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药理学研究方法范文1
关键词：血清药理学；肿瘤；细胞凋亡； 三磷酸腺苷酶；葡萄糖-6-磷酸酶
中图分类号：R285.5文献标识码：A
文章编号：1673-7717(2008)05-1108-02
Research Application of Blood Serum Pharmacology Method on Induction of Tumor Cell Apoptosisand Lowering of Enzyme Activity
CAI Shuo1，LIU Shan2，ZHANG Lihong1, Jin Chunfeng1, Liu Chunying1
（Liaoning University of TCM,Shenyang 110032,Liaoning China；2.Fourth People's Hospital of Shenyang,Shenyang 110032,Liaoning,China）
Abstract：Objective:To explore the application of blood serum pharmacology method in the research of inducing cell apoptosis and reducing the enzyme activity. Methods:Using Chinese native medicine serology method of treating the liver cancer, stomach cancer, lung cancer, big cancer of theintestines to discuss the effect of inducing tumor cell apoptosis, reducing the enzyme activity of ATP (Mg2+ - ATPase) and the glucose -6-phosphatase (G-6-Pase) of tumor cell. Results:①Four kind of different compound Chinese medicical blood serum all can induce the cell apoptosis of corresponding liver cancer cell lines ,A549 human lung cancer cell lines, CCL229 human colorectal carcinoma cell lines and cell line SGC7901. ②The activity of ATP and Glucose -6- phosphatase in tumor cell is decreased .Conclusion:The research application of blood serum pharmacology method on the induction of tumor cell apoptosis and the lowering of enzyme activity has the stability and the credibility.
Keywords:blood serum pharmacology;tumor;cell apoptosis;Mg2+-ATPase;glucose-6-phosphatase
20世纪80年代中期，日本学者Iwama H等率先提出“血清药理学方法”。此法是先给动物灌胃给中药，一定时间后再采集、分离其血清，并用此含药血清进行体外实验[1]。血清药理学方法已被广泛用于中医药作用机制的研究，研究层面已涉及到细胞增殖、分化、凋亡与细胞周期的调节以及基因表达等方面。本研究采用治疗胃癌、肝癌、肺癌、大肠癌等中药血清学方法，深入探讨其诱导肿瘤细胞凋亡、降低肿瘤细胞三磷酸腺苷酶（Mg2+―ATPase)与葡萄糖-6-磷酸酶(G-6-Pase)酶活性作用。
1 实验方法
1.1细胞培养主要试剂 抗肝癌、胃癌、肺癌、大肠癌等不同中药复方中的中药，均由辽宁中医药大学第一附属医院提供。
1.2中药制剂制备 将3个不同中药复方组成后传统煎制：中药清水浸泡2h，煮沸后文火煎15min，纱布过滤取汁，药渣加水再煎20min，两次药汁混合，浓缩为100%。
1.3药物血清制备 动物：SD大鼠由辽宁中医药大学实验动物中心提供。30只SD大鼠随即分为3组，即中药组10只，化疗组10只，对照组10只。实验前禁食12h，采用2次给药方法（第1次给药2h后重复等量给药1次），每100g大鼠灌胃中药制剂1mL，2次/日连续灌胃3天。化疗组、对照组生理盐水等量灌胃3天。分别在末次给药后1、2、3h采血，戊巴比妥钠麻醉，无菌条件下，下腔静脉取血，静置4h，4℃，3000r/min 20min离心，分离血清，同种条件药物血清混匀，过滤，56℃30min灭活，-20℃保存，备用。
血清分组：中药血清组（中药组）、化疗血清组（西药顺铂-DDP组）、对照血清组（对照组）。（1）中药血清组：临用前将中药组大鼠血清加入PRMI1640培养液，浓度分别为5%、10%、20%。（2）化疗血清组：用含10%化疗组大鼠血清PRMI1640培养液，DDP的终浓度为5%、10%、20%。（3）对照血清组：大鼠血清中加入PRMI1640培养液，终浓度为5%、10%、20%。
1.4细胞株 肝癌细胞株、SGC7901胃癌细胞株、细胞株 A549人肺癌细胞株和CCL229人大肠癌细胞株和均由中国医科大学生物教研室卫生部重点实验室提供。
2细胞培养
将细胞从冻存于液氮中的安瓶取出，放入37～40℃水浴中1min内融化，无菌条件下打开安瓶，接种于2只无菌培养瓶中。加入10%小牛血清PRMI1640培养液，在5%CO2，37℃条件下CO2培养箱中培养，倒置显微镜下动态观察细胞形态，24h后见细胞贴壁生长状态良好，弃培养液，分别加入各组血清，继续培养。
