越底面的块数为水平活动（crossing）得分，以直立次数为垂直活动（rearing）得分，每次3min。
1.4 高效液相-电化学（HPLC-EC）技术与单胺类神经递质的检测
1.4.1 试剂
去甲肾上腺素酒石酸盐（NE）、5-羟色胺盐酸盐（5-HT）、3-甲氧基-4-羟基苯乙二醇（MHPG）、5-羟吲哚乙酸（5-HIAA）（以上为SIGMA公司产品），乙二胺－四乙酸二钠（EDTA）（分析纯，汕头金砂化工厂，批号：010304）、辛烷基磺酸钠（东京化成工业株式会社，批号：A87509A）、无水乙酸钠（分析纯，南京化学试剂厂，批号：971142）、柠檬酸（分析纯，上海荣润化工有限公司，批号：20010630）、二正丁胺（化学纯，中国常州市光明生物化学研究所，批号：960308）、高氯酸（分析纯，上海桃浦化工厂，批号：0710）、甲醇（一级品，高效液相色谱专用，江苏淮阴塑料制品厂精细化工研究所，批号：980512），实验用水为重蒸馏水。
1.4.2 仪器
高效液相色谱仪由岛津LC-10A系列组成，LC-10AD泵，SIL-10A自动进样器，进针深度35mm，样品注射速度5μl/s，CTO-10AVP柱温箱，温度18℃，压力为160Kgf/cm2。L-ECD-6A电化学检测器，CLASS-LC10 VER 1.63工作站。色谱柱为Lichrospher C18， 4.6mm×250mm，江苏汉邦科技有限公司生产。
1.4.3 流动相的配备［4］
流动相为乙酸钠(100mmol/L)－柠檬酸(85mmol/L)缓冲液，pH 3.7，内含0.4mmol/L二正丁胺，1.09mmol/L辛烷磺酸钠，0.2mmol/L EDTA，及18%甲醇，真空抽滤，超声脱气15min后使用。流速为0.5ml/min。
1.4.4 样品制备及测定
实验第42天（治疗21天）后，断头处死大鼠，快速取大脑组织，并置于冰皿上，按Glowinski法分离下丘脑［5］，称重后加入0℃～4℃高氯酸提取液330μl（含0.01%半胱氨酸和0.5mmol/L EDTA）以及内标溶液（DHBA0.006mg/ml）20μl，冰浴中匀浆，4℃高速离心(10000r/min)，取上清液注入HPLC-EC检测系统测定单胺类神经递质及其主要代谢产物的含量，进样量为20μl。用内标法定量，峰面积计算含量。共检测出2种单胺类神经递质，其洗脱顺序依次为：(1)去甲肾上腺素(NE)；(2) 5-羟色胺(5-HT)。
1.5 统计学方法
以均数加减标准误(x±s)表示，统计分析用SPSS12．0统计软件处理。
2 结果与分析
2.1 各组大鼠Open-Field法行为学测定结果
Open-Field法是测定抑郁症大鼠行为学的经典方法，分水平运动和垂直运动两个观察面，以观察得分为评分计算单位。各组大鼠的水平运动评分见表1，垂直运动评分见表2。表1 各组大鼠Open-Field法行为测定水平运动评分结果（略） 注：与正常对照组比，P＜0.05，P＜0.01；与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01表2 各组大鼠Open-Field法行为测定垂直运动评分结果（略） 注：与正常对照组比，P＜0.05，P＜0.01；与模型对照组比，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：（1）在造模结束时（实验第21天），与正常对照组比较，模型对照组以及各治疗组大鼠的水平和垂直运动明显降低（P＜0.01）；模型对照组与各治疗组大鼠的水平活动和垂直运动差异无显著性。（2）在治疗第7天（实验第28天）后，针刺组大鼠的行为学评分明显升高，与正常对照组已经无明显差异（P＞0.05）；药物治疗组与正常组大鼠行为学评分相比，尚存在明显差异（P＜0.01），与模型组行为学评分差异无显著性（P＞0.05）。（3）在治疗21天（实验第42天）后，针刺组和药物治疗组行为学评分与正常组大鼠已经差异无显著性（P＞0.05）；与模型对照组比较，水平运动和垂直运动差异有显著性（P＜0.01）。（4）在治疗21天后，针刺治疗组大鼠与氟西汀药物治疗组大鼠的行为学评分差异无显著性。
2.2 各组大鼠海马区单胺类神经递质的测定结果
