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表观遗传学的意义范文1
中图分类号 G633.91 文献标志码 A
表观遗传学为人们理解遗传现象提供了全新的视角，成为“后基因组”时代的重要研究内容之一。同时，表观遗传学作为一个前沿领域，将是高中生物课程内容的一部分。如何在高中课程中实现其教育价值，对教育工作者又提出了新的要求。
1 表观遗传学：从“意外”发展而来的科学领域
“众所周知，DNA是生命的基本遗传物质，但令人怦然心动的是，你可以继承的不仅仅只有DNA序列，还有表观遗传信息。”表观遗传学是从对经典遗传学理论无法解释的“意外”现象的探索中发展起来的，这也使表观遗传学的研究格外令人着迷。
经典遗传学认为，遗传信息储存于核酸序列中，并通过生殖将遗传信息传递给下一代。它所揭示的“基因型决定表型”的遗传模式被广泛认知。然而，不符合此模式的遗传现象却一直困扰着遗传学研究者们。作为遗传信息完全相同的同卵双胞胎为什么会在成长发育过程中表现出不尽相同的外表特征？在生物体的发育过程中，虽然每个细胞拥有相同的遗传物质，为什么它们却遵循高度的时空特异性，从而分化为不同的组织？在过去的30年中，随着对DNA甲基化、组蛋白修饰、X染色体失活、基因组印记以及非编码RNA等领域的不断深入研究，许多困惑科学家已久的遗传学问题得到了解释，表观遗传学也逐渐成为一个新兴的热点研究领域。
表观遗传现象被定义为“非DNA突变引起的可继承的表型变化”。其中包涵三个关键点：
（1） 不是由DNA突变引起的；
（2） 可以继承的，或是说可遗传的；
（3） 引起了表型的变化。
一直以来，DNA被认为是遗传信息的唯一承载者。表观遗传学的研究表明，子代可以继承的不仅仅有DNA携带的遗传信息，还有“表观遗传信息”。而这些表观遗传信息虽然没有伴随DNA序列的改变却可以遗传下去。例如，在发育过程中，分化后的细胞和组织之间存在明显的表型差异，这些差异一旦形成便可以以一种克隆性的方式遗传给子代细胞。需要说明的是表观遗传现象中的表型变化是“开关”型的，即这种表型非“有”即“无”，而不是程度上的变化。
表观遗传学与克隆、干细胞、衰老与癌症等研究都有密切联系。在“后基因组”时代，表观遗传学的发展对生物学研究以及人类疾病领域的研究都具有深远的意义。
2 发挥表观遗传学在高中生物学中的教育价值的教学策略
表观遗传学现象广泛存在于生命周期的各个过程中，表观遗传学的调控对生物体来说具有普遍且重要的意义。不过，目前国内外高中生物教材几乎都没有完整介绍表观遗传学相P内容的章节。其原因固然比较多，但主要原因有：表观遗传学是近些年来才发展迅速，属于比较新的研究领域；表观遗传的机制非常复杂，要让高中学生理解其内在机制，有一定困难。然而，将表观遗传学的内容纳入我国的高中生物课程，已经基本达成共识。那么，这一内容在高中生物课程中的教育价值究竟表现在哪里？笔者认为，它不仅仅是为了让学生掌握更多的遗传学知识，完善遗传知识体系，更重要的是发挥它在提升学生学科核心素养方面的价值。
2.1 引导学生深入理解科学的本质
目前，人们对“科学的本质”还没有一个统一的定义，《2061计划――面向所有美国人的科学》所阐述的科学的本质得到很多学者的认可：
（1） 科学世界观：自然是可以理解的；科学知识是可改变的；科学知识并非很容易就可以；科学并非万灵丹，能解决所有的问题。
（2） 科学探究活动：证据对科学而言是重要的；科学是逻辑与想象融合成一体；科学知识除了能说明自然界的现象也具有预测的功能；科学家会验证理论以减少误差；既定的科学知识并不具有永久的权威地位。
（3） 科学事业：科学是人类的一项事业。
表观遗传学的发展历程，典型地体现出了科学的本质。因此，表观遗传学内容的教学，应着力于引导学生更好地理解科学的本质。
2.1.1 引导学生理解科学具有开放性
表观遗传学的发展表明，人类对遗传现象和本质的认识是不断发展的，因此，科学知识是一个开放的系统。虽然遗传学已经建立100多年，但是科学家们并没有停止对遗传问题的探索，遗传学仍然在发展。
在教学中，教师可以让学生尝试回答：“为什么遗传背景相同的同卵双胞胎在成长过程中会出现表型差异？”“为什么克隆后的小猫与‘单亲妈妈’会有不同花色？”……学生在寻求答案的过程中，会发现用之前所学的经典遗传学知识并不能回答好这些问题，而是要进一步寻找更合理的科学解释。由此可以让学生直观地感受到科学的开放性。
2.1.2 引导学生感悟科学讲求证据与逻辑
人们对遗传现象的认知程度会随着科学的发展而改变，但所有观点的产生都不是异想天开，而是基于科学实证。表观遗传学从对现象的认知到理论的建立都是基于科学证据的积累。这期间出现了很多假说，也经历了理论的不断提出与的过程。虽然目前仍然有很多还不能够被解答的问题，但是通过科学家们在DNA与组蛋白修饰、染色质重组以及非编码RNA等领域的不断探索，人们已经可以解释很多表观遗传学现象。科学研究的发展往往从认知规律开始，进而通过科学探究来逐步揭示规律形成的机制。教学时，如果教师引导学生基于表观遗传的现象，科学家揭示现象获得的研究事实来得出结论，既可以让学生更好地理解表观遗传学内容，知道知识是如何形成的，也能进一步引导他们认识到科学是重视证据和逻辑的。
2.1.3 引导学生理解科学的连续性
科学的本质特征，一方面表现在科学知识是暂时的、可变的；另一方面表现为科学知识又具有持久性。虽然科学家反对绝对真理的概念，并认为其中不确定性是事物本性的一部分，但绝大部分知识都具有持久性。因此，改变性与连续性是科学一贯的特征。高中阶段学生对表观遗传学相关内容的学习，既需要、也可以体现出科学的连续性。
经典的分子遗传学可以说是从“基因”的层面来进行研究，表型的改变归结于DNA序列的变化。而表观遗传学是从“染色质”的层面来进行研究，表型的改变归结于染色质状态的调整。所以表观遗传学狭义的定义为：通过调整染色质状态，在不改变DNA序列的情况下实现对基因转录的调节。学习有关内容时，教师要引导学生认识：表观遗传学的发展对经典遗传学来说并不是一种质疑和挑战，而是一种补充，是遗传学研究的一种延续。随着表观遗传现象分子机制的揭开，其与经典遗传学以及普遍的生物调控更容易地被结合起来。这种联系是一直就存在的，只是科学家需要通过对科学的不断探究去发现和理解它。科学是人类的一项永无止境的事业，遗传学的探索还将继续为人们揭开更多生命的奥秘。
2.2 注意引导学生进一步建立生命观念
“生命观念”是理解生命的本质所需要的观念，是对观察到的生命现象及相互关系或特性进行解释后的抽象。构建生命观念是发展核心素养的重要组成部分。表观遗传学内容的学习可以帮助学生完善结构与功能观、进化与适应观以及稳态与平衡观。
2.2.1 注意凸显表观遗传学如何体现出结构与功能的统一性
结构与功能观是基本的生命观念之一。结构是功能的基础，功能的有效执行必定依赖于特定的结构。在生物体的生命历程中，结构与功能是一个不可分割的整体。
表观遗传现象充分体现出结构与功能的辩证统一关系。研究结果表明，在表观遗传学“开启”和“关闭”两种不同的表型状态下，总是可以在其中的关键调控点找到结构差异，即结构决定功能。染色质在结构上并不是均一存在的，既有相对松散的有利于基因表达的常染色质，又有高度浓缩使基因沉默的异染色质。常染色质是以一种开放式的、对转录等过程所需的各种酶更为敏感的构象存在，随时可以开启基因的表达。而异染色质以一种超浓缩的致密结构存在，转录等相关的酶无法结合上去，从而抑制表达。这体现出染色质的结构和功能是相适应的。表观遗传学的各种机制之间其实是相互关联的，表观遗传因素通过调节染色质的结构、对染色质进行修饰等来影响基因的转录，从而达到调节功能的目的。
在教学中，教师可以结合表观遗传的实例渗透结构与功能观。例如，表观遗传学因素导致雌性哺乳动物的一条X染色体失活，失活后的染色体以致密的异染色质状态存在，称为巴氏小体。以玳瑁猫为例，玳瑁猫（母猫）的体表有黄色和黑色随机分布的花斑。控制黄色和黑色毛色的基因是位于X染色体上的两个等位基因。在个体的发育过程中，细胞内的一条X染色体随机浓缩而失去活性，从而呈现出这种黄黑相间的花色。
2.2.2 注意发挥表观遗传学在建立进化和适应观念上的价值
“生物进化”是生物学核心概念的重要组成部分，提供了将大部分生物学知识建成一个整体的框架。“遗传”“进化”与“环境”三者之间存在很微妙的关系。生物进化的前提是有可遗传的变异；遗传素材的多样性为自然选择提供了更多的原料从而更好地适应环境；而环境又像是一个有力的推手影响着进化的方向。表观遗传学的学习是一个将遗传、进化与环境很好整合的过程，能够帮助学生进一步理解三者的内在联系。
