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岁末感言范文1
[关键词] 骨髓间充质干细胞 可塑性 视网膜
视网膜是由视网膜色素上皮层和神经感觉层组成的对光敏感且精细的膜样结构，是视觉形成的基础。任何原因引起的视网膜血管，神经感觉组织和色素上皮的病变均可导致视力损伤，甚至致盲。各种原因引起的视网膜疾病的最终结果都是视网膜神经细胞的坏死或凋亡，造成不可逆的损伤，如：视网膜色素变性(retinitis pigmentosa, RP)、年龄相关性黄斑变性（age-related macular degeneration, AMD）等。虽然目前有多种治疗方法，但疗效均欠佳。随着干细胞研究的深入，利用干细胞，尤其是MSCs，诱导分化为视网膜各种细胞，恢复视网膜的结构和功能可能有望成为新的治疗途径。
干细胞可分为胚胎干细胞和成体干细胞。胚胎干细胞具有分化的全能性，可分化成为各种类型的细胞[1]。利用胚胎干细胞移植入受损部位可使组织再生恢复功能。已有报道指出胚胎干细胞可以向视网膜前体细胞诱导分化[2]。胚胎干细胞对于视网膜变性疾病的治疗有很大潜力，但是由于胚胎干细胞的研究在伦理方面存在很大争议。此外，胚胎干细胞的MHC-Ⅰ类分子随细胞分化而不断增加，使其排斥反应成为限制其应用的一个重要问题。成体干细胞是存在于个体组织中的具有多向或单向分化的潜能，广泛存在于骨髓、肝脏、心肌、脑、及视网膜等组织中。在特定情况下，如组织损伤等，可增殖分化修复受损的组织。各种成体干细胞中，以MSCs具有多向分化潜能，可分化成为包括骨、软骨、脂肪细胞、筋膜、肌肉及骨髓基质等[3]，而成为当前研究的热点。此外，MSCs克服了胚胎干细胞的缺点，来源丰富，取材方便，易于分离纯化，可塑性强且不存在伦理学问题。
1 MSCs概述
1867年Cohnheim在研究损伤修复时，利用可溶性苯胺染料经静脉注射后发现染料出现在远端受损修复部位的细胞中。并由此推测损伤部位的细胞是来自血液的，而且很可能来自骨髓。虽然这一推断至今尚未得到证实，但是最近的研究证实骨髓中确实存在一种不同于造血干细胞且具有多向分化潜能的干细胞，即MSCs。
1.1 MSCs的细胞学特点
MSCs除具有细胞核浆比值大，细胞器少等干细胞的一般形态学特点外，还有细胞呈梭形，粘附能力强，每2~4个细胞可形成一个集落单元[4]。MSCs分裂周期在33h左右，具有较强的分裂能力。体外培养的MSCs经过20~30次的细胞倍增后，应用带微孔的胶囊将其包绕并植入鼠的腹膜，可发现MSCs仍可分化成为纤维、骨、软骨等组织[5]。
1.2 MSCs的免疫标志物
利用流式细胞仪分析显示，MSCs大多数可表达SH2、SH3、CD29、CD44、CD71、CD90、CD106、CD120a、CD124等。MSCs不表达造血干细胞的标志物，包括脂多糖受体CD14、CD34以及白细胞的一般标志物CD45[3]。所以目前认为可以把CD44、CD105、CD106等骨髓细胞标志物阳性等作为MSCs免疫学鉴定方法。
1.3 MSCs诱导分化的分子因素
作为间质来源的干细胞，MSCs具有多向分化潜能且分化的方向视诱导因素的不同而各异。MSCs分化过程中涉及多种细胞因子。各种细胞因子的作用方式和信号传导过程也不同。其中，受体酪氨酸激酶（Receptor Tyrosine Kinase, RTK）可从细胞的增殖、生长、分化等方面调控细胞。过程包括配体―受体的结合，受体磷酸化并活化下游分子，通过级联反应对细胞生长分化等发挥重要作用[6]。影响MSCs生长分化的蛋白质分子包括多种生长因子分子，如BMP,activin等，和多种类型的白介素。这些分子通过不同时相和浓度作用于MSCs，使其生长并向多种细胞类型分化。Irina Kratchmarova等[6]，在研究多种细胞因子对MSCs对分化的作用机制时，发现hMSCs分化成为骨样细胞是表皮生长因子（epidermal growth factor, EGF）刺激产生的，而不是血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor, PDGF）。多数细胞内信号传导蛋白可同时传导两种配体的刺激信号，但是磷酯酰肌醇激酶3（PI3K）途径却是单独由PDGF激活的。利用PI3K的抑制剂可以使PDGF诱导分化的效应回退。这表明该途径可能是一个细胞分化的控制点。此外，Runx2与PPARγ是调节MSCs分化的的两个关键转录因子，通过以上两个转录因子的活化分别驱动MSCs分化成为骨母细胞或脂肪细胞。同时，14-3-3结合蛋白TAZ对Rux2与PPARγ依赖性基因有分别共同激活和抑制的作用。MSCs的分化分子机制复杂，对其进行全面的研究有助于成功诱导MSCs分化成为目的细胞。
2 MSCs在视网膜疾病研究中的应用
多种试验已证实MSCs可以分化成为包括视网膜的各种细胞在内的多种类型组织细胞或前体细胞。由于视网膜是由RPE、光感受器细胞和神经节细胞等组成。RPE和神经感觉层的细胞分别由胚胎发育时的神经外胚叶的外层和内层发育而来，各种细胞高度分化。因此，要实现将MSCs成功诱导分化成为视网膜细胞就需要不同的诱导条件。当前对于MSCs在视网膜疾病研究中的应用，大体是通过两条途径来实现的，即体外培养诱导和眼内移植。两条途径各有优缺点。利用体外诱导可以通过人工添加各种生长因子等，明确各种蛋白质分子对MSCs诱导的作用。培养液中成分明确便于分析，但是在尚未明确MSCs分化成为视网膜细胞的机制之前，体外培养无法准确诱导MSCs分成特定类型的细胞或前体细胞；成功诱导较为困难。与体外培养相反MSCs移植则可以应用体内适于MSCs分化的微环境诱导其分化成为特定类型的细胞或前体细胞。甚至某些分化的细胞可具有部分功能。但是眼内移植同样存在缺点。如体内微环境复杂，存在多种促进或抑制分化的因素。此外，复杂的体内环境对于MSCs诱导因素的分析同样是存在困难的。
2.1 细胞标志物的检测
检测MSCs是否被诱导成为目的细胞需要一定的检测指标。而在细胞类型的检测中，免疫标志物是较为可靠的指标，且在成为功能细胞前即可出现。几种视网膜细胞具有各自的标志物，RPE，可表达角蛋白、RPE65等，光感受器细胞表达视紫红质、视蛋白等。神经节前体细胞则可表达巢蛋白。神经胶质细胞可表达胶质酸性纤维蛋白等。所以当前对于MSCs诱导分化成为视网膜各细胞的研究也多采用这些标志物作为初步检测指标。而在功能检测方面，RPE常检测其是否形成色素或类似色素的颗粒。神经细胞则应用到电生理，如膜片钳等技术等；或是检测是否存在突触囊泡等。