应用高效液相电化学方法测定各组大鼠海马区内单胺类神经递质及其代谢产物的含量。我们在实验第42天，处死大鼠去大脑海马组织进行高效液相电化学检测，仅检测到海马区内5-HT和去甲肾上腺素的含量；5-HT的代谢产物5-HIAA和NE的代谢产物MHPG以及DA和它的代谢产物DOPAC，均没有检测到。5-HT和NE的含量见表3。表3 各组大鼠海马区单胺类神经递质的测定结果（略）注：与正常对照组比较，P＜0.05，P＜0.01；与模型对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01
结果表明：（1）与正常对照组相比，模型对照组大鼠海马5-HT和NE降低（P＜0.01）。（2）经过21天治疗，与模型对照组相比，药物氟西汀治疗组和针刺治疗组大鼠海马内5-HT和NE含量明显升高（P＜0.05，P＜0.01）；与正常对照组差异无显著性（P＞0.05）。（3）各组大鼠海马区内5-HT和NE的比值，差异无显著性（P＞0.05）。
3 讨论
关于抑郁症的病因和发病机制尚不确切。一般认为，本病的发生除了与心理－社会因素和遗传因素有关外，主要还由于患者脑内单胺类神经递质减少、相应受体的敏感性改变以及递质系统间失衡等因素有关。许多研究报告发现，抑郁症患者存在生物胺水平和(或)生物胺神经通路功能乃至结构的异常，而NE和5-HT被认为与情感障碍的发生关系最为密切；另一方面，NE和(或)5-HT再摄取抑制剂至今仍然是抗抑郁药的主体。其中，氟西汀是第一个选择性5-羟色胺再摄取抑制剂(SSRIs)，也是至今应用最广的抗抑郁药。研究资料表明［6］氟西汀有抑制神经元从突触间隙摄取5-HT、增加间隙中可供实际利用的5-HT，从而改善5-HT能神经元的功能状态而改善情感症状；同时，可以通过5-HT和NE能神经元之间的交互作用，影响和调节NE神经元功能、增加突触间隙NE含量而发挥抗抑郁作用。而另一方面，大脑内不同区域的功能存在差异，其中海马是边缘系统的重要组成部分，和情绪及动机的产生以及和脑的高级神经活动——学习记忆有关。海马还与额叶皮质、皮层下杏仁复合体、纹状核及下丘脑后部等有复杂的纤维联系；也是Papez情绪动机回路的一个重要环节［7］。应用核磁共振技术发现，与正常人相比，正在患抑郁症的患者左、右两个海马区的体积明显减小，直接提示了抑郁症与海马区的关系［8］。
针灸对抑郁症的治疗有确切的疗效。从我们的实验结果来看，针刺治疗可以显著地改善抑郁症模型大鼠的行为学异常，治疗21天时达到正常组大鼠的水平（P＞0.05），与氟西汀治疗相当（P＞0.05），而与模型对照组的水平运动和垂直运动评分存在明显的差异（P＜0.01）。但是从治疗过程来分析，针刺组大鼠的行为学评分首先得到改善，而且在治疗的第1周就已经与正常组大鼠差异无显著性。显现了针刺治疗抑郁症存在某种独特的机制，提示针刺治疗与药物（氟西汀）治疗在机制上可能存在明显的差异，针刺治疗有起效快的特点。本研究还提示，在深入探索针刺治疗抑郁症的神经生物学机制时，可能需要考虑观察的时间窗等因素，尤其是在治疗的早期和超早期。
我们的研究发现抑郁症模型大鼠海马区NE和5-HT含量降低，而通过21天治疗后，针刺组和氟西汀组海马区NE和5-HT的含量都升高，与模型对照组存在明显差异（P＜0.05，P＜0.01），而与正常对照组差异无显著性（P＞0.05），提示了针刺抗抑郁的作用与海马区、尤其是海马区NE和5-HT神经元功能改善有关。但是进一步的研究，还需要考虑海马区5-HT和NE等单胺类神经递质的动态变化规律，以及递质对应的受体功能和结构改变、受体之间交互作用等变化。
【参考文献】
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4 袁淑兰，阮金秀，杨晓敏. 双柱双泵高效液相色谱电化学检测器测定大鼠脑中生物胺及其代谢产物. 中国药理学与毒理学杂志，1990，4（1）：4－7．
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6 Wong DT， Bymaster FP， Engleman EA . Prozac (fluoxetine， Lilly 110140)， the first selective serotonin reuptake inhibitor and an antidepressant drug: twenty years since its first publication. Life Science，1995， 57: 411-441．