生物体能够产生后代并稳定遗传依赖于稳定传递的遗传信息与精密的调控机制。表观遗传信息的发现是对遗传信息的重要补充，拓展了遗传密码（DNA）的信息承载量。表观遗传信息的加入相当于扩大了遗传样本量，为自然选择提供了更多的素材。很多表观遗传学现象都是在生物后天的发育中表现出来的，体现出环境的塑造性。借助表观遗传学研究手段，人们能更好地理解环境因素对生命的影响，进一步理解“基因型+环境=表型”这一遗传学命题。研究结果显示，从单细胞到多细胞，表观遗传相关的DNA甲基化、组蛋白修饰的程度与类型以及RNA干扰机制在不同的物种中具有显著的差异，暗示着表观遗传调控在生物进化过程中的作用。表观遗传信息的发现以及表观遗传调控机制的研究对进一步理解遗传与进化具有重要意义。
2.2.3 利用表观遗传学内容引导学生建立稳态与平衡观念
在自然界生存，生物种群会找到一个合适的平衡点来有效地适应环境从而维持稳态。稳态不是恒定不变的，而是一种动态的平衡。动态平衡无处不在，各物种与生存环境之间存在平衡，物种之间存在平衡，种群之间存在平衡，个体之间存在平衡。与此同时，每一个生物个体也是一个复杂而精密的系统，在生存过程中，个体的各种结构之间、各种调控机制之间都存在平衡。在进行表观遗传学的教学时，教师可以通过以下几个层次引导学生建立相关的生命观念。
雌性与雄性之间的平衡：众所周知，X染色体的基因携带量较Y染色体来说是大很多的。如果雌性动物的两条X染色体都具有活性，那么雌性性染色体所携带的基因数目几乎是雄性的两倍之多。在哺乳动物中，雌性个体的一条X染色体会随机失活，从而维持与雄性之间基因的剂量平衡。
染色质结构之间的平衡：基因的表达与沉默是一个复杂且精密的过程。在哺乳动物中，染色质中的常染色质比例只占不到4%，而剩余的96%都为异染色质。需要注意的是，沉默染色质是动态变化的，这增加了问题的复杂性。要维持和延续染色质的这种动态平衡状态必定需要一个十分可靠的调控过程。因此，表观遗传现象往往是多种机制共同作用的结果。
表观遗传调控与环境因素之间的平衡：在表观遗传学研究还不明确的年代，人们常常把经典遗传学无法解释的现象都归结于“环境”的因素。研究数据表明，环境因素可以通过影响表观遗传标记从而影响基因功能。表观遗传具有时间上的多样性，同卵双胞胎在出生早期具有相似的表型，但随着不断地成长，差异会不断出现。数据显示，同卵双胞胎在遗传学标记的程度和分布上都有明显的不同，说明表观遗传调控与环境的变化之间存在一种动态的联系。
综上所述，高中阶段的表观遗传学内容的教学关键不在于表观遗传知识的深挖和补充，而在于以此为脚手架，引导学生更好地理解科学的本质、构建生命观念，从而使学生建立终生受益的素养基础。
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表观遗传学的意义范文2
1 DNA甲基化和组蛋白乙酰化
1.1 DNA甲基化 DNA甲基化是指在DNA复制以后,在DNA甲基化酶的作用下,将S-腺苷甲硫氨酸分子上的甲基转移到DNA分子中胞嘧啶残基的第5位碳原子上,随着甲基向DNA分子的引入,改变了DNA分子的构象,直接或通过序列特异性甲基化蛋白、甲基化结合蛋白间接影响转录因子与基因调控区的结合。目前发现的DNA甲基化酶有两种:一种是维持甲基转移酶;另一种是重新甲基转移酶。
1.2 组蛋白乙酰化 染色质的基本单位为核小体,核小体是由组蛋白八聚体和DNA缠绕而成。组蛋白乙酰化是表观遗传学修饰的另一主要方式,它属于一种可逆的动态过程。
1.3 DNA甲基化与组蛋白乙酰化的关系 由于组蛋白去乙酰化和DNA甲基化一样,可以导致基因沉默,学者们认为两者之间存在串扰现象。
2 表观遗传学修饰与恶性肿瘤耐药
2.1 基因下调导致耐药 在恶性肿瘤中有一些抑癌基因和凋亡信号通路的基因通过表观遗传学修饰的机制下调,并与化疗耐药有关。其中研究比较确切的一个基因是hMLH1,它编码DNA错配修复酶。此外,由于表观遗传学修饰造成下调的基因,均可导致恶性肿瘤耐药。
2.2 基因上调导致耐药 在恶性肿瘤中,表观遗传学修饰的改变也可导致一些基因的上调,包括与细胞增殖和存活相关的基因。上调基因FANCF编码一种相对分子质量为42000的蛋白质,与肿瘤的易感性相关。2003年,Taniguchi等证实在卵巢恶性肿瘤获得耐药的过程中,FANCF基因发生DNA去甲基化和重新表达。另一个上调基因Synuclein-γ与肿瘤转移密切相关。同样,由表观遗传学修饰导致的MDR-1基因的上调也参与卵巢恶性肿瘤耐药的形成。
3 表观遗传学修饰机制在肿瘤治疗中的应用
3.1 DNA甲基化抑制剂 目前了解最深入的甲基化抑制剂是5-氮杂脱氧胞苷(5-aza-dc)。较5-氮杂胞苷(5-aza-C)相比,5-aza-dc首先插入DNA,细胞毒性比较低,并且能够逆转组蛋白八聚体中H3的第9位赖氨酸的甲基化。有关5-aza-dc治疗卵巢恶性肿瘤的体外实验研究结果表明,它能够恢复一些沉默基因的表达,并且可以恢复对顺柏的敏感性,其中最引人注目的是hMLH1基因。有关地西他滨(DAC)治疗的临床试验,研究结果显示,结果显示:DAC是一种有效的治疗耐药性复发性恶性肿瘤的药物。 3.2 HDAC抑制剂 由于组蛋白去乙酰化是基因沉默的另一机制,使用HDAC抑制剂(HDACI)是使表观遗传学修饰的基因重新表达的又一策略。根据化学结构,可将HDACI分为短链脂肪酸类、氯肟酸类、环形肽类、苯酸胺类等4类。丁酸苯酯(PB)和丙戊酸(VPA)属短链脂肪酸类。PB是临床前研究最深入的一种HDACI,在包括卵巢恶性肿瘤在内的实体肿瘤(21例)Ⅰ期临床试验中有3例患者分别有4~7个月的肿瘤无进展期,其不良反应是短期记忆缺失、意识障碍、眩晕、呕吐。因此,其临床有效性仍有待于进一步在Ⅰ、Ⅱ期临床试验中确定。在VPA的临床试验中,Kuendgen等在对不同类型血液系统肿瘤中使用VPA进行了Ⅱ期临床试验,结果显示,不同的患者有效率差异甚远。辛二酰苯胺异羟肟酸(SAHA)是氯肟酸类中研究较深入的一种HDACI。其研究表明,体内使用安全剂量SAHA时,可有效抑制生物靶点,发挥抗肿瘤活性。大量体外研究结果显示,联合使用DNA甲基化抑制剂和HDACI会起到更明显的协同作用。
3.3 逆转耐药的治疗 Balch等使用甲基化抑制剂—5-aza-dc或zebularine处理卵巢恶性肿瘤顺柏耐药细胞后给予顺柏治疗,发现此细胞对顺柏的敏感性分别增加5、16倍。在临床试验中,Oki等将DAC和伊马替尼(imatinib)联合使用治疗白血病耐药患者,结果说明,应用表观遗传学机制治疗恶性肿瘤确实可以对化疗药物起到增敏作用,并且在一定范围内其疗效与体内表观遗传学的改变呈正比。Kuendgen和Pilatrino等对HDACI和化疗药物的给药顺序进行研究,结果显示,在使用VPA达到一定血清浓度时加用全反式维甲酸可增加复发性髓性白血病和骨髓增生异常综合征患者的临床缓解率,这可能与VPA引起的表观遗传学改变增加患者对药物的敏感性有关。
4 展望
总的来说,应用表观遗传学修饰机制治疗肿瘤具有良好的应用前景,与传统化疗药物联合来逆转耐药,将给攻克恶性肿瘤等疾病带来新的希望。
参 考 文 献
表观遗传学的意义范文3
【关键词】 川芎嗪 小细胞肺癌 微血管密度 血管内皮生长因子
恶性肿瘤的生长及转移依赖于肿瘤组织中新血管生成， 抑制血管生成能抑制肿瘤的生长和转移[1]。肿瘤细胞能够分泌多种血管生成因子，其中血管内皮生长因子(VEGF)是高效、高特异性作用于血管内皮的促血管生成因子，与肿瘤的生长和转移密切相关[2]。川芎是著名的活血、化瘀、抗肿瘤中药。已知川芎嗪可以抑制肿瘤的生长，其机制与其促进免疫功能有关[3]。川芎素(阿魏酸钠)抑制人肺癌A549细胞增殖，其机制与诱导细胞凋亡有关[4]。本试验观察川芎嗪对小鼠小细胞肺癌的抑制作用以及对肿瘤微血管密度和VEGF表达的影响，旨在探讨活血化瘀中药可能存在的其它作用及其机制。
1 材料与方法
1.1 药品与试剂
盐酸川芎嗪注射液（TMP，4 mg/2 mL/支，北京市第4制药厂），硫酸鱼精蛋白注射液(PTM， 50 mg/5 mL/支，上海生物化学制药厂)， VEGF抗体和Ⅷ因子抗体（Santa Cruze 产品），SABC试剂盒（武汉博士德生物工程有限公司），其余试剂均为市售分析纯。
