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微生物研究方法范文1
[中图分类号] R92 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2012）07（a）-0081-02
Study on the microorganism limited inspecting method of Tianbai Jinhuang Powder
ZENG Haikun1 HONG Meihua2 ZHUO Xiaoping2
1.Foshan Chinese Medicine Hospital in Guangdong Province, Foshan 528000, China; 2.Shanwei Institute for Drug Control in Guangdong Province, Shanwei 516600, China
[Abstract] Objective To establish the microorganism limited inspecting method of Tianbai Jinhuang Powder. Methods The recovery test of inoculating five positive control bacteria was used to determine whether it contained antibacterial component. Results The results of recovery test of two positive test bacteria by Tianbai Jinhuang Powder were both lower than 70%, which indicated that there was a certain antibacterial effect under this experimental condition, but the antibacterial effect could be eliminated through the media dilution method. Conclusion Tianbai Jinhuang Powder can carry on the microorganism limited inspecting method according to the medium dilution method.
[Key words] Tianbai Jinhuang Powder; The microorganism limited inspecting method; Methods study; Bacteriostat
天柏金黄散是一种中药验方制剂，由天花粉、红花、白芷、大黄等十一味药组成，具有活血化瘀、清热凉血、消肿止痛等功效，临床上常用于伤科跌打肿痛或外科疮疡红肿热痛等症。微生物限度检查法是检查产品及其原料、辅料受微生物污染程度的方法，产品的微生物限度检查方法的建立，应分析其组成成分，若产品的组分货源实验条件发生改变可能影响检验结果时，计数方法应重新验证[1]。为了更好地控制药品质量，建立天柏金黄散的微生物限度检查方法，笔者根据药典要求进行了方法学验证，结果满意。报道如下：
1 仪器与材料
1.1 仪器
SW-CJ-IF净化工作台，YXQ-LS-50SⅡ全自动立式电热压力蒸汽灭菌器，SPX-150B-Z生化培养箱，MJX-160B-Z霉菌培养箱，DT300电子天平。
1.2 检验用菌株
实验中所用到的检验菌株由中国药品生物制品检定所提供，分别是金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，CMCC（B）26 003，第4代）；枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis，CMCC（B）63 501，第3代）；大肠埃希菌（Escherichia coli，CMCC（B）44 102，第5代）；白色念珠菌 （Candida albicans，CMCC（F）98 001，第3代）；黑曲霉菌（Aspergillus niger，CMCC（F）98 003，第2代）。
1.3 试剂
检验用到的所有培养基均由中国生物制品检定所提供，其他试剂均为分析纯。
1.4 样品
天柏金黄散是广东省佛山市中医院制剂中心生产的医院制剂，批号为123J09。
2 方法与结果
2.1 菌悬液的制备
2.1.1 金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌及大肠埃希菌悬液制备 取经35℃培养20 h的金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌的新鲜营养肉汤培养物l mL，用0.9%无菌NaCl溶液10倍稀释至10-5～10-7，制成约为50～100 cfu/mL的菌悬液，做活菌计数备用。
微生物研究方法范文2
关键词：功能基因组；高通量数据；生物信息学
中图分类号：Q933 文献标识码：A 文章编号：1671-2064（2017）10-0190-01
功能基因组学（后基因组学），是在结构基因组所提供的丰富的高通量信息资源以及大量各类生成产物的基础上发展起来的基因组学的子学科。其通过在功能基因组水平或功能系统水平上全面地分析基因的功能，发展和提出了多种实验手段和分析方法，使得生物学的研究对象由单一基因或蛋白质转为多个基因或蛋白质组成的系统，进而得到关于基因表达、调控、功能以及生物的生长、发育的相关规律。
1 差异显示反转录PCR技术
差异显示反转录PCR（DDRT―PCR）技术是由Liang和Pardee等提出的，以PCR和聚丙烯酞胺凝z电泳为基础的功能基因组学的传统方法。该方法的基本原理是：以1对细胞（或组织） 的总RNA反转录而成的cDNA为模板，利用PCR的高效扩增，通过5’端和3’端引物的合理设计和组合，将细胞（或组织） 中表达的基因片段直接显示在DNA测序胶上，从而找出1对细胞（或组织）中表达有差异的cDN断。DDRT―PCR具有周期短，功能多，灵敏度高，所需RNA的量较少并且重复性较高等优点。但是，在实际施行过程中， DDRT―PCR技术存在着假阳性率高、凝胶中单条cDNA带成分不均一、所获cDNA仅代表mRNA 3’UTR（非翻译区）、一些低拷贝数mRNA不能有效呈现等问题。[1]
2 基因表达序列分析
