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细胞生物学常用研究方法范文1
关键词：细胞生物学 实验 教学改革
中图分类号：G642 文献标识码：A 文章编号：1673-9795（2014）01（a）-0104-02
细胞生物学是生命科学领域至关重要的基础学科。近年来，随着新理论、新概念、新技术的不断涌现，细胞生物学发展非常迅速。细胞生物学实验是细胞生物学的重要组成部分，但目前细胞生物学实验教学普遍滞后于理论课[1～2]。为了使细胞生物学实验教学质量上一个新台阶，我校对细胞生物学实验教学进行了改革与初步实践。在此，我们从课程内容安排调整，实验教学手段多样化和实验考核体系多元化三个方面进行阐述，以期为其他院校的细胞生物学实验教学的改革提供参考。
1 实验课程安排调整
传统的细胞生物学实验主要是以验证型实验为主，实验内容单一，不能激发学生的学习兴趣，不利于学生综合素质和创新能力的培养。传统的细胞生物学实验还存在学时过少，上课时间与理论课脱节的问题。鉴于以上原因，细胞生物学实验的课程内容和上课时间需要进行重新调整。
1.1 课程内容调整
实验学时由原来的32学时增加为48学时，实验内容由原来单一的验证型实验被调整为包括验证型、综合型和创新设计型三种类型的实验（见表1）。
1.1.1 调整验证型实验
基础性验证型实验的开设是为了巩固理论知识和基本实验操作技能的锻炼，因此，我们保留并重新调整了验证型实验。细胞形态结构和大小测量的实验被融入细胞培养实验中，小鼠巨噬细胞吞噬的观察实验被融入细胞吞噬与融合实验。DNA的Feulgen染色法和PAS反应法显示糖原及其它多糖都运用了细胞免疫化学方法，仅保留其一。为了学习不同细胞器的具体分离方法，线粒体的提取与观察实验被扩展为叶绿体和线粒体的提取与观察实验。
1.1.2 开设综合型实验
综合实验涉及了多种实验技术，系统化的综合实验有利于锻炼学生的综合素质[3]。细胞培养及细胞吞噬与融合被定为综合型实验。在细胞培养实验中，培养材料为配对的正常细胞与肿瘤细胞，实验涉及了细胞培养液的配制，细胞的复苏、培养和冻存，以及细胞形态的观察，大小测量和计数等技术。学生通过正常细胞和肿瘤细胞的比较，为学瘤细胞的基本特性提供了感性认识。在细胞吞噬和融合实验中，选择鸡红细胞为材料。以吞噬百分数和吞噬指数为指标，增加不同处理对小鼠巨噬细胞吞噬功能的研究；以聚乙二醇为诱导剂，研究不同的细胞密度、融合温度、乙二醇浓度及反应时间对细胞融合率的影响，筛选鸡红细胞融合的优化条件。
1.1.3 增加创新设计实验
最后，我们结合细胞生物学教研室中教师的科研工作，开展了创新设计实验，进一步培养学生的创新和科研能力[4]。首先，各实验小组学生根据设计实验的大方向查阅国内外文献后进行选题并完成实验设计。然后，按照小组阐述，学生发表意见，指导教师归纳总结的流程，对实验设计进行论证。最后，学生对实验设计进行修改和完善后，亲自进行实验前的准备及操作。
1.2 上课时间调整
为了配合细胞生物学理论知识的学习，细胞生物学实验的上课时间被调到与细胞生物学理论课同一个学期进行，而且从该学期的第四周开始实验，此时学生刚刚结束了细胞生物学第三章内容《细胞生物学研究方法和技术》的学习，对于常用的方法有了理论上的知识，有利于理解和掌握实验的内容。
2 实验教学手段多样化
目前，飞速发展的信息技术正以惊人的速度进入到教学的各个领域和环节，推动着教育教学的深刻改革。细胞生物学实验教学手段多样化的改革也离不开信息技术，需要现代教育技术的支持。
2.1 采用用多媒体技术
传统的实验课教学停留在黑板和挂图上，受时间和空间限制，难以调动学生学习的积极性。我们采用多媒体进行教学，提供了大量图表和图片以及动画，增加了教学信息量。多媒体教学优化了教学过程，充分调动了学生的积极性，提高了教学效率和教学效果。
2.2 介绍科学文献
细胞生物学实验操作技术是为科学研究服务的，教师在实验开始时展示与开设实验技术相关的3～5篇中外文科学文献，注重介绍文献中的实验方法，总结实验方法的进展，让学生了解实验方法的最新动态[5]。
2.3 利用网络教学平台
网络教学突破了传统教学中以“课堂、课本、教师”为中心的教学模式，能够更快捷和有效的进行信息交流，提高了学生的学习效率。通过实践和调查，学生通过网络平台主要解决了以下问题：第一，学生通过浏览网站，可以更有效的进行预习和复习；第二，学生在教学网络中的实验经验交流论坛中，通过交流实验心得加深了对实验的理解和掌握；第三，教学网站中提供了专业网站链接，便于学生充分利用网络资源，有利于培养学生的创新精神和创造能力。
3 实验考核体系多元化
传统的实验成绩基本上是根据学生的实验报告给定的，实验报告以学生抄写实验目的、原理、过程为主，不能体现出学生的实验操作能力和掌握能力，不利于学生良好实验素质和严谨科学态度的培养和形成。因此，实验考核系统的改革势在必行，我们采用不同的实验考核内容和不同的考核方式，即多元化考核体系进行考核。
3.1 基于实验类型的考核体系
根据基础性验证型、综合型和创新设计型实验各自的特点，我们建立了基于实验类型的考核体系，具体实验考核如下分配。
其中，基础性验证型实验注重考核学生的平时操作及实验结论，综合型实验注重学生的实际操作能力（占80%）。实验报告包括以下两方面的内容：第一，对实验结果的记录和分析。随堂记录实验结果可以促进学生对实验操作的重视；第二，通过解答实验后的思考题巩固实验内容。创新设计型实验注重对学生的创新能力进行考核，其中的论文写作为以后的毕业论文以及科研论文的写作奠定良好基础。
3.2 网络化考核体系
随着细胞生物学实验教学网络平台的开发，我们在网络平台上建立了考核数据库。对于耗时时间长的实验，教师让学生观看录像，然后提出问题进行考核。对于切片观察的实验，让学生对在网络平台上随机抽到的图片进行解释。此外，学生可利用计算机进行实验设计，完成对其创新能力的考核。
4 结语
在细胞生物学实验教学的改革中，我们通过对实验课程的内容及上课时间进行重新调整安排，借助多媒体技术、科研文献的介绍和网络平台等实现教学手段多样化，利用基于实验类型及网络的考核体系进行考核，充分调动了学生学习的积极性和主动性，提高了学生的科研和创新能力。
参考文献
[1] 张晓云，周汝滨，李永泉.《医学细胞生物学》教学改革的实践与思考[J].广东医学院学报，2004，22（1）：30-31.
