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表观遗传学研究方法范文1
近年研究表明，高等生命遗传信息的复杂性不仅在于基因组有更多的结构蛋白基因编码，还在于基因表达调控机制的复杂性。因此基因表达调控是现代分子生物学的核心。其主要探讨在不改变DNA序列的条件下改变基因的表达，这种改变不仅可以影响个体的发育，还可以遗传，因此表观遗传学(epigenetics)应运而生。表观遗传是指DNA序列未发生改变，而基因表达发生了可遗传的改变[1]。表观遗传改变从3个层面上调控基因的表达[2]，
1.DNA修饰：DNA共价结合一个修饰基团，例如甲基基团(CH3)，使具有相同序列的等位基因处于不同的修饰状态;
2.蛋白修饰：通过对蛋白进行修饰或者改变蛋白的空间构象来调控基因的表达，例如组蛋白乙酰化等;
3. 非编码RNA的调控：由非编码的RNA通过某些机制对基因转录或转录后进行调控，例如RNA干扰(RNA interference，RNAi)。
表观遗传学研究的内容非常广泛，涉及染色质重塑、DNA甲基化、X染色体失活和非编码RNA调控等[2]，目前研究最充分的表观遗传改变是DNA甲基化。
表观遗传学被Feinberg[3]认为是现代医学的中心，这是因为其有助于解释个人的遗传背景、环境因素、老龄化和疾病发生之间的关系。表观遗传学可以完成这样的工作是因为虽然DNA序列没有发生改变，但是表观遗传状态在人的一生中和不同的组织中是不同的，并且随着细胞逐渐适应人体内部环境和外部环境的改变，表观遗传机制将会通过对基因表达的编程和再次编程过程将这些改变记录下来[3]。
对于人类疾病，表观遗传学认为那是由于正常表型可塑性被破坏的结果。表型可塑性是指同一基因型受环境的不同影响而产生的不同表型，是生物对环境的一种适应。表型的改变包括行为、生理、形态等[4]。第一个由表观遗传学机制引起的人类疾病的例子就是癌症。1983年，研究发现与同一个患者正常的粘膜组织相比，结肠癌细胞DNA存在全面的去甲基化改变[5]。去甲基化被认为可以导致癌症基因的异常活跃，同时引起遗传不稳定性和染色体重组[6]。接着在癌症抑癌基因的启动子上发现存在高度甲基化[7～9]。
流行病学是关于人群疾病的研究，而疾病表观遗传学的进步只能来源于一门新兴的交叉学科，即表观遗传流行病学[3]。目前对表观遗传流行病学还没有公认的定义，Waterland and Michels[10]认为表观遗传流行病学是研究疾病发生危险与表观遗传变异之间关联的科学，而Jablonka[11]认为暂时的，表观遗传流行病学可以被定义为“研究可遗传的表观改变对疾病发生和分布的流行病学分支”。表观遗传流行病学在传统的流行病学病例对照研究、暴露测量和风险评估上做了一些改进。其所增加的表观遗传测量和统计学上的革新，主要是为了解决某些表观遗传方式不符合孟德尔遗传定律的问题。例如，某些印迹基因，其等位基因表达与否与其是来自于父亲还是母亲有关，这需要新的模型分析技术。
在表观遗传流行病学领域进行的第一项研究，是由De Baun等[12]建立的一个以人群为基础的脐疝巨舌巨人症综合征，beckwithwiedemann syndrome，BWS)登记系统。BWS临床表现为胚胎和胎盘过度增长、正中腹壁缺陷、耳垂皱纹或耳轮小凹、新生儿低血糖症、Wilms瘤和其他胚胎肿瘤的发生危险增加，例如肾上腺皮质癌、胚胎性横纹肌肉瘤和肝母细胞瘤等。BWS是了解肿瘤表观遗传学的经典范例，因为它是由少数几个基因发生表观遗传改变而导致的罕见家族性疾病。DeBaun等[12]设计了一个BWS登记系统，由一组专家通过对临床症状、家族史资料和医院病历进行严格调查，最终获得了数百个BWS家庭。研究将BWS每个临床体征发生的危险与每个遗传缺陷联系起来，第一个遗传缺陷就是胰岛素样生长因子II(insulinlike growth factorII， IGF2)基因发生印迹丢失(loss of imprinting，LOI)的改变。IGF2是一个印迹的生长因子基因，正常情况下只有遗传自父亲的等位基因才会表达，但是在BWS中，来自父亲和母亲的等位基因都表达了。这项研究最重要的结果是，虽然只有大约15 %的BWS患者出现IGF2基因的LOI改变，但是该研究将癌症的发生与表观遗传改变特异的联系在一起[12]。这是第一个以人群为基础将表观遗传暴露与肿瘤的发生特异的结合起来的范例，从流行病学角度探讨表观遗传学改变导致人类肿瘤发生机制的实例[12]。同时研究还将其他的表观遗传改变与BWS其他表型联系起来，将长QT内含子转录子1基因(long QT intronic transcript1，LIT1)基因的印迹丢失和细胞周期素依赖性激酶(cyclindependent kinase inhibitor，P57KIP2)基因突变与过度增长和正中腹壁缺陷联系起来，将单亲二倍体本身与低血糖症联系起来[12]。
二、表观遗传流行病学假说
由于表观遗传流行病学是一门新兴的交叉学科，其学科定义、发展方向和基本理论受到其前身学科流行病学和表观遗传学的影响。流行病学的发展方向虽然不断扩展，但其根本的学科定义和基本理论已经相当成熟。而表观遗传学这个学科名称虽然已经沿用了大约60年，但是学科领域正在不断扩展，其学科定义的内涵比较大而外延还在不断延伸中。因此作为下游学科的表观遗传流行病学的理论也在不断更新。目前表观遗传流行病学有若干假说，但是这些假说之间关系究竟是何种关系，还有待于进一步验证，本文仅提出两个相对成熟的假说。
1.年龄相关性疾病和常见疾病遗传和表观遗传学假说:现代医学更多关注的是减缓或减轻衰老造成的结果，而不是逆转和消灭疾病，因为对人类所有组织和器官的功能将随着时间的推移而逐渐衰退。有人将衰老定义为在相当一段时间内的表型可塑性的缺失[2]。这种可塑性的缺失会使得一些与潜在的与遗传变异相关的疾病的作用被加强，表现为部分与年龄相关常见疾病的发生，例如心脏病、糖尿病等。但是什么导致了这种表型可塑性缺失?这种缺失与疾病易感性位点的DNA甲基化水平是否存在相互关联?