2.2 MSCs诱导成为视网膜各细胞的关键
由于视网膜各种细胞高度分化，故利用MSCs诱导分化成为视网膜细胞需详尽了解诱导过程的关键因素。当前多数研究是将MSCs与特定细胞共培养并适当添加生长因子或利用体内微环境诱导。这些方法尚不能把诱导过程的关键因子一一阐明，但眼的发育过程为我们提供了可能与诱导过程存在密切关系的某些因子。
RPE的形成与TGFβ的超家族成员BMP和activin存在密切关系[7]，其中BMP对RPE的正确发育有重要作用。因为Noggin的过渡表达可导致区域特异性的RPE完整性缺损[8]。神经视网膜可由视杯的神经上皮发育而来或由RPE转分化形成，FGF家族成员的分子对分化的两条途径均有重要作用[9]。bFGF可使神经上皮向神经视网膜转换[10]，而胚鼠RPE中FGF9的表达则可使RPE向神经视网膜转变[11]。而在光感受器发育时两个重要的转录因子，视网膜链氨基酸拉链（Nlz）和核受体（Nrze3）可以调节视杆细胞特异性的转录，同时抑制视锥细胞相关的基因转录表达[12]。二者的同时缺失则可使视网膜前体细胞向视锥细胞分化[13]。
2.3 体外培养诱导MSCs向视网膜细胞分化
Urs Vossmerbaeumer等[14]利用RPE条件培养液培养MSCs，通过研究添加血管活性肠肽（VIP）是否可以调节MSCs的分化进程时发现MSCs可以表达RPE的某些特异性标志物，如：bestrophin,角蛋白8,18以及RPE65等；而且在进一步检测细胞功能时发现，利用促黑素（MSH）可以刺激已分化的MSCs表达色素颗粒，这些结果表明MSCs具有向神经外胚层分化的潜能，可以产生具有RPE特性的细胞表型且具有一定得功能。有学者利用鼠MSCs与不同发育时相的神经视网膜前体细胞（RPC）共培养时发现，与EB.5RPC共培养3d后的MSCs表现出神经元样外观，膜出现突起的结构。利用RT-PCR 和免疫荧光可检测到Pax6,Brn36和巢蛋白表达，如果将培养时间延长到7d或14d则无法检测到Pax6,Brn36的表达，而且在14d的培养后MSCs恢复原来的梭形外观，由此认为MSCs自身可能存在着反馈调节，可以再一定程度抑制其分化，以维持干细胞的特性。
CD90¬¬¬¬+的MSCs的可塑性已被多种实验证实,CD90+的MSCs可被包括牛磺酸、actinvin A、和EGF在内的多种介质诱导分化成为视网膜神经细胞样的细胞。被诱导的MSCs中30%可表达光感受器细胞的特异性标志物RHOS；同样也有30%的细胞可表达无长突细胞的标志物CRABP1。另外尚有少数细胞可被这三种介质诱导表达巢蛋白。
2.4 MSCs移植诱导分化成为视网细胞
多数MSCs体外移植治疗视网膜疾病研究的途径是利用分离培养的MSCs经视网膜下腔注射。有学者用GFP或BrdU标记CD90+的MSCs后注射入成年RCS鼠视网膜下腔。2W后发现CD90+的MSCs与宿主视网膜整合形成类似光感细胞层的结构，并且细胞可出现Opsin、RHOS、突触囊泡等，而分裂期细胞标志物PCNA并未测得。这表明细胞是进行了分化而不是分裂，这一结果证实MSCs可以分化成为视网膜细胞.该研究为视网膜变性病变的细胞疗法的研究提供了良好的前景和研究途径。
Wang.S等[15]利用RCS鼠的MSCs分别通过尾静脉和视网膜下腔途径对同基因鼠进行注射后，在不同时相进行光感细胞血管功能形态学方面的检查，发现视网膜下腔注射后可以很大程度上挽救视网膜的形态和功能，而经尾静脉注射则可对整个视网膜的光感细胞有挽救作用，两条途径结合则可以同时挽救光感细胞和视觉功能。
3 问题与展望
干细胞研究是当前的一个热点和难点。利用MSCs诱导分化成为视网膜细胞，可以为多种视网膜变性疾病带来希望，但是MSCs很难按预定方向分化，为此,需要从分子水平阐明MSCs分化过程的关键因子，并结合最新的组织工程技术从多方面研究MSCs的分化过程，实现其定向诱导分化成为视网膜各种细胞。在此过程中需要研究人员的不断探索。
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岁末感言范文2
[关键词] 干细胞 视网膜细胞 分化
视网膜是人体接受外来信息的重要部位。外伤、退行性病变及肿瘤等导致的视网膜损伤常引起严重的视力障碍甚至失明。目前随着干细胞生物学的深入研究，应用不同来源的干细胞及其前体细胞参与视网膜组织修复和细胞再生成为研究的热点。
1 眼源性干细胞分化修复视网膜损伤
1.1 来源于睫状边缘生长区和睫状体的干细胞
睫状体边缘生长区（ciliary marginal growth zone，CMZ）位于视网膜的边缘。视网膜大部分由CMZ产生的视网膜神经元组成，哺乳动物视网膜生成一旦完成，就不再继续生成。此外也没有发现类似CMZ。最近，Abdouh等[ 1 ]在成年鼠眼内注入生长因子，发现睫状体上皮细胞能重新获得胚胎期特征, 并能表达神经前体标记物nestin及视网膜祖细胞的同源转录因子Pax6和Chx10。这一结果提示成年哺乳动物的睫状体可能是潜在的视网膜前体细胞来源，只是正常情况下这些具有干细胞特性的细胞处于静止状态，睫状体内微环境不允许细胞的迁移和神经发生。
1.2 Müller细胞
Müller细胞为一种特殊的神经胶质细胞，在视网膜的发育和功能活动中起重要作用。最近Peter和Patrick等[ 2, 3 ]分别应用出生后的鸡及鱼为对象，研究视网膜神经毒性物质NMDA损伤后视网膜内神经元的再生情况。结果显示：Müller细胞在视网膜受到急性损伤后可重新进入细胞循环，且增殖的Müller细胞具有向损伤区扩展的特性。说明在未损伤视网膜内同样可能发生神经再生。Müller细胞可以为视网膜再生提供来源。许多研究还发现在视网膜急性损伤后，许多Müller细胞不仅经历增殖反应，还失去其Müller细胞的形态，并开始短暂表达原仅表达于胚胎前体细胞中的转录因子， 如Pax6、Chx10、甚至Six3[ 3-5] 。这说明增殖的Müller细胞可分化表达视网膜祖细胞。
1.3 虹膜色素上皮细胞（iris pigment epithelium,IPE）