[2] 张俭，刘胜贵.《细胞生物学》实验课程的教改探索[J].黔东南民族师范高等专科学校学报，2005，23（3）：71-72.
[3] 孙瞄，毛泽善，穆灵敏，等.开设细胞生物学综合实验的改革与探索[J].实验室科学，2006，4（2）：14-15.
细胞生物学常用研究方法范文2
[关键词]外泌体;分离;鉴定;差速离心法
中图分类号：TU755 文献标识码：A 文章编号：1009-914X（2016）24-0193-01
近年来，越来越多的证据表明外泌体对于细胞生物学以及医学研究方面具有重要的价值，而由于外泌体的体积结构方面的因素，其分离纯化还存在很大的困难，目前比较常用的分离方法有差速离心法、密度梯度离心法、超滤离心法、免疫磁珠法、多聚物沉降法等。
1.差速离心法
陈绍倩[1]等人以白血病细胞系K562细胞为材料，采用多步离心的方法成功地提取到了的外泌体。此种实验方法操作不是很复杂，实验设备要求相对简单，拥有超速离心机和细胞培养设备即可，是一种比较简便的提取外泌体的方法，基本可以满足实验研究的要求。但分离纯度不是很高，并且经过多次离心对外泌体的理化性质造成一定的影响。
2.密度梯度离心法
像所有的脂质小囊泡一样， 外泌体悬浮于特定密度梯度的蔗糖中，其密度范围从 1.13g/ml到1.210g/ml，将细胞混悬液或匀浆置于蔗糖介质的顶部，通过重力或离心力场的作用使细胞分层、分离，从而将外泌体从混杂的物质如蛋白聚集物或细胞凋亡的核小体碎片等中分离出来[2]。崔焱[3]等人根据其这一特性，从大量培养的肿瘤细胞上清中分离纯化外泌体，并对此进行了电镜鉴定;在得到大量较高纯度的外泌体的基础上，将其加入含有白细胞介素-2（1L-2）的淋巴细胞培养体系中，观察其对淋巴细胞增殖的影响。
3.超滤离心法
王伟[4]等人以树突状细胞为实验材料，基于对外泌体物理特性，大小以及密度的了解，将超滤离心分离外泌体的方法与传统的分级离心法进行了比较，通过实验证明超滤离心法耗时少，产量和纯度都得到了很大程度的提高，是一种比较高效的制备外泌体的方法。
4.免疫磁珠法
将具有磁性的磁珠表面包被特殊的抗体，细胞表面抗原能与连接有磁珠的特异性抗体结合，在外加磁场中，通过抗体与磁珠相连的细胞被吸附而滞留在磁场中，无该种表面抗原的细胞由于不能与磁珠结合而不能在磁场中停留，从而使细胞得以分离。Richard Wubbolts[5]等人在对外泌体进行蛋白质组学和生化分析的过程中，将外泌体的标志性蛋白―抗MHCII抗体包被于磁珠表面，通过抗原抗体特异性识别的特性有效的将外泌体分离出来。
无论采用哪种方法进行分离，如果想对其进行系统的研究都必须首先确定分离得到的产物是不是外泌体，其次要鉴定外泌体是否达到实验所要求的纯度和数量。因此，外泌体的鉴定是必不可少的。目前，常用的鉴定方法主要有电子显微镜观察、动态光散射技术、Western blot、纳米颗粒跟踪分析技术等。
其中电子显微镜观察法是从形态和大小上对外泌体进行鉴定，但由于电镜拍摄视野有限，因此这种方法只能对个别外泌体进行观察。而动态光散射技术则是从整体上对外泌体大小的分布情况进行检测，具有准确、快速、可重复性好等优点，但对于多分散的复杂外泌体样本的测量还存在一定的问题。Western blot则是通过抗原抗体特异性结合的原理，对外泌体中的标志蛋白进行检测，从蛋白质组学方面对外泌体进行鉴定。
随着科学技术的发展，纳米颗粒跟踪分析技术逐渐成为外泌体鉴定的新技术，不但可以实时对外泌体进行观测，同时还可以对每个颗粒的布朗运动进行追踪和分析，从而计算出外泌体半径和浓度。
外泌体作为细胞间物质信息的传递者，在细胞生物学以及分子生物学领域中，扮演着越来越重要的角色。因此，提高外泌体的分离纯度，改进外泌体的分离方法尤为重要。目前，虽然外泌体的分离与鉴定已经拥有系统的理论基础，但实际操作起来依然存在很多困难，无论是哪种方法，都有各自的优点和缺点，因此只有将各个方法有效的结合起来，例如差速离心法与免疫磁珠法、电镜法与Western blot结合使用，才能达到更好的分离鉴定效果。
参考文献：
[1] 陈绍倩，杜英，王 鑫，顾巧丽，黄玉敏，董子明.多步离心法提取K526细胞外泌体.郑州大学学报（医学版） ，2006，41（3）.
[2] Thery C，Zitvogel L，Amigorena S.Exosomes：composition，biogenesis and function.Nat Rev Immunol，2002，2：569-579.
[3] 崔焱，于津浦，李慧，杨莉莉，魏枫，安秀梅，任秀宝.肿瘤细胞来源胞外体的分离鉴定与功能检测.天津医药，2009，37（12）.