Bjornsson等[13]提出了一个模型，可以从表观遗传学角度回答上述问题，这就是常见疾病遗传和表观遗传学模型(common disease genetic and epigenetic model，CDGE)。这是一个疾病遗传易感性模型，同时包括一个表观遗传因素与其相互作用。环境因素作用改变了DNA和染色质上的表观遗传学标志，例如DNA甲基化依赖于从膳食摄入的蛋氨酸和叶酸，后二者都受到个体营养水平的影响。对小鼠的研究发现，降低膳食中蛋氨酸的水平，可以通过改变agouti基因的DNA甲基化水平而改变其毛发的颜色[14]。给大鼠简单地摄入低蛋氨酸水平的膳食，可以通过导致其DNA发生去甲基化的方式，诱导其更容易发生肝癌[15]。
在CDGE模型中，表观遗传学组还可以间接地与基因组相互作用。一些因素如DNA甲基化转移酶I和MeCP2蛋白是由基因表达产生，如果基因存在变异，可以通过影响DNA甲基化机器的保真度来影响疾病的易感性。这一机制来自新杆状线虫蠕虫实验。研究发现，遗传变异可以影响很多信号途径，这些途径似乎与编码染色质重塑的基因有关[16]。反过来，一些常见的DNA变异所编码的突变蛋白，如果由于表观遗传学原因没有被表达，也不会产生生物学作用。一个非常明显的例子是Rutherford和Lindquist[17]进行的果蝇实验，通过热休克。这一种外界刺激，可以提高果蝇表观遗传学的筛选能力，从而允许一些潜在突变基因表达的频率更高，但是对生物体本身不会产生严重影响。
对一组不同年龄的同卵双生子同胞的研究发现，提示与年轻的同胞对相比，年龄较大的同胞对个体之间表观遗传学标志物，例如DNA甲基化水平的不一致性更大[18]。但是，这项研究没有探讨同一个个体不同时期的表观遗传改变情况，所以我们不知道这是由于DNA甲基化水平的变化，还是他们本身就有差异。后来的一项研究没有发现DNA甲基化水平的变异与年龄之间存在相关，但是这项研究同样的也没有分析单个个体的甲基化水平是否随时间发生变化[19]。
CDGE提供了一个流行病学框架，通过这个框架将表观遗传学引入到疾病年龄相关易感性的遗传研究。在CDGE模型中，表观遗传学编码可以修正有害基因的效应或者受到异常环境因素的影响。因此，将表观遗传学引入到人类疾病的流行病学研究中，有助于解释基因组和环境因素之间的关系，还可以为疾病预防和治疗提供新的线索。
2.疾病和健康的发育源性假说:在近40年内，越来越多的流行病学研究提示胎儿宫内生长环境对其一生健康和疾病状况有着重要的作用。Forsdahl[20]首先通过队列研究发现，挪威40～69岁人群年龄调整心血管疾病(cardiovascular disease， CVD)死亡率与同一人群婴儿死亡率呈正相关关系。这一结果提示宫内环境因素决定了个体今后发生CVD的风险。随后Barker和Osmond[21]发现，在英格兰和威尔士，新生儿死亡率高的地区，成年人冠心病(coronary heart disease，CHD)死亡率也比较高，提示宫内环境是一个重要的中间变量。
在英国赫特福郡进行的一次回顾性研究发现，新生儿出生体重与CHD病死率之间存在负相关[22]。随后大量的研究结果都提示，新生儿低出生体重与心脏病[23]、高血压[24]、II型糖尿病[25]的发病危险增加有关，此外新生儿低出生体重还与异常的血糖胰岛素代谢[25]和血清胆固醇浓度[26]变化有关。
宫内环境除了与上述成年期慢性疾病发病危险增加有关，还有假说认为与成年期癌症的发生有关。1990年Trichopoulos[27]认为，乳腺癌的发生可能与个体胎儿时期宫内因素暴露有关。新生儿高出生体重与其今后发生乳腺癌的危险性增高有关[28，29]。此外，儿童白血病和癌也与新生儿高出生体重有关[30]。因此，有学者提出，胎儿在宫内暴露于较高的生长激素水平，可能会启动一些潜在的生物学机制，使得新生儿的出生体重和细胞增殖增加，为成人期发生心脑血管疾病、癌症和其他慢性病设定了相应的风险[29]。
不同的研究采用不同的观察终点都提示了胎儿早期宫内环境暴露与其今后的疾病状况存在关联。Lucas[31]用“编程”一词来描述在胎婴儿发育的关键或敏感时期，外界的刺激或伤害将对个体出生后造成永久的或长期的影响。Waterland和Garze[32]采用“代谢性印迹”来描述在生命的早期，胎婴儿在特定的敏感时期，对特定的营养水平的适应性反应，这种反应将会在该个体的成年期长期存在。此外代谢性印迹还提出宫内暴露和结局之间的关系是特异的和可测量的，并且可以用剂量反应关系或阈值关系来表示。
2004年，Lucas和Gluckman等[31～34]提出了人类健康和疾病的发育源性假说(developmental origins of health and disease，DOHaD)，即在哺乳动物出生前和出生后发育的关键时期，营养和其他环境刺激将对哺乳动物的发育进程产生影响并且在代谢和慢性疾病易感性上引起永久的改变。尽管很多人群流行病学和动物模型实验数据支持这个假说，但是关于该假说的生物学机制目前还不清楚。Waterland等[10]认为要理解DOHaD的生物学机制，就需要对表观遗传学的定义有个清晰的界定，应当接受Jaenisch和Bird[35]关于表观遗传学的新定义，即表观遗传除了遗传基因表达的改变外，还应当包括遗传基因表达改变的可能性。这个定义上的微小改变是非常关键的，这样表观遗传不仅能遗传基因的表达情况，还可以将应对细胞外信号反应而改变基因表达水平的能力进行遗传。Waterland等[10]认为，不同的引起个体间表观遗传变异的因素都可以导致疾病的发生，除了遗传和表观遗传外，随机性也可以影响个体表观遗传调控的建立。在表观遗传机制建立和成熟过程中，环境刺激对出生前和出生后早期的表观遗传水平有着重要的影响，所产生的错误信息在以后的表观遗传复制中被不断积累，最终导致个体随着年龄的增长而表观差异变得越来越大，一些个体更容易发生疾病。
目前大多数关于DOHaD的人群流行病学研究，都是采用出生体重作为新生儿营养水平和宫内发育的标志，尽管出生体重的结果很容易获得，但是对宫内发育来说这个指标还比较粗，会受到很多因素的影响。今后需要采用一些能够反映代谢性印迹的分子生物学标志物对DOHaD假说进行研究。
三、表观遗传流行病学研究常用的指标
前面已经提及，表观遗传学涉及的研究内容非常广泛，目前研究最充分的是DNA甲基化水平的改变，这也是表观遗传流行病学最为常用的指标。DNA甲基化是一种可遗传的表观遗传改变，并且在基因的转录表达抑制、X染色体失活、基因印记和基因组稳定中发挥作用。异常的甲基化水平改变与许多疾病的发生有关，包括出生缺陷、肿瘤、糖尿病、心脏病和神经系统疾病[36]。甲基化反应通常发生在DNA序列中位于鸟嘌呤之前的胞嘧啶碱基上，后者通常被称为CpG双核苷酸。DNA甲基化是在DNA复制后形成，在胞嘧啶环的第5位碳原子上共价结合的一个甲基，从而形成甲基化胞嘧啶。发生这种表观遗传学改变的胞嘧啶占到了哺乳动物基因组总胞嘧啶数的5 %，并且这种改变虽然不是DNA序列的改变，但是可以遗传。DNA甲基化反应是由一组DNA甲基化转移酶(DNA methyltransferases，DNMTs)催化，并且利用S腺苷蛋氨酸(SAM)和DNA作为反应的底物。蛋氨酸、胆碱、叶酸和维生素B12可以直接的提供或者再生甲基单位，并且被证实可以影响DNA的甲基化水平[37]。
对于DNA甲基化的研究，目前有很多方法，黄琼晓等[38]将这些方法大致分为两类：一类是从DNMTs的角度，另一类是从DNA甲基化水平的角度进行研究，后者又分为全基因组甲基化水平和位点特异性甲基化水平。目前表观遗传流行病学较多采用全基因组甲基化水平作为指标。