由于IPE细胞与视网膜色素上皮细胞（retinal pigment epithelium, RPE）的胚胎来源相似容易得到。且体外培养的IPE细胞又具有RPE细胞的某些功能，如吞噬感光细胞的外节膜盘，维持视网膜的代谢等。 所以可以将IPE细胞移植于视网膜下代替RPE细胞。动物实验显示将自体IPE细胞移植于视网膜下1～3个月，IPE 细胞形成单层或多层排列，移植区感光细胞保持良好；6个月时IPE细胞与RPE细胞形成连接，RPE细胞顶端色素颗粒增多，感光细胞外节变长，IPE 细胞与感光细胞外节接触，视网膜增厚，荧光素造影时没有发现渗漏[6]。近年来，许多临床工作者将IPE进行自体移植治疗视网膜变性疾病都取得了良好的临床效果[ 7]
2 非眼源性干细胞与视网膜修复再生
2.1 脑源性神经干细胞
Dong等[ 8]从人胚胎大脑皮层分离获得神经干细胞，在体外用转化生长因子β3处理后再移植到鼠玻璃体腔内。结果发现这些细胞移行并与宿主视网膜整合，分化成视网膜细胞且有视蛋白阳性表达。这不仅表明人类神经干细胞能移行整合到宿主视网膜，而且更为重要的是这些细胞经过处理后能够分化成视网膜细胞，特别是类感光细胞。 Nishida等将海马来源的干细胞注入到机械刮伤视网膜的成年鼠玻璃体腔内，结果发现移植的海马干细胞整合到宿主视网膜内，免疫组化显示多数细胞能表达nestin，并表现出对微管相关蛋白2ab、MAP5及胶质纤维酸性蛋白的免疫活性，证明了移植干细胞向神经元和星形胶质细胞分化。
2.2 胚胎干细胞( human embryonic stem, hES)
胚胎干细胞具有发育全能性，理论上可以分化出任何细胞类型。Haruta等将鼠胚胎干细胞在体外诱导分化为色素上皮细胞，并移植到4周龄的遗传性视网膜病变RCS鼠的视网膜下间隙。结果发现这些细胞具有正常视网膜色素上皮细胞的形态和生理特性。Meyer等将胚胎干细胞源的神经祖细胞注射到成年的遗传性视网膜退变小鼠玻璃体腔，16周后发现移植细胞与宿主视网膜整合，具有与视网膜神经元类似的形态结构和分布特征，并表达特异性蛋白。Meyer等还发现宿主视网膜神经元，特别是感光细胞的存活明显增加。最近，有学者将人胚胎干细胞进行体外培养，发现在合适的培养条件下大部分hES能够定向成为视网膜前体细胞，并主要分化为视网膜神经元(神经节细胞和无长突细胞) 。而将这种hES来源的前体细胞与视网膜变性小鼠的视网膜共培养，结果发现这些细胞整合到了变性视网膜上，并能表达感光细胞特异性标记物。
上述不同来源的干细胞虽然可以诱导分化产生特化的细胞并表达各种组织的特异性蛋白抗原，但是目前未能真正实现细胞功能。如移植的干细胞是否能够帮助修复受损的视网膜？受损的视网膜如果被修复是否伴随着视功能的恢复？这些问题目前还没有答案。尤其是胚胎干细胞的“成瘤性”问题和干细胞体内移植后如何获取免疫防御功能等一直是干细胞领域亟待正视与解决的关键问题。
2.3 骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cell，MSC）
MSC是目前备受关注的一群具有多向分化潜能的成体干细胞。研究发现MSC 有跨胚层分化能力，体外可经诱导分化为神经元及神经胶质细胞。MSC 能在小鼠视网膜内存活并能与原视网膜结构发生融合，因而有可能成为视网膜移植治疗中具有发育潜能的高纯度视细胞供体，在治疗视网膜变性疾病及视神经病变中有广泛的应用前景。
2.3.1 MSC 体外诱导实验
许多学者运用不同的方法进行了MSC 体外诱导的实验研究，证实MSC 经诱导后可向神经元方向分化。常用的神经细胞诱导介质主要有和二甲基亚砜，神经营养因子及全反维甲酸（ATRA），3-异丁基-1-甲基黄嘌呤及双丁酰环化腺苷酸（dbcAMP）等。
Woodbury等在MSC如何向神经元分化方面取得巨大成果。他们首次确定骨髓间充质干细胞能在体外分化为神经元。此实验中将成年鼠的MSC在培养基中传代20代次，显示了非凡的增殖能力。将其先后用不同的诱导介质来诱导产生神经元表型。分化的细胞群致密表达神经元特异性烯醇化酶（NSE），正在分化的细胞表达神经元前体干细胞特有的nestin，且几乎80%的细胞表达NSE和神经纤维丝蛋白（neurofilament, NF-M）。他们接着又对人类骨髓间充质干细胞的分化潜能进行了研究。证明了人类的间充质干细胞也具有向神经元分化的能力。最近Chiou等将人MSCs与RPE细胞共培养成功诱导分化出视蛋白表达阳性的感光细胞，其机制与RPE细胞释放的色素上皮因子诱导分化有关。
2.3.2 MSC 体内移植实验
国内外学者做了大量工作研究自体骨髓干细胞移植治疗RP的实验。2002年Tomita等报道，用PKH-67标记了富含干细胞的骨髓细胞，注射到用钩针损伤的成年大鼠视网膜下，2周后观察到在损伤部位来源于骨髓的干细胞形成了新的视网膜细胞，外源的干细胞主要存在于损伤部位周围的外核层，并且表达胶质纤维酸性蛋白（GFAP），钙结合蛋白（calbindin），视紫质和波形蛋白（vimentin），这一结果提供了骨髓来源的干细胞分化为视网膜神经细胞和修补受损视网膜的可能性。
Otani A等从小鼠骨髓中分离得到Lin谱系阴性的造血干细胞（Lin-HSC），移植入两种视网膜退形性变小鼠模型rd1和rd10眼中，使原本发生退形性变的视网膜血管网的数量和长度有了一定增长。与对照组比较，视网膜外核层及内核层的厚度增加，且有核细胞数量增加，同时可以观测到视网膜电图（ERG）记录的明显改善。他们同时进行了视网膜微点阵分析，显示多种抗凋亡基因（如热休克蛋白和转录因子）出现显著上调。
最近还有学者[18]将GFP转基因鼠骨髓源性干细胞移植入经碘酸钠定向诱导RPE受损鼠眼内，结果发现部分细胞能迁移整合到宿主受损RPE层内并拥有了RPE细胞表型，表现RPE细胞形态，表达色素颗粒，并且没有发现细胞融合。由此表明MSC可以成为视网膜组织再生的来源。
MSC 在眼科的应用研究刚刚起步。主要研究重点集中于寻找治疗视网膜色素变性可行的治疗方法上。其作为一种成体干细胞，除具有干细胞的共性外，还具有如下优势：取材方便且对机体无害；由间充质干细胞诱导来的组织在进行移植时不存在组织配型及免疫排斥问题；间充质干细胞在理论上可以向任何组织分化。
尽管近年来对MSC的研究取得了很大进展，但仍然存在以下问题尚待解决：(1)成体干细胞含量极微，每10万个骨髓有核细胞中约含有1个MSC，并且随着年龄的增加或体质的衰弱，细胞的数量逐渐减少；(2)目前尚未能建立鉴定MSC的统一标准，至今还未能筛选到MSC特异性的标记分子；(3)MSC具有多系分化潜能，但向多系分化的效率尚不太理想，尤其是在体外的分化是否会引起MSC遗传特性的改变还有待进一步证实；(4)是何种信号诱导了骨髓MSC向多系分化，其诱导分化的分子机制尚不明了。