细胞生物学常用研究方法范文3
[关键词]体细胞；核移植；克隆；表观遗传重构
[中图分类号]Q819 [文献标识码]A [文章编号]2095-0616（2016）05-40-04
一直以来研究人员普遍认为只有通过卵子和相互结合形成受精卵，随着受精卵的不断分化，最终才能发育成为一个新的生命，但在这个过程中，受精卵细胞同时也将逐渐地失去其发育成为完整后代的能力，把受精卵细胞具备发育成为完整个体的能力称为全能性。体细胞核移植（somatic cell nuclear transfer，SCNT）技术的成功归因于人们对细胞全能性的逐步认识。核移植（NT）就是将动物的体细胞或者早期胚胎卵裂球的细胞核，移植进经去核的发育成熟的卵母细胞的胞质中或受精卵中，得到重构的卵母细胞，然后通过重新激活，恢复其细胞分裂及分化，从而促使其发育成为与供体细胞的基因型完全相同的子代，这一技术也可称为体细胞克隆技术。体细胞核移植技术最早是由德国的胚胎学家Spemann 1938年提出的，他起初提出这个理论，主要是为了研究细胞核全能性的机制以及在胚胎发育的过程中细胞质与细胞核的相互作用机理。直到1952年Briggs和King按照他的理论，首次成功地进行核移植试验，他们首先将非洲爪蟾的卵子去除其细胞核，然后向其中移植进其囊胚细胞核，从而得到了正常的后代。随着胚胎工程技术的不断进步，人们先后以不同动物的胚胎细胞等作为供体，不断成功地培育出了各种克隆动物，如克隆羊、克隆牛、克隆猪、克隆小鼠以及克隆家兔等。其中最具有标志意义的是1997年Roslin、研究所的Wilmut等，首次在世界上报道了他们利用体细胞核移植技术，用成熟绵羊的体细胞（乳腺上皮细胞）作为核供体，成功地克隆出“多莉”羊，一下在全世界掀起了轩然大波。这一实验充分证明了高度分化的体细胞仍然具有全能性，人们可以利用体细胞，通过体细胞移植技术获得基因型与供体细胞基因型基本相同的子代个体。成为了生物学以及遗传学发展史上一个重要的里程碑事件。家兔是生物医学研究中最常用的实验动物之一。利用体细胞核移植技术生产克隆兔子是目前研究的热点，在生物医学领域具有十分诱人的应用前景。而家兔被认为是利用体细胞核移植技术难以成功克隆的哺乳动物之一，直到2002年法国学者Patrick Chesne等用卵丘细胞作为核供体首次成功克隆了家兔，突破了家兔难以成功克隆的关键问题，为扩大家兔在生物医学方面的应用研究提供了方法。应用这项技术，2006年我国学者李善刚博士应用成纤维细胞作为核供体成功地培育出克隆家兔，在此基础上他又进一步将转基因技术与体细胞核移植技术结合起来，成功培育出了表达绿色荧光蛋白的克隆兔，将该项技术推向新的高度。
1体细胞核移植的主要方法
具体来讲，体细胞核移植技术主要包括受体细胞的去核、核供体细胞的准备与选择、细胞周期的调控、细胞融合、重组胚胎细胞的激活以及培养等步骤。
1.1受体细胞的选择
在哺乳动物体细胞核移植的实验中，可以作为受体的细胞主要有以下三种：（1）去核的受精卯；（2）去核的MⅡ期成熟卵母细胞；（3）去核的早期胚胎细胞，其中MⅡ期卵母细胞是目前采用较多的核移植受体细胞，因为在这个时期，一方面该细胞体积较大，便于显微操作；另一方面重组胚胎所需要的各种细胞因子在MⅡ卵母细胞质中均存在，而且细胞营养成分充足。在细胞分裂过程中，结合在DNA上的各种细胞因子如转录因子等从DNA螺旋轴上脱离下来，与此同时胞质中的大量重组因子即可与DNA螺旋轴结合，从而促进基因重组的发生。另外一方面，因为选择合适卵龄的卵母细胞作为胞质受体，对体细胞核移植是否能够成功产生巨大的影响，故细胞培养的时间也特别重要，实验中一般多选择培养40～44h，传代4～6代的卵母细胞作为受体细胞。因为大量的实验证明，传代越多重组胚的囊胚率也越多。
1.2受体细胞去核的方法
先要对受体细胞进行去核，才能进行供体核的移植。受体细胞去核必须完全，如果去核不完全，一方面可能导致重组的胚胎细胞染色体形成非整倍体或多倍体从而使克隆直接失败，另一方面也可能使卵母细胞产生异常分裂进而发育受阻甚至可以导致胚胎的早期死亡从而使克隆最终失败。所以是否完全使卵母细胞去核，是保证核移植所形成的新的胚胎细胞能否发育成为正常个体的前提条件。为了减少实验中的干扰因素，可以通过缩短体外操作的时间并快速而准确的去除受体细胞核以避免孤雌发育。大体上受体细胞去核的方法可以分为两种方法，即化学去核法和机械去核法。具体有以下几种操作方法（1）盲吸法：这一方法的优点是不用借助于其他的化学物质，但此法耗费时间较长、易影响细胞质空间结构故对卵母细胞损伤比较严重，所以技术要求较高，不同动物去核率相差也较大，应用较少；（2）半卵法：这个方法是应用特制的卵母细胞切割刀，将卵母细胞切割成为两个半卵，然后丢弃含有极体的那一半半卵细胞，用两个不含极体的半卵细胞与供体细胞核进行融合，构建核移植胚胎。（3）化学试剂去核法：这种方法的原理是利用蔗糖或者脱羰秋水仙碱等化学试剂的作用，使受体细胞能够自行排出第二极体，从而实现去核的目的，但目前还不清楚化学试剂是否对受体细胞造成损伤；（4）挤压法及点压法：此两种方法均是利用固定管固定住细胞，使细胞染色于特定位置，然后挤压透明带，用去核针取出第一极体，再用荧光染料Hoechest33342染色后观察其去核率。