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表观遗传学的应用范文1
在Watson和Crick发现DNA双螺旋结构后的50多年里，基因工程药物在治疗人类疾病中逐渐占据一席之地，人类基因组计划的完成为基因治疗开辟了更广阔的空间。近年来随着遗传学的新兴学科——表观遗传学在人类疾病治疗方面获得了越来越多的证据[1]。它从分子水平上揭示复杂的临床现象，为解开生命奥秘及征服疾病带来新希望。
表观遗传学是研究没有DNA序列变化的情况下，生物的表型发生了可遗传改变的一门学科[2]。表观遗传学即可遗传的基因组表观修饰，表观修饰包括：DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑、X染色体失活、基因组印记、非编码RNA调控等[3]，任何一方面的异常都可能导致疾病，包括癌症、染色体不稳定综合征和智力迟钝[4]等。表观遗传的改变是可逆的，这就为治疗人类疾病提供了乐观的前景。本文从表观遗传学与人类疾病、环境与表观遗传学的关系以及表观遗传治疗3个方面进行综述。
1 表观遗传学修饰与人类疾病
1.1 DNA甲基化相关疾病
DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶(DNMTs)的催化下，将甲基基团转移到胞嘧啶碱基上的一种修饰方式。它主要发生在富含双核苷酸CpG岛的区域，在人类基因组中有近5万个CpG岛[5]。正常情况下CpG岛是以非甲基化形式(活跃形式)存在的，DNA甲基化可导致基因表达沉默。DNMTs的活性异常与疾病有密切的关系，例如位于染色体上的DNMT3B基因突变可导致ICF综合征。有报道[6]表明，重度女袭性牙周炎的发生与2条X染色体上TMP1基因去甲基化比例增高有关。DNMT基因的过量表达与精神分裂症和情绪障碍等精神疾病的发生也密切相关。风湿性疾病等自身免疫性疾病特别是系统性红斑狼疮(SLE)与DNA甲基化之间关系已经确定[7]，在SLE病人的T细胞发现DNMTs活性降低导致的异常低甲基化。启动子区的CpG岛过度甲基化使抑癌基因沉默，基因组总体甲基化水平降低导致一些在正常情况下受到抑制的基因如癌基因被激活[8]，都会导致细胞癌变。
1.2 组蛋白修饰相关疾病
组蛋白的修饰包括乙酰化、甲基化、磷酸化、泛素化、糖基化、ADP核糖基化、羰基化等，组成各种组蛋白密码。其中，研究最多的是乙酰化、甲基化。一般来说，组蛋白乙酰化标志着其处于转录活性状态;反之，组蛋白低乙酰化或去乙酰化表明处于非转录活性的常染色质区域或异染色质区域。乙酰化修饰需要乙酰化转移酶(HATs)和去乙酰化酶(HDACs)参与。组蛋白修饰酶异常可导致包括癌症在内的各种疾病，例如，H4K20的三甲基化是癌症中的一个普遍现象。甲基化CpG2结合蛋白2(MeCP2)可使组蛋白去乙酰化导致染色质浓缩而失活，其中Rett综合征就是MeCP2的突变所致。
1.3 染色质重塑相关疾病
染色质重塑是DNA甲基化、组蛋白修饰、染色质重塑复合物的共同作用。它通过影响核小体结构，为其他蛋白提供和DNA的结合位点[9]。其中染色质重塑因子复合物主要包括SWI/SNF复合物和ISW复合物。染色质重塑复合物如果发生突变，可导致染色质不能重塑，影响基因的正常表达，导致人类疾病。如果突变引起抑癌基因出现异常将导致癌症，例如：小儿科癌症中检测到SNF5的丢失。编码SWI/SNF复合物相关的ATP酶的基因ATRX、ERCC6、SMARCAL1的突变可导致B型Cockayne综合征、Schimke综合征甚至肿瘤。ATRX突变可引起DNA甲基化异常，从而导致数种遗传性的智力迟钝疾病如:X连锁α2地中海贫血综合征和SmithFinemanMyers综合征，这些疾病与核小体重新定位的异常引起的基因表达抑制有关[10]。
1.4 X染色体失活相关疾病
哺乳动物雌性个体不论有多少条X染色体，最终只能随机保留一条的活性。X染色体失活由X失活中心(Xic)调控，Xic调控X染色体失活特异性转录基因(Xist)的表达。X染色体的不对称失活可导致多种疾病，例如男性发病率较高的WiskottAldrich综合征是由于WASP基因突变所致。X染色体的PLP基因突变失活常导致PelizaeusMerzbacher病;X染色体的MeCP2基因突变失活导致Rett综合征[11]。在失活的X染色体中，有一部分基因因逃避失活而存在2个有活性的等位基因，使一些抑癌基因丧失功能，这是引发女性癌症的一个重要原因[12]。
1.5 基因组印记相关疾病
基因组印记是指二倍体细胞的一对等位基因(父本和母本)只有一个可以表达，另一个因表观遗传修饰而沉默。已知在人体中有80多种印记基因。印记丢失导致等位基因同时表达或有活性的等位基因突变，均可引起人类疾病。一些环境因素，如食物中的叶酸也会破坏印记。印记丢失不仅影响胚胎发育，并可诱发出生后的发育异常。如果抑癌基因中有活性的等位基因失活可导致癌症的发生，如IGF2基因印记丢失导致的Wilms瘤[13]。15号染色体的表观遗传异常可导致PraderWilli综合征(PWS)和Angelman综合征(AS)，PWS是由于突变导致父本表达的基因簇沉默，印记基因(如SNURF/SNRPN)在大脑中高表达所致;AS是由于母本表达的UBE3A或ATP10C基因的缺失或受到抑制所致。Beckwithweideman综合征(BWS)是11号染色体表观遗传突变引起印迹控制区域甲基化的丢失，导致基因印记丢失引起[14]。
1.6 非编码RNA介导相关疾病
功能性非编码RNA分为长链非编码RNA和短链非编码RNA。长链RNA对染色质结构的改变起着重要的作用。短链RNA对外源的核酸序列有降解作用以保护自身的基因组。小干涉RNA(siRNA)和微小RNA(miRNA)都属于短链RNA，在人类细胞中小片段的siRNA也可以诱导基因沉默。miRNA能够促使与其序列同源的靶基因mRNA的降解或者抑制翻译，在发育的过程中起着关键性作用。转录的反义RNA可以导致基因的沉寂，引起多种疾病，如使地中海贫血病人的正常球蛋白基因发生甲基化。由于miRNA在肿瘤细胞中的表达显著下调，P53基因可通过调控miRNA34ac的表达治疗肿瘤。在细胞分裂时，短链RNA异常将导致细胞分裂异常，如果干细胞发生这种情况也可能导致癌症。
2 环境表观遗传学
对多基因复杂症状性疾病来说，单一的蛋白质编码基因研究远远不能解释疾病的发生机理，需要环境与外界因素的作用才会发病。疾病是外界因素与遗传因素共同作用的结果。流行病学研究已经证实，人类疾病与环境有明确的关系，高血压、中风、2型糖尿病、骨质疏松症等疾病的发病率与环境有着密切的关系[15]。特别是在发育初期，不利的环境、 营养的缺乏都有可能导致出生低体重、早产、胎儿发育不成熟等[16]。环境与DNA甲基化的关系一旦建立，将为环境射线暴露与癌症发生提供依据[17]。
环境污染等不利因素均有可能增加基因的不稳定性，每个人对环境和饮食的敏感性可因先天遗传不同而不同，环境因素与个体遗传共同作用，决定潜在表观遗传疾病的危险性。有人推测上述因素肯定会在我们基因组上遗留下微量的基因表遗传学痕迹[1]。随着年龄增长，DNA甲基化等化学修饰改变也在长时间中错误积累，这也有助于解释为什么很多疾病总是在人进入老年后才发生。由此可见，如果改变不良生活习惯、减少环境污染，都有可能降低表观遗传疾病的发病率。因此研究环境与表观遗传改变的关系对于预防和治疗人类疾病都有着重要的意义。
3 表观遗传学药物
人类许多疾病都可能具有表观遗传学的改变，表观遗传学治疗研究如火如荼。已经发现许多药物可以通过改变DNA甲基化模式或进行组蛋白的修饰等来治疗疾病。目前，很多药物处于研制阶段，尽管其有效性尚未得到充分证实，但给癌症、精神疾病以及其他复杂的疾病的治疗带来了希望。
3.1 组蛋白去乙酰化酶抑制剂
目前发现的组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC Inhibitor)有近百种。其中FK228主要作用机制是抑制肿瘤细胞内组蛋白去乙酰化酶(HDAC)活性，引起乙酰化组蛋白的积聚，从而发挥抑制肿瘤细胞增殖、诱导细胞周期阻滞、促进细胞凋亡或分化等作用[18]。FK228单独用药或与其他药物或方法联合应用表现出良好的抗肿瘤作用，同时还可阻碍血管生成，具有抑制肿瘤转移、逆转耐药性、调节免疫力等作用。FK228还具有治疗炎症、免疫性疾病、视网膜新生血管疾病及神经系统等多种疾病的药理学作用。
3.2 DNA甲基转移酶抑制剂
核苷类DNA甲基转移酶抑制剂作用机理是在体内通过代谢形成三磷酸脱氧核苷，在DNA复制过程中代替胞嘧啶，与DNMTs具有很强的结合力。核苷类似物5氮杂胞苷(5azacytidine)是第一个发现的甲基化抑制剂，最初被认为是细胞毒性物质，随后发现它可抑制DNA甲基化和使沉默基因获得转录性，用于治疗高甲基化的骨髓增生异常综合征，低剂量治疗白血病。其他核苷类DNA甲基转移酶抑制剂有5氮2脱氧核苷(5aza2′deoxycytidine)，Zebularine(5azacytidine的衍生物)[19]，5Fluoro2′deoxycytidine，RG108，Procainamide，Psammaplins(4aminobenzoic acid衍生物)，MG98(寡聚核苷酸)等。DNA甲基化抑制剂Procainamide可用于抗心律失常。另外在茶叶和海藻中提取的EGCG也显示具有体外活性。临床中应用反义寡核苷酸对DNA甲基转移酶进行抑制正在进行实验。