动物行为学方法范文3
【关键词】 乌灵菌、慢性轻度应激、抑郁模型、行为学
【中图分类号】 R971+.43【文献标识码】 B【文章编号】 1007-8517(2009)24-0150-01
乌灵菌(炭角菌科真菌黑柄炭角菌,Xylaria nigripes)是生长在土栖白蚁巢中的一种真菌的菌核。主要成分有蛋白质、多糖、无机元素、维生素、腺苷类及铁、锰、锡等微量元素。据四川《中药志》记载,乌灵菌具有利尿,补心神,治失眠、吐血及产后失血等药用价值[1]。为确认乌灵菌的药效,本实验采用正常小鼠及慢性轻度应激(chronic mild stress,CMS)小鼠抑郁模型,观察乌灵菌对其行为的影响。
1 材料与方法
1.1 动物 健康BALB/c雄性小鼠,健康CD1雄性小鼠,8周龄,体重21±2 g,购自中国医学科学院实验动物研究所。室温25±1(C,明暗各12h,自由摄食。
1.2 悬尾实验[3] 小鼠口服给药1周后,于末次灌胃给药后1h,将尾部用胶布固定在玻璃棒上,悬放入高于水面5cm处,让小鼠适应1min后,开始记录时间,记录小鼠在5min内不动的时间。
1.3 小鼠强迫游泳实验[3]小鼠口服给药1周后,于实验前16h禁食不禁水,于末次灌胃给药后1h进行实验。有机玻璃缸高30cm,直径18cm。水深10cm,水温23±2℃。小鼠放入水中游泳6min,使用秒表,记录最后4min内累计不动的时间。
1.4 慢性轻度应激模型制备及分组 健康BALB/c雄性小鼠熟悉环境3天后,分为对照组和慢性轻度应激组,其中应激组单独饲养,并实施慢性应激实验,采用以下应激源处理:1次16h饮水剥夺、2次5min游泳(30℃)、2次彻夜光照、1次悬尾30min、45度斜笼2次(1次7h,1次17h)、 1次17h空笼无垫料、1次17h湿笼(100ml)、2次14h食物剥夺、2次合笼(1次17h,1次2h)。上述应激源随机组合,每天实施两种[2]。2周后,对所有应激组小鼠先行2 %蔗糖饮水实验。然后根据动物单位体重蔗糖溶液饮用量,平均将应激组动物分为:慢性轻度应激(CMS)组(灌胃1%羧甲基纤维素溶媒)、乌灵菌高、中、低三个剂量治疗组(0.25、0.50、1.00 mg /kg)。继续慢性应激并给予药物干预共4周,最后进行行为学评价,包括蔗糖饮水实验、自发运动实验。
1.5 蔗糖饮水实验 先行禁食禁水3 h,饮水瓶内加入2 %蔗糖溶液,称取瓶重并记录。1 h后撤掉饮水瓶再次称重。前后差值为小鼠蔗糖溶液饮用量,并用动物体重加以校正。
1.6 自发运动实验 实验于每天13:00～18:00安静环境下进行。将直径90 cm的圆桶置于安静环境中,将小鼠置于同一出发点,观察记录5min内小鼠的自发运动情况。圆桶上方通过数码摄像头与计算机连接并使计算机成功追踪小鼠的活动轨迹,记录小鼠走动的路程及活动范围。实验过程中及时清理桶底动物粪便,减少气味等影响因素。
1.7 实验材料 乌灵菌粉(浙江佐力药业有限公司提供)。
1.8 统计学处理 数据用均数±标准误(mean± SE)表示,采用SPSS 11.0统计软件进行单因素方差分析(one-way ANOVA),以P
动物行为学方法范文4
【关键词】 脊神经选择性结扎； 镜像痛； 模型
【Abstract】 Objective：To study choice and establishment of mirror-image pain model of selective spinal nerve ligation （SNL） in rats through the behavior observation，paw withdrawal thermal latency（PWTL） and mechanical withdrawal threshold（MWT） test.Method：100male SD rats were randomly divided into the SNL group for 90 rats and the sham operation group（Sham group） for 