点压法是挤压法的改进方法，优点是对卵母细胞胞质的损伤较小，在去核操作的过程中不用更换去核针，节省了时间，有效的提高了去核效率；（5）纺锤体探测技术：此法去除细胞核的方法是将卵母细胞放置于Spindle-view偏振光系统的倒置显微镜下，受体卵母细胞的纺锤体区域较其它部位明亮，从而清楚显示其染色置，而后再用去核针通过显微镜下操作去核，以利于去核的操作准确完全。（6）透明带膨胀辅助去核法：此法是先用去核针吸入适量操作液后稍施正压，使吸入的操作液平缓流出，推进去核管，使透明带逐渐膨胀，然后用去核针将细胞核取出，此法的优点是缩短了去核操作的时间并且显著地提高了去核操作后卵母细胞的生存率。（7）离心去核法：这个方法的原理是根据细胞质的密度小于细胞核，通过离心的方法将没有透明带的细胞核甩向一侧进而脱离卵母细胞。该方法的缺点是必须去除透明带，不利于之后核移植胚胎的发育。
1.3供体细胞选择与核的移植
实验中可用于核供体的细胞很多，主要有胚胎干细胞（ES细胞）、卵丘细胞、颗粒细胞、支柱细胞、细胞、乳腺细胞、神经细胞以及成纤维细胞等，其中最主要的是两种：一是生殖细胞如卵丘细胞，二是胎儿或成年成纤维细胞。影响核移植成败的一个重要因素是受体与供体细胞的细胞周期同步化发育，早期的研究认为要使体细胞核移植成功必需使供体细胞处于GO期，获得GO期细胞主要是通过两种方法：选择细胞类型或者人工诱导的方法。Inoue等研究人员在小鼠的核移植实验中发现，移植的效率较大的受到供体细胞的细胞类型以及其基因型的影响。近年来许多科研人员通过实验发现把没有经过休眠诱导的处于细胞周期中G1期、G2期以至于M期的细胞作为供体细胞进行核移植也可以获得成功。将供体细胞核移植进入受体细胞的常用方法主要可分为融合法以及注射法两类。其中融合法中目前最常用的是电融合的方法，这是因为电融合的方法具有细胞损害较小、可重复性好而且融合的效果较好等明显的优点，所以逐渐被广大的研究人员所应用。电融合方法的原理是通过细胞在强电场短时间的作用下，使细胞膜产生一过性的击穿，当电流使两个相邻的细胞膜接触的区域发生击穿时，两侧的细胞膜就可以在击穿的瞬间发生接触并融合成为一个细胞。注射法一般分为透明带下注射和胞质内注射。透明带下注射是把整个供核细胞注射至受体细胞卵周隙，这就需要在注射后还需使供体细胞与受体细胞进行融合。胞质内注射一般是用压电一陶瓷微注射系统，直接把供体核注入胞质内。
1.4卵母细胞的激活
因为缺少了受精这一步骤，在以成熟的卵母细胞作为受体的核移植实验中，缺少了自然受精过程中受精卵的激活过程，所以必须进行人工激活核移植后重构的卵母细胞从而促使其进一步分化发育。根据激活时期的不同，可分为移核前激活、移核时激活、移核后激活三种不同的时期。使卵母细胞激活的方法可以分为化学或者物理刺激的方法两类。激活方法目前应用较多的有钙离子载体A23187激活和离子霉素激活、乙醇激活、蛋白质合成抑制剂激活、氯化锶激活、提取物激活、蛋白质磷酸化抑制剂激活以及电脉冲激活、联合激活等。虽然卵母细胞可以被以上的各种化学物质以及物理刺激的方法激活，但是却不可避免地在激活的同时也造成受体细胞一定程度的损害，影响胚胎的发育。所以，是否能够尽快地探索出对卵母细胞损伤较小并且激活效率高的激活方法对体细胞核移植技术最终能否成功尤为重要。
2体细胞核移植技术的应用前景
体细胞核移植技术作为细胞生物学及发育生物学领域取得的最伟大的成就之一，应用前景必然是特别广阔的甚至是我们一时无法估量的！其潜在的经济效益是十分巨大的，随着这项技术的不断发展、逐步完善，必将带来生物学以及医学领域的一场深刻变革。这项技术在生物学方面如在保护濒危动植物物种、新物种的培育、优良畜种培育以及转基因动植物生产方面前景十分广阔。另外，这项技术在医疗卫生领域同样具有巨大的应用潜力和发展前景。尤其在医疗卫生领域，可能为机体损伤修复、器官移植乃至遗传性疾病、老年性疾病的治疗等打下坚实的基础，有着不可估量的作用，所以值得科研人员持续关注并为体细胞核移植技术的不断完善发展付出不懈的努力。
细胞生物学常用研究方法范文4
关键词：药物筛选;分子印迹技术;高通量筛选技术;生物芯片技术;生物信息学技术
药物筛选是应用适当的方法和技术根据特定的目的对药物进行优选的过程。药物的种类很多，从大量的药物中找出对特定疾病有针对性治疗作用的药物是个复杂的过程。传统的药物筛选一般是采用生物学方法，也就是将药物与相应的病原作用，能够有效抑制病原生长或对已有病原有杀灭作用的即为有效药物。然而对于由病毒或细菌引起的具有强传染性的疾病此种方法是一项既繁琐，危险性大又对实验条件要求极高的工作。因此，应建立非生物学方法来替代传统生物学方法。所谓的非生物学药物筛选方法即在不接触传染性病原的情况下进行药物筛选。筛选的方法可以是间接的筛选药物，如分子印迹法、生物信息学法;也可以是获得病原的相应结合靶点来选取有效药物，如高通量筛选技术和生物芯片技术。本文将对非生物学药物筛选方法进行简要综述[1]。
1分子印迹技术