3.3 联合治疗
DNA甲基化抑制剂与HDAC抑制剂联合应用治疗疾病可能具有协同作用。进行表观修饰治疗后的细胞可能对于化疗、干扰素、免疫治疗更具有敏感性。在癌症的治疗方面，应当包括遗传治疗和表观遗传治疗两个方面，同时运用两种或两种以上表观修饰的方法对病人进行治疗对人类疾病意义重大。
3.4 其他方法
人胚胎干细胞保留有正常基因印记，这些干细胞可能具有治疗意义[20]。另外，在女性细胞中非活性的X染色体中存在正常的野生型基因，如果选择正确的靶点，就有可能激活这个正常但是未被利用的野生型基因，从而对其进行基因治疗。有报道[21]运用RNAi技术沉默胰岛β细胞相关基因，抑制胰岛淀粉样形成可能用来治疗糖尿病。短链脂肪酸(SCFAs)丙戊酸钠用于抗癫痫，丁酸可用来治疗结肠癌[22]等。siRNA可在外来核酸的诱导下产生，通过RNA干扰(RNAi)清除外来核酸，对预防传染病有重要作用。目前，RNA干扰已大量应用于包括肿瘤在内的疾病研究，为一些重大疾病的治疗带来了新的希望。
4 结 语
从表观遗传学提出到现在，人们对表观遗传学与人类疾病的发生有了更深入的认识。人类表观基因组计划(human epigenome proiect，HEP)已经于2003年开始实施，其目的是要绘制出不同组织类型和疾病状态下的人类基因组甲基化可变位点(methylation variable position ，MVP)图谱。这项计划可以进一步加深研究者对于人类基因组的认识，为表观遗传学方法治疗人类复杂疾病提供蓝图[1]。但是，表观遗传学与人类生物学行为(临床表型)有密切关系，人类对表观遗传学在疾病中的角色研究还处于初级阶段。应更进一步研究表观遗传学机制、基因表达以及与环境变化的关系，有效减少表观遗传疾病的发生风险，努力探索这片造福人类的前沿领域。
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表观遗传学的应用范文2
表观遗传学（epigenetics)是与遗传学（genetic)相对应的概念，是对经典遗传学的有益补充；其认为在不改变基因序列的条件下，生物体从基因到基因表型之间存在一种调控，这种机制即“表观遗传学”的含义。尽管已被提出70余年,但直到近10余年，随着科学家们对这种“获得性遗传”的进一步认识，才成为生命科学界最热门的研究之一。因此,研究者们转换思维，从表观遗传学角度对AD发病及治疗进行了研究，发现了一系列表观修饰的关键酶类，以及对这些酶类发挥影响的药物，从而为AD药物研发提供了新的思路和研究方向。本文拟就AD的表观遗传学治疗研究综述如下。
1阿尔茨海默病（AD)概况
阿尔茨海默病（AD)是一种以进行性认知障碍和记忆力损害为主的中枢神经系统退行性疾病。它是最常见的痴呆类型，西方国家[中50%?70%的痴呆属于AD。其病因及发病机制复杂，涵盖了遗传和环境的危险因素，涉及成千上万个基因表达的改变，以及多种信号途径的上调，如P淀粉样肽W-amyloidpeptide,Ap)的沉积、Tau蛋白过度磷酸化、炎症、氧化应激、能量代谢、血管因素及细胞凋亡周期异常等。ad的典型病理改变包括突触丧失、某些神经递质水平下降、神经元内异常物质沉积以及选择性脑神经细胞死亡，使大脑受累区域广泛萎缩，导致记忆力丧失伴行为改变和人格异常，严重者可影响工作及社会生活。受累区域常会出现A沉积、老年斑（senileplaques,SP)、神经原纤维缠结(neurofibrillarytangles,NFT)及Tau蛋白过度磷酸化等。疾病逐渐进展恶化，甚至累及生命。遗憾的是目前尚缺乏延缓或阻碍疾病进展的治疗手段。
在AD中，涉及神经元退行性改变的基因达200余个,越来越多的研究数据发现在没有基因序列改变的情况下，某些机制也可以决定致病基因何时或怎样表达，最终导致AD发病。因此，AD基因组并不能完全解释发病机制[14]。已知编码APP、PSEN1和PSEN2的基因仅可导致家族性早发型AD(early-onsetAD,EOAD);而大多数（约95%)AD均为晚发型AD(late-onsetAD,LOAD)或散发型。因此可以推断，表观遗传现象或环境因素参与了LOAD的致病。这就部分解释了为什么同一家族中有的家庭成员发病而另一些不发病；而且，在年轻的同卵双胞胎中基因组无实质上的差异，而在同一老年双胞胎中其基因表观遗传学上存在显著差异。
大量研究数据证实，基因-环境相互作用在AD的病理生理过程中发挥了关键作用营养物质、毒素、环境暴露及人的生活行为,都可以在不改变基因组序列的条件下使基因激活或沉默。目前已知的可调控基因转录和表达的表观遗传学机制主要分两大类：①基因选择性转录的调控：包括基因组DNA甲基化，多种组蛋白甲基化及乙酰化等修饰；②基因转录后的调控：包括微小RNA(microRNA,miRNA)和小干扰RNA(smallinterferingRNA,siRNA)等非编码RNA的调节，以及沉默的核糖体RNA(ribosomalRNA,rRNA)基因。除此之外，染色体重塑、基因印记、X染色体失活也属于表观遗传学范畴。
2表观遗传学
表观遗传学的涵义即在DNA序列不发生改变的情况下，基因的表达与功能发生改变，并产生可遗传的表型。基本机制即：通过多种基因修饰，影响基因转录和（或）表达，从而参与调控机体的生长、发育、衰老及病理过程。至此，表观遗传学的发现极大丰富了传统遗传学的内容，使人们认识到遗传信息可以有两种形式：即DNA序列编码的“遗传密码”和表观遗传学信息。它和DNA序列改变不同的是,许多表观遗传的基因转录和表达是可逆的，这就为许多疾病的治疗开创了乐观的前景。
2.1组蛋白修饰
组蛋白在DNA组装中发挥了关键作用，利用核心组蛋白的共价修饰传递表观遗传学信息。这些修饰主要包括组蛋白甲基化、乙酰化、磷酸化、泛素化、ADP-核糖基化及特定氨基酸残基N-末端的SUMO化;其中组蛋白氨基末端上的赖氨酸、精氨酸残基是修饰的主要靶点,这些组蛋白翻译后修饰(post-translationalmodifications,PTMs)对基因特异性表达的调控，是其表观遗传学的重要标志。正常机体内，组蛋白修饰保持着可逆的动态平衡。一般而言,组蛋白乙酰化是在组蛋白乙酰转移酶（histoneacetyl-transferase,HATs)的催化下，从乙酰辅酶A上转移乙酰基到组蛋白N-末端的赖氨酸残基上；由于乙酰化中和了组蛋白的正电荷，使组蛋白末端和相关DNA带负电荷磷酸基团之间的作用减弱，降低了组蛋白和DNA之间的亲和力，这种染色质构象的放宽有助于转录因子向靶基因片段聚集并利于转录的进行。而去乙酰化则是组蛋白去乙酰化酶（histonedeacetylases,HDACs)将乙酰基从乙酰化组蛋白转移到乙酰辅酶A上，形成了致密的染色质状态，从而使基因转录下降或沉默。
2.2DNA甲基化
DNA甲基化较组蛋白修饰更进一步，是表观遗传学的又一重要机制。DNA甲基化主要是在DNA甲基转移酶（DNAmethyltransferase,DNMTs,包括DNMT1、2、3a/b和4)催化下，将同型半胱氨酸(homocysteine,Hcy)-甲硫氨酸循环中S-腺苷甲硫氨酸（SAM)中的甲基，由四氢叶酸转移到胞嘧啶的第5位上形成5-甲基胞嘧啶（5-methylcytosine,5-mC)。其中，相邻的胞嘧啶-鸟嘌呤二核苷酸（CpGs)是最主要的甲基化位点。在人类基因组中，CpG以两种形式存在：一种分散存在于DNA中，其CpG70%?90%的位点是甲基化的；另一种CpG呈密集分布于一定区域，称之为“CpG岛”（CpGislands),通常位于或接近基因启动子区（promoterregions),在正常人体基因组中处于非甲基化状态。CpG岛中的胞嘧啶甲基化可以阻碍转录因子的结合，从而可致基因沉默。一般而言，高度甲基化的基因可致表达抑制,而低甲基化的基因可增强基因表达或过表达。
2.3非编码RNA
表观遗传学调控机制涉及RNA的主要包括:miRNA、siRNA以及维持细胞周期的沉默rRNA基因的一部分。
miRNA是较短的双链RNA分子，约有22个核苷酸，来源于机体自身基因即细胞核及细胞质中较大的RNA前体，有自己的启动子和调控元件。人类基因组中有约700?800个miRNA。这些小分子RNA在转录后通过绑定靶mRNA,从而抑制转录或诱导mRNA分裂降解。大多数miRNA具有高度保守性和组织特异性，可以调控机体中30%?50%的蛋白质编码基因。siRNA长短与miRNA相似，作用方式也有很多相同之处，区别在于siRNA可以体外合成,多由外源性导入或感染诱导产生。
重复rRNA基因的复制为真核生物核糖体提供了初始活性位点，在基因表达中是蛋白质合成的热点区。不同细胞类型可表现不同的活性rRNA比率,提示随着细胞发育分化，rRNA基因拷贝数比例会发生改变。沉默rRNA的表观遗传学方式在这个过程中发挥了重要作用,使活性和非活性rRNAs保持了动态平衡。
2.4染色质重塑、基因印记和X染色体失活
染色质重塑（chromatinremodeling)指基因复制、转录和重组等过程中，核小置和结构及其中的组蛋白发生变化，引起染色质改变的过程；主要机制即致密的染色质发生解压缩，暴露基因转录启动子区中的特定结合位点，使转录因子（transcriptionfactor,TF)更易与之结合。基因印记(geneticimprinting)指来自亲本的等位基因在发育过程中产生特异性的加工修饰，导致子代体细胞中两个亲本来源的等位基因有不同的表达方式，即一个等位基因有表达活性，另一等位基因沉默。X染色体失活指雌性哺乳动物细胞中两条X染色体的其中之一失去活性的现象,即X染色体被包装成异染色质，进而因功能受抑制而沉默化，使雌性不会因为拥有两个X染色体而产生两倍的基因产物。