由于叶酸可以作为一碳单位的载体参与蛋氨酸循环，为甲基化反应提供甲基单位[37]，因此很多表观遗传流行病学研究开始探讨叶酸增补对甲基化水平的影响及与肿瘤发病危险之间的关系。例如Rampersaud等[39]的研究发现，叶酸缺乏会显著降低全基因组甲基化的水平。Pufulete等[40]研究发现，与安慰剂组相比，结肠癌病例每日增补400 μg/d叶酸可以使得白血球全基因组甲基化水平升高31 %，结肠粘膜组织细胞全基因组甲基化水平升高25 %。
除了DNA甲基化外，研究比较充分的表观遗传学改变还有染色质重塑，例如丝氨酸的磷酸化、赖氨酸的乙酰化和赖氨酸的泛素化等[3]。但是，目前这些指标在哺乳动物的研究还很少，因此还未被表观流行病学所利用。
四、表观遗传流行病学的未来研究方向
现在越来越多的研究围绕着疾病表观遗传学进行了更加深入的分析，包括全基因组分析和更大人群的研究。这些研究依赖于分析技术的发展，这些技术可以在上百万个位点深入评价表观基因组的变化。Feinberg[3]研究常见疾病，如精神分裂症和孤独症所采用的方法是基于全基因组高通量芯片的相对甲基化水平分析(comprehensive high throughout arraybased relative methylation analysis， CHARM)。该方法用于分析全基因组两百万个以上CpG双核苷酸位点。
表观遗传流行病学目前仍然存在很多待解决的问题，例如在人群研究和动物模型中应当收集怎样的科学信息?发生改变的表观遗传状态是否稳定?它们是通过生殖细胞传递的吗?如果是，这种表观遗传改变将会持续多少代人?这些表观遗传改变是否可以被逆转?等等[11]。尽管表观遗传流行病学非常复杂，但是作为一个新兴的领域，丰富了经典流行病学研究的内容，使我们对人类疾病的病因和分布情况有了更加深入的了解，最终可以帮助解释基因组和环境因素之间的关系，为疾病预防和治疗提供新的线索。
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表观遗传学研究方法范文2
题目：表观遗传学调控NK细胞分化及功能的研究进展
表观遗传学 (epigenetics) 是指在基因核苷酸序列不发生变化的情况下, 通过对转录表达的调控和转录后的调控使基因表达发生变化, 包括DNA甲基化、组蛋白共价修饰、染色质重塑、基因印记、及非编码RNA、微小RNA (miRNA) 、反义RNA转录后调控等[1]。环境、年龄改变、压力、疾病状态等, 均可以引起免疫细胞表观遗传学改变, 造成免疫系统功能紊乱, 导致疾病的发生与进展。因此, 表观遗传学逐渐成为免疫学研究的热点。
自然杀伤细胞 (natural killer cell, NK) 是天然免疫细胞, 主要来源于造血干细胞, 全身广泛分布。NK细胞通过一系列细胞生物学过程获得激活信号, 包括胞外钙离子内流、细胞骨架重排以及与靶细胞接触部位免疫突触形成, 最终通过分泌细胞因子、趋化因子及释放毒性颗粒执行清除病毒、肿瘤细胞以及发挥免疫调节功能。NK细胞功能异常导致多种疾病发生, 包括感染、肿瘤及自身免疫疾病[2,3]。近年来, 有很多学者先后报道了表观遗传学改变对NK细胞增殖、分化及功能的影响, 为NK细胞研究提供了新思路, 为新药的临床应用奠定了理论基础。本文对NK细胞的表观遗传学研究进展作一综述。
1 表观遗传学对NK细胞分化的影响
人类NK细胞表面特异性表达CD56或CD16分子, 根据其表达水平将NK细胞分为CD3-CD56bright CD16- (CD56bright) 、CD3-CD56dimCD16+ (CD56dim) 、CD3-CD56-CD16+3个亚群[4]。其中CD56bright亚群为调节性NK细胞, 可以参与适应性免疫调节, 通过分泌细胞因子和趋化因子 (IFN-、TNF-、IL-10、IL-13和GM-CSF) 对树突状细胞 (DCs) 、调节性T细胞 (Tregs) 、辅T细胞 (Ths) 及细胞毒性T细胞 (CTLs) 等进行免疫调控[5]。在类风湿关节炎中, NK细胞可以通过分泌IFN-诱导B细胞活化, 促进DC细胞成熟, 并可抑制T细胞向Th17细胞分化[6]。NK细胞分泌IFN-可以促进DC细胞分泌IL-27, 而IL-27可促进IFN-分泌, 这种正反馈参与抑制Th17介导的自身免疫疾病[7]。人和小鼠NK细胞均可通过分泌IFN-可以抑制CD4+T细胞向Tregs分化[8]。CD56dim为功能性NK细胞, 通过穿孔素/颗粒酶途径、Fas/FasL途径、TNF-а/TNFR-1途径、以及抗体依赖的细胞介导的细胞毒性作用 (ADCC) 完成对靶细胞的直接杀伤。近期也有研究者发现, 功能性NK细胞参与适应性免疫的调节, 直接杀伤适应性免疫细胞, 如Th17及滤泡辅T细胞 (Tfh) [9]。而CD3-CD56-CD16+亚群目前研究较少, 目前认为主要发挥ADCC作用。
表观遗传学修饰在NK细胞的分化、成熟中发挥了重要作用。早期的研究显示, IL-15受体信号通路对NK细胞的分化成熟至关重要, E4BP4 (NFIL3) 在其中发挥调节作用, 促进了造血干细胞 (HSC) 向NK细胞分化。动物实验显示, E4BP4基因缺陷小鼠NK细胞减少、功能下降, 而过表达E4BP4可增加Id2和Gata3的转录, 从而促进HSC向NK细胞分化增加[10]。在NK细胞发育中, 组蛋白甲基化也具有重要调控作用。Yin等[11]研究了zeste基因增强子同源物2 (EZH2) 对早期NK细胞分化的影响。EZH2作为重要的表观遗传修饰酶, 是PcG (polycomb group) 蛋白家族的重要成员, 在调控基因表达的过程中起关键作用[12]。EZH2主要对组蛋白H3K27进行甲基化, 从而沉默下游基因, 在细胞增殖、分化及肿瘤形成方面都有重要作用[13]。研究者[11]发现, 在小鼠及人中, 选择性失活EZH2或用小分子抑制其活性后, 可以增加IL-15受体 (CD122+) 阳性的NK祖细胞数量, 并促进成熟NK细胞增殖。NK细胞的扩增及杀伤作用还与CD122及NKG2D有关, NKG2D缺失可降低EZH2抑制剂对促进NK细胞增殖及分化的作用。另外, Tsuyama等[14]研究报道, NKT细胞淋巴瘤患者存在组蛋白去甲基化酶KDM6A基因突变, 此基因与血液肿瘤关系密切, 可能影响NK细胞的增殖。
FcRIIIA (CD16a) 由FCGR3A编码, 为NK细胞在成熟过程中获得。研究发现, 在CD16a+细胞中, FCGR3A启动子中转录起始位点的甲基化水平较CD16a-细胞和中性粒细胞明显降低。此外, 研究者还发现miR-218是NK细胞CD16a转录后的负调控因子。在NK细胞中过度表达miR-218可降低CD16a的mRNA和蛋白表达水平, miR-218在CD16a-细胞中水平明显高于CD16a+细胞。因此, 研究者推断, FCGR3A的转录起始位点甲基化及转录后miR-218的调控作用可以通过改变CD16a的表达来调节NK细胞的分化成熟[15]。