基因表达序列分析（SAGE）是Velculescu等人建立的一种快速高效地分析转录物的实验方法。其理论依据是：基因组中95%的基因可以由来自cDNA 3’端特定位置的一段9―11bp长的序列加以区分。这一段特异的基因序列被记作SAGE标签。基因表达序列分析通过对cDNA制备SAGE标签，然后将这些标签串联起来并对其进行测定，可以显示出各SAGE标签所代表的基因在特定的组织中是否有表达，同时还可以将SAGE标签所出现的频率作为其所代表的基因表达程度的指标。但是，应用SAGE技术有一个重要前提条件：GenBank中必须有某一物种足够多的DNA序列的资料（特别是EST序列的资料）。[2]
3 微阵列分析
DNA微阵列（microarray assay）技术包括cDNA微阵列和DNA芯片（DNA chip）两种方法，这两种方法的原理相同。首先是在固相表面合成成千上万个寡核苷酸“探针”（cDNA、EST或基因特异的寡核苷酸），该过程会用到光导化学合成、照相平版印刷和固相表面化学合成等技术。接着将寡核苷酸“探针”与来自不同细胞、组织或整个器官的用放射性同位素或荧光物标记的DNA或mRNA反转录生成的第一链cDNA进行杂交。最后对每个杂交点进行定量分析。定量分析的结果可以用于DNA测序、DNA突变和多态性分析以及对同一组织细胞在不同状态下或在同一状态下多种组织细胞基因表达水平的差异的检测，还可以发现新的致病基因或疾病相关基因等。微阵列分析的优点是可以同时对大量的基因，甚至是整个基因组的基因表达进行对比分析，并且在核苷酸杂交技术的各个方面应用。其在同时比较同一组织在不同状态下或各组织之间DNA序列分析以及基因的表达状况等方面具有极大的优越性。
4 反义RNA分析
反义RNA是能与靶RNA互补配对的，用来定点分析某一段DN段（基因）功能的小分子RNA。反义RNA分析即是利用反义RNA来进行功能基因组分析的方法。该方法首先分离基因片段的mRNA，合成其mRNA的互补RNA（反RNA）。然后给反RNA加上基因表达必需的元件（如启动子等），接着插入T-DNA。将其转化到植株中，那么合成的基因就会在植株中表达，并表现出相应性状。因为反义RNA与靶RNA碱基配对的结合方式，反义RNA可以在DNA复制、转录和翻译水平上对基因表达加以调控。
5 蛋白质组分析
蛋白质组分析方法主要涉及两个步骤：蛋白质的分离和蛋白质的鉴定。用于蛋白质分离的技术主要是双向凝胶电泳（2-dimensional gel electrophoresis，2-DE），其原理是细胞抽提物在电泳过程中蛋白质个体首先依据所带电荷然后依据分子大小被分离。这种方法的最大缺点是重复性差，使得几乎不能同来自其他实验室的资料进行比较。
6 生物信息学
生物信息学将DNA和蛋白质作为研究对象，以计算机等计算工具为基础，发展更新各种软件，收集、整理和储存DNA和蛋白质的序列和结构数据，并加以分析进而发现藏在基因序列中的规律。应用生物信息学可以对功能基因组研究过程中产生的高通量，高维度的数据进行处理，应用数理统计的方法，以计算机的快速运算能力，找到功能基因组的相关信息。常应用生物信息学将未知DNA序列与数据库中收集的DNA序列进行同源性比较，或应用相关软件进行核苷酸及氨基酸序列的同源性比较，以此来获得未知DNA序列的功能信息。[3]
7 小结与展望
随着发展，基因组学由结构基因组学向功能基因组学发展，由此也产生了大量应用于功能基因组研究的工具和方法。这些方法从不同的角度和方向挖掘基因本身蕴含的丰富信息资源。功能基因组学无论是应用于获取大量基因功能信息，亦或是针对特定基因的研究都取得了突破性的进展，发展速度迅速。但随着各类研究的不断深入进行，这些方法的精确性和准确性会渐渐不再满足条件，同时各项技术尚未解决的一些问题也会被放大，单个方法或技术可能难以对新的问题有较好的应用。结合各种方法，扬长避短，综合应用各种技术可以对功能基因组有更全面、深入的研究。[4]
功能基因组学的应用十分广泛，从动物、植物到微生物群落分析都可以取得较好的研究成果，也可以应用于医药、毒理等领域。随着计算机技术的发展，将生物信息学应用于功能基因组学，借助计算机强大的计算能力，功能基因组学将能取得更大的突破。
参考文献
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[2]常青山，余增亮.基因表达分析方法及其研究进展[J].生物技术通报，2002，（6）：27-31.
微生物研究方法范文3
[关键词]乌芪舒筋通络片；微生物限度；方法学研究；《中国药典》2015年版
[中图分类号] R286 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2017）06（c）-0093-04
[Abstract]Objective To establish a microbial limit test method of Wuqi Shujin Tongluo tablets.Methods Methodology research on microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets was conducted according to the "1105，1106，1107" of Chinese Pharmacopoeia 2015 edition with the fourth part.Results The total number of aerobic bacteria could be tested by plate dilution method and membrane filtration method，the total number of fungus and yeasts could be tested by the plate routine method，and the recovery was between 0.5 and 2，Escherichia coli，Salmonella，Bile salt resistant Gram-negative bacteria could be detected through control bacteria by direct inoculation method.Conclusion The total number of aerobic bacteria can be tested by plate dilution method，the total number of fungus and yeasts can be tested by plate routine method，and the control bacteria can be tested by direct inoculation method，the methods used are feasible，and easier to operate，which are suitable for the microbial limit test of Wuqi Shujin Tongluo tablets.