3AD的表观遗传学3.1组蛋白修饰
研究显示，在AD中存在组蛋白的PTMs。组蛋白3(histone3,H3)磷酸化作为激活有丝分裂的关键步骤，可使AD海马神经元呈过磷酸化状态。对APP/PS1突变小鼠和野生型小鼠进行条件恐惧训练,结果显示前者乙酰化H4较野生小鼠组降低50%;之后对突变组进行HDAC抑制剂（histonedeacetylasesinhibitors,HDACIs)曲古抑菌素A的治疗，显示前者乙酰化H4水平出现了上升。在一项皮层神经元培养模型研究中，APP过度表达则可导致H3和H4乙酰化降低，以及c-AMP反应元件结合蛋白（cAMP-responseelementbindingprotein,CREB)水平下降;而CREB则是脑神经元中激活记忆相关基因，形成长期记忆的关键蛋白。总之，尽管在AD患者、AD动物模型及AD培养模型中，都出现了组蛋白修饰,但这个过程是极其复杂的,特异性位点会因功能状态不同而出现组蛋白乙酰化增加或减少。
3.2DNA甲基化
3.2.1相关基因的甲基化研究显示，尽管很难判
断AD中甲基化程度是升高还是下降，但12个甲基化的AD特异性基因表现出了显著的“表观偏移”；同时研究还发现，在DNMT1启动子内一些CpG位点也表现出年龄相关的表观偏移。研究还发现，叶酸、甲硫氨酸及Hcy代谢与DNA甲基化机制显著关联。例如，人类及动物模型叶酸缺乏将导致基因组整体低甲基化，而补充叶酸则可部分逆转甲基化程度。Smith等研究发现，衰老及AD人群中都出现了叶酸缺乏和甲硫氨酸-Hcy周期的改变。另一研究发现AD患者脑脊液（cerebro-spinalfluid,CSF)中叶酸显著下降，同样下降的还有CSF及脑组织中SAM。同时还观察到AD患者脑组织中S-腺苷同型半胱氨酸(SAH)及血浆中Hcy的升高，后者可抑制DNA甲基化。
目前已知的AD相关基因主要包括：p淀粉样蛋白前体（APP)基因、早老素1(PS1)和早老素2(PS2)基因、载脂蛋白E(ApoE)基因、p-分泌酶（BACE)基因、sortilin相关受体基因(sortilin-relatedreceptor1gene,SORL1)以及白介素1a(IL-1a)和白介素6(IL-6)基因等。其中，APP基因、BACE基因或PS1基因均存在可调控的CpG甲基化位点。有研究显示,一例AD尸检的大脑皮层中APP基因发生了完全去甲基化，而正常样本或匹克氏病（Pick’sdisease)患者样本则没有这种变化。实验发现，叶酸缺乏所致的BACE和PS1基因表达增强，可通过补充SAM而恢复正常。同样，体内实验发现，给予APP过度表达的转基因小鼠缺乏叶酸、B12及B6的饮食，可以使SAH升高并上调PS1和BACE的表达，以及促进A的沉积和出现认知障碍。在LOAD尸检标本中，研究者发现了著名的“年龄依赖的表观遗传学漂移”(age-dependentepigeneticdrift);对CpG岛异常的表观遗传学控制,可能促成了LOAD的病理变化,因此，“表观遗传学漂移”可能是LOAD个体易感的重要机制。
3.2.2Tau蛋白相关的甲基化Tau蛋白是一种微管结合蛋白（microtubulebindingprotein,MAP),它能与神经轴突内的微管结合，具有诱导与促进微管形成，防止微管解聚、维持微管功能稳定的功能。对记忆和正常大脑功能起重要作用。然而，在AD中,Tau蛋白不仅不再发挥正常功能，还会因异常磷酸化或糖基化等改变了Tau蛋白的构象，使神经元微管结构广泛破坏，形成以Tau蛋白为核心的NFT,最终导致神经元功能受损或神经元丢失。
人体在正常条件下，Tau蛋白启动子的AP2结合位点是非甲基化的，但SP1和GCF结合位点则被甲基化。而随着年龄的增加，SP1作为一种转录激活位点甲基化程度升高,GCF作为启动子抑制位点则逐渐去甲基化，因此总体而言Tau蛋白的基因表达是下调的。尤其在额叶及海马区域，正常Tau蛋白也出现了年龄相关的下降。蛋白磷酸酶2A(PP2A)是一种针对磷酸化Tau蛋白的去磷酸化酶，PP2A催化亚基的甲基化可以激活该酶。研究显示，在APP及PS1基因突变的转基因小鼠中，PP2A的甲基化程度显著下降，结果显示Tau蛋白磷酸化增高。对培养的神经元添加叶酸拮抗剂甲氨蝶呤，也可导致PP2A去甲基化，从而增加Tau蛋白的磷酸化程度。另外，还有研究显示，Hcy可以使PP2A的甲基化程度及活性下降,而添加叶酸和B12则可以逆转这个过程。总之，Tau蛋白的磷酸化和脱磷酸化间平衡是维持微管稳定性的关键因素；而其中磷酸化相关酶类的甲基化程度,成为影响Tau蛋白磷酸化的重要因素。
3.2.3异常的细胞周期和神经元凋亡研究证实,细胞周期异常和神经元凋亡是AD神经退行性变的常见机制。AD神经元中细胞周期及凋亡途径关键因子受DNA甲基化影响并发生上调。包括细胞周期素B2基因、caspase-1基因、caspase-3基因等。这些相关基因的低甲基化使细胞进入异常细胞周期。同样,高Hcy可使培养神经元凋亡，也间接证实了低甲基化导致异常细胞周期；而使用SAM还可起到拮抗细胞凋亡的效果。
3.3A与miRNA
研究发现，miRNA可以调节APP的表达、APP处理、A聚积以及BACE1的表达，从而导致A毒性改变或影响神经再生。因而,miRNA失调可使APP表达及处理过程发生改变，最终引起神经元存活率和神经再生程度的改变。针对全球AD人群和正常老年人群的对比研究发现，特异性miRNA水平存在显著差异。研究显示，在AD中APP相关miRNA显著下降，而APPmRNA水平则保持平稳，提示miRNA影响APP表达是通过抑制转录而不是促进APPmRNA的裂解；同时，在AD皮层中miRNA-106b出现显著下降。具体机制还有待进一步研究。
3.4AD与一碳代谢
叶酸代谢又称为一碳代谢，需要SAM提供甲基。诸多研究表明,AD患者常存在血浆及CSF中Hcy升高（两者浓度升高常呈正相关)，血浆叶酸和B12水平下降，以及脑组织中SAM减少。早期暴露于缺乏叶酸及B族维生素饮食的动物，其AD相关基因在脑组织中发生了表观遗传学修饰。SAM作为甲基化过程最重要的甲基来源，其产生及循环依赖于甲硫氨酸循环的正常进行[11]。研究显示,AD患者CSF中SAM出现显著下降，口服SAM(1200mg,qd)4?8个月,可以使CSF中SAM浓度升高。同时，维生素B12缺乏可使SAM产生减少，从而影响甲基化。前瞻性队列研究表明，高Hcy与AD高风险显著相关，而较高的叶酸摄入量可以降低老年人的AD风险。叶酸缺乏导致的SAM缺乏以及Hcy升高，使甲基化水平下降；并且，Hcy影响SAM和SAH水平，后两者可调节DNA甲基化活性以及蛋白翻译后修饰。另外，研究还发现Hcy可通过抑制甲基化，降低PP2A甲基化程度，从而导致Tau蛋白过磷酸化、NFT及SP形成。因此，最关键机制即：叶酸/同型半胱氨酸代谢异常导致AD相关基因启动子的表观遗传修饰（CpG区域甲基化状态的改变)，使基因沉默（高甲基化）或过度表达（低甲基化)，最终发生AD。
4表观遗传学在AD诊疗中的应用研究
近年来，随着表观遗传学在AD研究中的不断进步，研究者已逐渐将其应用于AD的诊断及治疗中，尽管多数还处于临床前试验阶段，但表观遗传学应用于AD临床的前景是乐观并值得期待的。
4.1表观遗传学诊断手段
利用亚硫酸氢钠进行甲基化测序是检测DNA甲基化的金标准。该方法利用盐析法从血液中提取基因组DNA,经过亚硫酸氢盐处理后，变性DNA中胞嘧啶转换为尿嘧啶，而5-mC则不发生转换，因此在经过PCR扩增和DNA测序后，胸腺嘧啶则代表非甲基化胞嘧啶，而5-mC(主要为CpG二核苷酸）仍为胞嘧啶。继而由该方法延伸出多个DNA甲基化分析法，例如：甲基化特异性PCR(methylationspecificPCR,MSP)、结合亚硫酸氢盐限制性分析（combinedbisulfiterestrictionanalysis,COBRA)以及甲基敏感性单核苷酸引物(methylation-sensitivesinglenucleotideprimerextension,MS-SNuPE)等。然而，由于目前对AD相关基因甲基化的研究还不完善，只能在临床前研究中应用甲基化测序，用于对比分析AD中基因甲基化的真实状态。
实时基因成像（real-timegeneticimaging)技术是另一种判断基因表观遗传修饰的手段；该技术避免了尸检或动物研究，是一种新型的非侵入性的可视化基因调控检测。磁共振波谱（MRspectroscopy,MRS)即是这样一种特殊的磁共振成像，该技术可扫描到特定的蛋白，将来可使我们能够实现对基因表达变化的可视化实时检测，理论上而言可以追踪到DNA甲基化或组蛋白修饰的责任蛋白；因此，在一定程度上，将为AD的表观遗传学诊断和治疗提供新的手段[39]。
此外，另有研究发现，脂肪酸酰胺水解酶（fattyacidamidehydrolase,FAAH)参与了AD的发病，同时还发现FAAH易于从外周血中检出，并可作为一个新的潜在的AD生物标志物（biomarker),继而用于AD的预测或诊断。然而，由于一些AD相关蛋白或酶类在外周血中易降解，稳定的miRNA检测已成为反映疾病的重要手段。由于大多数AD患者外周血单核细胞中存在各种miRNA的表达上调（如miR-371、miR-517等),且与其在AD脑中高表达相对应，提示通过测定血浆及血单核细胞的miRNA谱变化,可作为AD诊断和病情评估的重要方法。