综上所述，虽然理论上干细胞研究为眼科学者展示了美好的前景。然而，只有在具有巨大挑战性的屏障问题获得解决，人类疾病的治疗才能迈入“干细胞”时代。
参考文献
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岁末感言范文3
[关键词]骨髓间充质干细胞；骨组织工程；细胞膜片；磷酸三钙
[中图分类号]R318[文献标识码]A[文章编号]1008-6455（2011）03-0408-03
Engineering bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell sheet and β-tricalcium phosphate ceramic
MA Dong-yang1,MA Jing2,JIANG Dong-hong3,WANG Jian-feng3
(1.Department of Oral and Maxillofacial Surgery,2. Department of Otolaryngology,3. Department of Medical Administration，Lanzhou General Hospital,Lanzhou Command,PLA,730052,Gansu,China)
Abstract:ObjectiveTo investigate the feasibility of constructing bone tissue using bone marrow mesenchymal stem cell (BMSC) sheet and β-tricalcium phosphate ceramic (TCP).MethodsWe first harvested a cell sheet from rabbit BMSCs using a continuous culture method and a scraping technique. The cell sheet was then wraped around a cylinder of β-TCP. Finally,the constructs were implanted into the subcutaneous pockets of nude mice for in vivo experiments. Gross view and histological examinations were performed to evaluate the harvested specimens. Results The cell sheet, with an average thickness of 158 mm, was composed of multi-layered cells separated in the extracellular matrix. Six weeks after implantation, the new bone tissue was present both on the edge and at the center of the TCP in sheet-TCP group. A layer of woven bone formed in the cell-sheet group. In contrast, the TCP was filled only with fibrous tissue in the TCP group,without evidence of bone formation.ConclusionThe study indicates that the combination of osteogenic BMSC sheet and β-TCP ceramic can engineer bone tissue and the engineered construct might be considered as a promising substitute for bone repair.
Key words:bone mesenchymal stem cell; bone tissue engineering; cell sheet; β-tricalcium phosphate
近年来，随着再生医学的迅速发展，组织工程有望为骨缺损提供理想的修复方法[1]。组织工程骨的传统构建方法是将具有成骨分化功能的种子细胞与三维支架材料复合[1-2]。细胞在体外扩增后常用胰蛋白酶消化成离散细胞悬液，在此过程中，细胞自分泌的细胞外基质、细胞-基质连接、以及细胞-细胞连接等结构都被破坏，而这些结构对于细胞分化、特异性表型维持、分泌、组织形成等功能非常重要[3]。再者，细胞与支架材料直接复合的方法存在细胞利用率低的缺点[4]。为了解决上述问题，我们提出新的组织工程构建策略，即应用细胞膜片与可降解的外源性支架材料复合来构建工程化骨组织。为验证这一构想，本研究选用来源丰富、容易获取、体外扩增速度快、安全实用性、无伦理学争议的骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cell, BMSC)作为种子细胞来构建细胞膜片，同时选择具有良好的生物相容性、可降解性、与松质骨的结构类似的多孔样磷酸三钙(β-tricalcium phosphate, TCP)作为支架材料。
1材料和方法
1.1 材料：3月龄成年新西兰大耳白兔，体重2.6～3.0kg，雌雄不限，由总医院动物中心提供。6周龄裸鼠(NIH strain, outbred) 购自中国科学院上海实验动物中心。DMEM培养基（购自Gibco, Invitrogen Corp）；L－谷胺酰胺、地塞米松、抗坏血酸、β-甘油磷酸钠、胰蛋白酶（均购自美国Sigma公司，胎牛血清(杭州四季青公司)，CO2细胞培养箱(Forma公司3110Ⅱ，美国)，倒置显微镜及照相系统(Olympas IX71. A21PH, 日本)，离心机(Heraens Cryofuge 8000, 德国)，一型超净工作台（苏州净化设备厂）。
1.2 方法