[Key words]Wuqi Shujin Tongluo Tablets；Microbial limit；Methodology research；Chinese Pharmacopoeia 2015 edition
踯问钔络片是根据我院省名中医验方制成的纯中药制剂，具有补肝肾，通络止痛的作用，由细辛、制川乌、制草乌、桂枝、牛大力、防己、黑老虎、蜈蚣、走马胎、羚羊角骨、牛膝、黄芪、杜仲、续断、甘草等药味组成[1]。该制剂微生物限度检查法原按《中国药典》2010年版进行方法学验证[2]，随着《中国药典》2015年版的实施，新版微生物限度检查方法变化很大，必须重新进行验证。为此，本研究按《中国药典》2015 年版四部“1105、1106、1107”项下方法[3]，对该制剂的微生物限度检查方法进行了再次验证研究，制订了新的切实可行的微生物限度检查法，替代了旧标准，并应用于该制剂的日常检验，使该制剂的微生物限度检查法提升到新版《中国药典》的水平。
1 仪器与试药
1.1 仪器
SZX型超净工作台（上海沪南科学仪器联营厂）；BHC-1300ⅡA/B3型生物洁净安全柜（苏州净化设备有限公司）；YXQWF32-500卧式榘形压力蒸气消毒器（湖南衡阳医疗器械厂）；LRH-250A生化培养箱（韶关市泰宏医疗器械有限公司）；MJ-160B-Ⅱ霉菌培养箱（上海跃进医疗器械厂）；CX31生物显微镜（奥林巴斯）；HTY HOMO761匀浆仪（浙江泰林生物技术股份有限公司）；JA2003N电子天平（上海精密科学仪器有限公司）；JC101型电热鼓风干燥箱（上海成顺仪器仪表有限公司、南通嘉程仪器有限公司合作出品）。
1.2 样品
乌芪舒筋通络片（肇庆市中医院，批号：15050401；15051102；15052401）。
1.3 菌种
实验所用的菌株传代次数不得超过5代[4]，并采用适宜的保藏方法保存，确保试验菌株的生物学特性。
金黄色葡萄球菌（Staphylococcus aureus）[CMCC（B）26003]、枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis） [CMCC（B）63501]、铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）[CMCC（B）10104]、白色念珠菌（Candida albicans）[CMCC（F）98001]、黑曲霉（Aspergillus niger） [CMCC（F）98003]、大肠埃希菌（Escherichia coli）[CMCC（B）44102]、乙型副伤寒沙门菌（Salmonella paratyphi B）[CMCC（B）50094]。以上菌种均来自于中国食品药品检定研究院。
1.4 培养基
胰酪大豆胨琼脂培养基（批号：3105210）、沙氏葡萄糖琼脂培养基（批号：3105120）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、沙氏葡萄糖液体培养基（批号：3105054）、麦康凯液体培养基（批号：3105291）、麦康凯琼脂培养基（批号：3105138）、RV沙门增菌液体培养基（批号：3104847）、木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂培养基（批号：3104852）、三铁塘琼脂培养基（批号：3105052）、肠道菌增菌液体培养基（批号：3105093）、紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基（批号：3104750），均由广东环凯微生物科技有限公司生产，使用前先进行培养基的适用性检查，并且在有效期内使用，培养基的制备按照标示方法进行。
1.5稀释液、冲洗液
pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液（广东环凯微生物科技有限公司，批号：3105256）、胰酪大豆胨液体培养基（批号：3105305）、0.9%无菌氯化钠溶液（自制）。
2 方法与结果
参照《中国药典》2015年版四部“1105、1106、1107”微生物限度检查法[3]进行验证。
2.1 菌液制备
2.1.1 金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌
取金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌的新鲜培养物分别接种至100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，30～35℃培养18～24 h；分别取各培养物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递增稀释级数制成每毫升含菌数为
2.1.2 白色念珠菌
取白色念珠菌的新鲜培养物接种至100 ml沙氏葡萄糖液体培养基中，20～25℃培养2～3 d，取培养物 1 ml，加 0.9%无菌氯化钠溶液9 ml，按10 倍递增稀释级数制备成每毫升含菌数
2.1.3黑曲霉