4.2AD的表观遗传学治疗
表观遗传学对研究AD的发病机制和病程转归,以及研发新的药物等方面开拓了广阔的空间。表观遗传学药物进入体内后，可充当基因转录或表达的“开关”，通过不同的基因修饰及调控基因表观修饰相关酶类的活性，继而达到在未改变DNA序列的情况下影响基因表型。因此，正是表观遗传学改变的“可逆性”，使与之相关药物的研发成为AD治疗研究的新方向和重点。
4.2.1HDACIs近年来，科学家们研发了多种新的HDACIs。根据化学形态主要分为4类：①短链脂肪酸类：如丁酸钠、苯丁酸盐和丙戊酸（valproicacid,VPA);②异轻肟酸（hydroxamicacid)类：如曲古抑菌素A(trichostatinA,TSA)、辛二酰苯胺异轻肟酸(suberoylanilidehydroxamicacid,SAHA);③环氧酮类：如trapoxinA和trapoxinB;④苯甲酰胺类：如MS-275。这些HDACIs与锌依赖性HDAC蛋白（zinc-dependentHDACprotein,I、II及IV类组蛋白亚型）相互作用；烟酰胺作为NAD+前体，可以抑制III类HDAC蛋白。其中，研究最广泛的是丁酸钠、苯丁酸盐、VPA、TSA和SAHA。
目前FDA批准上市的是SAHA,-种治疗T细胞淋巴瘤的新型化合物，不仅可增加组蛋白乙酰化水平，同时还可提高认知。在神经系统中，VPA具有抗惊厥和稳定情绪的作用，因此这些作用可能与引起组蛋白乙酰化改变有关；VPA还可以通过抑制GSK-3#介导的y-分泌酶裂解APP,从而抑制Ap的产生，减少A斑块，最终缓解AD模型鼠的认知功能障碍。Ricobaraza等研究显示，4-苯基丁酸乙酯（PBA)可通过降低GSD-3#来降低AD大鼠脑内Tau蛋白磷酸化，并可清除突触间A沉积，减轻内质网压力，从而恢复记忆并逆转学习障碍。而烟酰胺则可选择性降低Tau蛋白磷酸化并增加乙酰化的a微管蛋白。Fischer等也研究发现，非特异性HDACIs如VPA、TSA、4-苯基丁酸钠及伏立诺他等，都可以通过不同的表观遗传机制影响Ap沉积和Tau蛋白过磷酸化，并可改善学习和记忆力。另外,HDACi丙戊酸可以降低APP的表达，减轻大脑中的A肽斑块负担；研究还证实，HDACI治疗还可诱导树突发芽，增加突触数量，以及恢复学习行为和形成长期记忆。Zhang等报道，口服HDACIMS-275可改善神经炎症和脑淀粉样变，以及改善AD模型动物的行为能力。这些研究提示,HDACIs可通过调节HDAC蛋白活性和Tau蛋白磷酸化水平，从而用于AD的治疗.
HDACIs可选择性抑制HDACs,导致组蛋白乙酰化水平升高，恢复AD模型动物中组蛋白乙酰化水平及提高学习和记忆能力。例如：Guan等发现当脑内HDAC2过表达时，小鼠海马神经元树突棘密度降低、突触形成减少、CA1区LTP形成障碍、空间记忆和工作记忆损伤；而使用HDACIs则能够促进小鼠神经元树突棘和突触的形成，改善AD模型小鼠的学习和记忆减退状态。因此，HDAC2可能是HDACIs最适宜的治疗靶点之一，可能使脑神经元内合成新的蛋白以改善或恢复AD患者记忆。除此之外,HDACIs对基因表达的调节具有特异效应,可以在上调靶基因表达的同时下调其他基因;这种基因特异性常通过转录因子来调控，后者可以识别特定启动子和增强子序列，并赋予靶基因特异性（gene-specificeffects),使之对HDACIs具有敏感性[44],继而逆转表观遗传改变。同时，应用HDACIs治疗AD还应当考虑其是否可穿透血脑屏障，因此，最近的一项研究研发了一种可进入CNS(“CNS-penetrant”)的HDACIs(I类）EVP-0334,目前已进入I期临床试验用于AD治疗。
众所周知，AD大脑受累的主要区域为内侧嗅皮质、海马及杏仁核等。研究发现，与正常脑组织相比,AD患者皮质中HDAC6蛋白水平升高了52%,而海马中则升高了92%。HDAC6与Tau蛋白共同存在于核周，并发生相互作用；其中HDAC6具有独立的微管蛋白脱乙酰基酶的活性。使用HDAC6抑制剂Tubacin治疗或敲除HDAC6,并不能影响HDAC6与Tau蛋白的相互作用，但可以减少Tau蛋白磷酸化[55]。通过结合HDAC6,Tau蛋白可抑制脱乙酰酶活性,从而导致微管蛋白乙酰化增加；在Tau蛋白过表达的细胞中也可见这种增加；说明过量的Tau蛋白成为HDAC6的抑制剂，然而AD患者中正常Tau蛋白是减少的。文献显示，HDAC6的减少或丢失可改善联想和空间记忆形成[56,57],以及阻断A诱导的海马神经元线粒体运输障碍。最近有研究人员还发现,HDAC6无效突变（nullmutation)可以挽救神经元中Tau蛋白诱导的微管缺陷。他们采用遗传和药理学方法抑制HDAC6的tubulin特异性脱乙酰基酶活性，证实这种“挽救效应”有可能是通过增进微管乙酰化所介导的。这些研究结果表明,HDAC6有可能是AD和相关Tau病的一种独特的有潜力的药物靶点,HDAC6抑制剂有望成为AD治疗的新型药物。
目前研究证实，HDACIs可用来治疗神经变性病、抑郁、焦虑情绪、认知功能障碍及神经发育障碍,因此为AD的治疗提供广阔的前景。但现有的HDACIs存在生物利用度低、代谢快、低选择性等缺点。因此,研究开发结构新颖、副作用小、特异性及选择性高的HDACI具有重要的临床意义。
4.2.2饮食因素除此之外，饮食因素，例如叶酸、维生素B2、B6、B12、蛋氨酸、胆碱等都可以影响甲基供体SAM的形成，并影响DNMTs活性；同时，一些天然化合物，如异黄酮、黄酮、儿茶素、姜黄素、白藜芦醇等，可以改变表观遗传学机制,影响染色质修饰酶的活性，因此备受关注。
研究证实，传统用于抗肿瘤、抗氧化、抗炎、抗细胞凋亡及预防高脂血症的姜黄素，也可用于治疗AD：在体外实验中，姜黄素可抑制A聚集沉积、A#诱导的炎症、户分泌酶及乙酰胆碱酯酶的活性；而体内实验则证实，口服姜黄素可抑制AD动物脑组织中Ap沉积、Ap寡聚化及Tau蛋白磷酸化，并改善行为及认知。另有研究发现，姜黄素还可加速淀粉样斑块的分解，继而改善AD的空间记忆障碍。据Bora-Tatar等[65]报道，在33种羧酸衍生物中，姜黄素是最有效的HDAC抑制剂，甚至比丙戊酸和丁酸钠更强效；另有研究也发现，姜黄素可显著降低HDAC1、3和8蛋白水平，并可提高乙酰化H4水平。同时，姜黄素还是潜在的HAT抑制剂，2004年Balasubramanyam等[66]发现，姜黄素是p300/CREB结合蛋白HAT活性特异性抑制剂，对维持一定的CREB水平起到关键作用。因此，姜黄素对HDAC和HAT均有调节作用；作为已知的抗氧化剂，姜黄素可能是通过调节氧化应激，从而对乙酰化和去乙酰化具有双重调节作用。
AD表观遗传学改变受环境、营养因素等诸多因素共同作用，因此自孕前保健开始,直至子代的一生，都保持机体内外生存环境的良好，保证表观遗传学正常修饰及表达,在一定程度上可能会预防AD的发生。同时，由于目前糖尿病、肥胖、心血管疾病、高血压等都是公认的AD高危因素，通过表观遗传学机制防治这些疾病，也是降低AD的发生风险的重要手段。另外，提倡低热量、低胆固醇和富含叶酸、B族维生素及姜黄素等的饮食，以及降低血浆Hcy值，可能对保护大脑神经元，改善老年期认知，以及预防AD发生或逆转AD的表观遗传改变，起到一定的积极作用。
4.2.3其他因素由于DNA甲基化是可逆的，该过程的相关酶类也可作为AD治疗的研究靶点,例如DNMT抑制剂。然而，目前对DNMT抑制剂的研究多局限于肿瘤的治疗，因此对于AD的治疗作用还有待进一步研究。另外，研究发现AD中与APP裂解机制相关的多个miRNA也发生了改变,因此针对miRNA的AD表观遗传治疗成为重要研究方向。2006年，中国科学院上海生命科学研究院生物化学与细胞生物学研究所裴钢院士研究组研究发现，肾上腺素受体被激活后，可以增强y-分泌酶的活性，进而能够增加AD中Ap的产生。这项发现揭示了AD致病的新机制，提示肾上腺素受体有可能成为研发AD治疗药物的新靶点。
5展望
综上所述，在AD中，表观遗传学机制对疾病发生发展起到了关键作用，尤其是散发性AD。表观遗[8]传学调节障碍导致相关基因转录异常，引起关键蛋白或酶类异常，继而发生一系列病理生理改变，是AD发病的主要原因。表观遗传学改变可以通过表观遗传药物进行逆转，因而这不仅为AD的治疗开创了一片新天地，更引导医药行业进入了一个崭新的领域。
然而,使用表观遗传学药物治疗疾病也面临着一系列难题。对于目前可用的表观遗传学化合物如HDACIs及辣椒素等而言，主要的困难即缺乏针对不同脑区、不同神经元亚型或特异基因的“选择性”。
表观遗传学的应用范文3
关键词 药物成瘾，表观遗传学，组蛋白乙酰化，DNA甲基化。
分类号 B845
药物成瘾作为一种慢性复发性脑疾病。复吸率达95％以上。环境线索诱发的复吸一直是药物成瘾治疗的难题，大多成瘾者在经过戒毒治疗之后对环境刺激没有明显的渴求和复吸倾向，但离开戒毒所回到原来的生活环境之后，又会出现很高的复吸率。主要原因就是成瘾药物导致的异常记忆的长期存在所致。FosB是目前成瘾与学习记忆相关领域内发现保持时间最长的分子，但其时间长度显然无法与成瘾行为及成瘾记忆的长期性相匹配。成瘾记忆长期性的分子机制有待进一步探索。神经细胞中唯一保持稳定的就是染色体组，研究表明DNA甲基化等表观遗传学的改变是发育过程中细胞记忆的重要分子基础，进而维持细胞在分裂过程中保持表型的相对稳定，尤其是某些基因的甲基化能使该基因永久沉默和不再激活，有可能是细胞分化结束后记忆长期保持的重要分子机制。提示表观遗传变异的长时稳定性也许可作为成瘾长期性的非常重要的候选机制。因此，表观遗传学有可能为成瘾记忆长期存在的脑机制研究提供新视角，并且为药物成瘾的临床治疗提供新的思路。