3标本制备
3.1细胞凋亡 生长在培养瓶内的贴壁细胞用2.5%戊二醛4℃原位固定2h，用橡皮铲刮下细胞，转至离心管内，低温高速离心机2000r/min，15min，琼脂处理成块，PBS冲洗，1%锷酸（OsO4）后固定1.5h，梯度乙醇、丙酮脱水，Epon812树脂包埋，超薄切片机（LKB-V）切片，醋酸铀和柠檬酸铅双重染色，透射电镜（JEM-1200）观察、摄片。
3.2酶细胞化学 取出培养皿中的载片，PBS冲洗，2%多聚甲醛固定30min，8%蔗糖脱水，3次×30min，分别加入Mg2+-ATP酶和G-6-P酶孵育液，37℃孵育45min，双蒸水冲洗，2min×3次，2%硫化铵成色，2min，双蒸水冲洗，2min×3次，梯度乙醇脱水各10min，甘油明胶封片，普通光镜下观察、拍片。
4 结果
4.1 细胞凋亡 ①正常对照组：各组肿瘤细胞株多为长梭形，表面可见较多的微绒毛，线粒体、粗面内质网、高尔基复合体、溶酶体等细胞器丰富、排列规则。②中药组：细胞表为椭圆形、圆形。表面微绒毛明显减少、消失。胞浆浓缩，可见大小不等的空泡，泡内容物电子密度与机制相似。细胞核变小、不规则，染色质浓缩、边集，呈断裂状，部分线粒体肿胀、空泡化。可见到典型的凋亡小体：圆形，可见从凋亡细胞脱落。位于凋亡细胞一侧，表面有完整的细胞膜包裹，小体内可见染色质碎片及破碎的内质网、囊泡化的线粒体等结构。③化疗组：结果与中药组相似，可见典型的凋亡小体。
4.2 酶细胞化学 ①Mg2+-ATP酶：光镜下可见对照组细胞Mg2+-ATP酶主要定位在细胞膜内侧，黑色酶反应颗粒大小均匀，密度大，呈线状规则排列，酶活性强。与正常组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低。提示酶活性明显下降。②G-6-P酶：光镜下可见对照组细胞的G-6-P酶主要定位在细胞质内，酶反应颗粒粗大，排列密集，呈融合状，酶活性强。与对照组比较，中药组、西药组细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，西药组部分细胞为阴性。提示酶活性明显下降。 采用Tiger图像分析仪测定Mg2+-ATP酶和G-6-P酶阳性细胞平均光密度（AOD）值，与对照组相比，P＜0.01。
5 讨论
中药血清药理学方法是由日本学者于20世纪80年代首先提出来的。是给动物灌服中药一定时间后，取其血清进行实验的药理学研究方法。利用血清药理学方法，给大鼠灌服中药一定时间后，取出血清进行体外实验。能客观反映中药进入体内之后，经过消化、吸收、代谢等过程后发挥药效作用，中药血清药理学提示：中药复方诱导的肿瘤细胞株凋亡具有可靠性和可信性[2]。
本研究证实，4种不同中药复方的中药血清，均能诱导相应肝癌细胞株、A549人肺癌细胞株、CCL-229人大肠癌细胞株和SGC-7901胃癌细胞株发生凋亡，见到典型的形态学特征性指标――凋亡小体[3-4]。
Mg2+-ATP酶是质膜标志酶，主要定位于细胞膜内侧，此酶参与质膜上离子的主动转运，,维持细胞内K+和Na+浓度相对稳定状态,保持细胞膜内、外渗透压平衡以及参与保持细胞内外的化学梯度和跨膜电位，维持细胞内高钾低钠状态，从而保证细胞的活性。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，提示酶活性明显下降。G-6-P酶是内质网标志酶，是一种多功能酶,是细胞内糖原异生作用中重要酶之一，被称为“代谢标志酶”之一。此酶在糖代谢、免疫球蛋白合成及其它蛋白质合成、浓缩、加工等方面发挥重要作用。本实验中，药物血清作用后细胞的酶反应颗粒变小，数量减少，密度减低，有的为阴性。提示酶活性明显下降[5-6]中药血清诱导肿瘤细胞凋亡，降低肿瘤细胞株酶活性可能是中药复方抗肿瘤的机理之一。笔者同样成功应用本中药血清药理学技术进行了胃癌宁对人SGC-7901胃癌细胞株p53、bcl-2基因表达影响的研究[7]。
（1）给药方案与采血时间。目前存在多种给药方案。但一般使用灌胃方式，也可通过皮肤、黏膜、呼吸道等途径给药。给药时间最短者为1天，最长者为10天；给药次数也各不相同，有每天2次的，也有每天3次的。尽管已有研究表明，连续用药5天和10天所制备的含药血清的生物学效应是相似的，但无论哪种给药方法都必须使药物浓度达到相对平衡状态。根据目前掌握的大量药物的有效成分的药代动力学数据，本实验采用与多数研究者一致的即时血清在实验前禁食12h，次日采用两次给药方式（一次给药后2h等量给药），连续灌胃3天，日两次；采血时相，分别在末次给药后1、2、3h采血。证明是研究中药复方作用肿瘤细胞株较为可靠的血清药理学方法血清[8-9]。（2）含药血清用量。目前中药含药血清的浓度还没有确切的规定，选用5 、10 和20浓度的含药血清进行实验所得结果的说法不一，进行细胞增殖抑制作用的实验采用高浓度的效果好，而进行细胞增殖促进作用的实验采用低浓度的效果好[10]，本研究采用10的平均浓度进行实验，结果较好。当然，最佳血清浓度是因不同实验而异的，故最好的做法是通过预实验来确定。血清药理学可较好地克服了中药粗制剂直接进入体外实验的缺点，其结果的可信度明显优于中药粗制剂直接用于体外实验，不仅提示中药制剂在胃肠内处理过程中活性成分的转化与改变，而且有利于中药真正有效活性部位、有效成分的发现，将有助于促进中药药理现代化的发展，为新药开发奠定能基础。本研究进一步证实，血清药理学方法在诱导肿瘤细胞凋亡、降低酶活性等研究中的应用具有稳定性、可信性。血清药理学方法的应用将更多的相关中药方剂引入抗肿瘤细胞凋亡及诱导细胞凋亡方面的研究，筛选有效的中药成分与其有效组方来达到诱导大量肿瘤细胞凋亡，揭示中药的抗癌机理，为中药治疗肿瘤提供科学、客观和现代的手段与方法，是今后研究的重要内容，对人类攻克肿瘤有着重大意义。
参考文献
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药理学研究方法范文2
【关键词】 龙血竭;含药血清;蛋白沉淀