分子印迹技术也叫分子烙印技术或分子模板技术(molecularimprintingtechnique,MIT)，是一种模拟抗原与抗体相互作用的人工生物模板技术。分子印迹聚合物(molecularlyimprintedpolymers，MIPs)也就是由分子印迹技术制备出来的，具有高效、稳定、使用寿命长等优点。在对映体和异构体的分离[2，3]、固相萃取[4，5]、缓控释给药系统[6]、临床药物分析、膜分离技术[7]、模拟酶催化[8]、化学仿生传感器[9]等领域中MIPs都展现了良好的应用前景。MIPs的制备过程为：①在溶剂(致孔剂)中将模板分子和功能单体按照一定比例混合后一定条件下进行反应，通过共价键或非共价键作用形成可逆的模板分子-功能单体复合物;②加入交联剂、引发剂，使模板-功能单体复合物通过聚合反应在模板分子周围形成高交联的刚性聚合物;③将模板分子(印迹分子)从聚合物中洗脱解离出来，这样在聚合物的骨架上便留下了一个对模板分子有“预定”选择性的识别空位。空位中含有精确排列的与模板分子官能团相互补的由功能单体提供的功能基团[10]。分子印迹聚合物中的空位和模板分子形状、大小完全一样,从而实现对模板分子的特异性识别。印迹聚合过程如图1所示[11]。MIT具有分子识别性强、固定相制备简便快速、操作简单、性质比较稳定(耐酸碱、耐高温、高压等)、溶剂消耗量小、模板和MIPs都可以回收再利用等优点。
应用分子印迹技术，根据已筛选出的对相应病原有抑制作用的化合物作为模板建立生物法替代筛选模型。一方面可以避免与病原的直接接触，增强安全性;二是可以在普通实验室进行实验，实验条件要求低;三是有针对性的选择有效药物成分，缩短了筛选时间和实验强度;四是精确有效筛选。如中草药含的化合物结构类型多样，含量悬殊且许多成分是未知的，因此从中分离纯化有效成分是一项费时费力的工作，而且容易丢失微量的有效成分。为了尽快从中草药中寻找出高效的实体药物及各配方的有效成分，以及将中药推向国际市场并从中发现疗效显著的符合欧美市场要求的新药，就可以应用分子印迹技术来达到这个目的。谢建春等[12]以骆驼蓬种籽中抗肿瘤活性化合物哈尔满作为模板,用非共价键法制备了对哈尔满结构类似物哈尔明及哈马灵具有强亲和性的分子印迹聚合物。分离鉴定了骆驼蓬种籽甲醇粗提物中所含的哈尔明及哈马灵两种抗肿瘤活性成分。此实验结果说明了通过分子印迹技术能够有效地对中草药活性成分进行分离。实验还说明了通过分子印迹亲和色谱与质谱联用可以分离鉴定复杂成分中有效成分。这对于筛选已知药物的结构类似物无疑是种简单快速安全的方法。
2高通量药物筛选技术
高通量药物筛选(highthroughputscreening,HTS)是20世纪80年代后期发展起来的一项快速寻找新药的技术。筛选的对象是药物作用靶点，根据待选样品与靶点是否相互作用来判断待选化合物的生物活性。高通量药物筛选技术涉及自动化控制技术、细胞生物学技术、药理学实验技术、分子生物学技术和管理技术以及计算机计算等。随着各学科的发展及相应技术的成熟[13]，高通量药物筛选技术凭借其自动化操作系统和微量灵敏的检测系统，使其筛选速度快、规模大、用量小实现一药多筛。
高通量筛选的体外模型通常有分子水平模型和细胞水平的模型，分子水平模型主要分为受体模型、酶筛选模型和离子通道筛选模型。细胞水平药物筛选模型是以细胞功能为基础的筛选模型。各种模型筛选的原理有3个方面，一是待选化合物与靶点的作用。多数情况下药物与靶点相结合从而产生治疗作用。其作用原理如同受体-配体相互作用。可以与相应受体结合的化合物就有可能是有活性的成分;二是待选化合物对酶活性的影响。生物体内的许多生理生化反应都必须有酶的参与，加入待测化合物的同时测定酶的一些指标，以指标的变化为依据来评价化合物的作用。此种模型相对易于检测，被普遍使用;三是待测化合物对细胞的作用。通过化合物的筛选，了解整体细胞对化合物作用的反应。靶向细胞因子、生长因子、离子通道和G-蛋白耦联受体(GPCR)在细胞水平上的功能性检测中都取得了成功的进展[13]。(i)复合物化(ii)聚合(iii)去模板分子a.模板分子b.聚合前复合物c.聚合后复合物d.模板分子去除后的聚合物图1分子印迹聚合过程示意图据统计高通量药物筛选技术每天可以对数以万计的样品化合物进行筛选，应用得最多的是组合化学库。我国中药资源丰富，许多资源尚未开发。有部分中药及组方治疗作用明确，但大部分作用机理尚不清楚。从而限制了中药的发展及国际化的要求。由于中药有效成分具有多靶点的作用特点，故天然产物库的建立将为高通量药物筛选提供更多更全面的化合物[14，15]，同时中药有效成分的作用机理也会明确。罗弟祥等[16]用PTP1B(蛋白酪氨酸磷酸酶1B)抑制剂高通量筛选模型对17940个植物提取物和其组分进行了筛选，阳性率为2.85%[17]。另外针对肿瘤、2型糖尿病[18]、神经系统疾病、免疫系统疾病和感染性疾病等相关靶点明确的疾病，已经逐步建立和完善了以高通量分子筛选模型为初筛的筛选体系。随着生物化学、分子生物学、细胞生物学、蛋白质组学及基因工程等学科的发展，疾病的发病机理越来越明确。特别是对于一些病毒和病菌，它们的致病靶标也越发的清晰。只要针对相应的靶标进行筛选，就能够很快找到相应的有效药物，这样就可以减少操作的危险性，避免与相应病原直接接触，同时也加快了药物的筛选速度及筛选的精确性[19]。曹鸿鹏等[20]以神经氨酸酶(NA)为抗流感药物的作用靶点建立可用于高通量药物筛选的模型来筛选NA抑制剂，初筛发现12个化合物对流感病毒神经氨酸酶有可重复的抑制活性。高通量药物筛选过程是从药物作用靶点水平筛选药物即只是停留在分子细胞水平，而药物的作用多数是要全面分析。由于药物经过体内循环代谢到达靶点时的浓度及代谢物药效是有变化的，所以必须在筛选之后进行相应的组织器官和整体动物水平的药物筛选来确定药效。