取黑曲霉新鲜培养物接种至沙氏葡萄糖琼脂培养基中，20～25℃培养5～7 d，加入3～5 ml含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液，洗脱孢子。再选用适宜的方法将孢子悬液吸至无菌试管内，用含0.05%（ml/ml）聚山梨酯80的0.9%无菌氯化钠溶液制备成每毫升含菌数
2.2 供试液的制备
取供试品10 g，加胰酪大豆胨液体培养基至100 ml，用匀浆仪打碎，混匀，作为1∶10的供试液。量取1∶10的供试液10 ml，加胰酪大豆胨液体培养基稀释至100 ml，混匀，作1∶100的供试液。
2.3 微生物计数方法适用性试验
2.3.1 平皿常规法
2.3.1.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶10的供试液5份，每份100 ml，分e加入金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注胰酪大豆胨琼脂培养基，凝固，30～35℃中培养≤3 d，计数。
霉菌和酵母菌总数计数：取1∶10的供试液2份，每份100 ml，分别加入白色念珠菌、黑曲霉试验菌液适量，振摇均匀，使每毫升供试液含菌量≤100 cfu。取1 ml注入平皿中，平行制备2份，立刻倾注沙氏葡萄糖琼脂培养基，凝固，20～25℃中培养≤5 d，计数。
2.3.1.2 供试品对照组 取1∶10的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液，同试验组操作。
2.3.1.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下方法操作，加入试验菌液并进行微生物回收试验。
2.3.1.4 计算 各菌株的回收率（R）=（试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数）/菌液组的平均菌落数×100%[5-6]，依据《中国药典》2015年版四部规定，比值R应为0.5≤R≤2[7-9]（表1）。
2.3.2 平皿稀释法
2.3.2.1 试验组 需氧菌总数计数：取1∶100的供试液5份，每份100 ml，按“2.3.1.1”项下方法操作。
霉菌和酵母菌总数计数：采用平皿常规法R为0.5～2，所以不再进行稀释法研究。
2.3.2.2 供试品对照组 取1∶100的供试液，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。
2.3.2.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶100的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液并进行微生物回收试验。
2.3.2.4 计算 按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表2。
2.3.3 薄膜过滤法
2.3.3.1试验组 取1∶10供试液10 ml，滤过，取pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液200 ml，分2次冲洗滤膜，在第2次冲洗中加入相应的菌液适量（含菌量≤100 cfu），滤过，取出滤膜，需氧菌检查将膜贴于胰酪大豆胨琼脂培养基中，在30～35℃下培养，≤3 d，霉菌和酵母菌检查将膜贴于沙氏葡萄糖琼脂培养基中，在20～25℃下培养≤3 d。
2.3.3.2 供试品对照组 取1∶10供试液10 ml，以pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液代替菌液同试验组操作。
2.3.3.3 菌液对照组 取胰酪大豆胨液体培养基代替1∶10的供试液，按试验组项下操作方法加入试验菌液，同时进行微生物回收试验。
2.3.3.4 计算 按“2.3.1.4”项下公式计算，结果见表3。
由表1～3可知，乌芪舒筋通络片需氧菌总数计数检查采用平皿稀释法、薄膜过滤法，霉菌和酵母菌计数检查采用平皿常规法、薄膜过滤法，R均在0.5～2内，符合《中国药典》2015年版四部微生物学限度检查验证的要求。考虑到实际操作中，平皿常规法、平皿稀释法操作简便，优于操作繁琐的薄膜过滤法，故需氧菌总数计数法可选用培养基稀释法，霉菌和酵母菌总数计数检查选用平皿常规法为最佳方法。
2.4 控制菌适用性试验
2.4.1耐胆盐革兰阴性菌检查验证试验
取1∶10供试液适量，混匀，20～25℃培养2 h，作为预培养供试品。取预培养供试品3份，每份10 ml，分别加入10 ml肠道菌增菌液体培养基，第1份加入1 ml缓冲液作为供试品组，第2份加入1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml）作大肠埃希菌阳性对照组，第3份加入1 ml铜绿假单胞菌（含菌量≤100 cfu/ml）作为铜绿假单胞菌阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基10 ml，加入10 ml肠道菌增菌液体培养基及1 ml缓冲液，作为阴性对照组。于30～35℃培养24～48 h，划线接种到紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基的平板上，30～35℃下培养18～24 h，观察菌落形态，结果见表4。