记忆性NK细胞的概念由Sun等[16]最早提出。这类NK细胞可以长期存活, 具有免疫记忆功能, 当再次接触到记忆抗原时被激活。多种病毒可以诱导记忆性NK细胞产生, 目前报道的有巨细胞病毒, 单纯疱疹病毒、人类免疫缺陷病毒等[17,18]。记忆性NK细胞表达CD57和NKG2C, 不表达FcR、SYK、DAB2、ETA-2、PLZF和ILZF2。FcR、ETA-2、SYK的缺乏均有表观遗传学机制的参与[19,20]。IL-12信号通路通过其下游转录因子信号和转录因子4 (STAT4) 的激活影响记忆性NK细胞的扩增。Rapp等[21]发现Runx1和Runx3的启动子区域是STAT4的结合位点, 在NK细胞活化过程中, STAT4的结合会诱导RUNX基因位点的表观遗传学修饰, 从而导致表达增加。在病毒感染中, Runx1和Runx3或它们的伴侣分子表达减低是影响NK细胞扩增及记忆NK细胞形成障碍的原因。该研究证明, STAT4介导的Runx转录因子表观遗传学修饰可以调节NK细胞对病毒的适应行为。
2 表观遗传学对NK细胞功能的影响
NK细胞的功能主要包括杀伤及免疫调节作用。有研究显示, 在NK细胞活化过程中, 81%的主要位点出现CpG去甲基化, 生物学分析显示差异甲基化位点主要集中在免疫调节功能中 (如TNFA、LTA、IL-13、CSF2等) [22], 这提示表观遗传学修饰参与了NK细胞的活化, 并与NK细胞功能关系密切。
2.1 表观遗传学修饰对NK细胞表面受体的调节作用
NK细胞表面激活性受体与抑制性受体的相互平衡, 在NK细胞功能中发挥了重要调节作用。如激活性受体表达占优, 则NK细胞活化, 反之, NK细胞处于静止状态。
有学者[23,24,25]检测了NK细胞免疫球蛋白样受体 (KIR) 启动子的甲基化水平, 结果发现, 处于静息状态的人NK细胞92细胞系中KIR2DL1、KIR2DL2/L3高甲基化, 同时, 细胞表面的KIR表达降低。当应用5-氮杂胞苷进行去甲基化处理后, KIR启动子去甲基化, NK细胞表面KIR表达明显增加。另外, KIR的表达受miRNA调节。PIWI样RNA可以诱导KIR双向启动子KIR3DL1产生KIR反义转录本, 影响双链DNA的合成, 可减少90%的KIR表达[25]。
NKG2D是NK细胞激活性受体, 其表达增加可增强NK细胞功能。NKG2D通过识别不同的配体家族 (MICA、MICB、ULBPs 1-6等) 参与激活效应细胞、溶解靶细胞。NKG2D基因在NKG2D+NK细胞中去甲基化, 并与组蛋白H3赖氨酸9乙酰化 (H3K9Ac) 相关。用组蛋白乙酰转移酶 (HAT) 抑制剂 (姜黄素) 可以明显下调NKG2D基因H3K9乙酰化水平, 进而下调NKG2D的转录, 导致NKG2D表达减低, NK细胞杀伤功能下降。此研究提示NKG2D在NK细胞表面表达差异是由表观遗传学机制调节的, 并可以通过表观遗传治疗改善[26]。组蛋白去乙酰化酶抑制剂丙戊酸 (VPA) 通过激活基因启动子中组蛋白K9的高甲基化和DNA甲基化, 从而下调NKG2D的表达[27]。同样, miRNA也可发挥对NKG2D的调节作用。在HCV感染患者的NK细胞中, miR-182与对照组相比过表达, miR-182表达升高可降低NKG2D的mRNA水平, 而miR-182抑制剂能降低抑制性受体NKG2A的mRNA水平[28]。
2.2 表观遗传学修饰对NK细胞细胞因子分泌水平的调节作用
NK细胞分泌细胞因子同样受到表观遗传学修饰的调节。Luetke-Eversloh等[29]报道, NK细胞受到刺激后, IFN-及T-bet位点转录增加, 并发生去甲基化, 从而增加IFN-的分泌。Li等[30]发现, 在NK细胞激活过程中, 组蛋白去甲基化酶及甲基转移酶发生明显变化。在NK92细胞系中, 与NK细胞激活密切相关的PI3KCA, 、NFATC1及TNFSF9等基因, 经PMA和依诺霉素刺激可出现H3K4me3和H3K27甲基化修饰, 从而调控上述基因表达。采用H3K4和H3K37的特异性抑制剂可以增加NK细胞脱颗粒及IFN-、TNF-的分泌[22,30]。Cribbs等[31]用染色质甲基化及乙酰化的小分子抑制剂进行筛选, 并通过基因敲除方法确定了Jumonli型组蛋白H3K27脱甲基酶是NK细胞分泌细胞因子的关键调节因子。JMJD3/UTX (含有Jumonji结构域的蛋白3) H3K27去甲基化酶抑制剂GSK-J4可引发细胞因子转录起始位点H3K27甲基化, 并造成NK细胞IFN-、TNF-、GM-CSF、IL-10分泌下降。GSK-J4可以明显抑制类风湿性关节炎患者外周血或组织中分离出的NK细胞的细胞因子分泌, 抑制破骨细胞形成及骨破坏。除甲基化外, 组蛋白乙酰化修饰也对NK细胞细胞因子分泌起调节作用。VPA可抑制NK细胞对白血病细胞的溶解, 并且有剂量依赖性。VPA预处理可降低NK细胞IFN-分泌, 破坏CD107A脱颗粒, 并通过激活PD-1/PD-L1途径诱导细胞凋亡[27]。
H3K4me3脱甲基酶KDM5A调节基因转录并参与肿瘤的发生。Zhao等[32]研究证明KDM5A缺陷使IFN-产生减少, 并损害NK细胞的活化。KDM5A (-/-) 小鼠对单核细胞增生李斯特氏菌 (LM) 感染高度敏感。在NK细胞活化过程中, KDM5A的缺失影响STAT4磷酸化和核定位, 并增加了细胞因子信号转导抑制因子1 (SOCS1) 的表达。进一步研究揭示其机制为KDM5A与P50结合, 并与静止NK细胞中的SOCS1启动子区结合, 抑制染色质重塑, 导致在SOCS1启动子中H3K4me3修饰显著减少。
另外, Lee等[19]在研究记忆性NK细胞时发现, 人巨细胞病毒感染后, NK细胞Syk转录起始位点甲基化, Syk基因沉默, 可引起表达IFN-水平升高。BHLHE40为转录调节因子, 在活化的NK细胞中去甲基化, 诱导细胞因子分泌 (如IL-2、IL-12、IL-15、IFN、TNFA等) , 增强NK细胞功能。NFAT转录因子家族通过与启动子及增强子区域结合来增加NK细胞因子的表达。在活化的NK细胞中, NFATC1内含子9明显去甲基化, 可调节NK细胞分泌细胞因子[22]。
3 引起NK细胞表观遗传学变化的因素
多种疾病状态下, NK细胞的表观遗传学修饰会发生变化, 如巨细胞病毒感染会激活NK细胞, 引起81%的位点发生DNA去甲基化[22]。在儿童哮喘患者中, NK细胞DNA去甲基化, 引起NK细胞活性升高[33]。在类风湿关节炎及强制性脊柱炎中, NK细胞均存在表观遗传学改变[31,32,33,34]。
一些药物可以引起NK细胞的表观遗传修饰变化。Misale等[35]报道, 糖皮质激素可以通过影响H3K27me3来降低IFN-的表达, 从而抑制NK细胞的免疫功能。5-氮杂胞苷可引起NK细胞DNA去甲基化, 诱导相关基因激活, 促进NK细胞活化[36]。
运动也可以引起NK细胞表观遗传学修饰发生改变。Zimmer等[37]选取30例非霍奇金淋巴瘤患者及10名健康人, 干预组每人每天骑车运动30min。运动组的患者血清巨噬细胞游走抑制因子 (MIF) 及IL-6水平升高, NK细胞组蛋白H3、H4乙酰化水平降低。近期, 研究者再次证明运动可以通过升高组蛋白乙酰化水平及NKG2D的表达, 改善正常人NK细胞活化状态[38]。
压力及年龄的增长对NK细胞的表观遗传学也有明显影响。创伤后应激综合征可以加速NK细胞由年龄造成的甲基化水平升高, 从而影响机体免疫状态[39]。
综上所述, 表观遗传学修饰影响着NK细胞的增殖、分化、杀伤、免疫调节等, 在NK细胞调控中, 扮演重要角色。但目前, NK细胞表观遗传学研究多集中在基础实验阶段, 在临床疾病中的应用很少。NK细胞参与肿瘤、自身免疫疾病及感染的发病, 其异常是否与表观遗传学修饰有关?进一步研究NK细胞表观遗传学异常在疾病发生中的作用, 将基础研究向临床应用转化, 开拓疾病中NK细胞功能异常的新思路, 并为新型药物在临床中的应用提供研究基础, 将是本课题组今后努力的方向。