10 rats.All rats were observed behaviors，detected PWTL and MWT at the 1 day before operation and the 1，3，7，14，21，28 day after operation.Result：There had no significant differences in behavioral observation，PWTL and MWT values between the two groups at the 1 day before operation（P>0.05）.Post-operation，SNL group’s operated-foot appeared hit feet，bite feet behavioral phenomenon，and the PWTL values and MWT values were significantly lower compared with Sham group at 1-28 d post-operation，the differences were statistically significant（P
【Key words】 Spinal nerve selective ligation； Mirror-image pain； Model
First-author’s address：Luohe Medical College，Luohe 462000，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2014.18.010
镜像痛是指当躯体某一组织和部位发生损伤后，导致损伤侧和对侧相应部位均出现疼痛和痛敏现象[1]。临床上一些复杂的区域疼痛综合征及慢性病理性疼痛等均可出现镜像痛[2]。临床治疗效果不佳，动物实验研究较少。目前对镜像痛模型的研究多集中在对坐骨神经损伤后建立神经病理性疼痛模型的基础上筛选镜像痛模型，但在筛选方法、筛选标准、筛选成功率方面鲜见报道。本实验在建立坐骨神经选择性结扎（SNL）神经病理性疼痛模型基础上进行筛选以建立镜像痛模型，为镜像痛的机制研究提供实验依据，现报告如下。
1 材料与方法
1.1 实验动物分组 选取100只成年SD大鼠（漯河医学高等专科学校实验动物中心），雄性，体重250～300 g，将其随机分为SNL组90只和假手术组（Sham组）10只，两组大鼠的一般资料比较差异均无统计学意义（P>0.05），具有可比性。
1.2 制作方法
1.2.1 坐骨神经选择性结扎模型组（SNL组） SNL组90只，制作方法如下：以氯胺酮10 mg/kg和甲苯噻嗪100 mg/kg腹膜腔注射，大鼠麻醉后取俯卧位，后用聚维酮碘溶液消毒皮肤，于背部脊椎L3～S2节段作正中切口，分离右侧脊柱旁肌肉群，显露脊椎并咬断L4～L6椎骨横突，仔细分离并暴露的L4～L6脊神经，于近脊柱正中处用5-0丝线结扎L5、L6脊神经，并于结扎远端进行神经离断，后分层缝合切口。
1.2.2 假手术组（Sham组） Sham组10只，仅右侧显露脊椎并咬断L4～L6椎骨横突，分离并暴露的L4～L6脊神经但不予结扎，其余方法同SNL组。
1.3 疼痛行为学及痛阈测定 用Von Frey纤毛测定大鼠的机械缩足反射阈值（mechanical withdrawal threshold，MWT）以评价大鼠机械痛敏，用热痛刺激仪测定大鼠热刺激缩足反射潜伏期（paw withdrawal thermal latency，PWTL）以评价大鼠热痛敏。每只大鼠均进行标号并在手术前1 d和术后1、3、7、14、21、28 d分别测定MWT、PWTL值，每次测量均先测定MWT，再测定PWTL，在测量前先观察其添足、咬足、曲足等行为且每次测量均在上午8：00～10：00之间进行。
1.3.1 MWT测定方法 采用von Frey丝测定双后肢机械痛阈，将大鼠置于金属笼中适应环境30 min，用不同压力纤维丝刺激足底2、3趾间皮肤，每根重复5次，每次间隔5 s，直至找到出现50%（10次）抬足反应的纤维丝，其压力值（出现大于5次以上是缩足反应），即为阈值，左右足轮流测试，每足测量5次，取平均值[3]。