2.4.2大肠埃希菌检查验证试验
取1∶10供试液2份，每份10 ml，分别加入到100 ml胰酪大豆胨液体培养基中，第1份加入1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1 ml大肠埃希菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组；另取胰酪大豆胨液体培养基110 ml，加入1 ml缓冲液，作为阴性对照组，均于30～35℃中培养18～24 h。
取以上培养物1 ml加入到100 ml麦康凯液体培养基中，在42～44℃下培养24～48 h。然后划线接种于麦康凯琼脂平板上，在30～35℃下培养18～72 h，观察菌落形态，结果见表5。
2.4.3沙门菌检查验证试验
取1∶10供试液2份，每份100 ml，第1份加入1 ml缓冲液，混匀，作为供试品组，第2份加入1 ml沙门菌（含菌量≤100 cfu/ml），混匀，作阳性对照组。另取胰酪大豆胨液体培养基100 ml，加入1 ml缓冲液，作为阴性对照组，在30～35℃下培B18～24 h。然后分别取培养物0.1 ml，接种至10 ml RV沙门增菌液体培养基中，在30～35℃下培养18～24 h，取少量RV沙门增菌液体培养物，划线接种于木糖赖氨酸脱氧胆酸盐琼脂的培养基上，在30～35℃下培养18～48 h，用接种针挑选疑似菌落，进行斜面和高层穿刺接种于三糖铁琼脂培养基上，于30～35℃中培养18～24 h，观察菌落形态，结果见表6。
由表4～6可知，控制菌检查采用直接接种法，即可达到要求。
3讨论
2015年版与2010年版《中国药典》相比[10-11]，微生物计数法适用性试验，从对细菌总数作方法适用性检查，变成对需氧菌总数作方法适用性试验，试验菌株3种变为5种；培养基由胰酪大豆胨琼脂替代营养琼脂，用于检查需氧菌，沙氏葡萄糖琼脂培养基代替玫瑰红钠培养基，用于检查霉菌与酵母菌，虽然增加了试验的工作量，但却具有良好的广谱性，提高检出率，方法更灵敏[12]。对控制菌的检查，新版删除了大肠菌群的检查，新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查[13]，对含有药材粉末的固体口服给药制剂都必须检查沙门菌，提高了对致病菌控制的要求。
乌芪舒筋通络片处方药味中多种成分含有抗菌活性[14-15]，由实验可知，对需氧菌具有抑制作用，故需氧菌总数计数检查时采用常规平皿法回收率较低，需选用平皿稀释法或薄膜过滤法。
在实际工作中，匀浆仪打碎样品时，经常出现泡沫，往往对验证结果造成影响，待泡沫消除后再加入菌种，基本能消除由操作引起的影响。
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微生物研究方法范文4
【关键词】:维C银翘片 微生物限度检查 回收率 冲洗量 方法学验证
【中图分类号】R286.0 【文献标识码】A 【文章编号】1007-8517(2008)07-0044-02
维C银翘片具有辛凉解表,清热解毒的功能[2]｡临床用于流行性感冒引起的发热头痛､咳嗽､口干､咽喉疼痛｡当建立药品的微生物限度检查法时,应进行方法的验证,以确认所采用的方法适合于该药品的细菌､霉菌及酵母菌数的测定及控制菌检查[3]｡本文通过接种代表性的五株阳性菌株,采用常规法､稀释法､薄膜过滤法进行微生物限度检查方法学验证实验,为该样品建立了微生物限度检查方法｡
1仪器与材料
1.1仪器HTY-2000A集菌仪(杭州高得医疗器械有限公司);开放式集菌器(北京牛牛基因技术有限公司,批号:20051005)｡
1.2样品维C银翘片(云南雄业制药有限公司,规格/片,批号050301 050401 050412)
1.3 培养基和试剂硫乙醇酸盐液体培养基(批号, 040212), 改良马丁液体培养基(批号,0507062), 改良马丁琼脂培养基(批号,050520), 玫瑰红钠琼脂培养基(批号,030710), 营养肉汤培养基(批号,050508), 营养琼脂培养基(批号,050328),胆盐乳糖增培养基(批号,0504192),北京三药科技开发公司｡
1.4菌种大肠埃希菌(Escherichiacoli)[CMCC(F)44102]､枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis)[CMCC(B)63501]､金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)[CMCC(B)26003]､白色念珠菌(Candidaalbicans)[CMCC(F)98001]､黑曲霉(Aspergillusniger)[CMCC(F)98003](中国药品生物制品检定所提供)
2方法
按中国药典2005版一部微生物限度检查法(附录XⅢ C)[4]进行实验｡
