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分子生物学进展范文1
【关键词】龋病；牙菌斑；口腔细菌；代谢产碱
【中图分类号】R780.2
【文献标志码】A
牙菌斑生物膜是定植于牙表面的微生物群落，其与宿主防御之间存在着动态平衡，且与定植部位相适应。牙菌斑生物膜的细菌组成和代谢与龋病和牙周病关系密切。牙菌斑生物膜中糖源物质的摄入，致变异链球菌和乳杆菌等菌群产酸和耐酸菌并过度生长形成优势菌群，牙菌斑内pH迅速下降至临界值，从而引起牙齿脱矿。过去普遍认为，细菌产酸是龋病发生的直接原因。有学者认为，牙菌斑生物膜中耐酸菌比例的增加和口腔非耐酸性益生菌比例的减少是导致龋病的重要原因。当下的研究却发现，大部分的口腔益生菌都具有精氨酸脱亚氨酶系统（arginine deiminase system，ADS）或者尿素酶系统，可利用精氨酸或尿素为底物产碱，细菌代谢产碱可积极地调控牙齿脱矿与再矿化之间的平衡，阻止产酸和耐酸菌形成优势菌群，从而防止致龋性牙菌斑生物膜的形成。
研究显示，龋病与口腔微生物的产碱能力降低密切相关，调控牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱的能力可作为一种有潜在应用前景的防龋策略。随着细菌代谢产碱的能力与龋病呈负相关性的结论不断地得以证实，越来越多的研究者开始关注牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱的细菌学和分子生物学等基础和临床研究。本综述着重介绍口腔细菌代谢产碱的分子生物学研究进展，为未来的研究方向提供线索。
1 生物膜中细菌代谢产碱的主要途径
牙菌斑生物膜中细菌代谢产碱最主要的两大途径包括尿素酶和ADS。尿素在健康人群口腔中的浓度为3～10mmol·L-1，主要来源于唾液和龈沟液。尿素在口腔中可以被细菌尿素酶迅速分解并产生氨、二氧化碳和水。具有尿素酶活性的细菌包括唾液链球菌和内氏放线菌以及口腔嗜血菌属等。相对于尿素，精氨酸在口腔中的平均浓度仅为50μmol·L-1。精氨酸可以被细菌ADS分解代谢为鸟氨酸、氨、二氧化碳和腺苷三磷酸（adenosine triphosphate，ATP）。与尿素分解代谢不同的是，精氨酸代谢还为细菌提供了ATP，因此赋予了细菌额外的生长能量优势。多种口腔微生物均具有ADS，包括血链球菌、格氏链球菌和副血链球菌以及某些种类的乳杆菌属细菌和螺旋体。
精胺代谢是口腔中的另一条碱代谢途径。与尿素和精氨酸代谢相比较，精胺代谢酶活性较弱。精胺是精氨酸在细菌精氨酸脱羧酶作用下产生的中间代谢产物，也可来源于一些食物。精胺在牙菌斑生物膜和唾液中的浓度分别为0.75和0.2mol·L-1。精胺在细菌鲱精氨酸脱亚氨酶系统（agmatine deiminase system，AgDS）的作用下产生腐胺、氨、二氧化碳和ATP。该系统与ADS具有高度同源性。基因组分析和功能研究表明，AgDS存在于包括变异链球菌、表兄链球菌、汗毛链球菌、大鼠链球菌、链球菌、缓症链球菌和仓鼠链球菌以及唾液乳杆菌和短乳杆菌在内的众多口腔细菌中，其中大量的细菌与龋病密切相关。目前在所有具有AgDS的细菌中，仅大鼠链球菌、血链球菌和唾液链球菌等益生菌同时具有ADS和尿素酶系统。
2 生物膜中细菌代谢产碱与龋病的关系
有报道称，慢性肾功能衰竭患者唾液中的尿素水平较健康人高50倍，即使高糖饮食，其患龋率明显低于健康人群。Nascimento等发现：无龋人群的牙菌斑整体碱活性明显高于龋活跃人群；成年人非龋易患者唾液中的尿素酶活性是龋易患者的3～5倍，牙菌斑中的精氨酸脱亚氨酶活性是龋易患者的2倍。有报道称，儿童非龋易患者的牙菌斑尿素酶活性是龋易患者的2倍，唾液尿素酶活性是龋易患者的3倍，而且牙菌斑精氨酸活性是龋易患者的2倍。还有报道称，在牙膏或漱口液中加入精氨酸类化合物可降低人群的龋失补牙指数。上述研究均表明，牙菌斑生物膜中的细菌代谢产碱水平与龋病的发生呈负相关性。
3 生物膜中细菌代谢产碱的分子生物学研究
3.1尿素酶
口腔细菌代谢产碱途径的分子生物学研究最早开始于尿素酶，以前的综述中已经有详细的介绍。尿素酶是一种含镍的低聚物酶，编码尿素酶的7个基因排列成操纵子结构，ureC、A、B基因翻译产生α、β和γ三个亚基组成（αβγ）3结构，ureDEFG编码的辅助蛋白用于镍离子的整合和酶的激活。在有关口腔细菌尿素酶的研究中，唾液链球菌和内氏放线菌尿素酶的生物学特性及其基因表达调控的研究最为深入。这两种细菌的尿素酶有许多相似之处，均受多种环境因素的影响。以内氏放线菌为例，其尿素酶的活性在酸性环境下和有大量糖类物底物时增强，同时其酶活性也依赖于环境中氮源底物的量。值得注意的是，这些因素均与龋病密切相关；因此，Burne等提出当宿主处于患龋高风险时，唾液链球菌和内氏放线菌的尿素酶能够为防止龋病的发生发挥积极的作用。
3.2精氨酸脱亚氨酶系统
原核生物中广泛存在着ADS，该系统酶具有保守的一级结构。编码ADS的多个基因通常排列组成操纵子结构，但是其基因的排列顺序在不同的细菌间存在着差异。arcA基因负责编码精氨酸脱亚氨酶，这种酶可水解精氨酸生成瓜氨酸和氨。arcB基因编码一种分解代谢性鸟氨酸氨甲酰基转移酶，可将瓜氨酸转化为鸟氨酸和氨甲酰磷酸。位于arcB基因下游的arcC基因编码一种分解代谢性的氨甲酸酯激酶，后者可将氨甲酰磷酸的一个磷酸基团转移给腺苷二磷酸，从而生成ATP、二氧化碳和氨。此外，许多具有ADS的细菌，其操纵子中还存在一种编码精氨酸和鸟氨酸反向转运蛋白的arcD基因；精氨酸氨肽酶和相关转录调控子也是由ads基因簇中的基因编码。在具有ADS的细菌中，格氏链球菌是唯一由精氨酸脱亚氨酶arc操纵子与queA基因相连并共转录的细菌，这种基因被预测编码一种修饰tRNA的S－腺苷甲硫氨酸：tRNA核糖转移酶异构酶，后者与ADS转录调控子arcR共转录。
目前，已有众多关于口腔链球菌和非口腔细菌ads基因调控机制的研究报道。在口腔细菌中，ads基因的组成和调控研究主要集中在格氏链球菌、血链球菌和大鼠链球菌。虽然，ADS在不同细菌中的表达均受到多种环境因素的调控，如pH值、糖源、氧分压和精氨酸等，但是细菌间调控模式和机制却不完全相同。以格氏链球菌为例，其ADS主要受精氨酸和低pH值诱导，但是碳源性分解代谢物阻遏和高氧分压对精氨酸脱亚氨酶活性可产生抑制。这些环境因素对ADS的调控主要作用在转录水平，环境因素的调控作用主要通过多种调控蛋白质和多个双组分系统的交叉协同作用来实现。精氨酸对ADS arc基因转录的诱导作用主要通过ArcR进行调控；酸性环境诱导arc基因转录主要通过ArcR以及VicRK、CiaRH和ComDE的共同作用；碳源性分解代谢物对ADS的阻遏作用，则是通过宏观调控碳代谢蛋白质（carbon catabolite protein A，Ccp-A）实现的；高氧分压的环境信号则通过Fnr样蛋白Flp与双组分系统VicRK的协同作用，实现对精氨酸脱亚氨酶转录的抑制。此外，QueA对arc基因转录的影响整体表现为抑制作用，可能与影响了ads基因或其调控基因的转录效率有关。细菌间相互作用，如格氏链球菌在与内氏放线菌细胞共聚集的状态下，细菌内源性精氨酸的生物合成被激活，也可导致ADS的活性增强。
3.3鲱精氨酸脱亚氨酶系统
AgDS并非如ADS那样在微生物细胞中广泛存在。除部分口腔细菌以外，目前只在粪肠球菌、铜绿假单胞菌、蜡状芽孢杆菌、希氏乳杆菌和幽门螺杆菌等少数几种细菌中发现了AgDS。与ADS一样，AgDS的基因也通常以aguBDAC操纵子的形式排列。精胺依靠一种精胺－腐胺反向转运蛋白D（agmatine-putrescine antiporter D，AguD）进入细胞，并在aguA基因编码的鲱精氨酸脱亚氨酶作用下水解为N－氨甲酰腐胺和氨，而N－氨甲酰腐胺又经aguB基因编码的腐胺氨甲酰基转移酶代谢生成腐胺和氨甲酰磷酸。最终，aguC基因编码的氨甲酸酯激酶将氨甲酰磷酸的一个磷酸基团转移给腺苷二磷酸，从而生成ATP、二氧化碳和氨。腐胺可以在反向转运蛋白作用下交换细胞外的精胺。agu基因的转录调控子由位于agu操纵子上游相反方向的aguR基因编码。