1.3.2 PWTL测量方法 采用鼠爪热辐射刺激测痛仪[3]。先让大鼠处于自由活动状态，调整好刺激强度（r=72），将刺激装置放置在鼠爪下，按操作键，当鼠爪移动时系统自动记录大鼠反应时间，此时间即为大鼠足底PWTL，每足测量5次，时间间隔3～5 min，取平均值。
1.4 SNL镜像痛大鼠的筛选 实验结束后，对SNL组大鼠的实验记录进行分析，凡术后双足均出现行为学异常、PWTL值和MWT值降低的大鼠标记为SNL镜像痛组大鼠，其余为SNL非镜像痛组。
1.5 统计学处理 采用SPSS 13.0软件对所得数据进行统计分析，计量资料用（x±s）表示，比较采用t检验，以P
2 结果
2.1 行为学观察 SNL组与Sham组术前无特异，两组大鼠术后均出现舔舐伤口行为，SNL组大鼠行坐骨神经选择性结扎术后7 d内手术侧出现添足、咬足、垂足、脚趾并拢、屈曲等行为；SNL组7 d内对侧足也出现上述行为的定义为SNL镜像痛组大鼠，共筛查出14只，其余为SNL非镜像痛大鼠，共76只，对侧足未出现上述行为。
2.2 各组大鼠PWTL和MWT值的比较 各组术前PWTL和MWT值比较差异均无统计学意义（P>0.05），术后1～28 d，SNL镜像痛组和SNL非镜像痛组手术足PWTL和MWT值均明显低于Sham组，差异均有统计学意义（P
3 讨论
镜像痛在临床和动物实验中均较为普遍，表现为对侧肢体相应部位出现与患侧肢体相同的持续性疼痛、局限性疼痛、灼烧性痛、感觉异常、出汗等，如临床上复杂的区域疼痛综合征、截肢和中风后遗症等，加重患者负担，给患者带来极大痛苦[2]。
对于镜像痛的动物实验研究较早见于Zhang等[4]在2000年的单节段背根神经节慢性压迫实验中发现了镜像痛现象的报道。后关于镜像痛的报道陆续出现，Arguis等[5]发现在L5、L6脊神经结扎模型中，大鼠同侧和对侧后肢均出现机械刺激和冷刺激的痛觉异常。Schreiber等[6]在小鼠后足注射急性致炎物质角莱胶后，发现对侧后足出现了短暂延迟随后稳定持久的疼痛现象。
镜像痛模型的构建方面，周围神经损伤引起镜像痛的报道较多，如关节炎模型、癌症痛模型，但脊神经损伤模型最为多见，常见的脊神经损伤模型有坐骨神经慢性压迫模型（CCI）、脊神经选择性结扎模型（CNL）、脊神经选择性损伤模型（SNI）及脊神经背根神经节慢性压迫模型（CCD）等[7-12]。但在疼痛模型基础上如何筛选镜像痛模型的筛选方法、筛选标准、筛选成功率方面鲜见报道。
本实验在成功建立坐骨神经选择性结扎（SNL）神经病理性疼痛模型基础上，通过行为学观察和MWT及PWTL值进行筛选，以SNL组实验全程出现非手术侧足有上述特异性表现并与Sham组比较有统计学意义为依据建立SNL镜像痛模型。研究发现，SNL镜像痛模型组手术侧和非手术侧均出现添足、咬足等行为学现象和MWT及PWTL值降低，与Sham组相比机械刺激在术后14 d时出现明显差异（P
总之，本实验在成功建立大鼠SNL神经病理性疼痛模型的基础上通过行为学观察和MWT及PWTL值筛选镜像痛模型成功，为镜像痛的机制研究提供可靠的实验依据。
参考文献
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动物行为学方法范文5
[关键词]针刺疗法；穴组；慢性疲劳综合征；抗氧化
[中图分类号] R245.9 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2016）09（a）-0012-04
慢性疲劳综合征（chronic fatigue syndrome，CFS）是以持续或反复发作的严重疲劳为主要表现的一组证候群[1]。由于该病的临床表现及发病机制复杂，相对于西医学疗法，针灸可从整体上调节机体功能，在CFS治疗中具有明显优势。从目前针灸治疗CFS的研究现况来看[2-3]，大多数研究重点主要集中于针灸的起效机制和不同针灸疗法的疗效比较，缺少针对CFS基本病机的组穴研究。本实验选用对CFS具有较好治疗作用、符合CFS基本病机的“合谷、太冲”[4]为基础穴组，再配以CFS临床治疗中常用的“三阴交”或“足三里”[5]组成新的穴组，观察针刺各穴组对CFS小鼠的治疗效果，比较各穴组的作用差异，分析其配伍作用。
1材料与方法
1.1实验动物及分组