1.2 动物分组与造模[5] 取40只18～20 g的C57BL小鼠(购自中国医科大学实验动物中心)， 雌雄各半，随机分为4组，川芎嗪1、2组、鱼精蛋白组(阳性对照)、生理盐水组(NS)。
取接种小细胞肺癌细胞（购自中国科学院细胞库)14 d的C57BL荷瘤小鼠脱颈椎处死，无菌条件下取瘤组织加生理盐水研磨成匀浆，调细胞浓度后，每只正常C57BL小鼠右臀部皮下接种1×107个小细胞肺癌细胞。
1.3 实验方法
川芎嗪组剂量分别为100、200 mg/kg ， 生理盐水组每只0.2 mL，接种后第2天开始用药， 每天1次， 腹腔注射连续21 d;鱼精蛋白组60 mg/kg，接种后第2天皮下注射1次，第3天起每12小时1次，连续20 d。第22天脱颈椎处死各组小鼠进行检测。
1.4 一般检测
接种前和接种后每3天称量1次体重，按体重变化调整给药剂量。接种后每3天用游标卡尺测量1次荷瘤小鼠肿瘤的最长径(a)和最小径(b)，按V =0.5ab2计算肿瘤体积，第22天 处死小鼠，取接种部位肿瘤称重，计算肿瘤生长抑制率〔肿瘤生长抑制率(%)=(生理盐水组平均瘤重-治疗组平均瘤重)/生理盐水组平均瘤重×100%〕。
1.5 免疫组化染色
取肿瘤组织，固定、脱水、包埋，4 μm连续切片，VEGF抗体或Ⅷ因子抗体为Ⅰ抗，阴性对照用PBS代替Ⅰ抗，按照试剂盒说明书进行SABC法免疫组织化学染色。
1.6 VEGF 表达的定量分析
选取阳性细胞密集区域，在400×显微镜下选取20个阳性细胞，用图像分析系统测定平均吸光度(A值)，以此代表阳性细胞胞质单位面积内VEGF 相对含量。
1.7 肿瘤微血管密度分级（MVD)
依据Weidner[1]标准对着染的血管进行密度分级。高血管密度区多位于肿瘤边缘。在200倍镜每0.74 mm2的视野下，以与周围肿瘤细胞和结缔组织成分明显区别的棕黄色内皮细胞或细胞丛作为一个微血管，记录5个视野内的微血管数，取其平均值。
1.8 Western Blot
参照文献[6]，取肿瘤组织，溶于Laemmlis溶解缓冲液中(1% Triton X-100，1 mmol/L PMSF，21 mg/L aorotinin，0.5 mg/L leupeptin，1% SDS)，离心后将上清液移于另一试管中。Lowry法检测溶解液中蛋白含量。加入2×SDS加样缓冲液(125 mmol/L Tris-HCl，20%甘油，0.01%溴酚蓝，4% SDS，200 mmol/L DTT)，置沸水浴中加热5 min，按每孔30 μg蛋白量加样进行SDS2聚丙烯酰胺凝胶电泳。凝胶在转移缓冲液(25 mmol/L Tris，192 mmol/L 甘氨酸，20%甲醇) 中转移至硝酸纤维素膜，然后将膜浸没于含5%脱脂奶粉的TBST液中封闭。Ⅰ抗、Ⅱ抗分别与膜孵育，显影，NIH image1159计算机软件分析条带。
1.9 数据处理
计量资料结果以x±s表示，进行单因素方差分析，组间均值两两比较用SHK法，以上结果均由统计软件包(SPSS10.0) 完成。
2 结
果
2.1 川芎嗪对各组肿瘤生长体积的影响
川芎嗪各剂量组、鱼精蛋白组肿瘤体积均小于生理盐水组(均P
2.2 川芎嗪对肿瘤重量及生长抑制率的影响
川芎嗪各个剂量组、鱼精蛋白组小鼠接种部位的肿瘤重量均低于生理盐水组(均P
2.3 川芎嗪对肿瘤细胞VEGF 表达及肿瘤血管生长的影响
图像分析显示:VEGF 主要表达于肿瘤细胞内，阳性染色的肿瘤细胞多位于浸润边缘。血管内皮细胞呈弱阳性染色。川芎嗪各剂量组VEGF表达都呈现出弱阳性，各组A 值与生理盐水组比较，差异有显著性（P< 0.05)，见表2。实验结果显示:川芎嗪对C57BL 小鼠小细胞肺癌细胞表达VEGF 有抑制作用。图像分析显示:肿瘤组织切片中，微血管密集区多位于肿瘤细胞浸润的前缘部位。不同剂量的川芎嗪组肿瘤血管密度分级MVD 值低于生理盐水组(均P< 0.05)，见表2。实验结果显示:川芎嗪对C57BL 小鼠小细胞肺癌实体瘤血管生成有抑制作用。表2 川芎嗪对肿瘤血管生长的影响注：*P< 0.05，**P< 0.01 vs NS2.4 Western Blot
3 讨
论
VEGF 是一种重要的血管生长因子，对血管内皮细胞的增殖、基膜降解、内皮细胞迁移和血管构建的调控作用较强，且特异性高[7]。研究证明，VEGF是肿瘤血管形成的关键性介质[8]。无论是mRNA水平还是蛋白水平，在许多动物和人的恶性肿瘤中都有VEGF 的高表达;抑制VEGF 可以抑制肿瘤的生长[9]。本研究结果显示，小细胞肺癌细胞可表达VEGF，并与肿瘤的生长和转移密切相关。这与同类研究报道一致。
不少研究发现，肿瘤侵袭转移等恶性潜能随着肿瘤微血管密度(MVD) 的增加而明显增加[10]。因此，MVD 被认为是预测肿瘤转移、复发和预后的一项重要指标[11]。本试验结果再次显示了，MVD 升高与肿瘤生长、转移加快的一致性，并且与VEGF表达的升高也有正性相关性。
中医活血化瘀法及其方药治疗肿瘤有悠久的历史和确切的疗效。对其机制的探讨，既往是从抑制肿瘤细胞的增殖、增强免疫等方面进行。川芎为常用的活血化瘀中药，本试验再次证明了其主要成分川芎嗪有抗肿瘤生长和转移的作用。试验结果还显示川芎嗪抗肿瘤机制与抑制VEGF 表达，降低微血管密度密切相关。这与既往报道川芎嗪增强机体免疫[3]149-152或诱导肿瘤细胞凋亡[4]94-96而抑制肿瘤生长的机制不同。
有关活血化瘀中药的现代药理作用研究成果丰硕，但尚未见到有关抑制VEGF 表达及抗实体瘤血管生长的报道。这一试验结果突破了既往关于活血化瘀中药促进缺血坏死组织侧枝循环的建立，改善心血管功能，改善血液流变学，抗血栓形成，镇痛、镇静、抗炎，抗增生等认识的局限，从一个全新的角度认识了活血化瘀中药的现代药理作用。尤其是活血化瘀中药促进侧枝循环与抑制新血管生成之间的关系与条件，是否因为具体药物而有别，一味中药是否对于不同病理状态可表现出不同的作用等，都有深入研究的必要。许多中医诊断为“瘀血”的病症如肿瘤、类风湿性关节炎、糖尿病血管损害、动脉粥样硬化等，都有病理性的新血管增生。中医均以活血化瘀为主治疗， 其异病同治的共同机制是否与抑制VEGF 有关，研究这一问题能从一个角度揭示传统中医治法与方药的作用实质。
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表观遗传学的意义范文4
基因组印记
基因组印记是一种不遵循传统孟德尔遗传规律的表观遗传现象。这是由于来源于某一亲本的等位基因或其所在的染色体发生了表观遗传修饰，导致不同亲本来源的两个等位基因在子代细胞中表达不同。受印记机制调控而差异表达的基因称之为印记基因（imprintedgene）。目前在植物、昆虫和哺乳动物中均发现了基因组印记现象，而在鸟类、鱼类、爬行类和两栖类动物普遍认为不存在印记现象。1991年Bartolomei等采用基因敲除技术在小鼠中首次确认了类胰岛素生长因子2型受体和非编码RNAH19基因两个母源印记基因及一个类胰岛素生长因子2型父源印记基因。2007年，杜克大学的研究人员用机器学习的人工智能形式发现了156个新的印记基因，并以此为基础创造了第一张人类基因组印记基因图谱。
X染色体失活
X染色体失活是指雌性哺乳类细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象，X染色体会被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化，这种现象也称为X染色体的剂量补偿（dosagecompensation）。X染色体失活的起始和选择发生在胚胎发育的早期，这个过程被X染色体失活中心（X-inactivationcenter，XIC）所控制，是一种反义转录的调控模式。这个失活中心存在着X染色体失活的特异性转录基因，当失活命令下达时，这个基因产生1个17kb不翻译的RNA与X染色体结合，介导DNA甲基化和组蛋白修饰，引发并维持X染色体的失活。X染色体失活中心还有“记数”功能，即保持每个二倍体中仅有1条X染色体有活性，其余全部失活。X染色体的失活状态需要表观遗传修饰来维持，可以通过有丝或减数分裂遗传给后代。
非编码RNA