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表观遗传学研究方法范文3
随着对白血病发病机制的深入研究及其治疗方案的改进,白血病的完全缓解率也有明显的提高,但仍有一部分患者最终会复发。近年来的研究发现, 白血病的复发与微小残留病密切相关。微小残留病(minimal residual disease, MRD )是指经过诱导治疗达临床缓解时，白血病患者体内残留的少量白血病细胞。对患者进行微小残留病监测对白血病的治疗和预后判断具有非常重要的意义。检测MRD的关键是寻找分子基因标志。细胞免疫表型及遗传学的异常改变在急性白血病MRD 检测中占有重要地位。令人遗憾的是，这些方法只适用于少数患者，大多数患者并不具备遗传学的预后指标。随着对急性白血病分子生物学发病机制研究的进步，人们把急性白血病的发生归结为抑癌基因和原癌基因通过遗传学和表观遗传学机制的发生异常改变［1］。DNA甲基化作为一种重要的表观遗传调控机制，其与肿瘤发生、发展以及检测相关机制的研究逐步成为研究的热点。表观遗传学生物标记（Epigenetic biomarkers），特别是DNA 甲基化相关标记检测拥有遗传学标记、抗体等标志不具备的优势。本文就MRD细胞分子遗传学的检测方法及DNA甲基化检测MRD的临床应用进行综述。
1 常用白血病MRD检测方法的研究进展
1.1 分子生物学方法：遗传学的改变，包括染色体易位/缺失、基因突变等是白血病发生的基础，其所导致的正常基因表达调控紊乱和功能异常是白血病发生的主要原因。异常的遗传学改变，已成为急性白血病临床检验资料的重要组成部分。
实时定量聚合酶链反应( RQ-PCR ) 方法结合了PCR和荧光探针两种技术，通过定量检测白血病细胞中标志性基因实时观测MRD，是目前检测MRD最为敏感的方法，灵敏度可达10-4-10-5，已成为临床实验室建立MRD检测方法的首选。其检测的基因标志包括：（1）染色体异位形成的融合基因。如t(9:22), t(15;17),inv(16), and t(8;21)，T 细胞受体（T-cell receptor ，TCR）重排等，常见的融合基因包括: TEL /AML1、BCR /ABL、E2A /PBX1、MLL /AF4等。（2）在白血病中表达增高的肿瘤基因(如PRAME、 WTI 、PRAME、NPM1、STC- 1 等基因。（3）发生突变的基因(如FLT3 /ITD)。融合基因直接反映了白血病的病理特征,他在疾病发展过程中比较稳定,以其作为PCR检测MRD的分子标志具有特异性强、敏感度高的优点［2］。但是这些检查不仅价格昂贵，其检测的标本为RNA，存在不易保存，结果不稳定的缺点。更令人遗憾的是,由于白血病是一组异质性很大的恶性血液病，各亚型之间遗传背景不同，这些遗传学基因标志只能覆盖1/3的白血病类型，还有2/3类型的白血病不具备遗传学基因标志，无法在临床上进行MRD的检测。即使联合应用多种基因仍有40%～50%的患者无法找到适当的基因标志检测MRD，使其疾病状态缺乏准确的判断依据。
1.2流式细胞术( FCM)：FCM是通过检测在正常细胞上不表达或低表达而在白血病细胞上表达或高表达的白血病相关免疫表型来定量检测MRD，能够准确定量残留白血病细胞数，并且还能了解残留白血病细胞的凋亡情况［3］。其优势是每秒可检测5 000～10 000个细胞,并能用计算机记录处理,快速地对各个细胞进行多参数定量分析,灵敏度达到10- 4。但应用此法必须要对患者初发时的免疫表型特征有详尽了解,以便选择适当的标志检测MRD。因为白血病细胞与正常细胞相比, 通常低达10- 5～10- 6, 可能低于FCM检测范围而使这种方法缺乏特异性; 而且随着病程发展, 细胞表面的抗原发生改变, 会导致假阴性结果。
2 异常DNA甲基化检测白血病MRD的临床研究进展
DNA甲基化是指在DNA序列不变的情况下，通过影响基因转录活性以调控基因的表达。DNA甲基化作为一种表观遗传学改变与白血病的发生密切相关，在不改变遗传信息的前提下导致细胞遗传特性改变，作为肿瘤性疾病"二次打击"经典假说的重要补充，已成为白血病研究的新热点。DNA异常高甲基化导致抑癌基因的失活在白血病发生发展、诊断、监测微小残留病、预测病情以及指导治疗方面都有重要作用，这些表观遗传学标志作为MRD监测标志物的临床研究逐渐引起大家的关注。
P15基因甲基化与白血病的关系目前研究最为深入。73%～93%的急性髓系白血病(AML)和57%的急性淋巴细胞白血病(ALL)患者发生p15基因高甲基化，且持续p15基因高甲基化预示疾病复发。与p15基因甲基化患者相比，p15基因非甲基化患者5年DFS明显延长（15% v 62.5%；p＝0.02）［4］。
Au等［5］检测了l7例t-MDS/AMI 患者，l5例存在pl5甲基化。其中5例在发展为治疗相关的t-MDS/AML前即已存在pl5甲基化，最早为两年前。提示pl5甲基化发生在t-MDS/AMI 早期，检测p15甲基化有助于判断预后、指导治疗。在一组65例急性早幼粒细胞白血病的研究中，31例存在p15甲基化的患者5年无病生存率仅为29．64％ ，显著低于34例无甲基化的患者79%。p15基因甲基化与预后不良相关。
Id4和zo-1是我室新发现的两个血液系统相关候选基因，并对其在白血病发生、复发中的作用及应用于MRD检测进行了系列基础与临床研究。
采用MS-PCR的方法对完全缓解期白血病患者骨髓标本检测id4基因甲基化状态，结果发现：（1）58例完全缓解的急性白血病人MRD的检出率为41%，MRD阳性的患者12个月内复发率为62.5%，而非甲基化的患者12个月内复发率仅为10%。（2）16例异基因外周血干细胞移植后的白血病患者中，5例检测到MRD的患者中有4例在1年的随访期出现复发，而11例移植后MRD持续阴性的患者无一例复发。
研究对26例完全缓解的急性白血病患者进行zo-1基因甲基化检测，MRD检出率为34.6%，MRD阳性的患者12个月内复发率为57.1%，而非甲基化的患者12个月内复发率仅为15.4%，MRD阳性病人复发率明显高于阴性者。Id4和zo-1基因甲基化检测可能成为急性白血病新的生物标记用于预测疾病的预后以及复发。
随着PCR 技术的进步，将实时定量PCR（real-time PCR）与MSP 结合提高了甲基化分析检测的特异性和敏感性。高敏感性的甲基化定量PCR为MRD检测开辟了另一种解决方法。甲基化定量水平的变化对于细胞修复、肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标，可以从另一个层面上揭示其发生机制。因此，甲基化定量PCR技术被应用与临床各领域的研究。
Shuchi等［6］以启动子区高甲基化状态的雌激素受体α（estrogen receptor α;ER-α）和 p15INT4B 基因做为MRD标志，采用定量甲基化特异性PCR对180例急性白血病患者骨髓标本进行检测，结果发现：（1）临床缓解期的AML患者中, ER-α和p15INT4B基因启动子区呈现高甲基化状态的患者较低甲基化状态的患者有更高的复发风险，而且ER-α和p15INT4B基因启动子区甲基化水平的增高与患者无病生存期（disease free survival,DFS）缩短有明显相关性。（2）对5名儿童ALL患者ER-α基因启动子区甲基化程度进行了自诱导缓解后的追踪检测，结果提示疾病复发状态较缓解状态ER-α基因启动子甲基化水平增加。其结果与目前常用的MRD监测标志TCR/免疫球蛋白重排水平结果基本一致。