尽管AgDS的活性在口腔链球菌中存在着较大的差异，但其总体活性明显低于细菌ADS和尿素酶系统；尽管在变异链球菌和大鼠链球菌中检测到的AgDS与ADS的活性相似，但仓鼠链球菌和表兄链球菌AgDS却较其ADS的活性低50倍以上。在所有口腔细菌的AgDS活性当中，关于变异链球菌AgDS的研究最为深入细致，变异链球菌AgDS对细菌生长及耐受环境压力有着重要的意义。研究显示，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶缺陷株的生长速度明显慢于野生株。Burne等也曾报道，当变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶活性表达受到抑制时，其耐受酸、氧气和超氧化物的能力明显降低。
变异链球菌AgDS的活性表达受到细菌生长和多种环境因素的影响，其影响主要作用于细菌鲱精氨酸脱亚氨酶的转录水平。变异链球菌AgDS的表达同时依赖外源性底物精胺的供给。在仅有10mmol·L-1外源性精胺供给的情况下，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达可增高5倍。外环境pH值也是影响变异链球菌精胺脱亚氨酶表达的重要因素之一。刘娅玲等利用口腔恒化器模型研究发现，在pH5.5的酸性环境下，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达水平是pH7.0的中性环境下酶活性的3倍；同时，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达水平与细菌生长环境中的氧分压密不可分。氧气对变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的表达具有明显的抑制作用，当变异链球菌在无氧条件下培养时，其鲱精氨酸脱亚氨酶的表达是有氧培养条件下的3倍。
变异链球菌的AgDS活性依赖于细菌的生长周期，变异链球菌的AgDS在细菌对数生长早期表达较低；随着细菌进入对数生长中期，其酶活性表达逐渐增高；当细菌生长到达静止期时，其酶活性表达最高。此外，热刺激效应也可促进变异链球菌的AgDS活性表达。变异链球菌在44℃的条件下生长，其AgDS的活性表达是37℃条件下的2倍。变异链球菌AgDS的基因表达亦受到碳源性分解代谢产物的抑制。作为典型的抑制性糖源，葡萄糖对变异链球菌的AgDS具有较强的抑制作用；而当半乳糖作为糖源时，变异链球菌鲱精氨酸脱亚氨酶的活性是葡萄糖作为糖源培养条件下的5倍。
在变异链球菌中，众多环境因素对AgDS的调节作用是通过多种调控通路的交叉以及多种调控蛋白质的交互作用来完成的。研究显示，AguR作为agu操纵子的主要调控蛋白质，参与低pH和底物精胺对AgDS的调控作用。刘娅玲等发现：AguR是一种位于变异链球菌细胞膜中的跨膜蛋白质，包括4个跨膜结构域，蛋白质C-末端可能位于细胞内；AguR蛋白在激活时会产生变构裂解，最终与agu操纵子结合启动agu的转录。除此之外，AguR调控蛋白与AguD精胺转运蛋白的相互作用是调控agu转录的关键。在低pH值和精胺存在的条件下，AguR调控蛋白可与AguD精胺转运蛋白发生交互作用，从而诱导AgDS的表达。AguR与精胺结合导致AguR的变构激活，从而促进AguR与其靶标agu操纵子结合。酸性环境有利于AguR形成合适的蛋白质构型，使其对靶DNA的信号转导更加高效。在缺乏外源性精胺的情况下，AguR与AguD的相互作用可能会阻止AguR与其底物或靶标的结合。该项研究结果对阐明AgDS的调节机制具有重要意义。除AguR和AguD以外，其他多种宏观调控蛋白和双组分系统也都同时参与了对变异链球菌AgDS的调控作用。CcpA和CcpB作为主要的碳源性分解代谢物阻遏调控蛋白，是不同碳源底物调节AgDS转录的主要调控蛋白。包括CiaRH、ComDE和VicRK在内的多个双组分系统都共同参与了低pH条件下AgDS的诱导，而且CiaRH同时也是变异链球菌感受外界热刺激效应下AgDS优化表达的重要调控因子。目前，虽然有研究例证实双组分系统之间存在交叉调控和串话现象，但外界环境信号是通过怎样的具体途径传导诱导AgDS表达仍需深入研究。
分子生物学进展范文2
[关键词] 早期宫颈癌；复发；分子生物学
[中图分类号] R737.33 [文献标识码] A [文章编号] 2095-0616（2013）10-39-03
宫颈癌是女性最常见的生殖道恶性肿瘤。宫颈癌死亡率每年大约26万，其中80%发生在发展中国家，HPV16和18是最常见的两种致宫颈癌的病毒，70%的宫颈癌由这两种病毒引起[1]。近年来采用阴道脱落细胞图片检查的普及，使不少宫颈癌患者能早期发现、早期治疗，提高了患者的生存期。但临床发现宫颈癌年轻化倾向明显，25～54岁人群发病率不降反升[2]。导致早期宫颈癌复发的因素较多，许多国内外学者对早期宫颈癌的各方面进行了大量的研究分析，得出了很多与早期宫颈癌复发有关的原因。本资料通过对国内外最近五年相关文献资料的研究学习，总结导致早期宫颈癌复发的分子生物学因素。
1 宫颈上皮细胞间质转化
大量的研究表明宫颈上皮细胞间质转化（EMT）与宫颈癌的形成和转移复发有密切关系。
1.1 上皮细胞间质转化（EMT）
正常的上皮细胞靠专门的细胞间粘附力紧密连接在一起，而且具有顶-基底极性。间质细胞形似纺锤体，连接松散，流动性强，具有前-后极性。上皮细胞通过复杂的程序转变成间质细胞的过程称为上皮细胞间质转化。上皮细胞转变为间质细胞后会失去原来的特性，中间会形成一种亚稳定的细胞既有上皮细胞又有间质细胞的特性，这是一种很多肿瘤都有的过程[3]。上皮细胞间质转化有3种类型，其中第3型存在于肿瘤的侵袭与转移中[4]。宫颈上皮细胞通过EMT过程，形成上皮样的癌细胞失去极性，不稳定，但是还具有上皮细胞的其他特性，经恶化和分化形成具有转移、侵袭能力的癌细胞。癌细胞离开原始位置，侵入基底膜下，侵入血管和淋巴管随血液转移到另一个地方形成转移灶。在这过程中，还有以下因素参与，干细胞机制[5]、抗吞噬作用[6]、免疫逃避、药物抗性等。
1.2 EMT的分子生物学
上皮细胞间质转化的标志性分子变化主要有：（1）E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的下调。E-钙粘蛋白和β-连环蛋白的下调与早期宫颈癌的组织学分化、转移和复发成正相关[7]。（2）N-钙粘着糖蛋白、纤维连接蛋白以及波形蛋白的上调表达。波形蛋白的上调表达与早期宫颈癌的转移、复发成正相关[7]。（3）Rho GTP酶介导的细胞骨架重排。RhoC在正常宫颈组织、CIN 组织和宫颈癌组织中的表达逐渐增高，在有淋巴结转移的宫颈癌组织中的表达明显高于无淋巴结转移组织，同时RhoC的沉默可以明显降低SiHa细胞的体外粘附能力和侵袭、迁移能力[8]。（4）调控EMT的基因转录因子的上调和易位，如Twist1、Twist2、Snail、Slug、Six1等。Twist1、Twist2和E47抑制E-钙粘蛋白的表达以及调节其它基因功能诱导EMT过程[9]。
1.3 EMT的信号通路
上皮间质转化的信号通路有转化生长因子（TGF-β）通路、Wnt通路、Notch通路、NF-κβ通路等。这些通路相互作用，共同调节EMT的过程[10]。