非编码RNA是指不能翻译为蛋白质的功能性RNA分子，其中包括rRNA、tRNA、snRNA、snoRNA、microRNA等多种已知功能的RNA以及未知功能的RNA。按照它们的大小可分为长链非编码RNA和短链非编码RNA，前者在基因簇以至于整个染色体水平发挥顺式调节作用，后者在基因组水平调控基因表达并介导mRNA的降解，诱导染色质结构改变，决定细胞的分化命运，还对外源的核酸序列有降解作用以保护本身的基因组。microRNA是一类内源产生的长度约为22个核苷酸的非编码小RNA分子，广泛存在于真核生物甚至病毒中，通过调节编码蛋白的基因的表达或翻译来发挥调控作用。microRNA的功能十分广泛并且渗入到了生理病理学的各种调控途径中，包括发育周期、细胞增殖和分化、细胞凋亡、新陈代谢、神经调控、肿瘤发生以及病毒和宿主的相互作用等。在法医学应用中，由于降解后的片段长度过小，不能进行有效的PCR扩增，然而microRNA就能满足降解检材的PCR扩增，开始成为关注的热点。
表观遗传学在法医学中的应用
1表观遗传学与亲权鉴定
自1985年英国遗传学家AlecJeffreys教授首次报道DNA指纹图技术应用于法医DNA分析以来，DNA分析技术已经在多起重大的刑事犯罪侦破和民事诉讼中发挥重要的作用。目前主要是以荧光标记STR与SNP等传统遗传标记进行个体识别和亲权鉴定。但在法医学亲子鉴定中，尤其是子代为杂合子或者父（母）和子代为相同的杂合子的单亲鉴定中，亲代的必需等位基因可能无法确定，使基因座的鉴别能力下降。但通过使用亲缘特异性甲基化遗传标记可以直接判定等位基因的亲源，从而确定亲代的必需等位基因。Zhao等应用甲基化特异性PCR对被甲基化标记的母系SNP位点rs220028进行检测证明了这一观点。另外，Poon等报道，采用DNA甲基化标记可有效识别孕妇外周血中的胎儿DNA，这也为产前的亲权鉴定提供了一种非侵入性的检测方法。
2表观遗传学与年龄推断鉴定
个体年龄推断一直是法医学研究的重要内容。目前实际工作中，个体年龄推断主要依据人类学方法，通过测量与年龄相关的骨骼、牙齿标志等，根据相关模型进行推算。近年来，许多研究者发现表观遗传学为个体年龄推断的研究提供了一种新的思路。DNA甲基化随年龄变化的特点为利用甲基化标记进行年龄推断提供了可能。陈培利等利用人胚肺二倍体成纤维细胞（humanembryoniclungdiploidfibroblast，2BS）进行体外培养，发现其p16基因启动子区及外显子Ⅰ处的DNA甲基化水平随个体细胞代龄的增加而降低。Tra等用限制性标记基因组扫描（restrictionlandmarkgenomescanning，RLGS）技术对T淋巴细胞2000个基因座的甲基化年龄变化情况进行了调查，发现29个基因座有变化，其中23个增加，6个降低。由于甲基化标记数目众多，从中可以筛选出一组适合于法医学应用的、年龄变化有规律的座位，应用于微量检材的年龄推断。尹慧等用高效液相色谱（HPLC）法对94个健康个体DNA甲基化水平的检测发现，5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine，5mC）含量随年龄增加而降低，50岁以上与50岁以下年龄组5mC含量差异具有统计学意义。2010年，Teschendorff等通过对261个绝经后妇女全血样本约14000个基因启动子区超过27000个CpG的甲基化状态进行分析，证实干细胞多梳蛋白家族（polycombgroup，PcG）靶基因比非靶基因更容易随年龄发生甲基化，并且变化不依赖于组织类型、疾病状态和甲基化水平。
Bocklandt等通过分析唾液中的DNA甲基化标记，可以预测一个样本组成员的年龄，结果与实际年龄相差大约在5岁范围内。这项技术如果被确证，可能会成为法医取证方面很有用的一种工具。同时，它还表明了一种可能性：DNA甲基化修饰或许可以提供一种比计算生日更具医学相关性的年龄测定方法。
2010年，NorenHooten等在外周血单核细胞中的800个microRNA标记中筛选出9个与年龄相关的基因，但发现其中5个与疾病有关，该研究表明microRNA可以作为推断年龄以及和年龄相关疾病的诊断指标。
2011年，国内Jin等首次报道了通过体细胞发挥功能的组蛋白修饰基因对衰老这一重要生物学过程的调控作用。这项研究通过生物化学、分子生物学、遗传学和系统生物学相结合的方法，发现组蛋白H3K27me2/3去甲基酶UTX-1/UTX对衰老发挥了重要的调控作用。在秀丽线虫中，该基因的杂合突变体及野生型的RNAi敲降后都能极大地延长线虫寿命，使其抗逆性也大大加强。遗传学分析发现其功能依赖于胰岛素样信号通路。这种通过重新建立组蛋白修饰模式的方式，揭示了细胞的重编程在抑制衰老过程中的重要作用，并提示其作用机制在哺乳动物细胞中同样存在。
3表观遗传学与双生子的鉴别
同卵双生子（monozygotictwins，MZ）是由一个受精卵经过卵裂产生两个单独的细胞，并发育为完全独立的个体，因此同卵双生两个个体的遗传背景完全相同，享有共同的DNA序列。在法医DNA分析领域，现有的DNA分析手段尚不能有效鉴别同卵双生个体。
但是近年来，众多研究都已证实，同卵双生子的表观遗传学水平存在一定的差异。Fraga等对西班牙的40对同卵双生子个体进行研究，发现他们在DNA甲基化、X染色体失活、组蛋白位点特异性乙酰化上存在差异，并且这种差异会随年龄增长而增加。Kaminsky等对114对同卵双生子个体的DNA甲基化的研究显示，血白细胞、口腔黏膜上皮细胞和肠道组织中的甲基化状态均存在差异。
此外，Ollikainen等对新生儿不同组织相关的4个差异甲基化区域的甲基化状态进行了研究，发现甲基化水平存在显著差异。从上述研究成果中可以看出，研究人员已经把目光投入到了法医DNA分析的全新领域，尤其是DNA甲基化在同卵双生子中的研究。这些都为采用DNA甲基化这一表观遗传学标记进行同卵双生子个体甄别的可能性提供了强有力的理论支撑。
4表观遗传学与组织来源鉴定
在常见的法医学案件中，有时需要对生物检材的组织来源进行鉴定。传统的形态和生化方法信息含量少，容易受各种条件的影响，因此常常受到限制。随着分子生物技术的发展，以表观遗传学为基础的组织鉴定方法存在明显优势，越来越为人们所关注。
例如，富含CpG的Alu重复序列，在体细胞中是甲基化的，在生殖细胞中却是低甲基化的，有一个在进化上比较年轻的Alu亚族在中几乎是完全没有甲基化的。通过对这一Alu亚族甲基化的分析，就可以判断检材是否含有。范光耀应用联合亚硫酸氢盐的限制酶法，调查、常见体液、分泌液和组织的DEAD盒多肽4［DEAD（Asp-Glu-Ala-Asp）boxpolypeptide4，DDX4）］基因启动子甲基化水平，发现中的甲基化水平显著高于非组织。因此，选择一个合适的界值，可以根据DDX4甲基化水平有效地鉴别（斑）的种属来源。
Hanson等运用RT-PCR技术，根据microRNA的细胞组织特异性对血液、、唾液、阴道分泌液和经血进行来源鉴别，并通过与21种人体组织比对验证了各种斑痕microRNA表达的特异性，用于检测RNA的模板量最低可达50pg。Zubakov等运用微阵列和Taqman定量PCR技术确证了一些能运用于法医学实践识别血痕和精斑的稳定的microRNA标记。该项研究不仅将灵敏度提高到相当于单细胞水平的0.1pgRNA模板量，而且在新鲜与陈旧样本的比对中发现其microRNA分子绝对含量未发生明显变化。
5其他
近年来，随着学者们对RNA在法庭科学领域的研究逐渐广泛和深入，发现microRNA在法医学领域的应用价值也日益重要。2007年王芬等发现有6个microRNA分子在H2O2诱导PC12细胞凋亡后表达显著下调，这一结果为法医病理学者研究脑缺血再灌注损伤中神经细胞凋亡的机制提供了理论依据。2010年李文灿等在研究大鼠心肌组织microRNA降解与死亡时间的相关性时发现，其含量在机体死后120h内保持相对稳定的水平，可作为内参指标反映其他生物指标的变化水平。
随着分子生物学技术的飞速发展，法医工作者又面临一项新的挑战，即如何在日常的亲缘鉴定和个体识别工作中有效甄别伪造DNA。用于伪造DNA常使用PCR扩增的方法，因此使用亲缘特异性甲基化遗传标记，可以在进行亲子鉴定和个体识别的同时，检测样本的甲基化状态，从而鉴别样本是否为人工伪造DNA。因此DNA甲基化遗传标记在鉴定DNA是否人工伪造中发挥着重要的作用。
表观遗传学的意义范文5