1.2.1 兔BMSCs分离、培养、及细胞膜片构建：氯胺酮（10 mg/kg）肌内注射麻醉下，切取兔双侧髂骨并劈开，用含200 U/ml肝素的低糖DMEM冲洗髓腔、过滤骨髓、离心、弃上清、加入含10%胎牛血清的低糖DMEM培养液，轻轻吹打成单细胞悬液，接种到直径为10cm的普通培养皿里。加入含100 U/ml 青霉素、10%胎牛血清、50mg/L抗坏血酸、0.27g/L L-谷胺酰胺的低糖DMEM，置于37℃、5% CO2的孵箱内培养，每隔2天更换培养液一次。当细胞达90%融合时，用0.25%胰酶消化后按1:3 传代，换成含10%胎牛血清的高糖DMEM培养液，90%融合时再消化，按密度1×105个/cm2接种到直径为10cm的培养皿。细胞融合后，更换为含10%胎牛血清，1×10-7mol/L地塞水松，50mg/L抗坏血酸，10mmol/L β-甘油磷酸钠的高糖DMEM条件培养液，每隔2 天换培养液1次，经2周的连续培养，用细胞刮刀由外周向中心沿底壁仔细刮起，获得完整的细胞膜片[5]。
1.2.2 细胞膜片显微结构观察：随机选取所获细胞膜片，4%多聚甲醛固定，梯度乙醇脱水，常规石蜡包埋，切成5μm厚切片，苏木精－伊红染色（H&E）光镜下观察组织结构。部分膜片样本经丙酮固定，钙钴法进行碱性磷酸酶染色。部分膜片经2.5% 戊二醛固定，梯度乙醇脱水，干燥，喷金，扫描电子显微镜观察标本表面形貌及层面结构。
1.2.3 体内试验：实验组将单层细胞膜片剪切成10mm×25mm的长方形状（图1A），并由一端卷起包裹预制成的TCP圆柱体（直径0.8cm，高度1.0cm，70%孔隙率，平均孔径450± 50μm，图2A、B），静置孵育24h后移植到裸鼠背部皮下。作为对照，相同大小的细胞膜片和同规格经成骨培养基孵育24h的单纯材料也进行皮下移植。术后6周处死动物取材，进行大体观察及组织形态学分析：①组织学定性分析：各样本经石蜡包埋、切片后HE及Mallory 三色染色光镜观察；②组织学半定量分析：每组每例样本连续4张5μm厚切片，横贯整个样本，Mallory 三色染色后由独立的观察者采用NIH Image J图像分析系统在10倍镜下分析切片中骨样组织（砖红色）与纤维组织（淡蓝色）所占的面积百分比。每张切片随机选取4个视野，计量后收集各组数据，取其平均值。
2结果
2.1 膜片的构建：融合BMSCs经过2周连续培养，皿底有透明乳白色薄膜样物质形成，表面散在多个白色结节。用细胞刮沿皿底轻刮即可使其与培养皿底分离，刮起后膜片自行收缩，具有弹性和较稳定的机械性能，可以用镊子或血管钳进行钳夹操作。HE染色，所获膜片具有类似三维结构，由约8～10层细胞及细胞外基质组成，厚度平均158μm （图1B）。扫描电镜下观察：膜片中细胞被细胞外基质包埋，基质表面可见矿化结节聚集（图2C）。
2.2 体内实验
2.2.1 移植6周后：实验组和TCP组取材标本的形状与移植前无明显变化，但前者表面较硬，容易与周围软组织分离，后者表面被覆一层质软的纤维组织，不易分离。膜片组见纸片状硬质组织形成。
2.2.2 组织学结果：实验组的外周表现为矿化程度较高的板层状骨组织，可见致密骨基质、骨陷窝、骨细胞、成骨细胞等结构，材料内部的孔隙中央为纤维组织，周边见低度矿化的小梁骨（图3A、B、C）。组织定量学分析，骨与纤维组织的所占面积分别为22.5%和59.6%。单一TCP组孔隙内为纤维组织（面积比为76.1%），未见骨或软骨样组织。单纯膜片组见片状编织骨形成，致密的骨基质中可见类髓腔样结构（图3D）。
3讨论
本研究证实了BMSC膜片与多孔TCP支架材料复合构建组织工程骨的可行性。与传统方法相比，本研究应用的构建方法具有以下优点：①采用物理刮治的方法将体外扩增的细胞连同培养过程中自分泌的细胞外基质、形成的细胞基质连接一同收集，避免了传统用胰蛋白酶消化的有创收集方法；②具有较高的细胞利用率。
细胞膜片技术由日科学家Okano等[6]发明，他们将温度敏感性聚合物凝胶涂层于普通培养皿底壁制备出了温敏性培养皿，在37℃时聚合物对其表面扩增融合的单层细胞膜片有绝对亲和性，但降至其临界溶液温度32℃以下时，此聚合物对单层细胞膜片的亲和性消失，使细胞膜片自动从培养皿底壁释放。该培养技术避免了对细胞进行传统胰蛋白酶消化等处理，进而保留了细胞自分泌的细胞外基质以及一些重要的细胞表面蛋白如离子通道、生长因子受体、细胞-细胞连接蛋白。利用此技术，角膜、皮肤、心肌、肝组织等多种细胞密集型软组织已被成功构建[3]，但在用于骨组织方面的研究较少。2007年，Zhou等[4]首先报道用细胞膜片技术与复合离散细胞悬液的聚合物-陶瓷材料（磷酸三钙-聚已酸内酯复合物）构建出组织工程骨；Gao等[7]则用多层细胞膜片与管状珊瑚构建出管型骨。Okano等获取膜片的技术操作程序较复杂，而且应用温敏聚合物，可能会影响细胞的增殖分化。同时该技术获得的膜片为单层细胞组成，厚度只有约10μm[8]。相比之下，我们的细胞膜片获取方法简单易行，无需特殊材料或者设备，而且由多层细胞及细胞外基质组成，厚度可达158μm，更像三维结构的组织。另外，一定的厚度赋予了膜片相应的弹性和较稳定的机械性能，增加了可操作性。本研究则用单层膜片与已用于临床的人工骨替代材料TCP复合。
有趣的是，实验组中，不仅在支架材料的外周有矿化程度较高的骨组织形成，而且在材料内部也可见相当数量的骨小梁。这一结果表明：作为细胞释放载体系统，细胞膜片可赋予无机材料以生物活性。另一个有趣的结果是，与单纯材料组相比，实验组材料孔隙结构内的纤维组织量较少，意味着细胞膜片在促进成骨的同时阻止了纤维组织的张入，有望成为新型的具有生物活性的组织引导再生膜。
组织工程骨要取代自体骨移植大范围应用于临床，首先需要解决大体积支架内部细胞的氧气、营养供应以及代谢产物排泄。种子细胞在体外依赖于培养介质提供营养，而植入到体内后，如同非血管化的游离骨移植，则需依靠受区组织液的弥散渗透作用获得营养。然而，理论上体内环境通常所能提供的最大弥散距离是150～200μm，因此大体积复合物内相当数量的细胞因为无法获取营养物质并排泄代谢产物而死亡[9-10]。尽管已有诸多方法可促进组织工程植入物与宿主血管网的紧密联系，提高细胞成活率和组织修复功能，但目前为止，任何促进血管生长的方法都需要5～7天以上时间才能使植入细胞获得血液供应，在这段时间内，细胞需从组织液中获得足够营养[10]。本实验所应用的BMSC膜片厚度为 158μm左右，在有效组织弥散范围内。我们推测将其植入体内后易于成活，有利于提高细胞治疗的效率。
[参考文献]
[1]Meijer GJ,de Bruijn JD,Koole R,et al. Cell-based bone tissue engineering[J]. PLoS Med,2007,4(2):e9.