1.3.1 TGF-β信号通路 TGF-β是一组具有广泛生物活性的多肽，哺乳动物中有三种亚型TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3，其中TGF-β1是TGF-β相关的致瘤作用研究的重点，TGF-β1在肿瘤细胞中是上调的[11]。TGF-β通过细胞膜表面具有丝氨酸/苏氨酸激酶活性的TβR Ⅰ和TβR Ⅱ结合形成复合物。TβR Ⅰ有ALK1/TSR-1、ALK1/TSK7L、ALK5/TβRⅠ 3种受体，TβR Ⅱ只有一种受体。TGF-β与TβR Ⅱ结合形成复合物使TβR Ⅰ磷酸化，随之smads被磷酸化，诱导该复合物进入细胞核；这一信号通路受到干扰发生异常，与肿瘤的发生有重要关系[12]。与TGF-β信号通路影响细胞核内转录的因子有smad、Ras、Rho、TAK1、PP2A、β-catenin 以及NF-κβ、ATF2等。Smad7和TGF-β1与宫颈癌的发生发展、临床分期、侵润和淋巴结转移相关[13]。Stephanie等[14]的研究发现TGF-β信号通路在EMT过程中起着重要作用，从而导致癌细胞具有侵袭和转移能力。Iancu等[15]研究TGF-β通路在HPV诱导的宫颈癌中发现TGF-β通路的破坏与宫颈恶性进展有很大关系；在宫颈上皮样瘤变到宫颈癌的过程中TGF-β1表达减少；同时TGF-β1受体基因表达也下降。
1.3.2 Wnt信号通路 Wnt信号通路有经典的Wnt信号通路、Wnt/ca+通路、Wnt/PCP通路，其中经典通路最重要，通过β-catenin激活基因转录；其机理概括为WntFzdDshβ-catenin降解复合体解聚β-catenin入核TCF/LEF基因转录[16]。参与Wnt信号通路的蛋白有Frizzled、Dishevelled、Gsk3β、CK1、APC、β-catenin等。Wnt信号通路受到刺激后，APC基因突变使β-catenin降解复合物合成障碍，以及β-catenin基因突变使β-catenin不能被磷酸化和泛素化降解，从而使β-catenin降解障碍，胞浆内游离的β-catenin聚集，进入核内激活Cyclin D1、C-myc等基因转录，导致肿瘤发生。细胞核的Survivin、Cyclin D1受Wnt通路的激活[17]，影响宫颈癌的复发和转移。Survivin、P21、Cyclin D1蛋白对早期宫颈癌复发的影响中发现，三者在早期宫颈癌中的表达明显升高，并且三者共表达时与临床分期、病理分级有关；Survivin、Cyclin D1表达与早期宫颈癌复发有关，二者共同表达与盆腔淋巴结转移有关[18]。
1.3.3 Notch信号通路 Notch信号通路是肿瘤血管生成和转移的一个关键因素[19]。Notch信号通路由Notch、Notch配体（Jagged）、受体等组成，其中配体有Delta-like1、3、4，Jagged1、2，CSL，受体有Notch1、2、3、4，Notch信号通路在不同的肿瘤以及不同的阶段作用不同。Notch信号通路概括为DeltaNotch酶切ICN细胞核CLS/ICN复合体基因转录[19]。Notch1中有Notch1-RBP-Jκ路径、Notch1-PI3K-PKB-Akt路径、Notch1-IKK-NF-κB路径共同相互影响宫颈癌的发生发展[20]。Bajaj等[21]研究发现CD66+细胞中Notch信号通路对宫颈癌有重要作用。免疫组织化学分析显示Notch3在宫颈鳞癌中过度表达，Notch阳性表达的宫颈癌患者比阴性表达的患者的生存率小[22]。
1.3.4 NF-κB信号通路 基本的NF-κB信号通路包括受体、受体近端信号衔接蛋白、IκB 激酶复合物、IκB 蛋白和NF-κB二聚体。受到刺激后IκB 激酶复合物被激活，IκB 蛋白磷酸化和泛素化，IκB 蛋白被降解，NF-κB二聚体释放修饰后进入细胞核内，进行基因转录。NF-κB一般情况下位于细胞胞浆内，由两个功能亚单位P65和P50组成，与其抑制因子IκB-α和IκKB-β结合在一起。宫颈癌中IκB-α的去磷酸化使IκB-α减少，从而NF-κB的P65进入细胞核内[23]，参与细胞核内基因的表达调控。NF-κB激活对肿瘤的促进作用主要有：（1）①NF-κB激活对宫颈癌的转移有明显促进作用[24]；（2）NF-κB的GADD45α和γ表达下调使肿瘤细胞逃避凋亡；（3）NF-κB上调Cyclin D1等，促进肿瘤细胞生长。NF-κB的P65和c-IAP2的过度表达和caspase-3的下调，是宫颈癌发生发展的重要因素[24]。
2 小结
目前国内外对早期宫颈癌治疗后复发的因素研究较多，都认为复发是由于多方面、多路径的因素共同作用的结果。发现复发转移的关键因素，提高患者的生存率，减轻患者的痛苦是有必要的。除EMT、VEGF信号通路、notch信号通路等，是否可以发现更多关键的分子生物学层面的相关因素，使早期宫颈癌能更早的发现，得到早期治疗，阻断关键的分子生物路径，减少复发率。
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分子生物学进展范文3
【关键词】 中药； 多药耐药； 分子生物学
目前，化疗是治疗恶性肿瘤的主要手段之一，而在化疗过程中易产生肿瘤的多药耐药，大大降低了其疗效。因此，如何解决多药耐药就成为了提高化疗疗效，改善患者生活质量的关键问题。多药耐药(multidrug resistance，MDR)是一个多基因参与的过程，涉及多种耐药相关蛋白［1］。不同肿瘤具有不同的耐药表型，可以是某种耐药基因表达，也可能是多种耐药基因同时表达的结果，而由于中药的多靶点作用，其可通过作用于多个耐药相关蛋白达到逆转多药耐药的作用。目前，中药抗多药耐药的作用研究已深入到分子水平。本文概述近年来中药在逆转多药耐药的分子水平的研究进展。
1 肿瘤多药耐药经典途径
P-gp蛋白介导的多药耐药是研究最多，机制最为明确的多药耐药产生途径，因此被称为多药耐药的经典途径。由MDR1基因编码的P-gp蛋白ATP依赖性的药物泵，其是通过水解ATP提供的能量，将进入细胞内的药物泵出细胞，使得细胞内药物浓度不断下降，最终使药物细胞毒作用减弱甚至丧失出现耐药［2］。中药下调P-gp蛋白的实验研究较多，下面就分体外与体内实验分别阐述。
1.1 体外实验研究解霞等［3］对川芎嗪(TMP)逆转多药耐药机制的研究显示MCF-7/ADM 细胞P-gp蛋白表达率为(90.60±0.41)％，而加入非细胞毒性剂量川芎嗪后，耐药细胞P-gp的表达率则降为(69.10±1.65)％（P
1.2 体内实验研究李贵海等［6］粉防己碱对获得性多药耐药小鼠S180肿瘤细胞相关蛋白的调控研究显示单纯应用DDP的模型组，其P-gp蛋白的表达为13.13±5.33，而粉防己碱无毒性高低剂量组其表达分别降为7.41±3.35和9.22±2.36，且其抑制率显著提高，揭示逆转耐药的机制可能与其降低P-gp蛋白的表达有关。
另据实验报道，中药三氧化二砷、ECCG、甲基莲心碱、补骨脂素等也可下调P-gp蛋白的表达而达到逆转多药耐药的作用［7～10］。
2 多药耐药的非经典途径
由MDR1基因编码的P-gp蛋白过度表达介导的药物外排是产生MDR的经典机制，除此外，MDR还与多药耐药相关蛋白(MRP)、肺耐药相关蛋白（LRP）、谷胱甘肽S转移酶、拓扑异构酶、细胞凋亡等多种非经典机制密切相关。
2.1 MRP介导的多药耐药多药耐药蛋白1(MRP1)属于ATP结合的盒式(ATP-binding cassette，ABC)运输蛋白家族成员，它可以通过细胞膜转运多种抗肿瘤药，从而限制抗肿瘤药进入细胞［11］。
徐萌等［12］用汉防己甲素逆转肺癌耐药实验研究发现经汉防己甲素处理12，24，36 h后MRP蛋白表达量的表达分别为32.21±4.79，30.56±4.58，25.55±7.58，而对照组则分别为53.42±7.42，52.98±10.35，60.98±9.37，差异有非常显著性意义(P
另外，王利等［14］葛根素逆转人胃癌裸鼠原位移植瘤多药耐药性的体内实验研究显示5-FU联合葛根素组MRP蛋白阳性表达率为37.5%，显著低于对照组生理盐水组（82.5%）及单纯5-FU组（74%）（P
2.2 谷胱甘肽介导的多药耐药多药耐药的产生机制复杂多样，其中谷胱甘肽S-转移酶活性的增强是产生多药耐药的重要机制。肖希斌等［15］的研究显示K562/A02细胞GST-π的PCR扩增带亮度较强，而经甲基莲心碱(Nef)处理组PCR扩增带亮度明显减弱，提示Nef在mRNA水平上抑制GST-π基因的mRNA转录，蛋白质印迹检测结果亦显示，未经药物处理的K562/A02组的蛋白杂交带，明显强于K562/A02+Nef组，表明Nef能抑制GST-π蛋白的表达。