另一研究以启动子区高甲基化状态的p73、p15、p57KIP2基因为MRD标志，通过对199例Ph染色体和MLL阴性的处于完全缓解状态（complete remission,CR）的成人ALL标本进行定量甲基化特异性PCR检测，研究结果提示p73基因启动子区甲基化水平与第一次CR持续时间及无病生存期（DFS）及总生存期（overall survival, OS）缩短间有显著相关性［7］。因此，特定基因的定量甲基化PCR检测有可能成为一种评估急性白血病复发风险及MRD检测的有效手段。
结语
白血病作为一种恶性肿瘤，复发是影响其患者生存的主要问题。患者体内白血病微量残留病是复发的主要根源，对患者进行微量残留病监测在白血病的治疗和预后判断中具有非常重要的意义。遗憾的是，由于绝大多数患者缺乏明确的遗传标记作为早期检测和准确评估MRD的标志，在临床上常因治疗不足导致疾病复发或治疗过度引起严重并发症，绝大多数患者在发病后1~3年内死亡。因此，要在白血病MRD早期检测和指导治疗上有所突破，就必须寻找能够早期诊断白血病MRD的特异性强、通用性好的分子标志物。DNA 甲基化作为肿瘤相关标记，与遗传学标记、细胞表面抗体等标志具有更多的优势。首先，临床常规的肿瘤标记检测以蛋白或者RNA为对象，必须采集新鲜样本以确定检测结果的准确性。而甲基化检测则以DNA 为样本，很容易从各种体液中，甚至石蜡包埋组织中得到，极大地扩展了研究资源。其次，甲基化以DNA作为研究对象，较RNA 和蛋白更稳定，更容易保存。进而保证了检测结果的可靠性。因此，DNA甲基化定量水平的变化对于肿瘤预后、肿瘤化疗后的耐药等提供了新的研究指标，可以从另一个层面上揭示其发生机制。
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表观遗传学研究方法范文4
心肌缺血时,有氧代谢发生障碍,葡萄糖利用减少,脂肪酸利用增多,使氧利用率下降,心脏供能不足;同时,无氧代谢导致的酸性代谢产物增加,引起细胞内酸中毒。此外,心肌缺血还能引起氧自由基及钙离子超载,诱导心肌细胞凋亡,导致严重的临床症状。因此,改善能量代谢,清除自由基,减轻钙超载,抵抗细胞凋亡,实现心肌保护作用成为改善心肌缺血的重要途径[10]。研究表明,针灸在实现心肌保护方面具有自身的优势。一方面,针灸可通过改善能量代谢,实现心肌保护。心肌缺血时,能量代谢相关酶发生改变,电针能提高心肌组织糖原、琥珀酸脱氢酶和三磷酸腺苷酶的活性,纠正心肌相关酶的异常,增强能量代谢,改善心肌缺血。另一方面,针灸可减少自由基,缓解心肌缺血症状。热休克蛋白(HSP)属应激蛋白,能减少氧自由基释放,减轻心肌缺血损伤,从而保护机体[11]。研究证明电针“内关”穴可以增强缺血心肌细胞HSP90和HSP70mRNA表达,以减少氧自由基的释放,从而缓解家兔心肌缺血症状[12-13];而且,针刺“内关”穴能抑制细胞内Ca2+超载,实现心肌细胞保护,电针“内关”通过上调心肌钙泵和钠泵基因表达,增强钙泵和钠泵活性,降低心肌细胞内Ca2+含量,从而达到抑制钙超载,实现对心肌组织的保护作用,表现为促进心电活动、改善心肌组织形态和超微结构[14]。大量研究表明,针刺可以调控凋亡基因的表达水平,延长细胞周期,减少细胞凋亡,保护缺血心肌细胞。有研究指出电针可以调节诱导细胞凋亡因子Bax和抗凋亡因子Bcl-2在家兔缺血心肌中的表达,即抑制凋亡基因Bax和促进抗凋亡基因Bcl-2的表达,抑制心肌细胞凋亡,从而达到保护心肌细胞的作用[15]。c-fos基因是一种原癌基因,参与调节体内许多过程,如细胞周期、细胞分化、肿瘤转化及细胞凋亡等,正常情况下细胞内c-fos表达呈低水平状态,心肌缺血可激活c-fos基因的表达从而启动心肌细胞凋亡。研究表明,电针可降低c-fos基因表达,改善急性心肌缺血的过程[16-17]。所以不难看出,针灸能通过多种途径实现心肌细胞保护。总之,针灸干预心肌缺血的疗效和机制已初步得到证实和揭示,但尚未完全阐明,在一定程度影响了针灸治疗心肌缺血在临床的应用和推广。因此,需要引进新的理念、新的方法技术进行深入探索。
2表观遗传调控在针灸治疗心肌缺血的机制研究中的应用
目前主要涉及的表观遗传调控包括CG辅酶甲基化、组蛋白转录后修饰、RNA干扰等,具体可分为DNA甲基化、蛋白质共价修饰、染色质重塑、微小RNA调控4个方面[18-19]。越来越多的研究表明,表观遗传调控在心肌缺血过程中扮演重要角色,参与了疾病的发生、发展及预后的全部过程,因此,我们探讨从该角度开展针灸治疗心肌缺血机制研究的新方向。2.1表观遗传调控与心肌缺血的相关性以动物和人为载体的研究都表明,心肌缺血与表观遗传调控密切相关。表观遗传标记物在心肌缺血发生发展过程中的变化,反映出DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑及微小RNA是调控心肌缺血的关键因素。大鼠神经甲基化系统在心肌缺血中受到抑制,可导致缺血部位的儿茶酚胺浓度升高,作用于心脏,使心率加快,收缩力增强,心输出量增加;怀孕期间的营养不良会改变DNA甲基化,增加成年后患心血管病的风险,且DNA甲基化在6个特殊位点对产前环境很敏感,可能提高妇女患心肌缺血的风险[20-22]。同时,有研究认为,组蛋白H3赖氨酸4甲基化(H3K4me)转移酶和它们的辅助因子是调控胚胎发育及细胞特异性的重要因素[23];而Smyd2作为一种组蛋白甲基转移酶,介导H3K4甲基化,改变心肌细胞组蛋白甲基化修饰和心肌细胞靶基因的转录调控,促进心肌细胞分化和发育[24-25]。最新研究报道组蛋白H3赖氨酸27去甲基化酶赖氨酸K特异性脱甲基6A(UTX)可以促进心肌细胞生长发育,UTX基因敲除小鼠因心脏发育障碍死于胚胎发育早期[26]。除甲基化之外,组蛋白的乙酰化在心肌缺血中的作用受到广泛关注。发生心肌缺血后,心肌细胞蛋白发生了去乙酰化,抑制去乙酰化则能减少其损伤,组蛋白去乙酰化酶(HDAC)抑制剂通过组蛋白去乙酰化酶Sirt1介导,后者含量增加,能有效促进心肌缺血耐受,诱导心肌保护[27-29]。HDAC-7抑制剂可与缺氧诱导因子(HIF)结合影响基因转录,增强HIF活性,从而促进心脏血管新生[30-31]。同时,HDAC抑制剂曲古柳菌素A可降低缺血心肌凋亡基因Caspase3表达,抑制心肌细胞凋亡,也可促进干细胞向心肌细胞分化,介导心肌细胞再生[32-33]。进一步研究发现,组蛋白H3赖氨酸9乙酰化(H3K9ace)与缺血心肌保护密切相关,通过调节血管再生因子、细胞凋亡因子和HSP基因表达达到抗缺血性损伤效果。其中VEGF、Sirt1与组蛋白赖氨酸乙酰化关系最为密切[34-39]。除组蛋白修饰之外,microRNA上调或下调通过作用于靶基因激活相应的分子信号通路参与心肌保护,调控心肌缺血损伤。染色体重塑也被证明与心肌细胞生长发育相关[40-41]。