2.1菌液制备取经34℃培养18~24h,大肠埃希菌､金黄色葡萄球菌､枯草芽孢杆菌肉汤液体培养物1mL,加入9mL0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-5~10-7备用;取经24℃培养18~24h的白色念珠菌液体培养物1mL,加入9mL0.9%氯化钠溶液中,10倍稀释至10-6备用;取经培养一周的黑曲霉菌斜面物,加0.9%氯化钠溶液3mL,洗下孢子,转移至另一空管,标准比浊后,取1mL加入0.9%氯化钠溶液中10倍稀释至10-4备用｡
2.2 菌液的检验取上述金黄色葡萄球菌､枯草杆菌､大肠埃希菌10-5~10-7稀释液各1ml,用45℃营养琼脂培养基20ml注皿, 各平行测定两皿,30~35℃培养48小时, 计数, 应约为50~100cfu/ml;取上述白色念珠菌10-5~10-6稀释液及上述黑曲霉菌10-4孢子悬液各1ml,用45℃玫瑰红钠琼脂培养基20ml注皿, 各平行测定两皿,23~28℃培养, 逐日观察计数, 应约为50~100cfu/ml｡结果见表1｡
2.3供试液制备取样品10mg,加pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液100ml,用匀浆议混匀,作为1:10的供试液｡
2.4 回收率的测定
2.4.1 细菌数霉菌数常规法测定试验组:取1:10供试液1ml､50~100cfu试验菌同时加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果｡菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)｡
供试品对照组:取1:10供试液1ml加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果,测定供试品本底菌数
2.4.2 细菌数霉菌数稀释法测定试验组: 取1: 10供试液0.2ml/皿､50~100cfu 试验菌同时加入平皿中,立即倾注琼脂培养基,待凝固后,置规定温度培养24~72小时逐日观察结果｡
菌液组:测定每一菌株所加的试验菌数(同菌液检验)｡
2.4.3 细菌数霉菌数薄膜过滤法测定取1:10的供试液1ml,注入开放式滤器(先用少量缓冲液润湿滤器),用pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液冲洗滤膜,每次100ml共4次(每次充分振摇滤器,总冲洗400ml),留有少量缓冲液加1ml(50~100cfu) 试验菌混匀, 抽干后, 取出滤膜菌面朝上贴入规定琼脂平板培养基中,置规定温度培养48小时,结果见表2
2.5 回收率的计算按如下公式计算试验组的加菌回收率:试验组的加菌回收率=试验组的平均菌落数-供试品对照组的平均菌落数供试品对照组的平均菌落数×100%
2.6 控制菌检查方法的验证2.6.1 常规法:取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml,置35℃培养24小时;取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基,同时加入金黄色葡萄球菌液1ml,置35℃培养24小时,作为阴性菌对照组｡另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml, 置35℃培养24小时; 取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24小时,作为阴性对照｡
3结果与讨论
讨论: 从表2､表3知: 常规法对大肠埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,对金黄色葡萄球菌回收率底于70%,对枯草杆菌回收率为0;稀释法对金黄色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大肠埃希菌回收率均高于70%,对枯草杆菌回收率还是为0,说明采用稀释法还不能消除样品的抑菌活性薄膜过滤法对5株阳性试验菌株回收率均达到了100%,采用薄膜过滤法可以消除该供试品的抑菌活性｡
4结论
本样品通过接种5株阳性试验菌株进行方法学验证,通过进行三次平行实验,验证了其方法的有效性和可靠性,建立了维C银翘片微生物限度检查的方法: 细菌数需采用薄膜过滤法(用2.6.1 常规法:取1:10供试液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml,置35℃培养24小时;取pH7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液10ml加入100ml胆盐乳糖培养基,同时加入金黄色葡萄球菌液1ml,置35℃培养24小时,作为阴性菌对照组｡另取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中,同时加入上述大肠埃希菌液1ml, 置35℃培养24小时; 取1:10供试液1ml加入10ml胆盐乳糖发酵培养基中置35℃培养24小时,作为阴性对照｡
3结果与讨论