苗立云等［16］青蒿琥酯逆转K562/A02细胞耐药性机理的研究显示K562/A02细胞内GSH呈现高表达(P
2.3 核转录因子介导的多药耐药核转录因子（NF-κB）在细胞增殖和凋亡中起关键调控作用，而目前有研究显示其在多药耐药的产生中也扮演着重要的角色，陈进伟等［17］K562/A02耐药细胞NF-κB活性测定的研究发现活化后K562/A02细胞NF-κB表达明显增强(P
2.4 LRP及拓扑异构酶介导的多药耐药肺耐药相关蛋白（LRP）与拓扑异构酶亦是近期研究较多的耐药介导介质。LRP作用机制是通过降低药物的核质分布比率和通过囊泡、胞吐作用将药物排出细胞［19］。拓扑异构酶(TopoⅡ)是调控DNA拓扑状态的酶类，据研究发现，TopoⅡ质和量的改变会直接影响与DNA的结合，导致药物诱导产生的裂解复合物形成减少，从而导致耐药。孙付军等［20］研究发现苦参碱可以逆转小鼠S180肿瘤细胞获得性多药耐药，其研究表明经其诱导后LRP、TOPOⅡ小鼠瘤体中可呈稳定高表达，而给予小鼠100mg/kg苦参碱后的瘤体中两种蛋白的表达率分别降低为（10.76±6.28）%和（8.58±4.1）%，与对照组相比呈现显著性（P
2.5 降低细胞内CA2+浓度Ca2+是细胞内一个重要的调节细胞生长、分泌和传导等机制的信使，自从Tsuruo等初次发现MDR表型的肿瘤细胞内游离Ca2+浓度增高以来，许多实验证明耐药肿瘤细胞中Ca2+浓度高于非耐药肿瘤细胞，又有学者证实钙拮抗剂可逆转细胞对药物的耐药性。蔡宇等［23］补骨脂素对HL60/HT耐药细胞逆转及对细胞内Ca2+浓度影响研究发现耐药株HL60/HT细胞内Ca2+浓度明显高于敏感株HL60(P
2.6 凋亡相关基因介导的多药耐药Bcl-2家族是细胞凋亡的关键调控物，其中Bcl-2相对分子量为26 000，蛋白水平与肿瘤细胞的MDR相一致，其过表达的肿瘤细胞凋亡受抑制，同时对阿霉素、长春新碱、顺铂等多种化疗药物耐药，其机制可能在于其产物可以稳定细胞生存，抑制多种因素，包括化疗药物诱导的细胞凋亡，从而使细胞产生耐药［25，26］。
艾小红等［27］甲基莲心碱逆转肝癌HepG2/thermotolerance细胞对阿霉素耐受性的作用发现HepG2/thermotolerance细胞较HepG2细胞高表达Bcl-2蛋白，而甲基莲心碱能够下调HepG2/thermotolerance细胞的Bcl-2表达。钟陆行等［28］参芪扶正注射液对K562/ADM多药耐药的影响研究显示K562/ADM 细胞Bcl-2基因呈现高表达，经10 μl/ml参芪处理后其表达为68.39±3.89，而正常对照组则高达(93.82±2.32)，由此可见参芪扶正注射液可以明显下调Bcl-2表达率。
3 多靶点作用逆转机制
整体观念是中医的基本特点之一。从现代研究的角度看，可以体现在中药治疗肿瘤的多靶点作用。在逆转多药耐药中，中药的作用机制也并非只局限于某一点，而是一个综合的作用，这也正是中药在逆转多药耐药研究中越来越受到人们重视的原因之一。
3.1 体外实验研究侯华新等［29］用板蓝根高级不饱和脂肪酸对耐药肝癌细胞株BEL-7404/ADM逆转作用实验发现P-gp、MRP蛋白在Bel-7404/ADM 细胞中呈现高表达（与Bel-7404相比，P
3.2 体内实验研究董琳等［32］甲基莲心碱对胃癌多药耐药的逆转作用研究发现P-gp、MRP在 SGC7901/VCR细胞中呈现高表达（P
4 结论与展望
目前，研究发现多药耐药的产生主要存在以下几个方面的机制：①P-gp蛋白介导的耐药，另多药耐药相关蛋白(MRP)及肺耐药相关蛋白(LRP)的异常表达也受到重视；②酶系统异常，包括GSH，GST，DNA拓扑异构酶(TOPOⅡ)和PKC活性改变；③bc1-2基因高表达是抑制肿瘤细胞凋亡、导致肿瘤耐药的重要因素。而综合国内文献发现，中药对多药耐药的逆转作用亦是多渠道、多途径的，往往也是通过对不同耐药途径的综合调控作用而实现的。
不过，我们通过对近几年的文献研究可以发现中药在逆转多药耐药研究中亦存在一定的问题，其主要体现在以下几个方面：①研究多偏重于单体，而对复方研究较少，难以体现中医辨证施治的特点；②对机制的研究多偏重于经典途径，而对非经典途径研究相对较少；③中药对多药耐药的逆转作用往往是多方面的，而有些文献报道多只对单个耐药相关蛋白表达进行研究，不免存在以偏概全之嫌；④亟需探索中药研究的新方法，从而来弥补中药成分复杂给实验带来不稳定性。
总之，通过对近5年的相关文献分析，我们发现中药在逆转多药耐药的研究中已深入到分子生物学水平。其逆转作用往往是通过对不同的耐药蛋白的综合作用而实现的。由于中药成分的不单一性，使其作用往往不局限于某单一靶点，而是体现于多个靶点。其是通过多靶点的综合作用，从而可以从多角度、多层次来发挥逆转多药耐药的作用，另外中药体现出了毒副作用小，作用显著的优点而愈加受到国内外学者的关注。中药逆转剂的进一步研究推广势必有益于化疗疗效的提高和晚期癌症患者的生活质量的改善。
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分子生物学进展范文4
关键词：α-L-鼠李糖苷酶；基因克隆；基因表达；晶体结构
中图分类号：Q71；Q786 文献标识码：A 文章编号：1007-7847（2015）01-0068-07
ProgressesonMolecularBiologyandStructuralBiologyofα-L-rhamnosidasefromMicrobialSources
ZHANGXia1，LILi-jun1*，NIHui1.2’3，CA1Hui-nong1.2，3，SUWen-jin1，2，3
（1.CollegeofBioengineering，JimeiUniversity，Xiamen361021，Fujian，China；2.ResearchCenterofFoodMicrobiologyandEnzymeEngineeringTechnology，Xiamen361021，Fujian，China.，3.ResearchCenterofFoodBiotechnologyofXiamenCity，Xiamen361021，Fujian，China）
Abstract：a-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40）cleavesterminalα-L-r
hamnosespecificallyfromalargenumberofglycosides.Theenzymeisabiotechnologicallyimportanthydrolyticenzymeduetoitsapplicationsinthefoodandbeverageprocessingindustryandpharmaceuticalindustry.Basedonprimarysequencesimilarities，α-L-rhamnosidasesareclassifiedwithintheCarbohydrate―activeenzymes（CAZy）databaseintofourglycosidehydrolase（GH）families（GH13，GH28，GH78andGH106family），andthreeα-L-rhamnosidasesofGH78haveatypical（α/α）6-barrelstructure.Propertiesandapplicationsofα-L-r
hamnosidasefromdifferentmicrobialsourceshavebeenintroduced.Inaddition，therecentdevelopmentsoncloning，expressionofoiLi.hamnosidasegeneandthecrystalstructureoftheenzymeweresummarized.