总之,DNA甲基化、组蛋白修饰、微小RNA等表观遗传调控在心肌缺血过程中具有重要意义。2.2表观遗传调控与针灸防治心肌缺血机制研究从上述表观遗传调控与心肌缺血的相关研究成果可知,表观遗传调控介导细胞凋亡、心肌细胞保护和心脏血管再生,在心肌缺血发生发展过程中具有特殊地位,是目前医学研究的热点。从该角度切入进行针灸防治心肌缺血研究,必然是今后研究的一个新方向。同时,结合表观遗传调控自身特性,即强调除了DNA和RNA序列以外,还有许多调控基因信息,虽然本身不改变基因的序列,但其通过基因修饰、蛋白质与蛋白质、DNA和其它分子的相互作用,多层次、多途径影响和调节遗传基因的功能和特性,这些调节同时存在可逆性。这与针灸作用整体性、综合性、双向性、多靶点的特点具有一定的相似性。因此,将表观遗传学的理念和技术引入针灸抗心肌缺血机制研究,乃至整个针灸研究领域,都具有较强的可行性。结合针灸自身优势特点,以及其抗心肌缺血研究现状,融合上述表观遗传调控在心肌缺血发生发展过程的作用特点,我们认为,今后的研究可从两个方面进行,一是针灸对心肌缺血疾病的预防。治未病思想历来是中医理论的核心,早在《黄帝内经》中就强调“不治已病治未病”。现代研究证实,针刺具有提高机体机能的作用,如实施心肌缺血再灌注手术前针灸“内关”穴,能提高心肌细胞耐缺血能力,延长动物生存期,这无疑为心肌缺血患者赢得了宝贵的抢救时间[42]。而表观遗传调控与之密切相关,HDAC直接参与耐缺血,如果以此进行深入研究,一旦得以证实,将为临床进行再通手术前实施针灸干预的应用提供科学依据[43]。另一方面,则是在现有的研究基础上,继续深入探讨针灸抗心脏缺血机制研究。根据心肌缺血的不同阶段,有重点地开展相应研究。如急性期、亚急性期,主要围绕针灸促心肌细胞存活、抑制细胞凋亡,以及改善能量代谢,从而实现心肌细胞保护进行研究。针灸能有效调控心肌组织中Sirt1、HSP70、Caspase3、c-fos、Bcl-2等物质的表达,实现保护心肌目的,但其背后的调控机制如何,尚未得到证明。研究表明,HDAC能有效调控Caspase3表达,H3K9ace能影响HSP70水平等,从这些角度深入揭示针灸促心肌保护机制,将为针灸的更广泛应用提供基础。在慢性期,则主要围绕促进血管新生开展。已有的研究证实针灸能促缺血区域的血管新生,且与VEGF密切相关,但调控VEGF表达发生改变的机制并未得到证明。肿瘤存在大量的新生血管,研究中发现,H3K9ace在此过程中扮演重要角色,我们可以推测,在针灸促VEGF表达,介导血管新生过程中,H3K9ace可能具有重要意义。同时,也可以充分结合针灸抗心肌缺血机制研究成果,着重筛选出相应优势靶点,进行新药开发,或许可能成为新药开发的新靶点。除此之外,还可进行相应的拓展。研究表明,心脏中存在心肌干细胞,在某些影响因素干预下,能不断增殖、分化形成新的心肌干细胞。这个过程中表观遗传调控发挥重要作用[44]。针灸有促体内干细胞增殖、分化的能力,比如促脑内神经发生,实现脑保护[44-45]。那么针灸是否也能促进心脏干细胞增殖、分化,实现心肌保护?从表观遗传学的角度研究,也将成为我们关注的方向。
表观遗传学研究方法范文5
【关键词】钉螺；血吸虫病；生物学特性；人工培养；综述
【中图分类号】R532．21【文献标识码】A【文章编号】1673－5234（2015）12－1148－03
血吸虫病（schistosomiasis）是一种严重的共患寄生虫病，呈全球分布。在我国主要流行的是日本血吸虫病。2013年全国共报告血吸虫病感染184943例，晚期血吸虫病患者29796例［1］，血吸虫病的流行位居水传播疾病之首，严重影响我国的社会经济发展和人类健康。钉螺（Oncomelaniahupensis）是日本血吸虫的唯一中间宿主，主要分布在亚洲东部和东南部，中国内地仅有湖北钉螺一种，钉螺分布与血吸虫病的流行息息相关。目前防控该病最常用的方法是消灭钉螺，人工培养钉螺对研究钉螺的生物学特性和筛选灭螺药物具有重要意义。本文对钉螺的生物学特性和人工培养的方法进行综述。
1钉螺的生物学特性
1．1形态学
钉螺为水陆两栖，常栖息于田间、池藻等淡水水域。它主要由螺壳和软体两部分组成，软体部分的前部为头、颈、足和外套膜，后部是内脏；表面有纵肋者称“肋壳钉螺”，壳长约10mm，宽约4mm。壳面光滑者称为“光壳钉螺”，比肋壳钉螺稍小，长、宽分别为6mm和3mm，多见于山丘地区。钉螺形态学特点主要包括形态特征、解剖结构等方面。钉螺早期的研究重点集中在钉螺内外部的形态结构变化，如螺壳形状、螺肋的数目及厣核的旋数［2］，并以此来认识与鉴别钉螺，如巴西钉螺被认为是光壳钉螺的一种，螺壳黑色，螺壳外唇无隆起线，壳光滑有黄色“假眉”，厣与齿舌与湖北钉螺相同［3］。钉螺的形态特征是研究钉螺的分类、遗传和进化的基础，分布于山区的光壳钉螺和分布于湖沼水网地区的肋壳钉螺生存条件不同。湖北钉螺具有遗传多样性，而且具有不同程度的遗传变异［4］。石朝辉等［5］通过对湖北庙河上下游钉螺调查发现，两个地区钉螺分别为光壳钉螺和肋壳钉螺，上下游螺群的遗传距离并无明显差异。
1．2分类学
钉螺俗称钉螺蛳，为动物界第二大动物门－软体动物门腹足纲中的一类，有雌雄之分。早期对钉螺分类的研究主要是以钉螺形态学和解剖学为依据的，自1913年宫入庆之助和铃木稔在日本证实光壳钉螺为日本血吸虫的中间宿主以来，对钉螺分类的依据主要是根据形态和解剖结构，如螺壳、螺厣和螺肋数目及齿舌形态特征。美国Bartsh根据螺旋数、齿式将钉螺分为Oncomelania、Katayama和Schistomophora［6］。有学者发现螺壳颜色、螺厣、齿舌等差异不大，认为钉螺的分类以形态结构为依据并不严谨［7－8］。近年来分子生物学技术的发展对钉螺分类的研究起到了重要作用。George等［9］通过对中国大陆不同地区、不同种群钉螺的同工酶进行比较，再结合螺壳形态学的基础将湖北钉螺再分成3个亚种：滇川亚种（O．h．robertsoni）、福建亚种（O．h．tangi）和湖北亚种（O．h．hupensis）。牛安欧等［10］利用单重复序列锚定PCR技术（SSR－PCR）将中国大陆7省的湖北钉螺分为4类。周艺彪等［11］采用微卫星锚定PCR分子技术对19个种群钉螺的基因DNA进行分析，进一步验证了中国大陆湖北钉螺分为滇川亚种、广西亚种、福建亚种和指名亚种等4个亚种。
1．3遗传学
钉螺的生物特征、地理分布以及日本血吸虫和钉螺之间的相容性都与钉螺遗传学特性密切相关。表观遗传学、分子遗传学和景观遗传学的研究应用在生物灭螺中起着不可替代的作用。早期，表观遗传学常用来作为钉螺分类依据，刘月英等［12－13］认为中国大陆钉螺属于一属一种，世界各地钉螺作为同一种属只有种下亚种和地理株之分，但种下具体如何分类尚未得到解决。随着分子生物学的发展，钉螺种群同工酶谱的分析、DNA基因序列的研究进一步得到发展。日本血吸虫与钉螺之间的相容性主要取决于两者之间的同工酶等位基因［14］，而且不同种群的钉螺对日本血吸虫的相容性不同［15］。周晓农等［16］研究了中国9省34个地区螺群的同工酶，结果表明钉螺种群间的变异程度较大，而同种群内的变异较小，肋壳钉螺的遗传变异分化程度小于光壳钉螺，且钉螺从喜马拉雅山脉扩散至世界各地，因环境变化，基因也发生了剧烈漂移。景观遗传学是在2003年由Manel［17］首次提出，其结合了景观生态学和种群遗传学的特点，意义在于研究物种微进化与景观环境之间的关系，为研究钉螺遗传变异分化提供了新的研究方法［18］。崔斌等［19］采用微卫星锚定技术对湖北松滋地区不同景观环境下钉螺遗传特性进行分析，结果表明湖北钉螺种群间遗传变异并不明显，而钉螺个体间变异显著。景观遗传学作为一门新兴学科，将人类及其活动纳入了研究范畴，在理论和方法方面有很大的发展空间。
1．4生态学