龙血竭为传统中药,是龙舌兰科植物剑叶龙血树[Dracaena cochinchinensis(Lour)S.C.Chen]含树脂木材的乙醇提取物[1]。龙血竭总黄酮(sanguis draconis flavones,SDF)是从龙血竭中提取得到的主要成分[2],包括黄酮、二氢黄酮、黄烷、查耳酮、二氢查耳酮等20多种化合物[3]。动物实验表明,龙血竭总黄酮能对抗整体动物心肌缺血损伤[2]。本实验将龙血竭HPLC图谱征峰较明显的5个成分的峰面积作为检测指标(其中2个主要成分为龙血素A和龙血素B),以龙血竭原溶液为对照计算体外加样后提取百分率,进行血清处理方法的研究。
1、仪器与试剂
Waters高效液相色谱仪:515 HPLC泵,2487双波长吸收监测器,N2000双通道色谱工作站(浙江大学智能信息工程研究所);TDL802B台式离心机(上海安亭科学仪器厂);超声仪(上海超声波仪器厂);TU1810紫外可见分光光度计(北京普析通用仪器有限责任公司);ZH2 BLENDER涡旋混合器(天津药典标准仪器厂)。
广西产龙血竭(广西中医学院制药厂提供);龙血素A、龙血素B对照品(中国药品生物制品检定所提供);乙腈(色谱纯);甲醇,乙酸乙酯,丙酮,正丁醇,乙醚,三氯甲烷,正戊醇,95%乙醇,无水乙醇,三氯醋酸,均为分析纯;新西兰大耳白兔(广东省医学实验动物中心提供)。
2、HPLC法的建立
2.1色谱条件
色谱柱:Diamonsil C18(5 μm,250 mm×4.6 mm);保护柱:Easyguard C18 Replacement Cartridges Cat#6101;流动相:乙腈1%冰醋酸(体积比38∶62);检测波长:280 nm;流速:1.2 mL/min。
2.2溶液的制备
取龙血素A、龙血素B对照品适量,用甲醇分别配制成每1 mL含10 μg的溶液,作为对照品溶液。
取广西龙血竭,用甲醇配制成每1 mL含2 mg的溶液,0.45 μm微孔滤膜滤过,续滤液作为供试品溶液。
2.3线性范围
将龙血素A对照品溶液分别配制成浓度为0.925、4.625、9.250、13.875、18.500、23.125 μg/mL的溶液,进样10 μL,记录色谱图,进样量(m)与峰面积(A)的回归方程为:A=45 064 451m-10 379 768,r=0.999 2,线性范围为9.25~231.25 ng。
同上,将龙血素B对照品溶液分别配制成浓度为0.947、4.735、9.470、14.205、18.940、23.675 μg/mL的溶液,进样10 μL,记录色谱图,进样量(m)与峰面积(A)的回归方程为:A=33 227 615m-10 135 858,r=0.999 0,线性范围为9.47~236.75 ng。
2.4稳定性试验
取“2.2”项下的供试品溶液分别于0、2、4、6、8、24 h进行检测,分别记录5个特征性成分的峰面积,相应峰面积的RSD值分别为1.83%、3.09%、2.89%、2.47%、2.05%,即供试品溶液在24 h内保持稳定。
2.5供试品溶液HPLC图谱
取“2.2”项下的供试品溶液,龙血素A、龙血素B对照品溶液及空白血清样品,各进样10 μL,记录HPLC图谱,见图1。
图1供试品溶液(A)、龙血素A对照品(B)、龙血素B对照品(C)及空白血(D)HPLC图谱 略
含中药龙血竭的血清处理方法研究在供试品溶液图谱上选取5个特征峰较明显的成分作为检测指标,保留时间分别为10.232、15.498、26.665、35.732、38.732 min,其中峰4和峰5经验证,确定为龙血素A(4′羟基2,4二甲氧基二氢查耳酮)和龙血素B(4′羟基2,4,6三甲氧基二氢查耳酮)[4],峰1、2和3结构未知。由上图可知,空白血清样品无干扰。
3、结果与讨论
3.1提取率的计算
特征性成分的提取率=血清样品征性成分的峰面积/供试品溶液相应成分的峰面积×100%
3.2血浆样品的处理方法
3.2.1蛋白沉淀剂的选择
实验中发现,供试品溶液与10%三氯醋酸会发生反应,出现混浊现象,故使用常用的蛋白沉淀剂甲醇、乙腈、无水乙醇、丙酮进行处理。
由兔耳缘静脉取血约2 mL,置离心管中,加入供试品溶液1 mL,涡旋混合,分别加入各种蛋白沉淀剂甲醇、乙腈、无水乙醇和丙酮适量,离心,取上清液,水浴挥干后精密加入1 mL甲醇,超声溶解,0.2 μm微孔滤膜滤过,取续滤液10 μL进行HPLC检测。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照,计算得各成分的提取率见表1。
表1不同蛋白沉淀剂制备含药血清的特征峰的提取率 略
从表1可见,以甲醇作蛋白沉淀剂对5个特征峰的提取率均较低,丙酮次之,乙腈和无水乙醇相对高一些,但对峰3的提取率均低于50%,证明4种处理过程均无法避免血浆蛋白对药物的吸附,无法达到理想的提取效果。
按上述实验步骤,在分别加入蛋白沉淀剂后,加入与血样同等量的乙酸乙酯,提取3次,涡旋混合,离心,取乙酸乙酯层,合并提取液,水浴挥干,精密加入1 mL甲醇,超声溶解,经0.2 μm微孔滤膜滤过,取续滤液10 μL进行HPLC检测。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照,计算得各成分的提取率见表2。
从表2可见,含药血清在使用不同蛋白沉淀剂后,通过同种有机溶媒——乙酸乙酯进行提取,可不同程度提高5个特征性成分的提取率,以无水乙醇组提高效果最不明显,甲醇、乙腈、丙酮组均有显着提高,且乙腈组对5个特征峰的提取率均达到80%以上。
表2不同蛋白沉淀剂与溶媒结合提取制备含药血清的特征峰的提取率 略
3.2.2提取次数的选择
使用乙腈作为蛋白沉淀剂,加入与血样同等量的乙酸乙酯,分别按2、3、4次进行提取,水浴挥干后精密加入1 mL甲醇,超声溶解,0.2 μm微孔滤膜滤过,取续滤液10 μL进行HPLC检测。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照,计算得各成分的提取率见表3。