在高校遗传学教学中存在许多经典案例，如：果蝇的翅型、体色、眼色等性状的遗传；豌豆的性状遗传以及玉米籽粒的形状和颜色性状的遗传等。其中，还有一个非常重要的经典案例，即血型遗传。自20世纪初至今,ABO血型遗传一直是复等位基因的一个不可缺少的经典案例。随着科学技术的高速发展，血型的经典内涵得到不断提升，新的研究结果使血型遗传所涵盖的遗传学知识点越来越多，内容越来越丰富。因此，以我们身边最常见的表型--血型为案例开展遗传学教学不仅可以将复杂的知识点简单化、形象化，便于理解，还可以将繁多的基础知识串联起来，便于记忆。另外，以血型遗传作为经典案例在遗传学的教学中还可以不断加人新的研究和新的应用，使经典的内涵不断得到新的提升，让学生的视野接触到前沿的科学知识，为日后的科研接力打好基础。
1血型与遗传学之间的重要关系
开展案例教学，案例的选择是关键。血型是人类血液由遗传控制的个体性状之一，与人类的生活关系密切，用途广泛。自1900年到2005年，已检测出约29个血型系统[21。临床上最常用的有“ABO血型系统”、“Rh血型系统”、“MN血型系统”和“HLA血型系统”。这些血型系统涵盖了复等位基因、基因互作之上位效应等遗传学的孟德尔定律拓展原理，基因的表达调控及群体遗传等遗传学的精髓内容。透过这个知识窗口，可以看到遗传学在血型中的奥秘。
孟德尔遗传定律从建立、发展到不断拓展完善，一直都是贯穿高校遗传学教学的核心知识点。由于现在大学生从高中开始就接触孟德尔定律，如果大学教学还是重复高中阶段所涉及的内容，学生的学习兴趣难以提高。在高中知识的基础上，开展案例教学，引入现代遗传学在人类血型上的最新认识，则不但可以给学生一种似曾相识的感觉，还能自然地激起他们深入探索的兴趣。血型的遗传特征及生化基础可以清晰明了地向学生阐述清楚孟德尔定律的一些重要的延伸知识内容。从红细胞血型到白细胞血型，从常见的ABO血型到罕见的孟买、Rh血型，对于假基因、等位基因、复等位基因和拟等位基因等不容易理解的基因概念以及基因之间的相互作用都可以通过血型案例，把学生带入情境之中，在教师的指引下由学生自己依靠其拥有的基础知识结构和背景，在血型案例情境中发现、分析和解决问题，比较轻松地掌握这些容易混淆不清的概念和一些难以理解的遗传学现象，如非等位基因之间的相互作用之上位效应等。
此外，人的血红蛋白基因在不同发育时期的表达调控还涉及遗传学中的表型和基因型之间的关系，真核生物中的基因表达调控模式等知识点。对血型相关的一些遗传疾病进行分析，还可以引申出基因突变和染色体缺失突变及一些重要的遗传标记。血型的遗传学检测方法及临床上的输血原则和溶血、血型互配等现象也与受基因表达调控的红细胞的细胞膜糖基的特征和生化机制密切 相关，引导遗传学从理论到实验，再到实践中的应用。血型与疾病的关联分析，把科研思维引入高校遗传学教学中，让学生紧跟时展的步伐，理论联系实际，为日后的科研工作打好基础。
遗传学中两大重要的主题是遗传和变异，主要包括孟德尔遗传和连锁遗传、基因突变和染色体畸变。通过以复旦大学遗传学教学大纲为参考，与刘祖洞主编的《遗传学》和乔守怡主编的《现代遗传学》教材内容相比较发现，血型遗传案例除了与上述遗传学四大内容关联外，还涉及到基因的表达调控、群体遗传、表观遗传等知识点，其中大部分知识点都是要求学生重点掌握的内容。目前，血型案例所涵盖的主要遗传学知识内容及在遗传学学科中的重要意义的归纳见表1。因此，把血型作为经典案例，开展遗传学的案例教学既贴近生活，引发学生深刻的思考，又能代表性地进一步阐述探讨遗传学的生物知识。
2血型案例在遗传学教学中的开展
在以血型为案例的教学过程中，我们首先根据高校遗传学的教学目标和培养目标的要求，在学生掌握了一些遗传学的基础知识和理论知识的基础上，结合遗传学的教学进度逐步有序地进行介绍：1.血型基本知识介绍；2.红细胞血型的细胞膜糖基特征和生化机制；3.红细胞血型与输血；4.血型的遗传学规律特征，包括(I)ABO血型复等位基因遗传及其应用，（II)ABO血型基因的克隆，（III)ABO血型的遗传学鉴定；5.ABO血型的拓展，包括(I)孟买血型与拟孟买血型，（II)红细胞血型与白细胞血型。下面主表1血型与高校遗传学教学的重要关系
要选取两个方面阐述在遗传学教学中的开展过程。
2.1血型基本知识在教学中的开展
ABO血型系统是第一个被描述的红细胞血型系统，也是最具有临床意义的一个系统。因此，在进行血型基本知识介绍时往往以ABO血型为例。随着以分子生物学为基础的血型研究的发展，ABO血型的基因遗传背景目前已比较清楚。在介绍血型基因的基本知识同时也涵盖着遗传学知识的传播，而且随着血型基因知识的不断丰富完善，涵盖的遗传学知识也越来越广泛。
ABO血型由3个复等位基因控制，即iA、产和i°o在开展遗传学相关教学活动时，一般都用此作为分析生物界中复等位现象的经典例证。这些基础知识对于高校学生来说可能在高中的时候就已经获得。因此，在大学开展相关教学时，除了简单介绍这3个主要的复等位基因外，还可以深入讲述新的研究结果，到目前为止通过分子生物学方法已经确定了160多个^50等位基因，只是目前国际上以4川7基因作为等位基因的参比序列，其他基因均与其紧密相关，非常保守。在此基础上ABO血型又可分为许多亚群，其中A血型表现出最多的亚型。在红细胞血型系统中还有一种Rh血型，分为Rh阳性和Rh阴性。Rh血型主要由3个紧密连锁的基因D/d、C/c、E/e决定，这3个基因以单倍型方式传递，属于拟等位基因。这样在讲解原有知识基础上，又不局限于原有知识范围，由ABO血型到Rh血型，由复等位基因引出拟等位基因，在教学方法上可以通过相互比较，举例分析，扩大学生的知识面，提
高他们的学习兴趣。
人类的血型是不是一生恒定不变的？面对这个问题，很多学生都会认为血型是由遗传决定，不会改变。其实人类的血型也会发生变异，如急性白血病以及再生障碍性贫血可以使血型抗原减弱，骨髓增生异常综合征可以导致血型抗原丢失等。而且，健康人也存在血型变异的现象，但是这个是与细胞表面血型物质受到掩盖以及人体存在一些稀有ABO等位基因有关。这些新的知识可以向学生很好地展示“遗传和变异”，利用身边的血型案例调动学生的学习积极性，使他们积极主动地掌握遗传学的精髓。
此外，最近几年疾病引发基因甲基化和突变的研究'又可以结合表观遗传学的内容开展教学。
2.2红细胞血型的细胞膜糖基特征和生化机制在教学中的开展
人类ABO基因位于9号染色体长臂(9q34)，其基因产物是一些专一性的糖基转移酶，可以催化血型抗原前体特定部位的糖基转移，从而控制ABO血型抗原的生物合成。其中4基因编码产物为N-乙酰-D-半乳糖胺转移酶(简称A酶)，可以产生常见的A抗原；S基因编码产物ci-l，3-D-半乳糖转移酶(简称B酶)，可以产生常见的B表面抗原；和S基因同时存在产生的等位基因，其编码产物具有A酶和B酶的特异性，在红细胞表面上产生不同强度的A和B抗原；而O基因则是第258位和第349位碱基缺失导致的密码子移位，使终止密码提前出现，合成了无酶活性的短肽，因而体内没有A酶和B酶，也不能催化糖基转移，只有前体物质H的产生为H抗原(图1)。因此ABO血型有时也称为八811型[71。这样，不同的、B、0基因编码不同的多肽，产生具有不同功能的糖基转移酶，非常简单地引出了遗传学中经典的基因与酶的关系的“一个基因一条多肽(一个基因一个酶)假说”,使学生很容易获得一个基因决定一条相应的多肽链(酶)的结构，并相应地
影响这个多肽(以及由单条或多条多肽链组成的酶）的功能这种遗传学思想，达到良好的教学效果。
此外，最新研究发现ABH抗原除表达在血细胞表面以外，还可以出现在除脑脊液外的分泌液中；有大约80%的个体具有产生这些可溶性抗原的遗传基因；这种分泌抗原的表达由双结构基因控制，即第19号染色体2个紧密连锁的Ft/n(用和基因座。ABO血型抗原都由前体H物质合成，SeAe基因和丑冷基因都可以控制合成H物质；简单来说，基因的表达决定体液中是否出现ABH抗原，H/h基因的表达决定红细胞上是否出现ABH抗原。但是，并不是所有带m基因的个体唾液中都分泌ABH物质，还要受到Wh基因的制约，其中hh型(即孟买型)均为非分泌型[7]。这样又引出了遗传学中一个很重要的概念--上位基因，很重要的遗传学现象--上位效应。这些属于遗传学中基因互作的重点内容，而且发生基因相互作用的非等位基因仍然遵循孟德尔分离和自由组合定律，后代的基因型及其比例是可预计的，所以在遗传学教学中还可用于亲子鉴定、重大遗传疾病的关联分析、人种演化、群体遗传分析等相关内容。