[2]Quarto R,Mastrogiacomo M,Cancedda R,et al. Repair of large bone defects with the use of autologous bone marrow stromal cells[J].N Engl J Med,2001,344(5):385-386.
[3]Yang J,Yamato M, Shimizu T, et al. Reconstruction of functional tissues with cell sheet engineering[J]. Biomaterials,2007,28(34):5033-5043.
[4]Zhou Y,Chen F,Ho ST,et al. Combined marrow stromal cell-sheet techniques and high-strength biodegradable composite scaffolds for engineered functional bone grafts[J]. Biomaterials,2007,28(5):814-824.
[5]Ma D,Ren L,Liu Y,et al. Engineering scaffold-free bone tissue using bone marrow strom cell sheets[J].J Orthop Res,2010,28(5):697-702.
[6]Okano T,Yamada N,Sakai H,et al. A novel recovery system for cultured cells using plasma-treated polystyrene dishes grafted with poly (N-isopropylacrylamide)[J].J Biomed Mater Res,1993,27(10):1243-1251.
[7]Gao Z,Chen F,Zhang J,et al. Vitalisation of tubular coral scaffolds with cell sheets for regeneration of long bones: a preliminary study in nude mice[J].Br J Oral Maxillofac Surg,2009,47:116-122.
[8]Iwata T,Yamato M,Tsuchioka H,et al. Periodontal regeneration with multi-layered periodontal ligament-derived cell sheets in a canine model[J].Biomaterials,2009,14:2716-2723.
[9]Ren LL,Ma DY,Feng X,et al. A novel strategy for prefabrication of large and axially vascularized tissue engineered bone by using an arteriovenous loop[J].Med Hypotheses,2008,71(5):737-740.
岁末感言范文4
12月17日，《私人订制》在北京举行首映红毯典礼，导演冯小刚携四位主演一并出席，众多大咖强势助阵。有记者观影后发现，这就是部“够二”的《甲方乙方》，面对炒冷饭的质疑，冯小刚坦言：“我喜欢吃剩饭，入味儿，香！”如此拿着不是当理说，正如一男性嘉宾手持的“趣味”春联上精光闪闪的四个大字——“倍儿牛逼”，据说这也成为红毯的一大亮点。可无论怎样，也没有戏中扮演夜总会妈咪的85后女星邱晔引人注目：性感半球，整片脊背，臀沟股骨——如此无节操，真心无下限啊！由此我们也就对《私人订制》未映遭嘘、华谊兄弟股价触及跌停便不再惊呆了。
话说回来，普通的受众真的很宽容，他们从来不乏善良的愿望，“在一起”从春晚喊到了中秋，直至加上了“上头条”，只是点儿背真的怨不得这宽松的社会，有心细的网络小编为“峰怡恋”的艰难头条路做了如下记录：
9月13日王菲、李亚鹏事件：汪峰在微博上宣布自己离婚之后几小时，王李曝出离婚消息，瞬间就把汪峰深情并茂上千字的离婚感言秒成了渣；11月9日恒大事件：汪峰在演唱会上向章子怡深情表白，却万万没想到板上钉钉的头条却被恒大夺得亚冠冠军的巨大喜讯冲到不知何处；11月13日刘诗诗吴奇隆、杨幂刘恺威等事件：作为最近的话题人物，汪峰发新歌本来也有头条相，但是刘吴、杨刘等5对娱乐圈的情侣组团公开恋情，再一次让汪峰感受到了这个世界的满满恶意；只是近日，凭借着章子怡7亿陪睡案的收官鸣金，汪峰终于有望上头条了。好在此前汪峰在承受了一系列巨大的冲击挫败后，身为女一号的国际章在微博里转发男友的新歌，并且高呼汪峰是她的音乐国王，让男主人公深刻体味了挺的力度。
遗憾的是，到了年终岁末，被评论人徐鹏远认定存活在假想敌中的郭德纲，凭借“郭·吉诃德”般的大无畏精神，再一次搅动了演艺圈这潭浑不见底的浅水。徐文认为：“郭德纲的‘不入流’与自身性格、亲身经历和生存模式相关，他并不反体制，相反聪明地利用了这种矛盾赢得了一种类英雄的利益。郭德纲大有问题，但更有问题的是相声界只有一个郭德纲，整体不进步，‘有艺少德’的郭德纲恐怕还会继续流行下去。”所言中肯，值得关注。
岁末感言范文5
时光如水，一路向前，转眼2020年已经走到尽头，再见2020年，你好2021年。这里给大家分享一些关于再见2020你好2021的语录适合发到空间或朋友圈里，供大家参考。
再见2020适用于朋友圈的语录1.窗外没有太阳?不要紧，只要心里有光，怎样都会温暖，2020年的最后一天，愿我们都能温暖如初幸福依旧。
2.如果你有梦想，就默默去实现它，没必要让所有人知道。
2020年最后一天了，明年更加要加油哦!
3.你有你的背景，我有我的故事。
没有读懂我的故事，别给我多余的评价。别用昨日的眼光，看今日的我。2021加油。
4.任何事，任何人，都会成为过去，不要跟它过不去，无论多难，我们都要学会抽身而退。
5.关上2020的窗户，忘记忧愁，抛开烦恼，丢弃哀伤，扔掉失望，摆脱病痛;打开2021的大门，迎接希望，堆积收获，拥抱健康，感受欢乐，收集幸福!
6.生命的完整，在于容忍等待与爱，如果没有这一切，你拥有了所有，也是虚无。
7.望过去的一年，付出了汗水，付出了努力，收获了喜悦，收获了成功，在五彩斑斓的人生涂上了重重一笔;
新的一年到来，愿你执起勤奋的笔，加油，在事业的大道上留下浓浓的一笔。
8.辛苦一天，成就一天，奔波一月，丰收一月，付出一年，收获一年，2020回头遥望，人生麦田，黄金闪闪，2021举头展望，未来大道，幸福光芒!祝前程无量，喜悦丰收。
9.快乐和痛苦其实都是人生的财富，与其消极逃避，不如勇敢去面对，有时候，能够回忆也是一种幸福。
过去的事情可以不忘记，但一定要会放一放;今后的事情可能再失败，但一定要去搏一搏。2020再见，2021你好。
10.收起遗憾的感叹，收回后悔的心情，平静疯狂的回忆，稳重成功的感动，放开纠结的感情，重启奋斗的梦，幸福和成长的心，伴你2021继续远行，愿成功成就常在，新年幸福轻松。
11.只要还有明天，今天就永远是起跑线。
致即将逝去的2020!