清洁级健康雄性昆明小鼠60只，4～6周龄，体重18～22 g，由大连医科大学实验动物中心提供，许可证号：SCXK（辽）2013-0003。饲养环境温度（24±1）℃，相对湿度（50±10）%，小鼠可自由饮水及进食。适应性饲养3 d后，按照完全随机原则将小鼠分为5组：正常组、模型组、“合谷、太冲”组、“合谷、太冲、三阴交”组、“合谷、太冲、足三里”组，每组12只。实验过程遵守国家科技部的《关于善待实验动物的指导性意见》。
1.2主要器材及试剂
小鼠游泳池（长60 cm×宽50 cm×高35 cm）；束缚筒（根据有关文献自制[6]，采用50 ml医用注射器改装，筒壁周围用锯条锯出多条宽1 mm的通气缝隙）；针灸针（0.16×7 mm，北京中研太和医疗器械有限公司）；小鼠束鼠器（北京翼诺泰科技发展有限公司）；悬尾实验架（根据有关文献自制[7-8]，将一木制横梁水平放置，两端固定，横梁距离平面30 cm，四周封闭以阻挡小鼠视线，顶端开放以利于实验观察）；小鼠旷场实验箱（根据有关文献自制[9]，长50 cm×宽50 cm×高40 cm，无上盖，内壁黑色，底面平分为25个方格）；数码摄像机（日本佳能公司）；丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-PX）测定试剂盒（南京建成生物工程研究所）。
1.3造模方法
采用慢性束缚+力竭游泳复合因素建立CFS动物模型[10]，造模因素每日施加1次，共12 d。上午束缚：将小鼠放入自制束缚筒内，用注射器活塞调节筒内空间大小，以小鼠呼吸不受限制又能产生束缚效果为度，束缚时间每3天循序加量1次，分别为1、1.5、2、2.5 h。下午游泳训练：将小鼠放入水温（26±2）℃的游泳池中进行游泳训练，水深30 cm，前3 d为适应性游泳，30 min/d，其后为力竭性游泳，以鼻尖沉入水中8 s不能浮出水面为力竭标准[11]。正常组不予造模，正常喂养。
1.4针刺方法
造模完成后，将小鼠固定于束鼠器内，各针刺组分别针刺“合谷、太冲”穴，“合谷、太冲、三阴交”穴，“合谷、太冲、足三里”穴，参照《实验针灸学》[12]定位相应腧穴，双侧取穴，留针10 min，其间行针1次，施以平补平泻捻转手法，手法操作2 min，1次/d，共7 d。正常组与模型组仅给予相同时间和相同方式的固定，不予针刺。
1.5行为学观察指标
各组小鼠治疗后进行以下行为学测试。
1.5.1悬尾实验 将鼠尾末端1 cm的部分用医用输液胶布固定在悬尾实验架的木质横梁上，使小鼠呈倒悬状态，用摄相机记录小鼠5 min内的活动状态[7]，统计悬尾不动时间。
1.5.2旷场实验 将小鼠放入旷场实验箱底面的中央格内，以四只爪子进入一格记为水平运动1分，两只前爪腾空或攀附箱壁记为垂直运动1分，用摄像机记录5 min内的小鼠行为状况，统计运动得分[9]。
1.6血清抗氧化指标检测
行为学观察结束后，摘小鼠眼球取血，分离取上层血清，置于-20°冰箱保存备测。严格按照试剂盒说明检测血清MDA含量及SOD、GSH-PX活性。
1.7统计学方法
采用SPSS 17.0软件对数据进行分析，符合正态分布的计量数据以均数±标准差（x±s）表示。采用单因素方差分析进行组间比较，用LSD和SNK法进行两两比较，以P
动物行为学方法范文6
1.广州中医药大学第一临床医学院，广东广州 510006；2.广州市中医院，广东广州 510030；
3.广州中医药大学第一附属医院，广东广州 510400
[摘要] 目的 探究低剂量助孕丸、高剂量助孕丸和达芙通对肾虚型自然流产模型大鼠其子代生长发育及行为学的影响。 方法将14只SPF级母鼠随机分成5组，模型组、低剂量助孕丸组、高剂量助孕丸组、达芙通组、空白组，繁殖出子代小鼠，记录子鼠第1、7、13、19天的体重并绘制出生长曲线图，观测初生子鼠翻身试验、3周时平行爬杆实验爬行距离及跌落次数。结果 ①不同干预组对子鼠D7、D13、D19的体重影响差异有统计学意义（P<0.01），②不同干预组对子鼠初生翻身试验的影响差异无统计学意义（P>0.05），③不同干预组对子鼠平行爬杆实验爬行距离、跌落次数的影响差异有统计学意义（P<0.01）。结论 肾虚型自然流产模型大鼠对其子代的体重、平行爬杆距离及跌落次数均有影响，达芙通、助孕丸能对该类子鼠的体重、平行爬杆距离及跌落次数产生积极的影响，助孕丸的影响与其剂量有关，达芙通、助孕丸对子鼠生长发育的影响会随着子鼠的生长而改变。