2 成瘾记忆长期性分子机制的研究进展
2.1 学习记忆的异常改变是药物成瘾长期存在的重要原因
药物成瘾的形成是从偶尔或控制性使用药物发展到不可控制的强迫性使用药物的过程，其主要特征是产生不惜一切代价的觅药行为并长期保持这一行为。这一过程伴随着学习记忆功能的变化。大量研究表明，不论是学习记忆还是成瘾过程都使相应脑区结构和功能发生长时程变化从而导致行为改变。药物成瘾过程与学习记忆可能存在相同的神经生物学基础。行为学实验表明二者作用于相同的脑区，学习记忆过程中起关键作用的相关脑区(如，海马)参与成瘾药物的强化效应，在药物成瘾过程中起关键的作用的中脑多巴胺系统也参与学习记忆过程；电生理实验证明二者有相同的细胞机制，尽管成瘾药物主要通过中脑多巴胺系统产生强化作用，学习记忆过程主要发生于海马、杏仁核、前额叶皮层等脑区，但两个过程都在相应脑区出现细胞突触长时程增强(LTP)或长时程抑制(LTD)现象；分子生物学研究表明，学习记忆和成瘾的形成无论发生在哪一脑区，不论是通过何种信号转导机制最终大多汇聚于环一磷酸腺苷反应元件结合蛋白(CREB，cAMP-response element binding protein)，并通过CREB调控相应的靶基因改变细胞的可塑性。此外，某些个体初次接触成瘾药物就能产生深刻记忆从而形成和维持强迫性用药行为；戒断很长一段时间的成瘾行为仍能由条件线索诱发。以上事实表明学习记忆功能的异常改变并长期保持是产生药物成瘾的重要原因。
2.2 成瘾相关记忆长期性的分子生物学机制
成瘾药物进入体内会导致海马、前额叶皮层、中脑腹侧被盖区(VTA)及伏隔核等学习记忆相关脑区的多巴胺、谷氨酸等神经递质释放的异常变化，通过作用于相应的受体引发一系列分子事件，包括激活细胞内信号转导通路，改变神经营养因子、转录因子、即刻早期基因或染色体的结构等，并最终引起突触的可塑性、甚至神经元的形态结构发生变化，从而导致成瘾记忆的长期存在。因此阐明成瘾记忆长期性与顽固性的分子机制是治疗药物成瘾的关键。
CREB是目前研究最多的与成瘾记忆密切相关的分子机制之一，大多数成瘾药物都可以通过直接或间接途径增加多巴胺的释放，然后通过作用于D1受体增加cAMP的释放从而活化PKA，使CREB磷酸化调控靶基因的转录，调节成瘾药物的行为效应。CREB也是哺乳动物长时记忆形成的必要环节，促进海马、杏仁核CREB的活动的动物学习记忆能力增强。因此，CREB在药物成瘾与学习记忆相关基因表达过程中起枢纽作用，参与成瘾记忆的形成。长期慢性成瘾药物处理可使cAMP/PKA/CREB通路的功能上调，导致异常的记忆形成。毋庸置疑，cAMP/PKA/CREB通路的变化是成瘾记忆产生的关键分子机制之一，但是CREB的变化在停止药物使用后几天内便恢复正常，不能解释药物戒断后很长一段时间内(甚至终身)成瘾记忆长期存在这一客观事实。可能的解释是CBEB的变化是启动而不是维持成瘾记忆长期存在的更加稳定的分子机制的必要环节。
FosB是目前成瘾与学习记忆领域内保持时间最长的分子，在成瘾药物急性作用下通过cAMP/PKA/CREB通路诱发即刻早期基因c-fos、c-jum的表达，但在数小时后便恢复到正常水平。FosB也是Fos蛋白家族成员之一，但对药物的急性效应无明显的反应。相反在成瘾药物的反复作用下，FosB的表达逐渐增加，而c-fos、c-jun的表达逐渐减少。FosB蛋白具有较高的稳定性，在停止药物后数月内都保持相对稳定。FosB一旦形成后便能调节许多靶基因表达，细胞周期素依赖激酶5(cdk5)基因便是其调控的最重要的靶基因之一，参与神经元的生长。因此，FosB的高表达能够增强突触的可塑性，甚至改变神经元的形态，维持成瘾记忆的长期性。但是FosB蛋白的变化在停止药物后只能保持几个月，其时间长度仍然无法与成瘾行为及成瘾记忆的长期性相匹配。
2.3 成瘾记忆长期性的表观遗传学研究
表观遗传学(Epigenetics)是研究核苷酸序列不发生改变的情况下，基因表达了可以遗传的变化的一门遗传学分支学科。其中DNA甲基化的改变一般不可逆转，是发育过程中细胞记忆的重要分子基础，维持细胞在分裂过程中保持表型的相对稳定。由此推测表观遗传学的变化，尤其是基因的甲基化能使该基因永久沉默和不再激活，有可能是细胞分化结束后记忆长期保持的重要分子机制。可以推测DNA甲基化等表观遗传学的改变可能是成瘾记忆长期存在的分子基础之一。
真核生物的遗传信息主要储存在染色体上，染色体的基本结构主要是H2A、H2B、H3、H4四种组蛋白构成的八聚体以及缠绕在上面的DNA所组成。染色体空间结构的变化调节转录因子与相关基因的结合，从而控制基因的表达。表观遗传学机制主要通过改变染色体的空间构型来影响基因的表达，主要包括DNA甲基化、组蛋白修饰(包括乙酰化、甲基化、磷酸化等)、染色体重塑和非编码
RNA(如RNAi)等作用方式。DNA甲基化、组蛋白修饰和染色质重塑之间是相互作用的，染色质的重塑和组蛋白的去乙酰化是相互依赖的，DNA甲基化可能需要组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的活动或染色质的重塑中的成分参与。通常，DNA甲基化、组蛋白去乙酰化和染色质的压缩状态和DNA的不可接近性，以及基因处于抑制和沉默状态相关；而DNA的去甲基化、组蛋白的乙酰化和染色质松散状态，则与转录的启动、基因活化和行使功能有关。DNA甲基化是最早发现的基因表观修饰方式之一，可能存在于所有高等生物中。DNA甲基化能关闭某些基因的活性，去甲基化则诱导了基因的重新活化和表达。DNA的甲基化是在DNA甲基化转移酶(DNMTs)的作用下使CpG二核苷酸5’端的胞嘧啶转变为5I甲基胞嘧啶。乙酰化转移酶(HATs)主要是在组蛋白H3、H4的N端尾上的赖氨酸加上乙酰基，去乙酰化酶(HDACs)则相反。不同位置的修饰均需要特定的酶来完成，通过这些酶作用改变染色体的空间结构。
成瘾药物会导致VTA、NAe和其他相关脑区的mRNA水平的改变。这些基因表达的变化在戒断后可存月余。这些长时程的变化使人们将研究染色质重塑作为长时程甚至终身持续影响大脑奖赏区域的基因表达的分子基础。最近研究表明，早期接触成瘾药物不改变基因编码而调控基因活性的表观遗传学机制，对成熟的神经元具有长效作用从而增加成年后的成瘾易感性，并且在急性或慢性接触成瘾药物的过程中表现出不同的作用机制。
急性可卡因注射导致纹状体的e-Fos和FosB表达，并且这个现象与给药后30分钟内的H4乙酰化的短暂增加有关。CBP因为其内在的组蛋白乙酰化活性，在药物导致的FosB基因组蛋白乙酰化过程中起了重要的介导作用，并且也可能在其他基因中也起了类似的作用。急性可卡因注射也能诱导出e-Fos基因启动子的H3的乙酰化，并且这种作用需要蛋白激酶MSK1。相对于急性处理，慢性可卡因处理和自我给药可以激活或者抑制许多不同的基因。比如急性或者慢性处理都会产生FosB基因，但是急性暴露使H4产生乙酰化而慢性处理使H3产生乙酰化。慢性成瘾药物处理后特异性诱导的基因，比如Cdk5和Bdnf基因也表现出H3的乙酰化，并且得到证明的确是这种表观遗传学的变化引起来特定基因表达的变化。因为慢性处理后的戒断期，出现了可卡因引起的BDNF启动子的组蛋白乙酰化，组蛋白修饰的变化是先于这个区域BDNFmRNA和蛋白质的增加。
在急性和慢性给药引起的表观遗传学修饰不同，存在着由H4乙酰化向H3乙酰化的转变。在海马急性和慢性电刺激之后也会有这种类似的转变。这提示H3乙酰化可能象征着一种染色质变化的信号，代表持久稳固或者重复激活的基因的。HATs(组蛋白乙酰基转移酶)和HDACs(组蛋白去乙酰化酶)对于H3H4的特定乙酰基残余的催化反应的特异性现在知之甚少。急性或慢性处理之后，HATs或HDACs对于基因调控的截然相反的作用可能介导了H4乙酰化向H3乙酰化的转变。
全基因组水平的表观遗传修饰的检测手段使相关基因的筛查更为有效。可卡因调控Cdk5和Bdnf基因的组蛋白乙酰化，使应用染色体免疫沉淀芯片(ChIP on ChiD)或SACO[301的方法探索全基因组层面的染色质结构的检测方法显示出重要作用，提示染色质水平的失调可能导致可卡因成瘾。基因组层面的表观遗传学方法在发育和肿瘤生物学领域曾发现了许多令人振奋的结果，现在类似的研究正在成瘾研究中进行。现在Nestler的实验室初步鉴定了几百个慢性可卡因处理后显著过高或过低乙酰化的基因。
此外，慢性可卡因处理可引起甲基化CPG岛结合蛋白2(MeCP2)与甲基化CPG岛结合蛋白MBD1的高表达，通过蛋白去乙酰化酶抑制下游基因的表达参与成瘾过程。以上结果提示染色体重塑(组蛋白乙酰化与DNA甲基化)可能在成瘾记忆的形成与保持过程中起关键作用，从而为成瘾记忆长期性的分子机制提供了新的研究思路。目前研究初步发现组蛋白去乙酰化酶抑制剂(HDAC)参与苯丙胺行为敏感化的联想性学习记忆过程，这些结果表明表观遗传学的变化参与维持成瘾过程中神经适应性的变化。