12.我从来不信什么一夜成名，一夜暴富，只信一分耕耘一分收获。
2020再见!
13.你好，新的2021年!我们渴望成功，首先要志在成功。
14.一个胜利者不会放弃，而一个放弃者永远不会胜利。
再见2020，你好2021!
15.也许你的2020是苦涩的，或者是难忘的一年。
但你的2020也是快乐的充满收获的一年，2020年的最后一天，跟2020年好好的说一声“再见”，2021继续向前看!
16.总有无悔和后悔，总会无奈和不舍，总有简单和复杂，总有感慨和冷淡，总有难忘和想忘，生活却仍要向上，梦想依旧要奔忙，愿2021幸福相伴，快乐更长。
17.感叹过无奈年华，花开花落留不住，感慨过如水生命，月缺月圆控不住，感谢过感情友谊，情真情深止不住，感动着拼搏努力，激情向前停不住，2021的目标更远，2021的快乐更长，2021的未来愿你无限疯狂。
18.人生难免有低谷，就看你是否能给自己搭一个跳板;
事业难免有不顺，就看你是否能给自己一束阳光;不管过去有多失败，将来都是未知的，只有努力者才能获得新一轮的成功，加油!我看好你哟。
19.在烟花绽放的瞬间，趁着震耳的烟花声轻轻地对你说“我喜欢你”。
20.告别过去，迎接未来。
勇敢改变，勇敢接受，新人新物新景象!
再见2020你好2021经典短句1.时间，是最公平的，不管你是谁，它都平等对待。
珍惜时间就是珍惜生命，对于每个人的付出它会有不同的回报。再见2020，你好2021!
2.不管这一年，你过得快乐或是伤心收获还是迷茫，都得和那些开心的日子，那些孤独的夜晚，和那些破碎的承诺，还有那混乱的麻烦说再见了。
3.愿你放下执着，放下不甘心，从今以后，只负责精彩自己的人生。
往事不回头，未来不将就，你若盛开，清风自来。再见，2020!你好，2021!
4.生活，总是一半烟火，一半禅意。
2021，不再患得患失，带着一颗通透的心，去发现生活中的美好，感悟生命的真谛，不再把时间用来追忆和忧思。早安。
5.不要为失败找借口，只为成功找方法。
6.艰辛多彩的2020即将过去，崭新期盼的2021马上到来，祈愿家人在新的一年里平安健康!朋友们幸福快乐!世界和平吉祥!地球永远蔚蓝美丽!
7.当渐行渐远的今天即将成为2020年的封底，当渐行渐近的明天即将成为2021年的封面，奉上最衷心的祝愿：新年快乐，新年进步!
8.拼搏与努力，奠定了卓越的业绩;奋斗与汗水，成就了事业的辉煌;2021，编织伟大的梦想;2021，唱响幸福的篇章;新的一年，愿你继往开来，直挂云帆，想着理想尽情翱翔!
9.遗憾留给2020，好好爱自己，遇到珍惜自己的人。
10.风霜雪雨，2020已不再，悲欢离合往事散，酸甜苦辣也忘怀，成败弹指一挥间，望过去，展未来，2021新起点，新的辉煌新舞台，拼搏进取在未来，愿新的一年谱写新的篇章继往开来。
11.人生总会有不期而遇的温暖，还有生生不息的希望。
2020年最后一天了，再见了2020，2021也要加油哦!
12.回顾2020年，在工作上我们互相帮助，在生活上我们互相照顾，快把这些收起来吧;
我要在2021年里继续我们的快乐，继续我们的和谐。愿我们在新的一年里合作愉快，事业更上一层楼!
13.把2020年的失意化为勇气，痛苦转为力量，哀伤变成勇闯，困扰融成决心，阻难引为方向;在2021年里，坚持向前，努力去闯，追求不止;祝你早日成功，辉煌永享!
14.鲜花缤纷美酒醇，举杯同庆业绩高。
掌声不息泪花闪，你的辛劳我知道。成功之路汗水铺，拼搏换来事业傲。愿你再接再厉不骄傲，新年再把新功建!
15.请你好好努力，变得自律，变得优秀!
16.如果你要选择前方，那就不要再留恋过去的温暖，带上你的倔强与骄傲，就像向日葵迎着太阳，你也要迎着远方。
2021你好。
17.扫去一年的疲惫和风尘，其实我们还很年轻。
18.总结：辛苦一天，成就一天，奔波一月，丰收一月，付出一年，收获一年，2020回头遥望，人生麦田，黄金闪闪，2021举头展望，未来大道，幸福光芒!祝前程无量，喜悦丰收!
19.生命太短未来看似很长也不太长，我可以对2020情深义重但眼里心里还得是有无限可能的2021才行!
20.今天是2020的最后一天，每个人都是独立的个体，真的没有谁离开谁就活不下去的情况。
再见2020你好2021创意的说说1.我的征途是星辰大海，拜拜2020我不会回来了。
2.只管努力就好了，答案在2021年。
3.生活丰富又精彩，快乐辛劳紧相随。
一年汗水一年累，换来硕果一大堆。优秀先进全是你，奖金分红也不亏。愿你2021再努力，公司兴旺你最美!
4.在新春即将到来之际，愿我的祝福如冬日暖阳，春日清风，夏日阳伞，为你挡风阻沙，送去温暖，捎去清凉，陪伴你共渡今生!
5.辛苦一年不容易，今天大家聚在一起，为我们2020的成功举杯，心情无比激动，愿2021年的大家身体健康，万事如意，工作开心，再创佳绩，公司来年再创辉煌，龙年腾飞创造奇迹。
6.有一种结局叫命中注定，有一种心痛叫绵绵无期。
7.人类往往少年老成，青年迷茫，中年喜欢将别人的成就与自己相比较，因而觉得受挫，好不容易活到老年仍是一个没有成长的笨孩子。
我们一直粗糙的活着，而人的一生，便也这样过去了。
8.此时此刻，感慨万千，旧的一年已经过去，新的一年已经到来，展望未来，美好的日子正等着我们去奋斗，愿在新的一年里，我们能够继续经受住考验，克服困难，让公司的事业再度辉煌!
9.一个胜利者不会放弃，而一个放弃者永远不会胜利。
2020，再见;2021，你好!