3生物芯片技术
生物芯片(biochip)是指采用光导原位合成或微量点样等方法，将大量生物大分子如核酸片段、多肽分子甚至组织切片、细胞等生物样品以阵列式有序地固化于支持物(玻片、硅片、聚丙烯酰胺凝胶、尼龙膜等载体)的表面，组成密集二维分子排列，然后与已标记的待测生物样品中靶分子杂交，通过特定的仪器对杂交信号的强度进行检测分析来判断样品中靶分子的种类和数量[21]，从而实现对细胞、蛋白质、DNA以及其它生物组分的检测，把生化分析系统中的样品制备、生化反应和结果检测3个部分有机的结合起来，具有快速、高通量、高信息量、平行化、集约化、微型化、自动化、成本低、污染少、用途广等特点[22]。
生物芯片包括基因芯片、蛋白质芯片、芯片实验室(微全分析系统)、细胞芯片以及组织芯片等。另外根据原理还有组件型微阵列芯片、通道型微阵列芯片、生物传感芯片等新型生物芯片。药物通过不同的靶点作用于组织细胞，直接或间接地影响细胞内基因的表达及蛋白质的生成。通过对用药前后两组样品进行表达谱生物芯片检测，就可以反映出该药物作用后相应组织或细胞中基因表达谱及蛋白质等的变化，从而揭示药物的作用。生物芯片技术可以寻找药物靶标、进行毒理学研究、研究药物处理细胞后基因的表达情况、药物分析、中药研究、指导临床个体化用药、抗药性研究、建立生物技术平台等[23]。
托娅等[24]研究基因芯片筛选抗肿瘤血管生成中草药的相关基因，实验结果显示利用基因芯片技术可从基因水平解释中药的作用机制，为新药的开发提供理论依据。LiX等[25]采用微流体芯片技术检测中药成分对白血病细胞的早期细胞毒性，结果表明用此法不但能够缩短药物筛选的周期、降低实验成本而且还能解决传统技术中遇到的颜色和化学干扰问题。生物芯片技术使高通量药物筛选的单靶点单模型模式转变为同时对多靶点进行筛选的新模式，逐渐形成了超高通量药物筛选的概念。由于生物芯片体积小，包含的药物作用靶点多，从理论上讲，生物芯片技术和高通量药物筛选技术相结合，不仅可同时对大量化合物进行生物活性筛选，而且可同时对大量药物作用靶点筛选。随着分子生物学的发展而建立起来的分子水平的药物筛选模型，可以从更深入的层次评价药物的作用，从而可以为许多疑难病症提供新的治疗途径和方法。应用生物芯片大规模的筛选研究可以减少大量的动物试验，缩短药物筛选所用时间，增强实验过程中的安全性，从而带动药物的研究和开发。
4生物信息学技术
细胞生物学常用研究方法范文5
【关键词】兔视网膜色素上皮细胞；体外培养；中药含药血清；制备
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（x）.2013.11.685文章编号：1004-7484（2013）-11-6861-021体外培养兔视网膜色素上皮（retinal pigment epithelium，RPE）细胞
组织培养工作始于1907年，美国动物学家Ross Granville Harrison为解决“神经纤维的起源问题”，而设计出的“一种能在生活状态下直接观察正在生长的神经末端的方法”，即哈里斯悬滴培养法，后经美国医生M.T.Burrows和Alexis Carrel不断的改进和完善，组织培养技术得以迅速发展，作为一种研究组织和活细胞的良好方法，由于其具有的诸多优越性，现已被广泛应用于生物学、医学与药学的各个领域，成为重要的基础科学之一。
视网膜色素上皮位于视网膜的最外层[1]，是由单层六角形的色素上皮细胞所构成，它具有多种复杂的生化功能以及支持光感受器活动的色素屏障功能，并具有对视网膜外层传递来自脉络膜的营养，和对光感受器外节脱落的膜盘及代谢产物进行吞噬的功能，其代谢异常和丧失，可引起视网膜感觉层发生继发性变性改变，甚至导致失明。在组织胚胎学上视网膜色素上皮层由神经外胚叶发育而来，胚胎4周时细胞内出现色素颗粒，至第5周则完全充满其中。体外培养的色素上皮细胞属于贴附生长型细胞，其形态为扁平的多角形，细胞质近中央处有圆形的细胞核，细胞之间紧密相靠、互相衔接，具有连接成片的能力。
1.1取材为了避免细胞的生长，在摘取兔眼时不能通过碘酒消毒，因为碘酒中的碘有抑制细胞生长的作用。另外还要注意将眼球摘除之后要将其放入冰箱当中，放置的时间要在15分钟，并且在放置之前还要进行庆大霉素生理盐水的浸泡，这样在色素上皮分离、视网膜神经分离就比较容易。为了减少碘进入兔眼视网膜的概率，此时应该着重关注眼球内层的色素上皮细胞。这一点很关键。如果发现摘取的细胞生长缓慢，那么在排除了生物因素、物理因素之后就要考虑到这方面的原因。
1.2分离进行上述操作后，我们就要将其分离，此时将眼球球角巩膜缘后的3毫米地方做一环形切口，将其去除晶体、角膜、玻璃体去除，力量一定要均匀，将眼科周围的（弯）的头部钝缘通过视网膜向视进行轻刮，此时通过镊子将视网膜上的神经上皮去掉，这种方法是我们通过多次的实验总结出来的，通过这个可以干净、彻底地将视网膜进行分离。