尽管在许多成瘾关键因子中发现了表观遗传学修饰，但有证据表明这些修饰可能通过不同的作用机制起作用。转录因子FosB与成瘾状态的转换有关，在NAc能显示出在可卡因作用下大于25％的mRNA稳定状态所有变化。染色体免疫沉淀能显示其中一种mRNA的反应，可卡因能引起Cdk5基因14的FosB直接激活，而Bdnf基因则不是直接激活FosB，说明这些基因转录调控的变化不是通过相同的机制。Cdk5基因的激活部分介导了慢性可卡因引起的NAc中的树突可塑性。这些发现都支持这样一个模型：FosB的积累和特定启动子的染色体重塑因子相互作用在成瘾的发展和维持中发挥重要作用。
3 研究展望
表观遗传学和药物成瘾都不是新兴的研究领域，但是从表观遗传学角度研究成瘾问题，是近几年兴起的一个研究热点。从表观遗传变异解释药物成瘾的神经可塑性变化和精神依赖，为成瘾药物奖赏性的后天获得和成瘾相关记忆长时存在都提供了很有力的解释机制。目前对于成瘾进程中的一些关键因子的组蛋白乙酰化有了初步的研究，研究的结果使我们看到了更多表观遗传机制在药物成瘾研究领域的前景。
3.1 成瘾记忆再巩固过程的表观遗传机制研究
近几年来，记忆再巩固是学习记忆领域里的一个研究热点，结果表明记忆再巩固与记忆巩固存在部分共同的神经机制，但它不是巩固过程的延续，而是记忆过程中的一个独立现象，存在特有的神经机制。再巩固理论为成瘾记忆的长期性提供了一种新的解释机制，在特定环境使用成瘾药物会激活已经形成的成瘾记忆，被激活的记忆后会变得不稳定，在成瘾药物作用下能够促进记忆的再巩固过程，使原有的记忆痕迹更加牢固，多次结合后便产生病理性记忆，这种异常的再巩固机制可能导致成瘾记忆长期存在。
记忆再巩固过程需要合成新的蛋白质来维持原来的记忆的稳定，记忆提取激活后在外周或记忆相关脑区(如，海马、基底外侧杏仁核、伏隔核)注射蛋白合成抑制剂能阻断原来形成的成瘾记忆。ERK是参与成瘾记忆再巩固过程的重要分子，药物相关的环境线索在唤醒成瘾记忆时能够激活ERK的表达，记忆唤醒后抑制ERK通路可阻断记忆的再巩固过程，从而消除或减弱原来的成瘾记忆，抑制ERK通路下游的锌指蛋白(Zif268)的表达同样能干扰记忆的再巩固。说明ERK通路是成瘾记忆再巩固的关键环节，这种反复的再巩固过程和其积累效应会导致一段时间内相关记忆不容易消退致使成瘾记忆长期存在。记忆再巩固的表观遗
传机制研究可能是该领域研究的一个新的趋势。
3.2 成瘾过程中促进记忆的基因与抑制记忆基因的表观遗传学改变
许多基因参与记忆形成、巩固、保持与提取过程，一类是记忆促进基因(memory promoting genes)，另一类是记忆抑制基因(memory suppressing genes)。目前大多数研究关注记忆促进基因在记忆形成过程中的作用，发现了一些在短时记忆转化为长时记忆过程中起关键作用的基因。相对于记忆促进基因研究取得的重要进展，目前对记忆抑制基因情况知之甚少，蛋白磷酸酯酶1(proteinphosl)hatase1，PP1)与cAMP反应元件结合蛋白2(CREB2)是目前已知的两个抑制长时记忆形成的分子，二者都是多巴胺受体激活后诱发的cAMP/PKA/CREB通路的重要环节，抑制PP1与CREB2基因的表达则促进短时记忆向长时记忆的转换。提示这种甲基化的发生与记忆形成过程中匹配的环境线索相联系，即在条件化的过程起重要作用。因此，综合研究成瘾药物作用先记忆促进与记忆抑制基因的表观学变化便于更清晰的阐明成瘾记忆长期存在的分子机制。
3.3 存在的问题
许多表观遗传调控子的特异性拮抗剂的缺乏阻碍了精神障碍相关的染色质重塑的研究。所有的可用的组蛋白去乙酰化酶(HDACs)的拮抗剂都是非特异性的，能够阻止所有一型和二型的HDACs。更别说一些特定的HDACs(比如三型HDACs:termedsirtuins酵素和二型HDACs:HDAC6)除了组蛋白还能使其他蛋白质脱去乙酰基，这就使对这些抑制剂的生物学作用的解释更加复杂化了。特定HDACs或其他染色质重塑的特异性抑制剂才能使我们区分出精神病理现象中表观遗传调控机制所起的特定的作用。
表观遗传学的应用范文4
摘要：乳腺癌是女性常见肿瘤，近年来发病率逐年上升，乳腺癌易感基因1（BRCA1）已经证实与乳腺癌的发生发展有密切关联。新辅助化疗在乳腺癌综合治疗中的作用已得到广泛证实，是对非转移性的肿瘤在局部治疗前进行的全身性的、系统性的细胞毒性药物治疗。可以显著降低乳腺癌患者临床分期，提高患者生存率和生存期限，最常适应于乳腺肿瘤较大或有大量淋巴结转移者，近来新辅助化疗逐渐应用于早期乳腺癌患者。有研究报道乳腺癌患者BRCA1 基因表达水平高低与新辅助化疗敏感性有关，可以解释乳腺癌患者接受新辅助化疗后有无缓解。
关键词：乳腺癌；新辅助化疗；BRCA1 基因
乳腺癌在全世界范围内是最常见的女性肿瘤之一，占所有肿瘤的23%。每年约有1百万新增病例。美国癌症社会（American Cancer Society）发现，乳腺癌死亡率从1990年来一直在稳定下降，这得益于早期诊断的出现和越来越规范的治疗体系。乳腺癌在中国大陆地区女性常见死亡原因中排名第四。随着乳腺癌的发病率的提高，年轻女性患者也越来越常见，这可能主要与饮食逐渐西化，久坐的生活方式，生育的延迟以及外界环境中化学物质的污染有关。 1新辅助化疗与乳腺癌BRCA1基因甲基化 乳腺癌易感基因（BRCA1）是1990年Hall等发现，与乳腺癌发生有紧密联系的一组基因[1]，是主要的乳腺肿瘤易感基因。BRCAl基因定位于17q2l，长约81 Kb。共有24个外显子，其中第1、4号外显子不编码氨基酸，第11号外显子最长，约3.4 Kb，占整个编码区的61％[2]。BRCA1基因突变的乳腺癌患者有独特的病理学特征和基因表达方式。现在相关研究人员正在对不同人群中乳腺癌患者BRCA1基因突变的范围进行调查，我国台湾地区的调查提示BRCA1基因突变与乳腺癌的发生关联不大[3]。BRCA1基因启动子甲基化被认为是基因表达缺失的机制之一，并且在9~32%的散发性乳腺癌中有表达。Hsu[4]等发现BRCA1基因启动子甲基化在56%的早期散发性乳腺癌患者中存在。大多数BRCA1基因甲基化的肿瘤中BRCA1蛋白表达缺失或明显减少,表明在这些肿瘤中存在表观遗传基因沉默。BRCA1基因启动子甲基化的乳腺癌患者的雌激素受体和基底细胞表型表达下降[5]。 散发性乳腺癌患者虽然未发现体细胞BRCA1基因突变，但也存在其他机制导致BRCA1基因的失活[6]。表观遗传学修饰所致的基因沉默被认为是肿瘤抑制基因失活的重要机制。启动子CpG岛高度甲基化可致BRCA1表达缺失。表观遗传学上BRCA1基因失活和源于BRCA1基因突变者肿瘤中普遍的病理学特征有关。之前有统计证实大约10%的散发性乳腺癌患者中存在BRCA1基因CpG岛区高度甲基化[7]。表观遗传学中BRCA1基因沉默所致的基因变化与BRCA1基因突变肿瘤中观察到的变化相似。这些发现证实了表观遗传学中BRCA1基因失活在散发性乳腺癌发生发展中起到了重要的作用。目前还不是很明确表观遗传学的失活和BRCA1基因转录沉默是否与散发性乳腺癌中的三阴性乳腺癌或基底细胞样乳腺癌特异性相关，一些研究报道的数据提示BRCA1基因表达缺失和三阴性乳腺癌相关，其他亚型则无[8]。 2新辅助化疗与乳腺癌BRCA1基因表达 乳腺癌易感基因1（BRCA1）通过转录伴随核苷酸切除修复在DNA修复中起着重要的作用。有报道散发性乳腺癌患者同时存在BRCA1甲基化和BRCA1的mRNA的表达缺失的情况。散发性乳腺癌患者中躯体BRCA1突变较为少见。然而大约30%的散发性乳腺癌和70%的卵巢癌患者中BRCA1基因存在表观遗传学调控下降的现象[9]。BRCA1表达能调节对化疗的细胞应答。临床乳腺癌研究提示BRCA1在预测对DNA损伤媒介和紫衫类为基础的化疗的应答中起到一定作用。 BRCA1 mRNA表达水平可以作为生存率的最强的预测指标。BRCA1基因在DNA修复中起着至关重要的作用。散发性乳腺癌BRCA1表达降低与基因突变无关，与BRCA1基因启动子获得甲基化及调控BRCA1基因表达的上游通路异常有关[10]。 BRCA1基因编码在S期和G2期表达的细胞周期调控蛋白。在非小细胞肺癌中，患者生存率较低可能与BRCA1基因过度表达相关。在散发性乳腺癌中，BRCA1基因表达下降或缺失与肿瘤等级高，淋巴结分期高，肿瘤较大，侵袭血管，雌激素受体阴性，孕激素受体阴性及结局不好相关。BRCA1基因起着多功能的作用，在很多正常细胞功能中都有涉及。因此，功能性BRCA1基因表达缺失可能对化疗的细胞应答有重要影响，尤其对用DNA损伤介质处理的患者可能有预测价值。 3展望 乳腺癌对新辅助化疗的应答与生存率息息相关。从新辅助化疗获得最大生存获益的患者即对新辅助化疗完全应答。我们使用蒽环类药物治疗后BRCA1 表达水平作为疾病进展时间和总生存率的标记物,研究提示BRCA1 mRNA表达水平较低的散发性乳腺癌患者可能从蒽环类药物为基础的化疗中得到最大获益。一部分散发性乳腺癌患者BRCA1表达较低下，使用以DNA损伤为基础的化疗药物后，BRCA1基因突变携带者与BRCA1基因未突变携带者相比更可能达到病理完全缓解。使用以铂类为基础的化疗药物后，BRCA1 mRNA表达较低的散发性卵巢癌患者较BRCA1 mRNA表达较高患者有更长的生存期。 