Keywords：α-L-rhamnosidase；genecloning；geneexpression；crystalstructure
（LifeScienceResearch，2015，19（1）：068?074）
α-L-鼠李糖昔酶（α-L-rhamnosidase（EC3.2.1.40））属于转化糖苷水解酶类，能够专一、高效地水解许多糖苷类物质如柚皮苷（naringin）、芦丁（rutin）、橙皮苷（hesperidin）等末端的α-L-鼠李糖基[1]。α-L-鼠李糖苷酶的来源广泛，在动物组织、植物和微生物中均发现了α-L-鼠李糖秆酶。目前关于动物组织[2]和植物来源的α-L-鼠李糖苷酶的报道相对较少，主要是通过细菌（如芽孢杆菌属、拟杆菌属、乳杆菌属及单胞菌属等）和真菌（如曲霉属、青霉属、木霉属、犁头霉属及裂殖菌属等）发酵来获取α-L-鼠李糖苷酶。
不同微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶酶学性质存在差异。细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶最适pH呈中性或碱性，而真菌分泌的α-L-鼠李糖苷酶的最适pH一般在酸性范围内，主要在4.0～7.0[3-5]之间。微生物中的α-L-鼠李糖秆酶的最适反应温度一般是45?60℃[4、6]。近年来也有发现耐热、嗜低温及耐碱性的α-L-鼠李糖苷酶，如白曲霉MBRC4308[6]分泌的α-L-鼠李糖苷酶，在60℃保温1h后酶活仍有初始酶活的80%；ThermophilicbacteriumPRI-1686[7]产生的α-L-鼠李糖苷酶最适温度为70℃，在60℃处理24h后酶活为处理前的20%；而亚南极环境中的单胞菌属细菌[8]中的α-L-鼠李糖苷酶在-1-8℃具有活性。Rojas[9]等从白黄笋顶孢霉菌（Acrostalagmus luteo albus）分离到一种新型碱性α-L-鼠李糖苷酶，以对硝基苯酚-α-I-鼠李糖苷（pNPR）为底物测得酶反应的最适pH值为8.0，它可以在碱性条件下水解橙皮苷、柚皮苷以及槲皮苷等糖苷物质，扩大了α-L-鼠李糖苷酶的应用范围。
α-L-鼠李糖苷酶是柚苷酶及橙皮背酶的主要活性成分，是去除柑梧类果汁苦味的有效物质[1]。果汁中的苦味物质柚皮苷被柚苻酶水解的过程共有两步反应，首先在α-L-鼠李糖苷酶的作用下水解柚皮背生成普鲁宁，接着在β-D-葡萄糖苷酶的作用下，生成柚皮素。在果汁酶法脱苦过程中，α-L-鼠李糖苷酶参与的第一步反应是脱苦的关键，Chien[10]等用HPLC法证明仅有柚苷酶的另一组份β-D-葡萄糖背酶存在时，苦味物质抽皮苷是不能被水解的。有研究报道，对葫溪蜜柚果汁进行脱苦时，在α-L-鼠李糖苷酶加量为10U/mL的条件下40℃处理60min，苦味就能降低到阈值以下[11]。除了在饮料行业中用来去除柑橘类果汁的苦味[3、12]，在其他行业也具有很多潜在的应用价值，如通过水解柚皮苷生产L-鼠李糖[1]和普鲁宁降低黄酮类化合物的生产成本；增加酿造酒的香味[14、15]，改善葡萄汁和饮料的香气成分；切除一些糖苷类药物原料末端的L-鼠李糖等[16]。由于α-L-鼠李糖苷酶的重要应用价值，越来越多的国内外学者致力于该酶的研究开发。本文分别对微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆、表达以及该酶的晶体结构研究进展进行了阐述。
1α-L-鼠李糖苷酶的分子生物学研究
微生物分泌的α-L-鼠李糖苷酶是一种诱导酶，需要诱导物柚皮苷、橙皮苷、鼠李糖等存在时才能合成α-L-鼠李糖苷酶，而且微生物中α-L-鼠李糖苷酶的诱导受到碳源代谢调节，给微生物发酵产α-L-鼠李糖苷酶造成阻碍。同时随着α-L-鼠李糖苷酶的应用越来越广泛，传统发酵的生产方式不能满足日益增长的需求，也很难达到很高的纯度。因此，选择现代生物技术来研究α-L-鼠李糖苷酶是一种必然趋势
1.1α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆
早期对a-L-鼠李糖苷酶的研究主要是该酶的分离纯化及酶学性质，2000年后对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究日渐增多，表1列举了2000年以来微生物中GH78家族和近两年其他家族已克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因目前，从微生物中克隆α-L-鼠李糖苷酶基因主要采用PCR和构建文库的方法。据PuriM等报道，采用构建文库的方法克隆α-L-鼠李糖苷酶基因可以通过以下两种方法筛选阳性克隆；一种是利用pNPR作为底物筛选含有α-L-鼠李糖苷酶活性的阳性克隆；另外一种是采用多克隆抗体筛选产鼠李糖苷酶的阳性克隆。
细菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究比真菌稍早，在2000年[18]就有学者报道对Clostridium.stercorarium菌株中鼠李糖苷酶基因ramA的克隆。有些细菌中存在多个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，且它们的序列存在差异，在Bacillussp.GLl[31]中克隆到rhaA和rlmB两个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，它们分别编码两个不同的α-L-鼠李糖苷酶。来自植物乳酸杆菌（Latto-bacillusplantarum）[23]的rhaB1和rhaB2都是编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，它们的序列相似性仅为26%。不同细菌中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因序列各异，Bacillussp.GLl[31]中rhaA和rhaB与Clostridiumstercorarium中ramA序列相似性分别为41%和23%。植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantarum）[23]中的α-L-鼠李糖酶KhaB1和RhaB2与Bacillussp.GLl[31]中该蛋质（登录号：BAB62315）的氨基酸序列相似性均为23%，与ThermomicrobiaPRI-1686[7]中的RhaB（登录号：AAR96047）相似性分别为22%和23%。而少动鞘氛醇单胞菌FP2001（Sphingornonaspaucimobilis）[21]中克隆的α-L-鼠李糖苷酶基因rhaM，共有3354个核苷酸，同源性比对发现它与其他属于糖基水解酶（GH）家族78的α-L-鼠李糖苷酶基因没有显著的同源性。
国外关于真菌中α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆研究主要集中在来源于曲霉属的α-L-鼠李糖苷酶目前，曲霉属中的棘孢曲霉[19]、白曲霉[6]和构巢曲霉[29]等已有克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的研究报道。对目前已知的α-L-鼠李糖苷酶基因序列的分析发现，不同来源的α-L-鼠李糖苷酶基因序列差异较大。从棘孢曲霉[19]中克隆的两种编码α-L-鼠李糖苷酶的基因rhaA和rlmB的核苷酸序列几乎没有相似性，二者氨基酸序列相似性为60%，而它们与Clostridiumstercorarium中该酶的氨基酸序列[18]的一致性仅有11%。白曲霉中[6]α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列与棘孢曲霉[19]中rhaA和rhaB的氨基酸序列相似性分别为75%和67%，与细菌[7、18、20、21]来源的α-L-鼠李糖苷酶的氨基酸序列一致性低于30%。有些真菌中存在着多个编码α-L-鼠李糖苷酶的基因，如在棘孢曲霉[19]中分离到两种α-L-鼠李糖苷酶，并克隆了它们对应的基因：有研究者对构巢曲霉[29]的基因组信息进行分析发现，至少存在8个可能具有α-L-鼠李糖苷酶功能的基因，而目前已克隆到rhaA和rhaE两种：我国学者对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的研究相对较晚，主要是对犁头霉属[32-34]的α-L-鼠李糖苷酶基因的克隆，已成功克隆出芦丁-α-鼠李糖苷酶基因cDN段[32]和人参皂甙-α-鼠李糖苷酶基因[33、34]。近年有研究者从黑曲霉DLFCC-90菌株[26]中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，该序列和α-淀粉酶的序列有较高的同源性，被归类到糖苷水解家族GH13。此外，笔者巳经从黑曲霉JMU-TS528（集美大学生物工程学院发酵工程研究室保藏的菌株）中克隆到α-L-鼠李糖苷酶基因，共编码655个氨基酸，序列已上传至NCBI数据库（登录号：KC750908.1），经同源性比对发现，它与白曲霉[6]（AB374267.1）中的α-L-鼠李糖苷酶基因的相似性高于90%。