表3不同提取次数制备含药血清的特征峰的提取率 略
由表3结果可见,使用与血样同等量的乙酸乙酯提取3次(见图2)的效果明显优于提取2次,当提取次数为4次时,对各特征性成分的提取率影响则较小,再增加提取次数意义不大。
3.2.3提取溶剂的选择
使用乙腈作为蛋白沉淀剂,采用其他种类提取溶剂如正丁醇、乙醚、氯仿对血样进行处理。以供试品溶液5个指标性成分的峰面积为对照,计算各成分提取率见表4。
图2含中药龙血竭血清HPLC图谱 略
表4不同提取溶剂制备含药血清的特征峰的提取率 略
正丁醇对于峰2、4、5的提取率达到80%以上,但对峰1和3的提取率均低于75%;而乙醚和氯仿对峰3的提取率均低于50%,不及使用乙酸乙酯为提取溶剂的效果。
4、结 论
将含中药龙血竭的血清先通过乙腈沉淀血浆蛋白,再使用与血样同等量的乙酸乙酯提取3次,可使龙血竭中5个特征性成分的提取率达到80%以上。本研究结果可为中药龙血竭的体内药动学研究提供依据。
【参考文献】
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药理学研究方法范文3
【关键词】 数学 公理化方法 研究数学 作用
【中图分类号】 G424 【文献标识码】 A 【文章编号】 1006-5962（2013）02（b）-0042-01
1 数学公理化方法概述
1.1 数学公理化方法的内涵
纯形式公理化方法的特征是具有高度的形式化和抽象化，系统的基本概念、基本关系用抽象的符号表示，命题由符号组成的公式表示，命题的证明用一个公式串表达。一个符号化的形式系统只有在解释之后才有意义。同时，作为一个符号化的形式系统，可以用来提供简洁精确的形式化语言；提供数量分析及计算的方法；提供逻辑推理的工具。
公理化方法的具体形态有三种：实体性公理化方法、形式公理化方法和纯形式公理化方法，用它们建构起来的理论体系分别为《几何原本》、《几何基础》和ZFC公理系统。
1.2 公理化方法的基本思想
数学是撇开现实世界的具体内容来研究其量性特征形式与关系的。其结果只有经过证明才可信，而数学证明采用的是逻辑推理方法，根据逻辑推理的规则，每步推理都要有个大前提，我们不难想象到，最初的那个大前提是不可能再由另外的大前提导出的，既是说，我们的逆推过程总有个“尽头”，同样，概念需要定义，新概念由前此概念定义，必也出现这样的情况最原始的概念无法定义。
因此，我们要想建立一门科学的严格的理论体系，只能采取如下方法：让该门学科的某些概念以及与之有关的某些关系作为不加定义的原始概念与公设或公理，而以后的全部概念及其性质要求均由原始概念与公设或公理经过精确定义与逻辑推理的方法演绎出来，这种从尽可能少的一组原始概念和公设或公理出发，运用逻辑推理原则，建立科学体系的方法叫做公理化方法。
2 数学公理化方法的逻辑特征
2.1 协调性
无矛盾性要求在一个公理系统中，公理之间不能自相矛盾，由公理系推出的结果也不能矛盾，即不能同时推出命题A与其否定命题，显然，这是对公理系统的最基本的要求。如何证明给定的公理系统的无矛盾性呢？若想通过“由这一公理系作出全部可能的推论并指出其中没有矛盾”来证明是不可能的。
2.2 独立性
独立性要求在一个公理系统中，被选定的公理组中任何一个公理都不能由其他公理推出。独立性其实要求的是公理组中公理之间不能有依从关系，若某一公理被其余公理推出，那它实质上就是一个定理，在公理组中就是多余的，所以，独立性要求公理组中公理数目最少。
2.3 完备性
完备性要求在一个公理系统中，公理组的选取能保证由公理组推出该系统的全部真命题，所以，公理不能过少，否则就推不出某些真命题，这是关于完备性的古典定义。现代数学常借助模型的同构给公理系的完备性下定义，即如果公理系T的所有模型或解释都彼此同构，就称这个公理系是完备的。
在上述公理化方法的三个特征中，无矛盾性是最重要而又是非有不可的。独立性从理论上讲，从完美简炼上讲，应该要求，因为公理和定理在整个系统中处的地位不同，公理是出发点，定理是推出的，不能混在一块。但是，独立性要求有时可降低。现行中学几何体系就放弃了这一要求。至于完备性，要求就大大放宽了；而且“从研究完备的公理系确定的对象转向研究其公理系不完备的对象”被认为是现代数学的特征之一。
3 数学公理化方法在研究数学中的作用和意义
3.1 表述和总结科学理论
公理化方法使有关的理论系统化，把它们按照某种逻辑顺序构建成一个系统，因而便于人们系统地理解知识体系，便于掌握理论的本质。它是应用演绎推理的基本方法，它为认识世界提供了演绎推理的模式，提供了一种理性证明的手段，它是表述科学理论一种比较完善的方法，它为各门科学提供了一种思想方法上的示范和有效的表述手段，有利于促进理论的完善和严格化。它赋与数学内在的统一性，有助于人们了解数学各分支、各部门之间的本质联系。
3.2 完善和创新理论
公理化方法的应用要求一门科学的充分成熟：积累了一定数量的基础知识，进行了一定的系统分析和研究，对该门学科知识结构有了较深入的理解。因此，实现公理化的过程也是深入研究理论体系的过程。采用公理化方法还可以发现和补充理论系统中的缺陷和漏洞。从而有利于完善已有理论，创建新的理论。
3.3 培养和熏陶人们的逻辑思维能力
数学学习，重要的不在于只是记住概念、公式、定理和法则，而在于学会如何去获得这些知识，即学会正确地进行数学思维，逻辑思维正是数学思维的核心成分之一。逻辑思维能力是一种重要的数学能力。而公理化方法使逻辑思维在数学中的作用得以充分发挥，大大提高了数学教育的成效，实现高度的思维经济，这无疑对培养和熏陶学生的逻辑思维能力有其十分重要的作用和意义。此外，由于公理化方法可以揭示一个数学系统和分支的内在规律性，从而使它系统化，这也无疑有利于人们学习和掌握。
4 结语
公理化方法是是建立某些抽象学科的基础，是加工、整理知识，建立科学理论的工具，公理系统的形成是数学分支发展的新起点。公理化方法有助于发现新的数学成果，可以探索各个数学分支的逻辑结构，发现新问题，促进和推动新理论的创立和发展。对各门自然科学的表述具有积极的借鉴作用。同时公理化方法对于学生理解和掌握数学知识、数学方法及培养学生逻辑思维能力具有重要作用。公理化方法本身及其在数学理论和实践应用中的巨大作用，随着科学技术的发展还在继续向前发展。