2.2相关技术的拓展应用
ABO血型的分子检测是分子遗传学教学中PCR技术拓展应用的案例。血型基因的表达影响血型的表现型，表型相同的个体其基因型不一定相同。如何区分iAiA、Pi0在表现型都是A型和iBiB、iBi0在表现型都是B型的个体，可以根据A、B、0血型基因碱基的差异，应用聚合酶链式反应-限制性片段多态性(PCR-RFLP)技术分型人类ABO血型的方法。这种方法可以对个体血型(血型基因型)进行判定：是属于AA型、AO型，还是BB型或BO型。在这个基础上，我们进行了改进，并结合教学进程，作为自选实验在学生中开设，获得了学生的好评。在135个学生中开展自选实验，其中有80%的学生选择ABO血型鉴定这个实验，并表示对这个实验很感兴趣。
此外，还可通过分析核苷酸来确定分泌型ABH血型的Se基因型。主要基因分型技术有：（l)PCR-序列特异性引物(PCR-SSP)，这是一种新的基因多态性分析技术，根据基因座某一碱基的差异设计一系列引物，特异性引物仅扩增与其对应的等位基因， 而不扩增其他的等位基因；（2)PCR-DNA测序法，先通过PCR扩增基因的主要片段，然后测定序列;(3)PCR-限制性内切酶法，用对位点特异的限制性内切酶消化基因，再通过Southernblot分析来确定。目前，PCR-SSP常用于胎儿血型鉴定及白血病引起的血型抗原异常等血型鉴定。随着450基因结构和研究方法的迅速发展，AB0血型定型也将进入基因定型的时代，揭示更多的关于AB0基因和AB0血型表观遗传学等方面的奥秘。
在教学过程中还可以设计一系列与血型相关的论题，引导学生査阅相关方面的最新进展，总结出血型与人类疾病和性格之间的关系以及蕴涵的遗传学原理。学生可以分组制作PPT讨论，还可针对某一论题，学生组队分为正反两方，开展辩论式讨论。一学期可以安排一次课时(45分钟)开展辩论式讨论,前30分钟让学生正反方陈述观点，列举证据开展辩论，后15分钟用于总结和点评。在这个模式下，几乎所有的学生都积极主动地参与进来，将引导、鼓励与考评相结合，充分调动了学生学习的积极性[11]。开展“血型是否可以决定性格”类似专题的辩论式讨论，既增加了遗传学教学的兴趣性及可接受性，还可以使学生的思维在辨析中得到操练。正反两方队员通过收集资料和案例，与同学辩论解释的过程中，不仅掌握了深奥的科学知识，而且还与现实生活相联系，并且将遗传学应用于实际，填补了传统教学在知识灵活认知与实践中的不足。
3以血型为案例开展遗传学教学的优点
作为日常生活中被人们广泛熟知的遗传学常识，血型遗传学的研究历程符合遗传学的发展规律与教学规划，其作为遗传学教学案例有着不可替代的优势：
表观遗传学的意义范文6
[关键词] DNA甲基化；5'-Aza-CdR；HT-29；LoVo；Wif-1基因
[中图分类号] R735.3 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2014）08（b）-0016-06
Effect of 5-Aza-dC on mRNA expression， protein expression and methylation of Wif-1 gene status in HT-29 and LoVo Colorectal cancer
GE Chang XU Chunwei WANG Luping FANG Yuan ZHANG Yuping
Department of Pathology， the Military General Hospital of Beijing PLA， Beijing 100700， China
[Abstract] Objective To investigate the effects of 5-Aza-2-deoxycytidine （5-Aza-dC）， a methylation inhibitor， on the mRNA expression， protein expression of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. Methods HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines was treated with different dosages of 5-Aza-dC. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines were treated with different dosages of 5-Aza-dC （0.5， 1.0， 1.5 μmol/L）. Wif-1 gene DNA， mRNA and protein were determined by Methylight， SYBR Green PCR and Western blot respectively. Results Methylight detection showed that the Wif-1 gene methylation had effectively been reverserd by 5-Aza-dC. Moreover， the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-dC increased respectively in HT-29 Colorectal cell line[（1.000±0.000）， （1.207±0.052）， （1.790±0.033）， （2.016±0.123）]， and the expression levels of Wif-1 gene mRNA treated with 5-Aza-Dc increased respectively in LoVo Colorectal cell line [（1.000±0.000）， （1.294±0.048）， （1.893±0.061）， （2.204±0.041）]. Western blot indicated that 5-Aza-dC could recover the Wif-1 protein expression respectively in HT-29 Colorectal cell line [（0.456±0.040）， （0.511±0.025）， （0.857±0.031）， （0.934±0.047）]， and the protein expression was （0.842±0.032）， （0.844±0.044）， （0.854±0.037）， （0.856±0.034）， respectively in LoVo Colorectal cell line. The Wif-1 gene mRNA effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=144.823， P=0.000） and LoVo Colorectal cancer line （F=476.195， P=0.000）， and the Wif-1 protein effects within certain extent dose and time dependent with statistical significance in HT-29 Colorectal cancer line （F=129.674， P=0.000）， but without statistical significance in LoVo Colorectal cancer line （F=0.117， P=0.948）. Conclusion The methylation of promoter region is a main cause for transcriptional inactivation of Wif-1 gene in HT-29 and LoVo Colorectal cancer cell lines. 5-Aza-dC may effectively reactivate the gene transcription through a demethylation role.