虽然对微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因克隆的报道越来越多，但对该基因在转录水平上的调控研究并不多。目前，仅指出α-L-鼠李糖苷酶基因的表达量受诱导碳源的影响，葡萄糖在转录水平抑制该基因的表达。因此，笔者认为今后的研究可在克隆α-L-鼠李糖苷酶基因的基础上进一步鉴定与该基因跨膜转移或翻译直接相关的基因和蛋白，阐明葡萄糖抑制基因与α-L-鼠李糖苷酶基因相互作用的关系，从而明确碳源代谢调控α-L-鼠李糖苷酶基因的机制。
1.2α-L-鼠李糖苷酶基因的表达
通过α-L-鼠李糖苛酶水解柚皮苷生产普鲁宁可以降低普鲁宁的生产成本，但目前报道的α-L-鼠李糖苷酶大多数是以柚苷酶的形式存在，而在柚苷酶水解柚皮苷的过程中，普鲁宁作为一种中间产物，会进一步被分解成柚皮素，不能大量积累普鲁宁。所以表达出只具α-L-鼠李糖苷酶活性的蛋白质具有重要的应用价值。近几年有人对α-L-鼠李糖苷酶基因的表达进行了研究，表2列出了具有代表性的微生物中α-L-鼠李糖苷酶基因表达出的具有活性的蛋白。
在研究α-L-鼠李糖苷酶基因表达时，大肠杆菌是研究者常用的表达宿主。虽然采用原核表达系统来表达真核微生物中的基因容易出现没有活性的产物，目前已有不少研究者将微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶基因，通过大肠杆菌表达出有活性的蛋白。如Jules[22]等将植物乳酸杆菌（Lactobacillus plantaram.）和嗜酸乳酸杆菌（Lactobacillus acidophilus）中克隆得到的鼠李糖苷酶基因ram1Lp、ram2Lp和ramALa，在E.coli中表达出活性蛋白Ram1Lp、Ram2Lphe RamALa，其中RamALa酶活最大，达到8.5mU/μg。不同的α-L-鼠李糖苷酶基因表达后产物的水解底物不同，乳酸片球菌[24]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因ram和ram2，采用E.coli表达系统成功表达出活性蛋白Ram和Ram2，但Ram只能有效地水解合成底物pNPR，而Ram2能特异性水解橙皮苷和芦丁糖，两种酶均不能水解柚皮苷，以pNPR为底物测得Ram和Ram2的酶活分别为8.7U/mg和0.036U/mg。植物乳酸杆菌NCC2451231中rhaB1和rhaB2基因表达的RhaBl和RhaB2能特异性地水解α-1，6糖苷键，但不能水解柚皮苷中的a-1，2糖苷键，RhaB1和RhaB2的最适底物是橙皮苷和芦丁。有研究者发现有些细菌中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因表达后的产物是二聚体，例如Clostridium stercorarium[18]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因ramA成功在（PWS1261）细胞中表达出的蛋白Ram78A包含两个相同的亚基，Lactobacillusplantatum[23]中rhaB1和rhaB2基因采用E.coli表达出的α-L-鼠李糖苷酶以二聚体形式存在。
由于原核表达系统本身存在的一些缺陷，有时表达出的α-L-鼠李糖秆酶不具有活性[36]，所以有研究者采用真核表达系统来表达α-L-鼠李糖苷酶基因。目前对α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达的报道并不多，我国研究者已在酵母中成功表达了芦丁鼠李糖苷酶基因[36]、人参皂苷-α-鼠李糖苷酶基因[33]以及黑曲霉中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因[26]。其中黑曲霉中的α-L-鼠李糖苷酶基因序列与α-淀粉酶基因序列相似性较高，通过酵母表达后的产物具有水解芦丁、柚皮苷及橙皮苷的功能。米用酵母细胞表面展示技术将Alternaria sp.L1[28]中rhal1编码的α-L-鼠李糖苷酶固定在酿酒酵母细胞表面，该细胞能特异性地水解葡萄柚果汁中的柚皮苷达到果汁脱苦的作用。RhaL1固定在酿酒酵母细胞表面后，该酶在70℃环境中活性很高，在60℃处理2h后酶活达到处理前的95%，扩大了该酶在工业生产中的应用范围。目前对黑曲霉来源的α-L-鼠李糖苷酶基因的异源表达研究较少，笔者正在研究从黑曲霉jMU-TS528菌株中克隆到的α-L-鼠李糖苷酶基因的真核表达。国外的研究者报道了土曲霉[25]、构巢曲霉[29]和棘孢曲霉[35]中编码α-L-鼠李糖苷酶的基因在酵母中的成功表达。鼠李糖能够诱导构巢曲霉[29]中rhaE的表达，葡萄糖对该基因的表达产生抑制作用，rhaE在酿酒酵母中表达的产物，能够水解底物pNPR，酶活达到1.4U/mL。通过系统发育树分析发现，在真菌来源的α-L-鼠李糖苷酶基因中，rhaE是首个与细菌中α-L-鼠李糖苷酶基因亲缘关系比其他真菌中的α-L-鼠李糖苷酶基因更近的基因。土曲霉中α-L-鼠李糖苷酶基因采用酵母表达系统得到的产物和天然发酵的α-L-鼠李糖苷酶一样，都可以水解芦丁，重组酶酶活力高达9U/mL，比天然酶高出3倍，而且大大缩短了天然发酵获取α-L-鼠李糖苷酶的时间，同时酶的产量比天然发酵的α-L-鼠李糖苷酶提高了4倍。尽管近年来，利用基因工程技术来构建产α-L-鼠李糖苷酶的工程菌的研究逐渐增多，并取得了一定的进展，但酶活水平始终未能达到工业化应用的要求；目前国际上对α-L-鼠李糖苷酶分泌机制的研究也不多，因此如何进一步提高该酶的胞外分泌水平，是该酶能否得到推广应用的关键：
2α-L-鼠李糖苷酶的结构生物学
蛋内质需要形成一定的空间结构才能有活性，近年来，虽然对α-L-鼠李糖苷酶基因克隆和表达的报道很多，佴对它的结构方面的研究报道还比较少：2000年Zverlov成功克隆Clostridiumstercorarium[18]中编码α-L-鼠李糖苷酶基因ramA后，首次通过圆二色谱法测得该酶二级结构包含27%的α-螺旋和50%的β-折叠结构。
CAZy（http：///）数据库依据氨基酸序列相似性对糖苷水解酶类进行了分类，微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶包含在GH13、GH28、GH78和GH106糖苷水解酶家族中。目前，由PDB数据库可以搜到3个鼠李糖苷酶的晶体结构，分别是来自Bacteroides thetaiutaomicronVPI-5482菌中的α-L-鼠李糖苷酶（PDBcode：3CIH）、Bacillus sp.GLI（PDBcode：20KX）和Streptoinycesavermitilis（PDBcode：3W5M、3W5N）菌株中α-L-鼠李糖苷酶。Cui[31]等于2007年解析了α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）的晶体结构，该酶由N、D1、D2、C和A5个结构域组成；结构域A包含其（α/α）6的桶状结构，Asp567、Glu572、Asp579和Glu841在该酶的催化作用和底物结合方面起到了关键作用，它们与鼠李糖相互作用，将其突变后，α-L-鼠李糖苷酶（RhaB）酶活大幅度降低；并认为RhaB的空间结构与Lactobacillusbrevis菌株的麦芽糖磷酸化酶MalP和Vibrioproteolyti-cus菌株的壳二糖磷酸化酶ChBP的结构相似。