参考文献
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药理学研究方法范文4
[关键词] 华法林；心房颤动；CYP2C9；VKORC1
[中图分类号] R541.7+5 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2014）32-0151-04
Dose study on atrial fibrillation patients’ warfarin use based on pharmacogenetics
FU Yongping1 ZHANG Ziyan2
1.Department of Cardiology， Affiliated Hospital of Shaoxing University， Shaoxing 312000， China； 2.Department of Hematology， Heze Hospital of Traditional Chinese Medicine in Shandong Province， Heze 274035， China
[Abstract] Objective To compare the strengths of warfarin based on pharmacogenetics or defined by clinical indicators. Methods Either from outpatient or inpatient department， 220 patients who needed anticoagulative treatment by warfarin were recruited. These cases were divided into two groups. Warfarin use method of one group was determined by pharmacogenetics， specifically， CYP2C9 and VKORC1 genotyping were carried out to ascertain and adjust use dosage by Polymerase chain reaction-restriction nuclease fragment length polymorphism（PCR-RFLP）. As for the other group， therapeutic regimen was defined by the stable and qualifying time， the frequency of drug adjustment， absolute difference between initial and eventual dose and the proportion of anticoagulant overdose. Additionally， the severity and incidence of hemorrhagic events were closely observed during half year’s following up. Results Compared with traditional warfarin use regimen defined by clinical indicators， the results obtained by pharmacogenetics， including the stable and qualifying time， the frequency of drug adjustment， absolute difference between initial and eventual dose， the proportion of anticoagulant overdose（1.8% compared to 16.4%）， and the incidence of severe hemorrhagic events were unanimously better and statistically difference （P
[Key words] Warfarin； Atrial fibrillation； CYP2C9； VKORC1
我国心房颤动患者数接近1000万，心房颤动的主要危害是脑梗死，而脑梗死的致残率高，使患者生活质量严重下降，给患者及其家属带来巨大的精神负担和经济损失。抗凝治疗能够减少心房颤动的栓塞发生率，但由于医患双方对其出血副作用的担心，使用华法林抗凝人数很少。虽然有新型抗凝药物的出现，但新型抗凝药物价格昂贵，尚无针对性拮抗剂，在肾功能不全病人使用的局限性以及在瓣膜性心脏病应用的局限性，大规模应用新型抗凝药物并不适合我国国情。相比之下，华法林价格便宜，每日服药一次，肾功能不全患者无需调整剂量，所以华法林在抗凝治疗中的地位尚无可替代。为更好地探索我国心房颤动患者的华法林使用剂量的个体化差异，本研究以门诊或病房房颤患者为研究对象，对CHA2DS2-VASC评分≥2分以上需要华法林治疗的患者进行研究。
1对象与方法
1.1研究对象
选择2012年10月～2013年12月心内科门诊或病房需要使用华法林抗凝的心房颤动患者220例。其中男123例，女97例，年龄35～97岁，平均（57.5±12.5）岁。入选标准：（1）汉族；（2）≥18岁；（3）心房颤动患者；（4）CHA2DS2-VASC评分≥2；（5）签知情同意书并能够配合临床随访观察。排除标准：（1）严重的肝、肾功能不全或甲状腺疾病；（2）近期手术史；（3）急性心肌梗死1个月内；（4）活动性消化性溃疡；（5）感染性心内膜炎；（6）必须长期服用非甾体类抗炎药；（7）必须使用试验药物以外的抗血小板、抗凝药物及溶栓药物；（8）恶性肿瘤；（9）处于妊娠期；（10）有血液系统疾病，血小板缺乏症；（11）不能定期门诊复诊条件或治疗过程中不能规律服药；（12）拒绝随访。