参考文献： [1]Watanabe Y,Maeda I,Oikawa R,et al.Aberrant DNA methylation status of DNA repair genes in breast cancer treated with neoadjuvant chemotherapy[J].Genes Cells,2013,45（4):89-95. [2]Alili C,Pages E,Curros Doyon F,et al.Correlation between MR imaging-prognosis factors and molecular classification of breast cancers[J].Diagn Interv Imaging,2014,95(2):235-242. [3] Raphael J,Mazouni C,Caron O,et al.Should BRCA2 mutation carriers avoid neoadjuvant chemotherapy[J].Med Oncol,2014，31(3):850-855. [4] Mulligan JM,Hill LA,Deharo S,et al.Identification and validation of an anthracycline/cyclophosphamide-based chemotherapy response assay in breast cancer[J].J Natl Cancer Inst,2014，106(1):335-342. [5]Rovera F,Chiappa C,Coglitore A,et al.Management of breast cancer during pregnancy[J].Int J Surg,2013,11(4):64-68. [6]Badora A,Kaleta B,Nowara E,et al.Multiple primary malignancies in BRCA1 mutation carriers--two clinical cases[J].Ginekol Pol,2013，84(10):892-896. [7] Huszno J,Budryk M,Ko?osza Z,et al.The influence of BRCA1/BRCA2 mutations on toxicity related to chemotherapy and radiotherapy in early breast cancer patients[J].Oncology,2013，85(5):278-282. [8] Ratanaphan A.A DNA Repair BRCA1 Estrogen Receptor and Targeted Therapy in Breast Cancer[J].Int J Mol Sci,2012,13(11):14898-14916. [9] von Minckwitz G, Martin M. Neoadjuvant treatments for triple-negative breast cancer(TNBC)[J].Ann Oncol,2012,32(5):35-39. [10]Sousa B,Cardoso F.Neoadjuvant treatment for HER-2-positive and triple-negative breast cancers[J].Ann Oncol,2012,23(4):237-242.编辑/许言
表观遗传学的应用范文5
关键词：生物科学 遗传学 教学内容 重复
中图分类号：G642.3 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1672-8181.2013.19.020
遗传学是研究生物遗传和变异规律的一门科学。它是现代生命科学教学中最重要的主干课程之一，是高等院校生物科学等相关专业必修的专业基础课。现今，遗传学正以极快的速度向前发展，并不断渗透到其它生物、医学学科，这使得原本在遗传学中讲授的内容也同时出现在其他课程的教学内容中。这种现象反映了遗传学在生命科学中的核心地位，也凸显了高校遗传学教学所面临的教学内容重复问题。事实上，为体现一门课程的系统性、完整性和先进性，在编写教材时，学科之间有关内容的相互渗透、交叉以至重复是不可避免的。但相同的内容在多门课程的课堂教学中反复出现会使学生失去学习兴趣，浪费宝贵的课时，使教学效率大打折扣。本文将对该问题进行分析，并提出一些对策供同行讨论。
1 遗传学与其它课程教学内容重复的具体表现
目前，我国各大专院校生物、医药、农林等专业均开设有遗传学。虽然不同专业的教学重点有所不同，但核心内容相对统一。遗传学是笔者所在学院生物科学等专业本科生的一门必修课，这门课的任务是：引导学生牢固掌握遗传学最重要的基本原理，熟悉各分支学科的主要理论与研究方法，了解遗传学的重大理论与技术进展，熟悉遗传学研究技术与实验装备，为学生毕业后在本学科以及相关学科中的发展打下坚实的基础。
除遗传学外，我院还为生物科学专业的学生开设有细胞生物学、分子生物学、基因工程、生物化学、微生物学等专业必修课。我们选用的遗传学教材的内容基本上涵盖了遗传学的各个发展阶段，其中，遗传物质的细胞学和分子基础、染色体的结构变异、基因突变与DNA损伤修复、原核生物和真核生物基因表达的调控等章节[1]与上述几门课程的教学内容分别存在着不同程度的交叉（表1），有的甚至是其它课程的重点内容。尤以分子生物学、基因工程这两门课的教学内容与遗传学的相似度最高，这三门课几乎都重复着共同的遗传学问题――遗传物质的结构、复制、转录、翻译、调控、突变、重组等。另外，我院生物科学专业细胞生物学、分子生物学的开课时间与遗传学相同，这使得遗传学教学内容重复的问题更加突出。
表1 遗传学教学内容在其它课程中的分布
2 问题的根源
其它课程的教学内容与遗传学出现重复并不是偶然的，这种局面的形成与遗传学自身的发展特点及其学科内涵有很大的关系。
遗传学的研究进程按照不同历史时期的学术水平和工作特点，大体上可划分为经典遗传学、生化遗传学、分子遗传学、基因工程学、基因组学和表观遗传学等数个既彼此相对独立又前后互相交融的不同发展阶段[2]。如果以半个多世纪前Watson和Crick提出DNA双螺旋结构为界，也可以简单的将整个遗传学的发展过程划分为经典遗传学（classical genetics）和分子遗传学（molecular genetics）两大阶段：经典遗传学以孟德尔遗传学为基础，主要研究性状在系谱中的传递，即基因在亲代和子代之间的传递问题；分子遗传学则是在分子水平上研究生物遗传和变异机制的遗传学分支，主要研究基因的本质、基因的功能以及基因的变化等问题。
在整个遗传学的发展史上，分子遗传学的地位无疑是相当重要的。它的兴起使遗传学的面貌焕然一新，既系统地继承和发展了经典遗传学和生化遗传学的研究脉络，又全面地影响并渗透到后继学科的各个领域。从内容上来看，分子遗传学与分子生物学的学科界限十分模糊。通过对上述课程教学内容的分析我们也不难发现，那些重复的内容有相当一部分是分子遗传学范畴的。另外，由于生化遗传学和早期的分子遗传学研究都以微生物为材料，因此遗传学与微生物学、生物化学之间必然存在着千丝万缕的联系。而基因工程学、基因组学本身就是现代遗传学的分支学科，它们成为生物科学专业的必修课或进入课堂教学是高校课程设置不断细化和专业化的结果，也难免会与同时开设的遗传学存在教学内容上的重叠。
3 解决教学内容重复问题的对策
教学内容重复无疑会影响教学效果。我们通过实践发现，从授课内容本身、教师和学生、以及教学方法等环节入手，能够有效地避免重复对教学带来的不利影响。
3.1 合理调整教学内容
近些年来，同行们在遗传学教学内容的调整上作了大量的改革和探索。常见的做法是根据自己的理解及理论专长跳跃式地分割讲授，或根据自己的经验对教学内容做出取舍，甚至有人提出只讲经典遗传学而放弃分子遗传学。上述做法并不能有效地解决遗传学的教学内容重复问题，相反会造成教学不成体系的局面，对“教”和“学”都很不利[3]；而如果无视教学内容重复的存在，贪多求全、面面俱到，对所有内容蜻蜓点水般逐一讲解，又无法实现大学遗传学教学深度和难度的提升。
我们认为，对遗传学教学内容进行删减是必要的，但必须遵循遗传学的发展历史和保持其完整的知识结构体系，不能大刀阔斧整章删除，而应在重复章节内部进行微调，具体做法包括：精简繁杂冗长的内容，下放学生能看懂的内容（自学），突出基础性、应用性的内容，增加前瞻性的内容等。这就要求教师有较高的遗传学理论修养，准确把握各章节特别是重复内容在整个遗传学教学体系中的地位，做好教学内容的层次划分，根据层次选择不同的授课侧重点。
3.2 加强授课教师之间以及师生间的协调沟通
教学内容重复已成为遗传学等课程授课教师的共识，对各自的教学内容进行删减无疑成了最简单、最常用的一种解决方法。但如果大家在没有交流的情况下对同样的内容都作了删除，重复的内容反而会变成被遗忘的内容。因此，积极促成遗传学与其他相关课程任课教师间的沟通十分必要。
我们认为，集体备课是教师之间进行相互沟通的一种有效形式。通过这种方式，相关课程的教学人员能够坐下来共同研究教学内容，在“知己知彼”的基础上协调、统筹各自的授课章节，明确重复内容的教学分工，制订满足包括遗传学在内的多门课程教学需要的授课计划，做到各有侧重而又不失体系的完整性。这不仅可避免实际教学过程中的低级重复，还能保证课程之间的相互衔接，有助于学生顺利地掌握所有课程的教学内容。另一方面，还应当加强授课教师和学生之间的课内外交流。如：教师可在开课前召开师生座谈会，了解所教班级学生对重复内容的掌握情况；开课后则根据学生的反馈，随时调整教学方案。
3.3 优选教学方法