来自Streptmnyces avermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶（SaRha78A）的晶体结构有两种，一种是原蛋白形式，另外一种是包含L-鼠李糖的晶体结构，这两种形式的结构变化很小，RMSD值仅为0.21A，它们均由1个α和5个β结构域组成，分别是N、D、E、F、A和C；结构域A包含（α/α）6的桶状结构，与Cui[31]等报道的RhaB的催化域相似；SaRha78CM由13个α-螺旋组成，结构域N包含10个β-折叠，结构域D的11个β-折叠和E的13个β-折叠展现出一个β-卷心折叠，结构域F由16个β-折叠组成两个平行的β-折叠片；L-鼠李糖分别结合在结构域A和D中，结构域A中的L-鼠李糖结合在该酶的活性口袋的芳香基氨基酸TrP747和TrP640之间，与周围的氨基酸形成12个氢键，结合后的船型构象被认为是GH78家族α-L-鼠李糖苷酶水解聚糖的过渡态构象；结构域D中的L-鼠李糖结合在β-折叠间，L-鼠李糖的O2、O3和O4原子分别和α-L-鼠李糖苷酶的Trp203、Asnl80和AsP179形成氢键，L-鼠李糖的O3、O4位置与一个正二价钙离子形成配位共价键，同时钙离子与该酶通过Aspl79、ASnl80、Asn228和Pro233氨基酸产生相互作用：Glu636和Glu895是在该α-L-鼠李糖苷酶的催化作用中的关键氨基酸，Glu636在催化过程中提供质子，将其突变后，该酶酶活下降了40倍。通过对α-L-鼠李糖苷酶的晶体结构的分析发现，该酶有4个结构域高度保守（RhaB：A、C、D2、D1；SaRha78A：A、C、E、F），GH78家族α-L-鼠李糖苷酶的催化域是一个（α/α）6的桶状结构，鼠李糖结合在该桶状结构的深沟里[31]。此外，在streptomyces awermitilis[37]菌株的α-L-鼠李糖苷酶中还发现了一个新的非催化碳水化合物结合域（non-catalyticcarbohydratebindingmodule，SaCBM67），SaCBM67位于结构域D，通过钙依赖的方式与L-鼠李糖结合，在用EDTA螯合钙之后，SaCBM67失去与L-鼠李糖结合的功能。通过对179和180位置的氨基酸的突变实验发现，突变后该酶水解阿拉伯树胶的活性大大降低，而对水解芳香基鼠李糖苷的活性影响不大，研究者认为SaCBM67对该菌株中的α-L-鼠李糖苷酶酶活有着一定的影响。
3展望
微生物来源的α-L-鼠李糖苷酶具有很多潜在的应用价值，近年来，对该酶的研究越来越受到学者的关注，从不同水平对α-L-鼠李糖苷酶进行了研究。首先，在α-L-鼠李糖苷酶产酶菌株的筛选、发酵条件的优化以及酶的分离纯化和性质研究日趋成熟，为产业生产α-L-鼠李糖苷酶酶制剂及α-L-鼠李糖苷酶在食品医药加工工业中的应用提供了一定的参考价值；其次，在分子生物学方面，对不同来源的α-L-鼠李糖苷酶基因进行了克隆，并通过生物信息学分析、基因的表达以及晶体结构的研究，使得对α-L-鼠李糖苷酶的了解进一步深入。这些研究为构建工程菌生产α-L-鼠李糖苷酶，提高α-L-鼠李糖苷酶的酶产量，降低目前生产α-L-鼠李糖苷酶的成本提供了理论指导。但目前对不同来源的α-L-鼠李糖苷酶的合成途径、诱导机制和催化机制研究较少，因此，可进一步通过利用分子生物学、结构生物学和计算生物化学等技术，对α-L-鼠李糖苷酶进行更深层次的研究。从分子水平上来研究α-L-鼠李糖苷酶的催化机理，结合定点突变等技术来提高α-L-鼠李糖苷酶的催化活性。同时，通过计算模拟等手段研究α-L-鼠李糖苷酶的底物结合特异性，扩大α-L-鼠李糖苷酶在各生产工艺中的应用范围因为自然分离纯化的酶难以满足苛刻的工业生产过程，所以酶的改造成为一种非常有效的替代途径，依照α-L-鼠李糖苷酶的晶体结构信息，加深对其结构和功能的认识，为α-L-鼠李糖苷酶定向进化和改造奠定理论基础：
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分子生物学进展范文5
关键词： 高等师范院校 分子生物学 教学改革
分子生物学是高等师范院校在生物学、生命科学、基础医学等学科开设的核心课程之一。本学科理论研究深，前沿性强，不但是生物学研究与教学的基础课，而且广泛应用于生物实验的各个领域。分子生物学主要研究蛋白质、核酸等生物大分子形态、结构及其相关性与变化规律的学科。分子生物学的理论体系演变发展步伐很快，也对高校的教学与科研带来了巨大的挑战。
高等师范院校的教学与一般高校不同，在科学研究与科学教育的同时还肩负着培养教师的任务。因此，各学科在教学过程中，不仅仅要把知识传授给学生，还要让学生掌握研究方法与教学技巧。高等师范院校在教学中更要重视学生知识的传承转向能力的培养。我国很多的高等师范院校都在推行教学改革，在分子生物学教学方面如何联系科学发展的实际应用与理论教学是高等师范学院在分子生物学教学改革方面所要研究的课题。高师院分子生物学教学改革实践要做好以下几点。
1.选好教材，加强专业英语教学
教材是学生学习与教师备课的基本资料，分子生物学在市面上的教材有很多，由于分子生物学的知识涵盖面广，不同的教材编写的侧重点不同。其中赵亚华老师编写的《分子生物学教程》，陈启民等主编的《分子生物学》，朱玉贤等主编的《现代分子生物学技术》在大学比较常见，这些都比较适合本科教育。各种各样的教材要求老师在选择教材时要根据时展特点、师范学校办学风格来综合考虑。很多学校在未经开会探讨的情况下，根据个别人的观点来购买教材，这是不合理的。在选教材方面也不能一味求新，新同学没有专业基础，选择既理论基础深厚，又能反映分子生物学新进展的教材是有效教学的前提。
分子生物学是门基础理论与科技前沿结合紧密的学科，在大学推行双语教学的今天，选择教材也应该搭配一本外文教材。开设一门分子生物的专业英语是必要的。如果师范院校学生的专业英语水平提高了，当走向社会，对提高我国的基础教育水平也有很大的帮助。在外文教材的选择上，各高校一般选择Gkarp的Cell and Molecular Biology，Robert Weaver的Molecular Biology，P.C.Turner的Molecular Biology。教材的选择也要根据学生的实际水平，选择与中文教材近似的外文教材，不能脱离实际，否则不但起不到提高学生专业英语水平的目的，反而会严重挫伤学生的学习积极性。
2.教学大纲的革新
进入了二十一世纪，教学设施已经有了明显的改善，很多学校仍然没有摆脱旧的讲学模式，经常是教师在讲台一味照课本或者讲义讲课，学生拼命地记笔记，有的老师甚至省去了板书。有的学校的多媒体教学设施甚至成了迎接教学评估的形式。这样的现象在高等师范院校更严重。在课程内容安排上，不仅要做到重点突出专业性，而且要与其他课程结合穿插，与生物化学、微生物遗传学、遗传学、基因工程等课程相互渗透、相互联系。在课堂上要把多媒体教学作为主要教学手段，可以制作课件，也可以留下几章让学生自学制作，课件可以在下课后拷贝给学生。这样既可以提高学生的学习积极性，又可以避免学生上课只顾记录笔记，而不注重听课与理解的传统教学弊病。老师在编写课件时还要做好与教育学理论的结合，并配合视频、图片、新闻等形象的、有时代感的元素，与学生互动。比如原核生物和真核生物的染色体结构、原核生物的转录、DNA的复制、蛋白质的合成、基因克隆等，用形象的图片与视频效果要比看教材好得多。
3.加强教师的定期培训
高等师范院校肩负着培养教师的责任，所以师范学校的教师既是老师又是学生。教师在教书育人的同时还要加强自身的学习，不但要学习专业知识，而且要加强教学方法与水平的学习。教学改革在现实层面首先改革的是教师，加强对教师的专业培训，提高政治思想水平，强化对教师的科学管理，这些都是高等师范院校要重视的。分子生物学领域知识更新快，发展迅速，而且分子生物学最突出的科研成果一般都发表在外文期刊上。教师提高英语水平与计算机应用水平，加强随时关注分子生物学领域发展动向的意识，并将本学科相关的新概念、新思路和新成果等内容引入课堂，给学生提供一些能够接受的，难度适中的文献，可以与学生一起开阔视野、一起提高。另外，教师人格与教学风格对学生影响也很大，不但能影响到学生对分子生物学的理解，而且能影响到学生以后的教学风格的成型，注意语言与修养的培养，也是高等师范院校在教学中要注重的。
4.改革教学模式，强化实验教学
在继承传统的教学方式严谨的优点的同时，在课程上到一定阶段，学生对分子生物学有所了解后，在教学方式上可采取课堂讨论等互动教学方式，同时将新知识、新进展作为专题让学生自己研究了解，并作出总结在课堂讨论。互动式教学可以将分子生物学理论细分，让学生分组作深入探讨，以提问回答的形式由老师引导完成学习，彻底改变传统教学模式枯燥的特点。
高等师范院校教学改革是提高教学质量的关键，也是培养优秀教师的前提，不仅体现在分子生物学课程中，而且涵盖了教学的各个方面。不断地改革意味着不断地突破，这样才能培养出符合时代要求的教师。