1.2方法
由专人收集临床资料和随访登记，与患者签署书面知情同意书，病例随机分为两组，一组为药理遗传学组（110例）：抽取外周静脉血2 mL，提取基因组DNA，使用聚合酶链反应-限制性内切核酸酶片段长度的多态性（PCR-RFLP）给患者进行CYP2C9和VKORC1基因型分析，根据计算模型（http：//）确定的华法林剂量用药，并进行调整。另一组为临床指标组（110例）：根据临床指标确定的华法林剂量用药。华法林片由齐鲁制药有限公司生产，批准文号：国药准字：H37021314，每片2.5 mg。两组患者在性别、年龄、合并疾病病史及合并用药等一般资料方面差异无统计学意义，具有可比性，见表1。
1.3 CYP2C9和VKORC1基因型分析材料与方法
1.3.1 试剂 基因组DNA抽提试剂盒、Taq DNA聚合酶、10×PCR缓冲液、10 mmol/L dNTPs、25 mmol/L氯化镁、DNA 标记物（采购自加拿大Bio Basic Inc.）；引物由上海生工生物工程有限公司合成提供；限制性内切酶AvaⅡ、Nsi I、Msp I及琼脂糖（均购自美国Promega）。
1.3.2 仪器 HH-W21.420型电热恒温水箱（天津泰斯特仪器有限公司）；DYY-6C型稳压稳流电泳仪（北京六一仪器厂）；多功能暗箱式紫外线分析装置（北京赛百奥公司）；FerroTec基因扩增仪（杭州大和公司）；LX-100手掌型离心机（江苏海门）。
1.3.3 基因组DNA提取及PCR扩增 取外周抗凝血液2 mL，使用基因组DNA抽提试剂盒提取基因组DNA，-20℃保存。PCR反应的引物设计参考有关文献[1-3]，VKORC1基因检测的正向引物为5’-GCCAGCA-GGAGAGGGAAATA-3’，反向引物为5’-AGTTTGGACTACAGGTGCCT-3’；CYP2C9 *3基因检测的正向引物为5’-AATAATAATATGCACGAGGTCCAGAGATGC-3’，反向引物为5’-GATACTATGAATTTGG-GACTTC-3’；CYP2C9 *2基因检测的正向引物为5’TACAAATACAATGAAAATATCATG-3’，反向引物为5’-CTAACAACCAGACTCATAATG-3’。PCR反应体系包括基因组DNA 0.2 μg，2.5 mmol/L，dNTPs 4 mL，10×PCR缓冲液5 μL，25 mmol/L的MgCl2 4 μL，10 μmol/L的引物各3 mL，5 u/L Taq聚合酶0.5 μL，加超纯水至50 μL。CYP2C9*2反应条件为：先94℃预变性5 min，然后94℃处理45 s，再50℃处理45 s，最后72℃处理1 min，共35个循环，接下来72℃延伸5 min；CYP2C9*3的反应条件为：先94℃ 预变性5 min，然后94℃处理45 s，再56℃处理45 s，最后72℃处理30 s，共35个循环，接下来72℃延伸5 min；VKORC1-1639G>A的反应条件为：先94℃ 预变性5 min，然后94℃处理45 s，再59℃处理30 s，之后72℃处理30 s，共35个循环，最后72℃延伸5 min。
1.3.4 限制性内切酶片段长度多态性（RFLP）分析 取用VKORCl、 CYP2C9 *2、CYP2C9 *3PCR产物各10 μL，然后分别加入限制性内切酶AvaⅡ、Msp I、 Nsi I各0.5 μL以及牛血清白蛋白0.2 μL和缓冲液2 μL，再加入超纯水至20 μL，37℃水浴4 h。酶切产物在2.5%琼脂糖凝胶电泳，最后紫外灯下观察条带。
1.4 观察指标
观察两组患者达标稳定时间（从给予首剂华法林开始到INR值在达到治疗范围（2～3）且INR值稳定所需要的时间）、药物调整的次数、终点剂量与初始剂量的绝对差值、抗凝过量的比例（INR初次超过4的比例），并观察随访过程中出血事件的严重程度和发生率。随访时间约半年。
1.5统计学处理
应用SPSS 15.0统计学软件，对所有计量资料均先进行单样本正态分布检验，正态分布或近似正态分布资料的组间比较采用t检验。计量资料数据采用（x±s）表示。计数资料的组间比较采用χ2检验，P
2 结果
2.1 CYP2C9和VKORC1基因型分析
药理遗传学的方法组共对110例患者采用聚合酶链反应-限制性内切核酸酶片段长度多态性（PCR-RFLP）进行CYP2C9和VKORC1基因型分析，CYP2C9基因具有高度多态性，在基因编码区和非编码存在许多单碱基突变，最主要的有3种： CYP2C9*1、CYP2C9*2和CYP2C9*3， CYP2C9：*1型102例占92.7%；CYP2C9：*2型0例占0%；CYP2C9：*3型8例占7.3%。VKORC1发现有AA、AG、GG三种基因型，VKORC1：AA型81例占73.6%；VKORC1：AG型26例占23.7%；VKORC1：GG型3例占2.7%.
2.2 两组临床观察指标的差异
患者随访时间半年，半年后对两组患者在达标稳定时间、药物调整的次数、终点剂量与初始剂量的绝对差值、抗凝过量的比例、严重出血发生率进行观察和比较，药理遗传学的方法与临床指标组相比，各项指标均具有优势，具有统计学差异（P
表2 两组临床观察指标的差异（x±s）
注：药理遗传学组与临床指标组相比，各观察指标差异有统计学意义（P
2.3 CYP2C9和VKORC1基因型分析结果
对所有抗凝过量和严重出血患者都进行CYP2C9和VKORC1基因型分析。出现抗凝过量共20例：基因类型为CYP2C9*1，VKORC1：AA共10例，有4例出现严重出血，基因类型为CYP2C9*3、VKORC1：AA共6例，有3例出现严重出血；基因类型为CYP2C9*1、VKORC1：AG共1例，基因类型为CYP2C9*3、VKORC1：AG共2例，基因类型为CYP2C9*3；VKORC1：GG共1例。10例严重出血患者的VKORC1基因型均是AA。