为了保持遗传学完整的知识结构体系，所谓的重复内容不但不可不讲，而且还要下功夫选择合适的教学形式或方法来讲。对于在其他课程已深入学过而在遗传学中只需一般了解的内容，通过简单的问答引导学生回顾这部分内容即可；对于对遗传学新知识点有重要铺垫作用的其他课程的基础性知识，可采取布置学生课前或课中自学、再集中小结的方法帮助学生巩固复习之，还要注意从遗传学的角度阐明同一知识点，突出遗传学的学科特色；对于其他课程仅略有涉及但在遗传学中须进一步加深了解的内容，宜先勾起学生对这部分知识的点滴回忆，同时指出学生现有知识的不足，从而激发他们的求知欲，然后顺理成章地讲下去，在学生的高度关注中完成该知识点在遗传学中的深入讲授；对于一些有特殊作用的重复内容，则要综合运用多种教学方法将其讲好讲透，如：减数分裂在遗传学和细胞生物学的教材中均有详细的描述，属于重复的教学内容，但却是理解遗传的连锁交换和重组的一把钥匙；在整个遗传学的教学过程中，应反复多次向学生强调和提及减数分裂过程中的染色体行为，将这部分知识迁移和渗透整合进连锁遗传分析、真核生物遗传分析、细菌和病毒的遗传分析等多个章节，使枯燥难懂的遗传学分析过程变得易于理解，让重复的内容为新的知识点和教学难点服务。
此外，遗传学与其他课程之间还可以开展合作教学。如：我们尝试将遗传学和细胞生物学这两门专业基础课的实验课合二为一，以综合性大实验的形式开设，从而将遗传学和细胞生物学关联起来，有助于学生从整体上把握这两门课程，实现了教学资源的整合，提高了教学效率，较好地化解了教学内容重复的问题。
4 结语
遗传学与多门课程教学内容的重复是客观存在的，随着生物科学专业课程设置专业化程度的提高，这种局面将变得愈来愈突出。因此，调整遗传学教学内容势在必行。但无论进行怎样的调整，都必须遵循遗传学的发展历史、保持基础遗传学完整的知识结构体系。作为遗传学的授课教师，既要关心遗传学研究的最新动态，又要加强对遗传学理论体系的整体把握和理解，只有这样才能合理有效地解决遗传学教学内容重复的问题，从而节约教学资源，提高专业课教学质量。
参考文献：
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作者简介：袁茵（1981-），女，河南开封人，研究生，讲师，从事遗传学教学工作，广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州 510006
陆幸妍，广东药学院生命科学与生物制药学院，广东广州 510006
表观遗传学的应用范文6
[关键词]先天性小耳畸形家族；FGF3基因；甲基化
[中图分类号]R764.7 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2012）04-0611-02
Study of methylation of promoter of FGF3 gene in genetic microtia pedigree
LIU Jia-feng,SUN Jia-ming,LI Xiao-dan
(The department of plastic and reconstruction, Union hospital ,Tongji medical college, Huazhong science &technique university,Wuhan 430022,China)
Abstract: Objective To explore the methylation in promoter of FGF3 gene in genetic microfia pedigree. Methods The methylation in FGF3 gene in 32 people of genetic microtia pedigree and 20 healthy controls were measured using Methylation-specific PCR(MSP). Results The methylation of FGF3 gene in microtia were significantly lower than those in control(P
Key words:Genetic mierotia pedigree;FGF3 gene;Methylation
小耳畸形是常见的先天性疾病，对其基因学的研究虽有一定的定位，然而，目前仍未明确某个基因的改变必然引起小耳畸形的发生。FGF3是脊椎动物头部软骨形成的关键调节因子，FGF3及FGFR2基因的突变可能导致在胚胎时期软骨细胞分化及迁移的障碍，有学者发现一家系FGF3基因上存在三个纯合子突变，并认为该突变与内耳发育不良及小耳畸形有密切相关[1]，而FGF3基因启动子甲基化状体及其在遗传性小耳畸形发生中的作用至今仍未见报道，本文拟通过对遗传性小耳畸形家系的研究，了解家系成员中FGF3基因启动子甲基化状态及其在小耳畸形发生中的作用。
1 资料和方法
1.1 研究对象：选取2007年7月～2011年7月在华中科技大学同济医学院附属协和医院整形外科就诊的遗传性小耳畸形家系4个，选其健在的直系亲属32人进行研究，其中男性19人，女性13人，年龄5～57岁。选择同期就诊的耳廓正常、无其他先天性畸形家族史的患者20例为对照。
1.2 实验方法
1.2.1标本采集及DNA提取：抽取两组病例空腹静脉血6ml,4℃保存备用，血标本收集完成后，提取血样中的DNA，用分光光度计定量，琼脂糖凝胶电泳质检。质检合格的DNA将浓度调整后，置-20℃储存备用。
1.2.2 亚硫酸氢钠处理基因组DNA：参照甲基化特异性PCR方法，用亚硫酸氢钠处理基因组DNA，用2.5倍体积预冷无水乙醇和2μl糖原沉淀DNA，-40℃ 过夜；然后用70%乙醇洗涤沉淀2次，干燥后用30μl去离子水溶解，-4O℃ 保存。
1.2.3 甲基化特异性PCR：设计FGF3基因甲基化引物正义链和反义链，非甲基化引物的正义链及反义链。总体积为30μl反应液中含DNA 5μl，10×缓冲液3μl，MgCl22.5mmol/L，引物0.5μmol/L，dNTP250μmol/L，Hotstar Taq 0.5μl。MSP反应条件：95℃,15min，95℃, 30 S，60℃ 30s，72℃ 30s，35个循环，72℃ 延伸10min。
1.3 统计学方法：采用SPSS11.5软件统计数据，血浆FGF基因甲基化分析采用χ2检验，P≤O.05为差异有统计学意义。
2 结果
实验组血浆FGF3基因甲基化程度明显小于对照组（P
3 讨论
3.1 先天性小耳畸形是常见的先天性疾病，其发病率较高，约1/7 000[2],它主要因为胚胎时期第一鳃沟及其邻近的第1、2鳃弓的发育异常引起的一组颌面畸形，主要表现为外耳及中耳的异常，传导性或混合性耳聋，有时伴有耳前凹陷或副耳[3-4]。其病因尚不明确，环境和遗传是重要发病因素，遗传因素虽不是小耳畸形的主要致病因素，但目前家族遗传性小耳畸形的报道并不鲜见[5-6]，基因改变在小耳畸形发生中的作用受到学者们的广泛重视。
3.2 传统的基因突变是指存在DNA序列改变的可遗传的基因表达的改变，但是近年来发现以DNA甲基化、组蛋白修饰[7]及染色质重塑等为主的没有DNA序列变化的改变，可产生可以遗传的基因表达改变，统称为表观遗传学改变。DNA甲基化是指CpG二核苷酸中的胞嘧啶第5位碳原子被甲基化，在DNA序列不变的情况下，控制基因的表达，调节DNA重组及某些特定基因组区域的转录活性。DNA的甲基化状态改变作为一个表观的标签，易于受激素、饮食以及药物等外界因素的可逆的修饰，标示出该基因是沉默或表达。当甲基化程度越高，基因就越“沉默”，反之亦然。在肿瘤疾病中DNA甲基化改变表现为整个基因组低甲基化、局部基因高甲基化[8]。潘博等[9]前期研究未发现小耳畸形患者中存在EYA1基因突变位点，林琳[10]等对该基因启动子的甲基化状态进行研究，结果发现存部分区域的低甲基化，并推测可能与小耳畸形的发病有关。
3.3 FGF3是脊椎动物头部软骨形成的关键调节因子[11]；而在胚胎肢体发育中，成纤维细胞生长因子受体（FGFRs）在由干细胞向软骨细胞分化中发挥重要的作用。Hellingman等[12]认为FGFR2在人间充质干细胞向软骨诱导分化的第一期，即间质凝集期有明显的表达，表明FGF3及其受体信号途径在软骨发生过程中起重要的作用。FGF3及FGFR2基因的突变，可能导致在胚胎时期软骨细胞分化及迁移的障碍。有学者发现FGF3上存在的三个纯合子突变（p.S156P，p.R104X，及p.V206SfsX117）与以内耳发育不全、小耳及小牙症为表征的综合征性耳聋有密切相关[1]；目前虽尚未见小耳畸形患者中存在FGF3基因甲基化改变的相关报道，对于其基因甲基化状态的研究将进一步解释FGF3基因与小耳畸形发生的关系。
3.4 笔者的研究发现在FGF3基因启动子上存在低甲基化状态，提示可能与小耳畸形的发生有关，其机制可能是因为FGF3基因具有基因剂量效应，即剂量达到一定阈值基因才能发挥正常功能，所以同一家系不同成员中存在外显不全或表观度变异。此外，基因低甲基化也可能引起患侧组织染色体重构，并进而导致细胞表型的变化。进一步的研究将详细了解哪些具点的甲基化改变，以及FGF3整体的低甲基化改变对基因表达及耳软骨细胞发生及迁移的影响。
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