关键词 肾虚型自然流产模型；子代生长发育；子代行为学
[中图分类号] R114[文献标识码] A[文章编号] 1674-0742（2014）07（a）－0041-02
[基金项目] 广东省普通高校“中医女性生殖调节与安全性研究”重点实验室开放基金（K5101017）。
[作者简介] 赵静（1988.8-），女，浙江上虞人，硕士，医师，研究方向：生殖健康与生殖障碍的中医药研究。
[通讯作者] 曾蕾，女，博士，主治医师，研究方向：生殖健康与生殖障碍的中医药研究，邮箱：winnalei@hotmail.com。
目前，大量的研究证实，母鼠妊娠期间暴露于一些特殊环境，接触一些特殊物质，会对其子代生长发育及行为学产生影响。如刘艳华等[1]、刘婉华等[2]、丁淑瑾等[3]等均证实了这一点。基于以上认识，该研究2011—2013年从中医角度，肾虚型自然流产模型大鼠进行不同干预处理，从而观察其子代生长发育及行为学的影响，现报道如下。
1资料与方法
1.1一般资料
羟基脲（规格：10 mg×20片/盒，国药准字：H37021289）；助孕丸（规格：36 g/瓶；达芙通地屈孕酮片，规格：10 mg×20片/盒，批准文号：H20090470）。
1.2动物
SPF级雄性SD大鼠5只，购自中山大学实验动物中心，合格证号：0112829；SPF级雌性SD大鼠14只，购自广东省医学实验动物中心，合格证号：0116331；饲养于广州中医药大学第一附属医院SPF级实验中心，检疫合格后于标准条件（22~25 ℃，14 h照明）下饲养。
2方法
2.1分组
按随机数字表将雌性大鼠分为5组，模型组（3只）、低剂量助孕丸组（3只）、高剂量助孕丸组（3只）、达芙通组（3只），空白组（2只）。
2.2确定妊娠
将雌鼠与雄鼠按2∶1的比例于每晚7点至次日早上7点合笼，第2天7：30—8：30行阴道涂片检查，以涂片中发现大量确定为妊娠第1天。连续合笼7 d未见大量则停止合笼，14 d后再次合笼。
2.3造模模型组
妊娠第2~8天早上9点以羟基脲450 mg/（kg·d）灌胃，下午4点以生理盐水灌胃；低剂量助孕丸组：妊娠第2~8天上午以羟基脲450 mg/（kg·d）灌胃，下午4点以助孕丸3号浓缩干粉3.54 g/（kg·d）（成人等效剂量）灌胃；高剂量助孕丸组：妊娠第2~8天早上8点以羟基脲450 mg/（kg·d）灌胃，下午4点以助孕丸3号浓缩干粉7.08 g/（kg·d）（成人等效剂量2倍）灌胃；达芙通组：妊娠第2~8天早上8点以羟基脲450 mg/（kg·d）灌胃，下午4点以达芙通3 mg/（kg·d）灌胃；空白组：妊娠第2~8天早上8点及下午4点均以生理盐水450 mg/（kg·d）灌胃。
造模完成后妊娠母鼠于孕18 d独立分笼，于孕（21±2）d产下子鼠，产下子鼠当天确定为出生第1天。
2.4指标监测
①母鼠怀孕及产子情况；②子鼠体重：对子鼠出生第1、7、13、19天分别称重；③初生鼠翻身实验：对子代初生鼠于当天做翻身实验，方法是将初生鼠四脚朝天，背于实验台，观察在10 s内能翻身者，四脚着地者为翻身成功，否则为失败；④平行爬杆距离及跌落次数：将3周子鼠置于直径约2 cm 的钢管上，用秒表计算1 min内爬行距离及跌落次数。
2.5统计方法
所有计量数据均以（x±s）表示，运用spss15.0统计软件对数据进行分析，组间比较采用ANOVA分析。
3实验结果
3.1不同干预组产子情况
模型组产子（7.50±0.500），低剂量助孕丸组（12.00±1.000），高剂量助孕丸组（10.00±1.000），达芙通组（5.00±1.000），空白组（9.00±0.000）。
3.2子鼠体重