3 讨论
华法林在抗凝治疗中的地位尚无可替代。但华法林治疗窗很窄，而且用药的个体性差异和种族差异也很大，要达到相同作用效果，最大剂量与最小剂量相差可以达到10倍以上。目前发现影响华法林药效学的基因主要有2个，细胞色素氧化酶P450 2C9（cytochrome P-450 2C9，CYP2C9）和维生素K环氧化物还原酶复合体1（VKORC1）。华法林全部由肝脏代谢，CYP2C9是人类肝脏中一种重要药物代谢酶系统，是华法林代谢最关键的酶，CYP2C9基因具有高度多态性，在基因编码区和非编码存在许多单碱基突变，其中研究最多也是最主要的有3种，即野生型CYP2C9*1、突变体CYP2C9*2和突变体CYP2C9*3，这几个等位基因的多态性可以影响华法林药效，导致个体对华法林的敏感性不同以及华法林在抗凝治疗过程中出血的危险性，对华法林的使用剂量密切相关的两个等位基因分别为CYP2C9*2和CYP2C9*3。基因型CYP2C9*2和CYP2C9*3的患者所需的华法林治疗剂量小[4，5]。VKORC1是人体内维生素K依赖性凝血因子生成的限速酶和关键酶，华法林通过竞争性抑制此酶的作用而达到抗凝效果。VKORC1发现有AA、AG、GG三种基因型，AA基因型为华法林剂量敏感型，所需的华法林治疗剂量小。AG、GG两种基因型为华法林剂量抵抗型，所需的华法林治疗剂量大[4，5]。纳入药理遗传学的方法组的患者CYP2C9和VKORC1基因型见2.1。本研究中发现：CYP2C9基因型分布CYP2C9*1占92.7%，CYP2C9*2占0%，CYP2C9*3占7.3%。CYP2C9基因型分布以CYP2C9*1为主，与西方人相似[6-10]，可见CYP2C9基因型分布无明显种族差异。本研究中：VKORC1基因型分布AA占73.6%，AG占23.7%，GG占2.7%。与文献报道我国汉族人VKORC1基因型以AA型为主，GG、GA型少见相符[6-9]，而西方人以GG、GA型为主，AA型少见，提示VKORC1基因型存在人种差异[6-9]。已知CYP2C9*1、VKORC1-AA型基因的患者，所需华法林剂量减少，这可部分解释我国汉族人所需华法林剂量低于西方人群的原因。
本研究通过对两组间临床观察指标（表2）的比较，药理遗传学的方法组与临床指标组比较，稳定达标时间更短，药物调整的次数更少，终点剂量与初始剂量的绝对差值更小，抗凝过量的比例更低，严重出血事件发生率更低。药理遗传学的方法组各项指标均具有优势，具有统计学差异（P
本研究中观察对象共发生抗凝过量例数20例，抗凝过量患者中基因型表现以CYP2C9*3或VKORC1：AA为多见，抗凝过量患者平均年龄（72.4±9.4）岁，也较大。观察对象共发生9例严重出血，其中严重出血病人中7例抗凝过量，另外2例并未出现抗凝过量，但年龄较大，提示抗凝过量和年龄是出血的重要因素[4，11-14]。严重出血患者的VKORC1基因型均是AA，VKORC1基因型表现为AG、GG的严重出血病例没有观察到。CYP2C9*3且VKORC1：AA的患者严重出血发生率较高，应重点关注此类患者。严重出血患者平均年龄为71.5岁，高于本研究观察对象的平均年龄。药理遗传学的方法能够及早发现这些出血高危患者，避免严重出血的发生。这也是药理遗传学的方法指导华法林使用剂量组严重出血发生率低的主要原因。
基于药理遗传学的方法指导华法林使用剂量比根据临床指标确定的华法林剂量用药方法使用剂量推荐剂量更加精确，剂量调整小而少，能更快到达INR治疗范围，而且严重出血发生率低，对患者更安全，值得推广应用。
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药理学研究方法范文5
1 资料与方法
1.1 一般资料
接受前列地尔注射液治疗的患者214例，年龄为28～65岁，平均（43.1±21.9）岁，其中男128例，女86例。将所有患者顺序编号，随机分为两组，奇数组列为对照组107例，偶数组列为观察组107例。两组患者一般资料（性别、年龄、婚姻状况、职业、文化程度等）比较，差异无统计学意义（P ＞ 0.05），具有可比性。
1.2 方法
对照组采用0.9%氯化钠注射液100 mL静脉滴注，同时给予前列地尔注射液10 μg，每日1次，疗程10 d。观察组采用前列地尔注射液10 μg加入0.9%氯化钠注射液100 mL中再静脉滴注，每日1次，疗程10 d。医护人员在静脉滴注前对患者进行必要的心理护理，滴注期间要随时记录和观察患者的临床症状，采取有效护理干预措施减轻患者血管疼痛，滴注后要追踪患者的临床反应。治疗期间经医护人员果断、快速、有效的处理，所有患者无一例死亡。
1.3 统计学方法
所有数据资料均采用SPSS 16.0统计学软件进行处理，计数资料采用χ2检验，以P ＜ 0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 患者在静脉滴注过程中的临床症状比较
患者在静脉滴注过程中的临床症状比较结果显示，观察组血管疼痛、局部红肿、静脉炎人数明显少于对照组，差异有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表1。
2.2 患者在静脉滴注后的不良反应比较
患者在静脉滴注后的不良反应比较结果显示，观察组发热、胃肠道反应、继发性出血、头疼人数明显少于对照组，差异均有统计学意义（P ＜ 0.05）。见表2。
3 讨论
研究表明，前列地尔在改善患者心脑血管循环的同时，会引发一些不良反应，例如血管疼痛、局部红肿、静脉炎、发热、胃肠道反应、继发性出血、头疼等。前列地尔是一种新型的药物运转系统制剂，其主要的作用机制是前列地尔进入人体后会刺激机体血管，产生5-羟色胺和缓激肽，引发对血管的炎症和疼痛作用。随着药物浓度的加大，其不良反应也会越严重。对照组采用滴斗入药，其局部药物浓度必然大于观察组的静脉滴注，不良反应情况越发明显且严重。