讨论: 从表2､表3知: 常规法对大肠埃希菌､白色念珠菌､黑曲霉回收率高于70%,对金黄色葡萄球菌回收率底于70%,对枯草杆菌回收率为0;稀释法对金黄色葡萄球菌､白色念珠菌､黑曲霉､大肠埃希菌回收率均高于70%,对枯草杆菌回收率还是为0,说明采用稀释法还不能消除样品的抑菌活性薄膜过滤法对5株阳性试验菌株回收率均达到了100%,采用薄膜过滤法可以消除该供试品的抑菌活性｡pH7.0氯化钠-蛋白胨缓冲液每筒冲洗400mL)进行测定､霉菌数和酵母菌数可采用稀释法进行测定､控制菌大肠埃希菌采用常规法法进行检查｡
参考文献
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[3]中国药典2005年版[S].一部.2005,附录71.
微生物研究方法范文5
本文提出了一种采用硫酸/盐酸混合溶液分析棉（亚麻）/再生纤维素纤维混纺产品纤维含量的新方法，并着重分析了采用混合酸溶液法测定纤维素纤维和再生纤维素纤维混纺织物纤维含量的优点及试验步骤。
关键词：棉（麻）/再生纤维素纤维；混合酸溶液；含量；试验方法
1引言
目前，国际和国内对于棉（麻）/再生纤维素纤维混纺织物的化学分析方法有多种，例如甲酸/氯化锌法、硫酸法、锌酸钠法等。国内的检测机构对于此类产品的分析多采用GB/T 2910―2009规定的甲酸/氯化锌法，该方法适用范围较广，但测定过程复杂，影响因素诸多，例如试验用溶液配制、溶液保存、溶解温度、溶解时间、修正系数等。各条件对最终结果的影响程度不一，在实际试验过程中较难控制，易导致试验结果不准确甚至错误。而本文提出了一种采用硫酸/盐酸混合溶液分析棉（亚麻）/再生纤维素纤维混纺产品纤维含量的新方法――混合酸溶液法，这种方法克服了上述方法的不足，且测试结果准确可靠。
本文重点分析了混合酸溶液法测定棉（麻）/再生纤维素纤维混纺织物纤维含量的试验原理与方法。其中再生纤维素纤维包括粘纤、莫代尔、莱赛尔三种再生纤维素纤维。
2原理
用硫酸/盐酸混合酸溶液把粘纤、莫代尔、莱赛尔从已知干燥质量的混合物中溶解去除，收集残留物，清洗、烘干和称重；用修正后的质量计算其占混合物干燥质量的百分率，并由差值得出再生纤维素纤维的质量百分率。
3试验
3.1标准
FZ/T 01057.4―2007纤维鉴别方法：溶解法；AATCC 20A.12.3：59.5%硫酸法。
3.2试样
纯棉筒子纱线、纯亚麻筒子纱线、不同比例的浅色棉（亚麻）/再生纤维素纤维混纺试验样品。
3.3设备
电热鼓风烘箱、水浴恒温振荡设备、真空抽滤装置、0.0001电子分析天平、量筒、密度计、称量瓶、三角烧瓶、烧杯、玻璃砂芯坩埚、干燥器、生物显微镜。
3.4试剂
36%~38%盐酸（分析纯）；
70%（m/m）硫酸：98%（m/m）的硫酸312.5 mL倒入230 mL的蒸馏水（三级水）中搅拌均匀即可；
混合酸溶液：70%（m/m）硫酸20 mL与35%（m/m）盐酸800 mL充分混合均匀即可；
1%（m/m）稀氨水：取50 mL氨水（试剂5）加水845mL稀释即可。
3.5试验步骤
3.5.1纤维修正系数d
取100 mL硫酸/盐酸混合酸溶液于250 mL具塞三角烧瓶中，放置在23℃~25℃的恒温水浴中。分别取质量为m0经预处理的纯棉筒子纱线、纯亚麻筒子纱线样品放入上述溶液中，振荡25 min~30 min。
用真空装置抽吸过滤上述溶解液，把残留物移回具塞三角烧瓶中用同温度同浓度的50 mL硫酸/盐酸混合酸溶液充分振荡、洗涤，并用真空装置抽吸过滤。
把残留物重新移回具塞三角烧瓶中用同温度蒸馏水充分振荡清洗，抽吸过滤，然后用1%（m/m）稀氨水中和清洗并使残留物浸没于溶液中10 min，再用常温的蒸馏水充分清洗，真空抽吸过滤，直至采用pH试纸测试试样呈中性，把剩余残留样品烘干、冷却，称重记为m。纤维修正系数计算公式如公式（1）所示，结果记录如表1所示。
由表1可知，硫酸/盐酸混合溶液对于棉、亚麻纤维的质量修正系数分别为1.05、1.10。
3.5.2样品测试步骤及验证结果
取质量为m0（m0 ≥1.00 g）经预处理的待测样品放入100 mL硫酸/盐酸混合酸溶液中，按照3.5.1的方法进行试验，剩余残留样品的质量记为m1，纤维含量计算公式如公式（2）所示。
其中：P――不溶组分净干质量百分率，%。
棉/再生纤维素纤维混纺织物纤维含量与亚麻/再生纤维素纤维混纺织物纤维含量验证结果分别如表2、表3所示。
表2棉/再生纤维素纤维混纺织物纤维含量测试结果
表3亚麻/再生纤维素纤维混纺织物纤维含量测试结果
由表2、表3可知：对于各种棉（亚麻）/再生纤维素纤维的混纺产品纤维含量测得值与设计混纺比例的偏差均小于1%，符合FZ/T 01053―2007的规定。
4结论
1）对于各种混纺比例的棉、亚麻/再生纤维素纤维产品，硫酸/盐酸混合酸溶液法测得的含量结果与实际混纺比例偏差均在FZ/T 01053―2007规定的允许偏差范围内，可满足检测需求。
2）此方法所用溶剂配制过程简洁、安全，且试样溶解过程影响因素较少，溶解温度、时间易控制，结果稳定性良好。
微生物研究方法范文6
【关键词】微生物采油技术 微生物 发展
1 微生物采油技术概述
1.1 微生物采油的涵义及分类