[Key words] DNA methylation； 5-Aza-dC； HT-29； LoVo； Wif-1 gene
结直肠癌（colorectal cancer，CRC）作为最常见恶性肿瘤之一，其发病率仅位于肺癌和前列腺癌（女性为乳腺癌）之后，居第3位，而每年CRC病死率约占全部恶性肿瘤死亡总人数的8%，在恶性肿瘤死因中居第4位[1]。CRC的发生与发展与癌基因和抑癌基因的缺失、扩增或突变有关。有些基因在染色质水平上发生表型遗传修饰改变也会导致表达下调。表型遗传修饰最多见的是CpG岛（CpG island）的甲基化改变。Wif-1基因（Wnt inhibitory factor-1）定位于人类染色体12q14.3上，由10个外显子组成，全长约200 kb。Wnt/β-catenin信号传导通路是调控细胞生长增殖的重要途径之一，其异常激活已发现与多种人类肿瘤密切相关[2]。Wif-1基因是这条通路的下游区基因也是这条通路的拮抗基因。Wif-1基因的高甲基化在多种肿瘤中都已证实是存在的，它作为一种肿瘤抑制基因（tumor suppressor gene，TSG），其启动子的高甲基化参与了肿瘤的发生发展。本实验通过研究5'-氮杂-2'-脱氧胞苷（5'-Aza-CdR）对HT-29和LoVo细胞株作用后Wif-1基因的DNA层面、mRNA层面和蛋白层面的改变，探讨肿瘤发生发展过程中Wif-1基因失活的甲基化机制及药物恢复Wif-1基因表达的可能性，以期寻找CRC的肿瘤标志物及新的治疗靶点。
1 材料与方法
1.1 材料
结直肠癌细胞株HT-29和LoVo（北京大学医学部107实验室）；DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）；核酸蛋白质浓度测量仪B-500（上海创萌生物科技有限公司），DNA甲基化修饰试剂盒及甲基化阳性/阴性对照（美国ZYMO公司）；qPCR反应试剂ROX（TaKaRa公司）；Mix（上海辉睿生物科技有限公司）；Mx3000P定量PCR扩增仪（美国Stratagene公司）；引物由生工生物工程（上海）有限公司合成；5'-Aza-CdR（美国Sigma公司），以DMSO溶剂充分溶解后配制成0.1 μmol/L的母液，分装后-80℃保存；Wif-1和内参β-actin（美国Santa Cruz公司），Western blot相关试剂（北京索莱宝科技有限公司）。
1.2 细胞培养和干预
结直肠癌细胞株HT-29和LoVo置于10%胎牛血清和100 μ/mL青霉素、链霉素的RPMI1640的培养基中常规培养，胰酶消化传代。取贴壁生长良好的细胞以RPMI1640调整细胞密度至2×106/mL，接种于六孔培养板。干预的LoVo和HT-29细胞分别加入0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR混合培养液，每24小时更换新鲜培养基，连续作用72 h；以HT-29和LoVo分别加入等量DMSO溶剂培养作为对照（0 μmol/L）。
1.3 Methylight方法
取对数生长期的HT-29和LoVo细胞株，胰酶消化后抽提DNA。抽提DNA按DNA提取试剂盒（德国QIAGEN公司）说明提取上述两种细胞不同浓度梯度的细胞DNA，用紫外分光光度仪（上海创萌生物科技有限公司）测DNA浓度，以DNA浓度在25 ng/μL为最低浓度，使用DNA修饰试剂盒进行亚硫酸氢盐修饰，按照试剂盒说明书操作，Wif-1基因甲基化引物和探针设计：Wif-1基因序列参照GenBank。甲基化引物和探针由Beacon Designer 7.9软件设计，其引物序列上游引物：5'-TAAACGGGAATAGTTTTGGTTGAGG-3'；下游引物：5'- TACTACTCAAAACCTCCTCCTCGCTAC-3'；探针：FAM 5'- CTCCTCGTACCGCACCTACGCAACCTA-3' BHQ1，内参β-actin基因甲基化按文献[3]设计，上游引物：5'-TGGTCATC CAGGTTTAGTAACT-3'，下游引物：5'-AACCAATAAAC CTACTCCTCCCTTAA-3'，探针：FAM 5'-ACCACCACCCAACACACAATAACAAACACA-3'BHQ1。PCR反应总体系为20 μL，2×Taq PCR Master Mix 10 μL；修饰后的DNA模板2 μL；上、下游引物各1 μL（10 pmol）；探针FAM 0.4 μL（10 pmol）；ROX 0.3 μL。反应条件：94℃预变性5 min；94℃ 30 s，52℃ 45 s，72℃ 45 s，共50个循环；72℃延伸5 min，4℃冷却5 min。经亚硫酸氢盐修饰的Human Methylated & Non-methylated DNA Set作为阳性、阴性对照，水为空白对照。
1.4 实时荧光定量PCR分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因mRNA的表达情况
取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，胰酶消化后抽提细胞总RNA，逆转录合成cDNA，行实时荧光定量PCR。Wif-1引物由Primer Premier 5.0软件设计，上游引物：5'- GTTCCACGGACCTCACT-3'，下游引物：5'-ATGTCGGAGTTCACCAGA-3'；内参基因GAPDH上游引物：5'-GGCTGCTTTTAACTCTGG-3'，下游引物：5'-GGAGGGATCTCGCTCC-3'。20 Μl PCR反应体系含10 μL SYBR Premix Ex TaqTM（2×）、上、下游引物（10 μmol/L）各1、0.3 μL ROX Reference Dye（50×）、4.0 μL DNA模板、3.7 μL dH2O。反应条件为95℃预变性5 min；95℃ 10 s，55℃ 40 s，72℃ 45 s，共40个循环；72℃延伸1 min，70℃延伸30 s，95℃延伸30 s。实验重复3次，取均值。扩增完毕后分析熔解曲线，采用2-ΔΔCt法分析Wif-1 mRNA表达。ΔΔCt=（Ct处理组目的基因-Ct处理组内参基因）-（Ct对照组目的基因-Ct对照组内参基因）。
1.5 Western blot分析结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白的表达情况
取对数生长期的HT-29和LoVo细胞，在上述两种细胞株各个浓度梯度的每管细胞中加入80 μL蛋白裂解和1 μL蛋白酶抑制剂PMSF液于冰上裂解30 min。15 000 r/min 37℃离心，10 min后取上清液提取总蛋白，BCA法蛋白定量。总蛋白100℃变性5 min后，配制浓度为12%的SDS-PAGE凝胶，进行蛋白质电泳，蛋白电泳分离后经电转移槽转移至PVDF膜。BSA室温封闭2 h后，PVDF膜置于1∶200稀释的Wif-1单克隆抗体稀释液中4℃冰箱内培养过夜，TBST洗膜3次，每次10 min，再置于1∶20 000稀释的HRP标记的山羊抗兔IgG稀释液中37℃培养2 h，TBST洗膜4次，每次10 min，然后加入ECL发光液显影，采集并分析处理图像。凝胶成像系统摄像并分析各条带吸光度值，以0.5 μmol/L 5'-Aza-CdR条带吸光度值（A）/β-actin条带吸光度值（A）为基准，设置为1。以目的基因条带吸光度值（A）/β-actin条带吸光度值（A）作为Wif-1蛋白的相对表达强度。实验重复3次，取其平均值。
1.6 MethyLight结果判断标准
同时扩增目的基因（Wif-1）和内参基因（β-actin），根据标准曲线得到两者的原始拷贝数，计算标准甲基化指数（the normalized index of methylation，NIM）。其定义为：NIM=[（Wif-1 sample/Wif-1 positive）/（β-actin sample/β-actin positive）]×100，其中Wif-1 sample指样本中甲基化Wif-1基因的拷贝数，Wif-1 positive指阳性对照中甲基化Wif-1基因的拷贝数，β-actin sample指样本中甲基化Wif-1基因的拷贝数，β-actin positve指阳性对照中甲基化Wif-1基因的拷贝数。NIM≥4为甲基化，NIM
1.7 统计学方法
采用统计软件SPSS 19.0对实验数据进行分析，计量资料数据以均数±标准差（x±s）表示，组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），行配对t检验，并设定P值为双侧分布，以P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1基因甲基化状况
将阳性对照按10的倍数稀释成1×100～1×10-6 7个浓度梯度制作标准曲线（其拷贝数为103～109/mL）。各浓度梯度反应均做复孔。MethyLight的线性范围为104～108拷贝/mL，R2为0.907。实时荧光定量PCR得出数据按MethyLight结果判断标准，在DMSO对照组、0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR中HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状态分别为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化。见表1、图1。