为了预防和控制在静脉滴注过程中所发生的各种不良反应，医护人员需要对患者进行必要的临床护理干预。护理干预措施主要为：①心理护理：用药前，医护人员要为患者详细讲解药物的药理和不良反应，使患者有充足的心理准备，与患者进行交流，对其进行安抚[4-5]。②血管保护：对患者进行静脉穿刺时，医护人员需要选取较粗的血管，经常更换输液部位尽量减少药物对血管壁的持续刺激，避免发生渗出性血管炎症[6]。如果出现穿刺部位血管疼痛，医护人员要立即给予处理，最大限度减轻患者疼痛[7]。在静脉穿刺时，尽量做到一次成功，减少对患者血管的再次伤害[8]。③棉片配制：丁卡因的浓度不要过高，医护人员要避免将棉片直接覆盖在患者血管的穿刺点位，尽量选取远心端。棉片的面积不要过大，使用过程中要尽量保持湿润。④滴速设定：由于药物会引发对患者的不良反应，医护人员可以设定滴速为30滴/min[9]，尽量减少血管内药物的浓度，经常对进行巡视，观察其穿刺部位和患者的状况，减少疼痛的发生。
对于不良反应的处理，医护人员要使用50%硫酸镁湿敷患者的红肿部位以减轻疼痛，利用其高渗作用，促进机体局部组织的水肿消退。本次研究也表明，现用现配前列地尔注射液时，需要注意采用合适的滴注方法可以起到稀释药物浓度的作用，减少其对人体产生的疼痛伤害，降低并发症的发生几率。
药理学研究方法范文6
【关键词】 药理学；记忆法；作用
【中图分类号】G633.92 【文献标识码】B 【文章编号】2095-3089（2013）17-00-01
如果现在在一个医科大学做一个关于最容易挂科及最累的科目的调查的话，无疑答案中出现次数最多的科目一定会有药理学。多数学生反映，药理学内容繁多，不易理解，考点抽象，课程枯燥，记忆困难。由此可见，机械式的记忆方式无法应对药理学考试，更勿论学生帮助理解学科知识。明确多种记忆方法及其作用，在卫生职业药理学教育中，运用多种记忆方法，可以到达事半功倍的效果。
一、关于药理学
作为临床医学专业开设的一门专业必修课程，药理学可谓是沟通医学和临床医学的重要桥梁。它通过研究药物与机体间相互作用及作用规律，用药学基础知识来说明药物在机体内的过程和药物作用的原理，既是巩固学生的药学基础知识，又是为学生从事临床工作打下基础。其重要性就体现在沟通了药学和医学上，同时这也决定了药理学的复杂性和知识性强。大量的药物、药名、药效、用途、不良反应，不是死记硬背的机械式记忆方式就能够应付。它要求学生要在的理解的基础上，分门别类，又加以区分比较，这是一个非常复杂的记忆过程。单一的记忆方式效率低下，印象不深刻，容易混杂知识，造成记忆混乱，最重要的是容易遗忘，而如果学生运用多种记忆方法交替使用，发挥各种记忆方法的特点，可以有效帮助学生有序地记忆大量知识，并且不易记忆混乱，造成失误。故而，教师要做好药理学教育，不仅是联系药学基础，传授知识，加强学生对知识的理解认识，而有意识地引导学生运用多种记忆方法进行记忆，解决记忆困难的问题，使学生长久地有效地记住药理学繁杂的知识，亦是十分重要的。
药理学既是一门主干医学基础课程，又是一门基础医学与临床医学之间的桥梁课程，其具有内容繁琐、枯燥、难于记忆的特点。而进入高职院校学习的学生，往往基础较差，且多数学生学习的积极性、主动性不高。为了提高学生学习的积极性，变被动学习为主动学习，教师在教学过程中应在传统教学方法的基础上，综合应用启发式、比较法等等多种教学方法，使枯燥、乏味的药理学课堂变得生动、丰富，以提高学生学习兴趣，保障教学质量
二、多种记忆方法在药理学教育中的作用
药理学是基础医学与临床医学、医学与药学相互联系的桥梁学科。学好药理学非常重要，但药理学内容枯燥繁杂，记忆起来很辛苦。结合学科特点、讲究科学的记忆方法，利用语言的韵律和节律编成口诀，化繁为简，提高学习的趣味性并加深记忆。药理学学习中运用记忆法及体会药理学是研究药物与机体相互作用的规律及其原理的学科，其内容广泛而又复杂，不但要学习各种药物的药理作用，还要记忆种类繁杂的药物名词、用法及不良反应等。面对一大堆千奇百怪的新老药名时，记忆起来实在犯难。运用记忆法以激发学习兴趣，增强记忆。
2.1推理记忆法
做学问贵在寻根究底，而“不求甚解”和死记硬背是不可取的
A、药理作用作为内容多而复杂的药理学基础知识，容易被遗忘或者混淆造成记忆混乱。在药理作用上，运用推理记忆法，可以系统地掌握知识。在教学中，在联系概论和各论时，加入推理记忆法，在基础上提出问题让学生进行推理学习，从而记忆具体的药理作用，可以将内容系统化，使其条理清晰，不易混淆，推理后的记忆内容印象深刻，不易遗忘。
B、在药物分类上，推理记忆法也有很大的作用。在教学中，由发病机制出发，进行推理，要达到治疗目的，必须用什么类型的药物。以此种推理，引导出药物分类的系统推论，这样等于在理解的基础上，将药物知识系列分类，故而就变得容易记忆了。
2.2比较记忆法
有比较，才能鉴别，才能清晰明确，加深记忆.
药理学的知识繁多，药物之间有共性有差别。在教学中，教师要发挥主导作用，创设环境，发挥学生的主观能动性，启发学生思维，让学生在不同药物中找共性找差别。学生自己通过比较多种药物的特性、作用、副作用，掌握不同药物的优劣性及该药物自身的特点、最适合的情况，减少了死记硬背的分量。
2.3规律总结法
有规律才能够更方便教师教学。
即使是复杂的药理学知识，只要善于总结，也能找到药理规律的。学会在杂乱中寻找规律内容是学好药理学的一个关键，掌握药物间的规律，减少了机械记忆的内容，使记忆内容变得有迹可循，易于记忆，不易遗漏忘记。
2.4口诀记忆法
利用口诀，将知识更好更概括的掌握。
将药物特点编成口诀，有时利用谐音，帮助记忆也是很好的记忆方法。通过一个个口诀进行记忆，朗朗上口，又富有趣味性，可以提高记忆效率，利用学生接受。
三、总结
卫生职业药理学，引起其内容繁多复杂，不易记忆，使许多学生望而生畏。要学好药理学，多种记忆方法的运用必不可少。多种记忆方法能互相弥补，系统化知识，条理清晰化，帮助学生记忆，减少机械记忆的内容，比起机械记忆，不仅仅停留在知识表面，而更利于学生真正理解掌握知识，在进化的临床生涯中正确运用药理学知识。
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