经统计，不同干预组子鼠在D1平均体重差异无统计学意义（P=0.500 ＞0.05），D7、D13、D19差异有统计学意义。与模型组比较，D7，达芙通组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.003＜0.01），空白组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.002＜0.01），D13，空白组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.006＜0.01），达芙通组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.000＜0.01），D19，空白组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.005＜0.01），高剂量助孕丸组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.030＜0.05），达芙通组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.000＜0.01）。与空白组相比较，D7，空白组高于模型组，差异有统计学意义（P=0.002＜0.01），空白组高于高助孕丸组，差异有统计学意义（P=0.001＜0.01）；D13，达芙通组高于空白组，差异有统计学意义（P=0.000＜0.01），高助孕丸组高于空白组，差异有统计学意义（P=0.000 ＜0.01），低助孕丸组高于空白组（P=0.001 ＜0.01），D19，达芙通组高于空白组，差异有统计学意义（P=0.001 ＜0.01），空白组高于低剂量助孕丸组，差异有统计学意义（P=0.001 ＜0.01）。见表1。
表1 不同干预组子鼠各时间点平均体重[g，（x±s）]
3.3子鼠行为学实验及比较
3.3.1初生鼠翻身实验成功率：模型组（0.60±0.507），低剂量助孕丸组（0.52±0.511），高剂量助孕丸组（0.78±0.411），达芙通组（0.00±0.000），空白组（0.44±0.527）。经统计，差异有统计学意义（F=2.237，P=0.076），不同干预组初生翻身实验结果无显著差异。
3.3.2子鼠平行爬杆实验爬行距离模型组（35.00±25.386），低剂量助孕丸组（67.86±42.416），高剂量助孕丸组（32.44±19.648），达芙通组（122.40±38.017），空白组（86.67±43.116）。经统计，差异有统计学意义（F=8.380，P=0.000），不同干预组平行爬杆实验爬行距离有显著差异。达芙通组高于模型组（P=0.000），空白组高于模型组（P=0.001），低剂量助孕丸组高于模型组（P=0.008），空白组高于高剂量助孕丸组（P=0.002）。
3.3.3子鼠平行爬杆实验跌落次数模型组（2.33±1.345），低剂量助孕丸组（1.61±1.469），高剂量助孕丸组（1.33±1.323），达芙通组（0.00±0.000），空白组（0.11±0.333）。经统计，差异有统计学意义（F=6.203，P=0.000），不同干预组平行爬杆实验跌落次数有显著性差异。空白组低于模型组（P=0.000），达芙通组低于模型组（P=0.001），空白组低于低剂量助孕丸组（P=0.004）。
3讨论
体重是反映子鼠生理变化的基本指标，而初生翻身试验、平行爬杆距离、跌落次数是反映子鼠行为症状的基本指标[4]。这些指标一起可以用来评价子鼠生长发育及行为学的情况。邢志强[5]、丁瑜等[6]、张婧等[7]、李学伟[8]的实验发现母鼠妊娠期暴露于一些特殊的物质，如：氟西汀、邻苯二甲酸、双酚A、氰戊菊酯、会对子鼠的行为学产生影响。张先庚等[9]的实验发现优裕环境母鼠胎教可以增加子鼠的体重、身长，从而促进子鼠的生长发育；母代的地震恐惧影响可以遗传到子代，并降低体重和身长，延缓子代的生长发育：金匮肾气丸可纠正地震恐惧导致的子鼠发育迟缓。王米渠等[10]通过猫吓孕鼠造模“恐伤肾”的实验方法，对第二代初生鼠、青年鼠、成年鼠的诸种行为遗传测试，其结果表明受惊恐的子代鼠在“作强”（体力、心力、性力）行为的活动水平降低。
该实验以罗颂平教授研究团队病证结合肾虚型先兆流产模型为基础，探索不同干预方法对其子代行为学的影响。该实验的结果提示：母鼠肾虚会影响到子鼠生长发育及行为学，达芙通、助孕丸能对肾虚型母鼠产下的子鼠的生长发育和行为学起到积极的作用，这一点与其他实验结果相同，但助孕丸的剂量仍需斟酌。该实验未从细胞学、分子生物学、免疫学等角度进入深入研究探讨分析，这一点也是作者将来进一步研究的方向。
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