表1 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状况
2.2 结直肠癌细胞株LoVo和HT-29中Wif-1基因mRNA表达状况
实时荧光定量PCR得出的数据检验扩增效率（E）通过公式E=2-1/斜率-1计算，Wif-1基因mRNA为0.945，GAPDH基因mRNA为0.977，两个基因的扩增效率相差
表2 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1基因mRNA表达状况（x±s）
注：与DMSO对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01
2.3结直肠癌细胞株HT-29和LoVo中Wif-1蛋白表达状况
Western blot结果运用Image J软件进行条带图像分析，获得HT-29和LoVo细胞株各条带光密度值，并计算出两种细胞在各组中的平均光密度比值，进行半定量分析及统计学分析，并以各实验分组为横坐标，将测出相应的平均光密度比值为纵坐标，绘出柱状图后发现0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1蛋白表达水平较DMSO对照组上调，并且有药物浓度依赖性（F=129.674，P=0.000），与DMSO对照组比较，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组比较，差异均有统计学意义（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo细胞株中Wif-1基因的蛋白表达水平较DMSO对照组略微上调，并且有药物浓度依赖性但差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组差异均有高度统计学意义（t = 19.414，P = 0.003；t = 30.468，P = 0.001；t = 102.233，P = 0.000）。见表3、图3。
表3 HT-29和LoVo细胞株中Wif-1蛋白表达状况（x±s）
注：与DMSO对照组比较，*P < 0.05，**P < 0.01
A：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中HT-29细胞株Wif-1蛋白Westernblot条带图；B：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中HT-29细胞株Wif-1蛋白柱状图；C：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中LoVo细胞株Wif-1蛋白Westernblot条带图；D：DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组中LoVo细胞株Wif-1蛋白柱状图
图3 各组HT-29细胞株及LoVo细胞株Wif-1蛋白表达
3讨论
CRC是最常见的消化道恶性肿瘤之一，每年全球新发病例达123万，病死率约为发病率的1/2。我国CRC发病率虽低于西方发达国家，但近20年来CRC的发病率仍在逐渐上升，同时，其发病年龄有增高趋势。近年研究表明CRC的发病是多因素、多阶段、多基因连续累积发生的过程，除遗传学改变外，表观遗传学改变亦参与CRC的发生、发展过程。表观遗传学是指不涉及DNA序列改变，但基因表达却发生可遗传的改变，DNA甲基化、组蛋白修饰、MicroRNA等是表观遗传学的主要形式。与肿瘤发生关系最密切的是DNA甲基化修饰异常，其中包括基因组去甲基化及部分区域高度甲基化两种形式。DNA甲基化可以导致癌相关基因沉默，病变迅速进展为癌。CRC有若干高度甲基化基因，若能认识CRC中基因异常DNA甲基化，将可能获得CRC诊断的肿瘤标志物及新的治疗靶点[5-7]。
经典Wnt/β-catenin信号通路发现迄今已数十年，作为一条高度保守的信号通路在动物胚胎的器官发育各个阶段均发挥异常重要的作用。Wif-1基因是Wnt/β-catenin信号传导通路的拮抗基因之一，属SFRP拮抗家族，在种族间高度保守，最早在人类视网膜中发现[8]。它主要通过捆绑Wnt信号蛋白，阻止其与Frizzled受体相互作用，从而抑制通路的异常激活。Nosho等[9]的研究发现，在早期CRC中伴有Wif-1表达的下调，可能通过引起经典Wnt/β-catenin信号通路的激活，导致通路下游靶基因的过度表达，伴随细胞过度的增殖和失控的分化从而引起肿瘤的发生。表观遗传学改变如基因5′端CpG岛甲基化是Wif-1基因失活的重要机制。已有一系列研究证实在各系统肿瘤中，启动子区甲基化可引起Wif-1基因失活[10-12]。在CRC中，Taniguchi等[13]和Lee等[14]的研究显示，Wif-1启动子区的甲基化率都很高，分别为82.0%和74%。齐健等[15]的研究结果与国外基本一致，Wif-1甲基化率为84.7%。Wif-1基因的启动子中存在T细胞相关因子（T cell factor，TCF）的反应元件[11]，而TCF是目前已知的Wnt通路中重要的核内靶因子，Wnt信号活化可使β-catenin在胞浆内累积并进入核内识别淋巴结增强因子/T细胞相关因子（lymphoid enhancer factor/T cell factor，LEF/TCF）等转录因子，激活Wnt信号的靶基因，控制胚胎发育及细胞生长、分化及凋亡等。Kansara等[16]和Chung等[17]的研究结果显示，Wnt拮抗物的高甲基化可以增加β-catenin在细胞质中的积聚及经典Wnt/β-catenin信号通路的激活。
本实验研究中笔者采用去甲基化药物5'-Aza-CdR处理两个结直肠癌细胞株：MSS细胞株HT-29和MSI细胞株LoVo后通过实时荧光定量PCR检测，笔者发现DNA层面上DMSO对照组，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5′-Aza-dCR中HT-29细胞株中Wif-1基因甲基化状态分别为甲基化、甲基化、未甲基化和未甲基化，LoVo细胞株中Wif-1基因甲基化状态都为未甲基化，说明去甲基化药物5′-Aza-CdR能够逆转Wif-1基因甲基化状态，同时在mRNA层面上笔者发现在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=144.823，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有统计学意义（t=6.945，P=0.020；t=41.629，P=0.001；t=14.262，P=0.005）；LoVo细胞株中Wif-1基因的mRNA表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=476.195，P=0.000），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR差异均有高度统计学意义（t=10.656，P=0.009；t=25.486，P=0.002；t=51.323，P=0.000）。最后通过Western blot在蛋白层面上发现在0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR作用后，HT-29细胞株中Wif-1蛋白表达水平较DMSO对照组上调，并且有时间、药物浓度依赖性（F=129.674，P=0.000），与DMSO对照组比较，1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组比较，差异均有统计学意义（t=45.825，P=0.000；t=9.584，P=0.011）。LoVo细胞株中Wif-1基因的蛋白表达水平较DMSO对照组略微上调，并且有药物浓度依赖性但差异无统计学意义（F=0.117，P=0.948），与DMSO对照组比较，0.5、1.0、1.5 μmol/L 5'-Aza-CdR组差异均有高度统计学意义（t=19.414，P=0.003；t=30.468，P=0.001；t=102.233，P=0.000）。
本实验研究显示甲基化酶抑制剂5′-aza-dC可通过启动子甲基化而失活的Wif-1基因的异常甲基化状态得到逆转，而使该抑癌基因恢复其转录活性，以使该基因在肿瘤的发生发展中发挥可能的抑制肿瘤的作用。肿瘤的发生发展涉及多种途径和多种基因的改变，其中表观遗传学的变化逐渐受到医学研究的重视。异常甲基化是表观遗传学研究的一个重要内容，往往是导致抑癌基因失活的主要原因。本研究希望能通过对异常甲基化的进一步研究，来寻求结直肠肿瘤诊断的新标志物和治疗的新靶点。
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