1.3消化将去除视网膜神经上皮层的眼球挂置于自制的眼杯中（由橡胶瓶塞和针灸针制成），滴加0.25%的胰蛋白酶没至距角巩膜缘切口1mm处，放入二氧化碳孵箱中消化10-15min，消化时间可根据具体情况而定，如新制胰蛋白酶消化时间可相应缩短。与先消化后分离相比，我们的方法可以较准确地把握消化时间，同时消化洗脱下来的色素上皮细胞也较多，杂细胞较少。
1.4吹打我们总结了一下，吹打30-40次后就可以充分的将细胞制成悬液；另外在进行冲洗时最好选用合成培养液如DMEM代替PBS缓冲液，目的是尽可能地模拟细胞生存的内环境，减少细胞离体后再培养时的贴壁时间。
1.5关于微生物污染组织细胞在培养时一般失败的最主要的原因就是微生物的污染，在体外培养的细胞没有免疫能力，缺乏机体屏障，当发生细菌、霉菌时缺少相应的防御能力最终细胞出现死亡，鉴于这个原因，实验的成功就必须做好防止污染的工作，进行操作时要做到无菌操作，并且确保各个环节都是无菌状态。
我们的体会就是严格按要求操作，决不能马虎、懒惰，更不能抱有侥幸心理。无菌培养室每天都要用0.2%的新洁而灭擦洗地面一次，紫外线照射消毒30-50min，超净工作台台面每次实验前要75%酒精擦洗，然后紫外线消毒30min。实验前认真清洗（经清洁液处理过的器具先用自来水冲洗20遍，之后一次蒸馏水清洗5遍，最后再用3次蒸馏水清洗3遍）、消毒培养用品；实验时也要保持无菌操作，如打开或封闭瓶口等都应在酒精灯近火焰处烧灼；拿取培养用品都应在超净工作台内完成；现在进行细胞培养大多数是通过二氧化碳孵箱，因此需要再次强调一下孵箱中的消毒的问题，孵箱虽然为细胞的生长提供了良好的环境，例如提供了恒定的二氧化碳、在维持PH值稳定时也做的相当的到位，但是开放式的培养，就给细菌、真菌提供了良好的生长环境，因此做好孵箱中细菌防止工作很重要，如果孵箱中的存在着污染那么整个细胞培养工作就会功亏一篑。因此定期地对箱内清洁，定期地将水槽中的无菌的蒸馏水进行更换很重要。
由于在体外培养的细胞缺乏一定的抵抗能力，因此要做好微生物污染的工作，为了提高微生物的免疫力，可以选择在培养液中加入一定的抗生素。但是通过实验表明，加入抗生素的作用有限，并且也尝试通过对细胞进行抗生素的冲击疗法、动物体内接种、加温处理等，上述方法都是有限的，因此做好预防工作是势在必行。
附：兔视网膜色素上皮细胞体外分离、培养及鉴定6只家兔空气栓塞法处死，随即于无菌操作下摘除眼球，经0.9%氯化钠溶液充分冲洗后，在角巩膜缘后3mm处环形剪开，弃眼前节和玻璃体，用显微镊轻轻撕去视网膜，加入0.25%胰蛋白酶，于37℃消化10-15min，后经小牛血清终止消化，800r/min离心10min，弃上清，加入DMEM培养液，接种于50mL培养瓶中，在37℃，5%CO2，90%湿度的孵箱中培养，待细胞贴壁后，每3d换液一次，直到细胞融合，行1：2传代，倒置显微镜下观察细胞形态改变，经细胞免疫化学抗角蛋白与抗S100染色进行视网膜色素上皮细胞鉴定，选择1-2代对数生长期细胞，0.25%胰蛋白酶消化，制备成单细胞悬液。细胞计数板准确计数，调整细胞浓度到1×105个/ml待用。2中药含药血清（medicated serum）的制备
为在体外实验中能观察到中药经体内胃肠吸收、生物转化后的综合整体药理效应，日本昭和药科大学田代真一教授于20世纪80年末首次提出“血清药理学（serum pharmacology）”的概念[2]，具体是指将中药或复方经口给动物灌服，一定时间后采集动物血液，分离血清后用含有药物成分的血清进行体外实验的一种半体内实验方法。此法不仅可排除由于中药复方粗制剂直接加入体外试验系统对实验造成的干扰，而且含药血清能较真实地反映药物在体内的状态，使体外试验能较好地重复在体试验的结果，它为科学地阐明中药复方的作用及其机制提供了新的研究方法。
2.1供体动物的选择为避免种属差异导致的实验偏差，我们选择与培养细胞同种动物（家兔）作为血清供体，具体方法：在性别、年龄、体重方面与细胞供体家兔保持一致；为保证各实验组细胞于造模前处于相同的实验条件，我们给予各组同种正常血清（normal rabbit serum，NRS）孵化36h；鉴于生理、病理状态下可能会产生较大的药代动力学差异，给予含药血清供体家兔造模。
2.2给药方案的制定首先采用与临床实际给药途径相同的方法（灌胃）给药；其次为提高体外实验体系中含药血清的浓度，在给药剂量上，我们结合临床常用量、动物体表面积比值及实验目的，设定成人临床日用量的10倍和20倍（量效关系）作为最后的给药剂量；最后在给药时间及采血时间上，由于中药及其复方成分复杂，血药浓度及半衰期难以准确测定，我们采用供体动物实验前禁食8-12h，每天灌胃给药2次，连续给药3d，末次给药后1h，心脏取血的方法获得含药血清[3]。
2.3血清的灭活和保存由于血清中所含生物活性物质可能会对体外培养的细胞产生毒性及严重干扰作用，我们对血清进行微孔滤膜（0.45μm、0.22μm）除菌，56℃水浴30min灭活，以去除非药理性干扰；考虑到含药血清长期低温（-20℃，2个月）保存后药效会显著降低，我们将新鲜制备的含药血清置于4℃冰箱保存，以备随时取用，剩余血清-70℃以下低温冰箱长期保存。参考文献
[1]葛坚.眼科学（第2版）[M].北京：人民卫生出版社，2010：63-65.