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分子生物学进展范文6
关键词生物技术;分子生物学;教学改革
分子生物学是从分子水平上研究生命现象、生命本质及其规律的的科学，主要研究核酸、蛋白质等生物大分子的形态、结构特征及其重要性、规律性和相互关系的科学，是21世纪最具活力的生命科学之一。[1]目前，分子生物学是生物技术专业学生一门重要的专业必修课。因此，确定合理、科学的教学改革方案，优化、重组教学内容，精心设计教学方法和教学手段，对保证生物技术专业分子生物学课程教学质量具有重要意义。[2]
1分子生物学教学现状
（1）分子生物学是生物技术专业的一门主要课程，教学单位往往会根据教师上课需求以及市场需求来选择教材，然而，却有可能忽略了对学生的接受能力以及理解程度的考虑。部分分子生物学教材内容高深莫测、专业词汇多且与实际联系不够紧密，造成学生在学习过程中困难重重，严重降低了学生对该学科学习的积极性。（2）教学条件限制。在分子生物学课堂中，使用多媒体设备等教学手段对提高学生的学习积极性以及学习效果有明显的促进作用。然而，部分教学单位由于教育资源分布不均匀，难以利用先进的教学手段。（3）分子生物学课程所涉及的知识点以及生物学过程，大多数是看不见摸不着的微观世界，学生在学习的过程中难以直观感受。（4）理论知识更新快，实验技术发展快。分子生物学作为生命科学的前沿学科，其发展日新月异，这也对教学提出了更高的要求。授课老师需及时接纳最新知识，充分备课。
2分子生物学教学改革的主要措施
2.1PBL教学法的合理运用
PBL（problem-basedlearning，问题式学习）教学法于1969年由美国Barrows教授创立，并引入高等教育，很快在高校中广泛应用。是一种以问题为导向，以学生为中心的教学方法。其主要流程是：老师提出问题，学生作为主体进行分组讨论，学生解决问题。[3]在PBL教学过程中，学生是主体，老师则主要起到辅导的作用。分子生物学课程内容复杂，用传统的教学方式不易调动学生的学习积极性，而且课堂效率不高。在课堂中适当引入PBL教学法，可改善教师唱独角戏，学生被动接受的状况。在进行PBL教学前的备课过程中，任课老师应查阅大量的文献，充分考虑在讨论案例过程中可能出现的问题，内容涉及分子生物学以及其他学科如生物化学、细胞生物学等。在课堂上，教师应寓教于乐，充分调动学生积极性，控制好课堂节奏，同时应根据教学大纲的安排，强调学习过程中应掌握的知识要点。[4]在分子生物学的教学过程中，PBL教学可分为四个阶段：（1）提出问题。开展PBL教学的时间不宜在课程开始的阶段，而应在课程中后期，学生具有一定的分子生物学基础后再开展。PBL教学讨论的主要题目应该是分子生物学教学过程中的重点或者难点，并且结合生活实际的讨论内容。教师在这个过程中是组织者的身份。（2）人员组成。为调动学生参与的积极性，同时考虑到团队的高效性，将每个班级分成4~6组，每组包括4~6名同学。分组结束后，要求各组成员选拔出该组的组长并选定拟解决的问题，然后进行人员的分工，明确每个成员应完成的内容和时间节点。老师负责全程把控，掌握教学的整体节奏与进展，及时了解各组的情况，包括进程、主要观点、存在问题、后续进展等。鼓励各组结合自己的研究、思考提出自己的想法。对成效较好的小组，给予肯定和表扬；对存在问题较多或进展较慢的小组有针对性的指导，帮助小组找到解决问题的核心路径。（3）成果展示。学生展示自己的研究成果，并开展充分讨论。主讲老师在学生讨论完毕后，对学生的成果、讨论的主题、各组的亮点、学生关注点较集中或争议较大的问题、学生未掌握到的知识点、研究时未关注的部分、下一步学习或研究中需要改进的研究方法进行总结、归纳，并提出改进意见。[5]（4）考核评分。考核评分是对PBL学生成果的集中体现，评分体系主要包括三部分：一是课件制作，占比30%，评价标准主要是内容正确、重点突出、课件美观、清晰易懂，能综合运用图片、音频、视频、动画等表达自己的观点；二是课件展示，占比40%，准备充分、逻辑正确、条理分明、落落大分，能清晰的阐述自己的研究成果、观点等；三是课堂讨论：占比30%，主动思考，积极参与，能够抛出富有启发意义的论点，回答问题时中肯全面。
2.2提倡分组讨论，开展小班教学
在讨论课开始前2周，老师将要讨论的内容告知学生。以小组为单位进行学习，各小组成员间可以进行分工协作，分头寻找资料、讨论并汇总；课堂上以小组形式提出问题，介绍小组观点、结论，老师也会对该小组的汇报进行点评；课后以小组为单位进行复习，增强学习效果。小组学习活动的意义既体现个人的价值和责任，更强调成员间彼此赋予信心和力量，通过体验团队的智慧和协作，培养了学生间可贵的团队合作精神。分子生物学的课堂提倡小班教学。一方面，可以增加师生间互动的频率。由于分子生物学课程所涉及的知识点以及生物学过程，大多数是看不见摸不着的微观世界，学生在学习的过程中难以直观感受，这就增加了学生学习该课程的难度。小班教学有助于老师关注每一个学生对相关知识的把握；另一方面，小班教学易于实施多种教学形式，灵活掌握教学要求和进度，便于及时调整教学内容。
2.3利用网络资源，提升自主学习能力
自主学习强调的学生作为知识的主动构造者自己进行学习的意愿和能力，反映了教学向个性化、创新化、自主化、多元化过渡的趋势。分子生物学作为前沿科学，信息量大、更新快，要积极利用互联网信息资源，提升学生学习和借鉴优秀研究成果、自主学习的能力。教师要由照着教材讲变成开放式、启发式教学，最大限度调动学生学习的积极性、思考的主动性、课堂的参与性。鼓励学生自主学习，主动去学习和研究当前科研的最前沿知识，在研究的过程中敢于提出自己不同的看法，培养学生探索创新精神。[6]让学生由被动受教变成自主学习，主动参与到课堂学习中，形成教学工作“教”与“学”相辅相成、相互促进。教师要积极拓展教学内容的外延，主动介绍国内外优秀的生物网站、资源库、期刊、论坛等，鼓励学生积极开展课外阅读，丰富学科专业知识、前沿信息、专业词汇等知识，激发学生探索新知识的热情，也不断培养学生自主学习、发现问题、解决问题的能力。[7]
2.4建立形成性评价体系
“形成性评价”的概念是由斯克里文1967年所著《评价方法论》中首先提出来的，与传统的“终结性评价”不同，它是对学生的学习过程进行的评价，旨在确认学生的潜力，改进和发展学生的学习。因此，形成性评价方式更能体现出学生的学习效果。[8]分子生物学课程的目的在于培养学生形成良好的分子生物学学习习惯和实验习惯，提高他们的科学素养和创新能力。期中或期末考试不能全面真实地反映出学生的真实学习情况，采取形成性评价的方式显得更加科学和必要。具体如下：一是平时成绩，占课程总成绩60%，包括课堂考勤，占总成绩5%、课堂作业，占总成绩10%、课堂提问，占总成绩5%、PBL讨论会，占总成绩10%、实验考评，占总成绩30%。二是期末考试，占课程总成绩40%。由于形成性评价是强调过程的评价方式，引导学生重视平时的学习情况，大大减少了学生考前突击的可能，也更能真实地反映出学生的真实水平。
2.5优化实验教学体系
分子生物学实验技术是生物技术专业学生必须掌握的重要基本技能之一。其研究方法及策略已被广泛应用于生命科学的研究当中。[9]通过对学生实验技能的培养，一方面有利于将理论教学与实践教学相结合，丰富教学内容，提升教学的实践性、实用性、综合性，便于学生理解和掌握；另一方面，在提升学生综合素质、学习兴趣、创新能力、思考能力等方面也有十分重要的作用。[10]因此，增加分子生物学实验学时数，开展综合实验也是课程改进的一个重要方向。在实验教学中，教师要结合分子生物学快速发展的特点，选取与教学内容相适应的操作性、设计性实验，并做好不同实验之间的关联与衔接，建立实验的逻辑体系。一是分组分工，辅助实验老师提前做好实验准备工，并提前观察、发现问题及时记录。二是教师针对前期准备工作中发现的问题有针对性的阐述，并对实验流程、操作方法、各环节中注意事项进行讲解与演示，指导学生开展实验。三是讲解与演示结束后，学生动手实验，教师应注意注意观察过程和细节，对共性问题，要及时统一纠正，对个别同学的个性问题，要个别指导。既确保操作的准确性、严谨性，也要保证实验质量，通过实验检验教学情况。
3结语
生物技术专业应用人才培养是一个综合性、系统性的工程，涉及到教育环节的方方面面。课程教学是其重要的一环，分子生物学课程教师要积极发挥作用，不断提升专业能力、教学能力，教学理念与时俱进、教学手段丰富灵活，激发学生学习的主动性、创造性，提升学习内容掌握能力及应用效果，为国家培养知识、能力、素质协调统一的应用性、复合型人才。
参考文献
[1]朱玉贤,李毅,郑晓峰等.现代分子生物学(第四版)[M].北京:高等教育出版社,2013.