钉螺繁殖、分布及扩散等生态学特征与血吸虫病的流行息息相关。钉螺生态学的研究对血吸虫病的传播和预防可以起到理论指导作用。钉螺的生长繁殖易受灭螺药物和环境改变的影响，其分布密度与植被盖度有关［20］。林丹丹等［21］对鄱阳湖的自然环境进行研究发现植被总盖度与钉螺分布成正比，总盖度越高钉螺分布越广。地形是影响钉螺分布重要的因素之一，杨慧等［22］对云南地形的考察，发现云南地形以山区为主，呈孤岛性分布，扩散不明显，建议灭螺范围应以阳性钉螺分布地区为主，并适当扩大范围。钉螺的扩散方式主要以主动扩散和被动扩散为主，水流、光照强度、钉螺吸附能力以及水中障碍物均可影响钉螺的扩散［23］。此外，自然因素和社会因素如水灾、水利工程建设及旅游开发等也可影响钉螺分布与扩散。
1．5生理生化
钉螺的生理生化对研究灭螺药物的作用机制以及灭螺效果具有重要意义。杜小华等［24］用不同浓度的水和乙醇提取物配置成不同浓度的羊踯躅溶液进行灭杀钉螺实验，结果显示浓度不同的提取物处理钉螺后的灭杀率不同，其中以70％乙醇提取物灭杀钉螺的效果最佳。周康等［25］通过实验发现瑞香狼毒同上述几种药物一样对钉螺的主要能量代谢物质糖原有较强的抑制作用，而且以浓度为70％乙醇提取物的效果最好。黄春兰等［26］用硫酸、蒽酮比色法鉴定湖北钉螺各月份的肝、头足部肌肉和整体软体组织的糖原含量，结果表明整体软体组织和肝的糖原含量随着时间的推移而下降。吴明煜等［27］用不同浓度的蛇床子总香豆素处理液浸泡钉螺，在浸泡液处理的前96h内，钉螺体内糖原的含量随着浸泡时间的延长而降低，说明蛇床子总香豆素可以影响钉螺的糖原含量。胡彦龙等［28］研究发现田皂角甙当浓度超过0．80g／L时可以明显降低钉螺体内糖原含量，降低的幅度达12．49％～73．16％。刘金涛等［29］发现浓度大于0．85g／L的苦楝子可以降低钉螺内的糖原含量，降低幅度为10．78％～69．94％。过氧化物酶、三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶、乳酸脱氢酶是钉螺进行有氧呼吸的关键酶，抑制这些酶的合成可以有效地杀灭钉螺。顾文彪等［30－31］用苦楝叶提取液浸泡钉螺发现三磷酸腺苷酶、琥珀酸脱氢酶和乳酸脱氢酶降低，而一氧化氮合成酶增高，一氧化氮合酶的升高可以使NO合成增加，破坏钉螺机体内的线粒体氧化磷酸化，使能量合成受抑制，达到杀灭钉螺的效果。王万贤等［32］分别采取樟树的新鲜叶、茎皮和根皮调配成1％、0．5％、0．1％、0．05％等4个不同浓度的溶液处理钉螺，结果显示钉螺体内的过氧化物酶的活性随着浸泡的时间延长活性降低，其中以根皮的效果最好，叶的效果较差，建议大量种植樟树作为生态林可达到较好的抑螺效果。
2钉螺的人工培养研究
2．1钉螺螺卵的孵化和幼螺的生长
对于钉螺螺卵的孵化和幼螺的生长，主要的影响因素为温度、水和食物。钉螺螺卵的正常孵化需要在水中或是湿润的泥面上［33］，饲料以奶粉及复合动物饲料为主，其中藻类喂养幼螺存活率较高，达90％以上，且生长良好［34－35］。田建国等［36］采用了收集螺卵恒温孵化法、直接恒温孵化法和自然状态孵化法三种方法对钉螺螺卵进行孵化，结果显示泥土也可以影响钉螺螺卵的孵化。
2．2成螺的人工培养
成螺培养因实验目的不同，室内培养方法也不尽相同，常用室内培养感染性钉螺是泥盘草纸饲养法［37］。成螺培养主要为感染性钉螺，其中毛蚴感染钉螺的比例至关重要，张聪等［38］采用泥钵内铺细土泥法，按毛蚴与钉螺数量比为5：1、10：1、20：1三种不同比例进行感染，结果显示毛蚴感染的比例为10：1时，钉螺阳性感染率最高。
3结语
表观遗传学研究方法范文6
1 miRNAs与食管癌
miRNAs已经在食管癌组织样本中得到了广泛的研究（见表1）。
miR-21是较早发现的miRs，其基因位于染色体17q23上。Feber等[10]分析了一个小样本，分别来源于新鲜冻存正常上皮（n=9）、ESCCs（n=10）、BACs（n=10）和前期病变（n=6），方法为miRNA芯片和生物信息学聚类分析，他们检测到肿瘤中miR-21的表达量比正常上皮细胞增加了五倍。Akagi等[11]应用定量逆转录PCR发现miR-21在ESCCs中升高，特别是在那些伴有淋巴结转移的患者中。由于ESCCs和BACs不仅由肿瘤细胞组成，还有不同比例的浸润白细胞，在以上所有研究中测到的miR-21的特异性，需要根据所选肿瘤细胞和miR定位以及下游分析物的精确度来重新考虑。
2 DNA甲基化与食管癌治疗
只有少数研究关注或检测了ESCCs中DNA的低甲基化，Lima等[12]通过10个ESCCs病例，选取新鲜冻存肿瘤组织和正常鳞状上皮，分析其DNA甲基化模式，数据显示肿瘤高度甲基化基因有BCL3，属于κB家族抑制剂，调节NFκB活性，以及TFF1，一个三叶草因子家族成员。BCL3或TTF1DNA甲基化以及蛋白质表达改变产生的功能上的结果仍然需要阐明。在另一项BACs全基因组甲基化研究中，Alvarez等[13]把一小组经组织学证实为BACs的新鲜冰冻组织样本和与之相关的前期病变进行平行分析，分析内容包括：①全基因组胞嘧啶甲基化；②RNA文库；③基于测序的比较基因组杂交。DNA甲基化检测法是基于Hpall小片段富集连接介导的PCR，候选轨迹通过基于质谱的高通量定量甲基化PCR分析来验证。值得重视的是，该研究揭示了与DNA高甲基化相比，DNA低甲基化在早期BAC致癌作用中的优势。此外，文章作者检测了一系列基因的DNA低甲基化，它们与免疫系统例如趋化因子（如CXCL1，CXCL3）有关。在BAC致癌作用过程中，DNA甲基化也发生在CpG岛之外的基因区域。再有，通过结合DNA甲基化、RNA文库、aCGH分析和体外功能试验，Alvarez等人很好地支持了一个事实，即单个候选位点和/或DNA甲基化分析不足以揭示表观遗传、基因和功能性结果之间的复杂联系。
总的来说，尽管受DNA甲基化调节的许多基因已经确定，但ESSCs和BACs中DNA甲基化和与之相关生物学效应和功能仍需进一步研究，期望能够从分子病理学角度认识它们的致癌作用，进而在未来的工作中将靶向于DNA甲基化的药物变成现实。
3 食管癌致癌作用和组蛋白修饰
食管癌组织样本的组蛋白修饰研究局限于一系列排除ESSCs并且涉及到免疫组化染色得到的特异性组蛋白标志。另外两个结合了ESCCs中几种组蛋白标记的全方位研究也已经进行。Tzao等[14]检测了组蛋白3赖氨酸18（H3K18ac）、乙酰化组蛋白4赖氨酸12（H4K12ac）、二甲基化的组蛋白3赖氨酸4（H3K4me2），以及三甲基化组蛋白3赖氨酸27（H3K27me3）。在他们的研究中，组蛋白标记物与肿瘤分化（H3K18ac， H4K3me2， H3K27me3）、肿瘤阶段和淋巴结状态（H3K27me3），以及改善的预后（低H3K18ac， 低H3K27me3）有关。
考虑到HDACs对食管癌治疗的潜在作用，它的几种抑制剂起着越来越受重视，但目前这方面研究很少。Toh等[15]描述了ESCC中HDAC1下调和正常鳞状上皮的比较。在一个更为全面的研究中，Langer等[16]收集了180例BACs，其中2/3患者的主要治疗是切除肿瘤，另外1/3先接受化疗。大体上，分别有50%和30%患者观察到HDAC1和HDAC2表达减少。只有HDAC2与病理指标（肿瘤分化、淋巴结分期）有关，HDAC1和HDAC2都没有显示出对预后有影响。
我们相信，随着研究的不断深入，表观遗传治疗将有望为食管癌的治疗带来新思路及方法，对预防及改善预后、减少复发等起到关键作用。
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