细胞生物学常用研究方法范文6
关键词：医学基础综合实验技能；研究生；课程实施
《医学基础综合实验技术》是一门包括分子、细胞、蛋白领域的基础实验技术课程，其中包含的实验技术是目前在科研领域应用非常广泛的技术，是医学院校研究生完成课题不可或缺的实验技术，因此《医学基础综合实验技术》已成为研究生课程的必修内容之一。为了提高实验课教学效果，应注意如下几个教学环节。
1合理设置实验内容
《医学基础综合实验技术》实验教学内容应根据医学科研的具体特点和培养目标而设置。首先要强调基础性，把分子生物学的质粒提取、转化、酶切和细胞生物学的细胞培养无菌技术及蛋白质电泳融合在整个实验课里，使整个实验具有连贯性。其次，要注重实用性。要完成一项医学课题，掌握分子生物学的real-time PT-PCR，细胞生物学的细胞培养以及显微镜技术，蛋白质学的Western blot等几项常用且比较前沿的实验技术是必不可少的，对于完成研究生课题有着至关重要的帮助，因此这些实验技术设置在了我们的课程里。
2改变实验课教学方式
2.1调整理论课和实验课顺序 在传统的实验教学中，一般将理论课安排在实验课的前面，造成理论和实践脱节。教师在课堂上花大量的时间讲解实验原理、方法和注意事项，但是由于学生对该实验缺乏感官认识，只能理解吸收一小部分内容，使学生置于消极的被动状态下，难以调动学生的学习积极性，不利于思维的开发和创新能力的提高。针对这个问题，应适当调整理论课和实验课的授课顺序，尝试将某些理论知识的学习放到实验课的后面，即学生先做实验，然后带着问题进入理论课的学习，教师可以将实验的结果和讨论结合到课堂的理论教学当中，从而引导学生解决问题。例如，教师在讲解蛋白质电泳时，学生对蛋白质在凝胶中从负极向正极泳动的原因较难理解，可以尝试先进行蛋白质电泳实验的操作，学生有了明确的感性认识，带着问题进课堂，用实验现象去辅助理解和掌握相关理论知识。这种实验课和理论课相结合的教学方式有助于学生更好的掌握实验的原理和技术，也有利于学生求知欲的激发和学习主动性的提高[1]。
2.2让学生参与准备流程 《医学基础综合实验技术》实验准备工作繁多，如：试剂的配制、高压、分装，实验耗材的灭菌，菌种的培养等，在传统的实验教学模式中，这些工作已经由实验师完成。学生进入实验室后只是根据老师的指导将这些实验试剂进行加样，对于试剂如何配置等却一无所知。这种教学流程使学生在实验中处于被动，缺乏主动操作和思考，不能提高学生的实践能力，并会使学生对实验课失去兴趣。因此，可以尝试开放实验室[2]，鼓励学生利用课余时间参加实验准备，让他们了解实验前需要什么，如何准备，增加学生动手的机会，调动学生的积极性，扩大知识面，为独立完成毕业论文打下坚实的基础。
2.3通过小组合作，培养合作能力 一个科研课题通常需要几个学生通力协作才能顺利完成，所以可以通过小组合作的方式培养学生的实践和合作能力。例如，在Western blot实验中，将2～3个学生分为一个小组，可以将提蛋白、配凝胶及电泳、转膜等工作分工，每个学生都要独立完成实验的一部分，然后将各个部分连接起来，在实验过程中，要求每组同学分工协作、互相帮助、取长补短、密切配合，这样一个Western blot实验才能成功完成。小组合作的方式有利于知识互补和互相学习[3]，既培养了学生独立思考和动手的能力，又培养了他们的团队合作精神和对科研工作的严谨态度。
2.4增加自主实验设计 《医学基础综合实验技术》这门课程不仅是为了让学生掌握几项实验技术，更重要的是培养学生的实验设计能力，帮助学生建立整体的科研思路，将所学的实验技术应用到具体的科研课题中。现在的实验教学内容往往是几个固定的实验项目，学生只是单纯的接受和学习，实验课结束后，仅仅了解了实验的一些原理和操作，而不能将这些技术应用到未来自己的科研课题中。因此增加学生自主实验设计的内容是解决这一问题的有效方法。首先让学生根据自己将来要进行的课题研究，应用实验课所学的实验技术设计合理的实验方案，让学生在讲台上对自己的方案进行讲解，并接受同学的提问，最后由教师进行讲评。当实验课进入这个环节后，新颖的教学方式和丰富的教学资源极大的调动了学生的学习兴趣，充分发挥创造性思维，将所学和所用紧密联系起来。这种实验课模式充分调动学生的学习积极性，极大的提到了学生的创新思维和实践动手能力。
3建立科学的考核制度
传统的实验课成绩往往以实验报告为依据，不少学生应付了事，抄袭现象时有发生，实验报告无法真实反映学生的动手能力和操作水平。因此，可以用多个方面综合评价学生的实验课成绩。例如：①实验课出席率；②平时实践表现；③实验报告；④自主实验设计。通过综合的考核方式建立，能够增加学生的学习积极性和对实验课的重视，同时又能够比较全面的评价实验课的成效。
4教师的必备条件与自我提高
师资队伍的建设是实验教学改革可持续发展的根本保障[4]。作为一名实验技术课程的讲授者，既是科研服务工作者，同时又是学生的接触科研的启蒙老师，教师在课堂上的一言一行，一招一式均要规范，使学生从教师身上学到严谨的科学态度，严肃认真的工作作风，严格规范的实验操作。因此，教师应具备以下条件：①热爱实验室工作，认真对待科研及教学；②具备良好的专业知识，能够熟练使用实验室的各种仪器，深度了解实验技术的原理；③不断的获知和学习科研领域中的新兴技术，能够对实验课内容进行更新；④具备科研和教学等多种技能，工作积极上进，具备不同学科间的科研协作精神和认识。
《医学基础综合实验技术》是一门更新换代特别快的实验课，要求讲授的内容与时俱进，教师需要不断提高理论基础知识和业务实践能力，既要经常查阅国内外文献，又要积极参加学术交流，对所学知识进行更新，这样才能提高教学质量，培养出高素质的医学人才。
参考文献：
[1]吴艳峰，曹雪涛.关于免疫学实验课教学改革的几点思考[J].中国免疫学杂志，2011，27（5）：468-470.
[2]杨雅婷，李天俊，王英超，等.高校生物化学开放性实验室建设的研究与实践[J].天津农学院学报，2013，20（1）：55-57.