微生物采油技术是指将筛选的微生物或微生物代谢产物注入油藏，经微生物的生命活动或代谢产物的某些特性作用于原油，改变原油的某些物化特性，从而提高原油采收率的技术。根据实施过程与方法的不同，分为地上微生物采油技术与地下微生物采油技术。地上微生物采油技术是指在地上经微生物发酵工程研制、生产微生物的某种代谢产物注入油藏而提高原油采收率。即利用优良微生物在地上发酵生产采油制剂的技术。目前，广泛应用的有微生物多糖和微生物表面活性剂。地下微生物采油技术将在地上模拟油藏条件筛选的微生物菌种与营养物注入油藏，微生物在油藏中运移，生长繁殖产生多种代谢产物，作用于原油而提高原油采收率； 或用生长繁殖的菌体细胞及代谢产物封堵贮油岩层大的孔道，调整水驱油剖面；或将营养物注入油藏，激活油藏内的原生微生物生命活动提高原油采收率。由于地上微生物采油技术，存在纯种发酵，产品单一，且成本较高，因此，相比之下地下微生物采油技术更有发展前景。
1.2 微生物采油技术的现状与发展趋势
2009年，“世界石油微生物技术大会”于尼日利亚召开，微生物采油技术进一步引起了世界的关注。早在1926年，微生物采油的想法就已经提出，上世纪中叶美国与苏联成功的进行了微生物采油实验。我国的微生物采油技术起步较晚，大约在上世纪60年代开始了微生物炼油的研究，经过多年的努力，在这一方面的研究取得了较大的成就。直到现在，全国多个油田都开展了微生物炼油技术的应用，取得了明显的效果。对于石油微生物遗传学研究，目前已经建立了细菌以烷烃、奈和水杨酸、甲苯和二甲苯三类典型烃类物质生长的遗传学模型。在高粘采油机理的研究方面，筛选高粘性优良菌种，探讨高粘性采油机理。成为了急需解决的技术难题。各国的研究结果表明，微生物提高采收率技术在成本上很有优势，有着极大发展空间。微生物采油十分环保，比起其他的采油方式对环境的污染很小，不会对环境造成2次污染，不会对人体健康带来威胁，这一种绿色工艺。由此可见，微生物采油技术将会有更好的发展前景，为人类的发展做出一定的贡献。
2 微生物采油技术机理
2.1 微生物改变原油结构
微生物生长代谢能降解原油的重组分变成轻组分 ， 产生的 CO2、 H2、 N2、 CH4等气体增加油层压力 ，细菌对油层直接作用，在贮油岩石表面生长繁殖，占据孔隙空间而驱出孔隙中的原油，降低原油中的某些组分而降低原油粘度，从而使其流动性变好。
2.2 微生物改变驱油环境
微生物生长代谢产生能促使油释放的代谢产物，如低分子量的醇、有机物、生物表面活性剂等，使油水界面张力降低，从而使原油从岩石中释放出来，从而提高采收率；溶剂性产物可溶解原油，生成的CO2、 H2、CH4等小分子产物可起到溶解驱油的作用；微生物可以产生有机酸，增加孔隙度，提高渗透率，增加油层压强等使其更容易开采出来；微生物代谢产生的生物聚合物可控制液体流动，或者形成选择性封堵。
3 微生物采油技术的方法及优缺点
3.1 微生物采油技术方法
用于微生物采油的微生物必须是厌氧或兼性厌氧型微生物；这内微生物在油层高温、高压、高盐等极端环境下能正常生长繁殖并产生代谢；大多数采油微生物能以烃类作为碳源，并能以贮油层内的无机盐作氮源或作营养元素；采油微生物必须与其注入油层的环境条件相配伍相适应。微生物采油技术根据实施过程与方法的不同，分为地上微生物采油技术与地下微生物采油技术。另外也可以分为微生物采油方法分为生物工艺法与微生物地下发酵提高采收率法。采油界普遍认为，地上微生物采油技术实施的是微生物纯种发酵，产品单一，且成本较高。如将筛选的微生物混合菌种或单一菌种，注入贮油岩层，在贮油岩层这个巨大的天然的发酵罐中生长繁殖，产生多种代谢产物，菌体细胞和多种代谢产物联合作用于原油，改变原有的某些物化性能，提高原油采收率。所以地下微生物采油技术是较地上微生物采油技术更先进的高新技术，有着更广阔的开发应用前景。现正推广应用。鉴于地下微生物采油技术解决的技术性问题不同，采用的方法及工程实施不同，近30―35年在世界范围内开展的地下微生物采油现场试验及应用主要分成六大类：微生物清蜡处理法、单井增产微生物处理法、微生物驱油法、微生物压裂液压裂法、激活油藏微生物群落发和微生物选择性封堵法。
3.2 微生物采油技术的优缺点
3.2.1微生物采油技术的优点
微生物采油技术的优点：首先它对环境的污染较小，不会伤害人类的身体健康。其次这项技术与其他技术相比，成本更低，更加经济。再者微生物采油工艺工程十分简单，所需设备与其他技术相比更是简单的多。微生物采油的方向广，使用与重质油、轻质油等各种类型的原油。最后微生物一起体积优势，能够达到其它技术多不能达到的死角。
3.2.2微生物采油技术的缺点
微生物采油技术的缺点：首先微生物采油技术不能在冬季施工，这将有碍有采油量，给企业带来一定的损失。其次微生物产生的生物聚合物可能产生沉淀，影响采油的正常进行。再者在重金属含量、温度较高及盐度较大的情况下，微生物很容易遭到破坏。最后微生物的施工条件很难恰当的把握。
4 结论
生物技术在国外一直是热门，随着生物技术的发展，微生物采油技术日趋成熟，我国的对生物技术的重视程度及在生物技术上的发展与国外相比还有很大的距离，但本世纪以来，生物技术在我国得到了极大的发展。生物技术极其的有用，而微生物采油更是重中之重，它不仅缓解了国际石油压力，还降低了石油价格，减轻消费者的经济压力。如此重要的一门技术，需要更加广阔的发展空间，其必将为人类带来巨大的财富。
参考文献
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