10.留住快乐，记住经验，攒下运气，带上福气，拼出积极，搏出努力，告别2020年，迎接新喜，好运伴随，幸福跟随，成就自己，成功公司，万事如意，新年快乐。
11.今天是2020年最后一天，我们即将和2020说再见。
匆匆岁月，我们奋斗不息，我们用心生活。
12.一无所有就是拼搏的理由。
再见了，2020年!你好，2021年!
13.花开花落，此消彼长，云卷云舒，又是一年。
愿时间更替带给你漂亮心情，飘送着我的祝福，萦绕在您的身边。祝你新年快乐!快乐每一天!
14.用真诚品味回忆，用真情品味朋友，用真心品味工作，用勤奋品味学习，用感恩品味幸福，用宽容品味年轮!
15.新的一天用运动投资健康，用读书和旅行提升眼界，这些自我提升的好习惯，值得每一个人努力去养成。
早安!2020的最后一天!
16.悲观主义是一种态度，一个勇敢的人的态度。
2020，再见;2021，你好!
17.醒来打开窗一阵哆嗦2020的最后一天，有时候就觉得整个人空荡荡的，或是说有种所有喜怒哀乐都平静下来以后的无力感。
18.不知不觉，时间就走到了2020年的最后一天了，还是很忙，不过还好有青梅酒。
感谢朋友，知道我喜欢喝青梅酒，找了朋友各种打听帮我买来，谢谢!
19.新的一年总会有新的挑战，愿自己还能够保持一个好的心态。
再见2020，你好2021!
20.经验是过去一年坎坎坷坷练出来的，成功是过去一年碰碰撞撞闯出来的。
你好2021的人生感言文案1.过去的一年，努力是你的佐佑铭，勤奋是你的宗旨，拼搏是你的后盾，终于握住成功的手;新的一年来到，愿你坚持去年的方针，加油鼓劲，获得事业大丰收!
2.挥挥手，辞旧日，2020随风逝;
想过去，忙碌多，2021奋力博;有欢笑，有悲伤，2020有成长。汗水与泪水交织，2021将圆满结局。愿2021的你更加努力，大业兴起。
3.或许我应该高冷一辈子，再也不想辜负别人的热情，2020再见。
4.有时候，这个世界很大很大，大到我们一辈子都没有机会遇见。
5.亲爱的，公司过去的一年，是艰苦的一年，是开创的一年，更是丰收的一年，因为有了您的不懈努力，我们才会把公司做的如此顺利。
6.在这欢喜的时刻，在这总结的时间，愿大家犒劳自己的身体，解放自己的心情，总结自己的经历，成长自己的2020，喝酒喝出情谊，谈心谈出欢喜，愿2021的大家多多努力，再创辉煌。
7.风尘仆仆随着新年的钟声消散在2020，快乐幸福尾随着辞旧的欢笑迎面在2021，祝你扫走寒风，迎接暖暖的春风，生活甜蜜如花，家庭和谐如画!
8.今天是2020年最后一天，我们即将和2020说再见。
匆匆岁月，我们奋斗不息，我们用心生活。
9.辛苦一年不容易，大家都很努力，工作有了新成绩，欢喜我们都如意，2020总结走过去，2021重新再崛起，把激情留下，把斗志守住，把目标牢记，把奋斗拼起，愿你2021再创辉煌，成就奇迹。
10.为了不让生活留下遗憾和后悔，我们应该尽可能抓住一切改变生活的机会。
11.你好，新的2021年!脑袋口袋，心态决定成败。
12.人要为自己活，钱要为自己赚，公司是你和钱的天，有公司的效益，就有大家的晴天，2021年我们成功，今天大家要尽情欢，喝酒吃菜诉情谊，多分财气和人气，愿你万事如意。
13.对自己狠一点，逼自己努力，再过几年你将会感谢今天发狠的自己。
努力过后，才知道许多事情，坚持坚持，就过来了，再见2020，你好2021。
14.岁末，又到岁末。
感谢您一年的付出与拼搏，感谢您与公司一起快乐的成长。展望，就有希望。希望明年您一如既往的工作，收获加倍的快乐，充实幸福的生活。祝你健康，幸福吉祥!
15.过去辉煌不容忘记，美好明天需要奋斗，新一年已经到来，在激烈市场竞争环境中，我们依然面临很多挑战。
愿同志们再接再厉，努力向前，再创新辉煌。
16.旧的一年已经过去，新的一年已经到来，展望未来，美好的日子正等着我们去奋斗，愿在新的一年里，我们能够继续经受住考验，克服困难，打造一份不一样的天空!
17.一心一意的努力不会白费。
认认真真的生活，总能闯出自己的一片天。
18.时间就是这样：夜里想着心事，第二天的闹铃就响了;
下几次雨，夏天也结束了;等反应过来的时候，一年已经快要过去了。
19.生命就是一个逐渐支出和利用时间的过程。
一旦丧失了时间，生命也就走到了尽头。
岁末感言范文6
打造娱乐篮球
2005年12月17日，361°与中央电视台体育频道联合了一条重磅消息：361°运动武装与CCTV-5联手重塑“篮球公园”，打造全民娱乐的篮球运动与最受瞩目的篮球赛事。据悉此次361°与央视合作，三年的累计投入将超过6000万元现金，包括节目冠名权，15个单项擂台赛冠名权，惟一装备提供，场地以及活动费用等。不少人都笑称361°是在“玩命”。
当时，篮球公园还只是个想法，具体就是模仿美国NBA花式篮球，并融合街球、街舞、拉拉队表演等时尚元素，吸引球迷参与。而这种娱乐+营销的做法已并不是什么新鲜事了，在体育营销与娱乐相结合方面，早在几年前，百事可乐和肯德基就在中国推出了针对青少年的足球和三人篮球比赛。作为一个全新探索的节目，对电视台和赞助商来说都存在着风险。所以当篮球公园制片人向企业推销娱乐篮球节目的想法时，对此感兴趣的企业寥寥无几。
2005年10月，当篮球公园制片人找361°商谈时，361°表现出了敢为天下先的勇气。没有过多犹豫，一出手就是每年2000万元，这也一举创下了CCTV-5最高的单笔赞助。
当然，361°的果断之举有着自己的考虑，公司营销总监夏友群称:“商业投资不可能没有风险，但投资篮球公园有巨大商机，所以没有犹豫。”实际上，361°果断出手原因有三点。第一点看中的是CCTV-5的品牌，CCTV-5在国内良好的频道覆盖率、栏目收视率、强大的赛事与媒体资源等，是国内其他电视频道所难以匹敌的。第二点是篮球所拥有的群众基础，据一份调查报告显示，中国大概有三亿人打篮球，40%的中国儿童说篮球是他们最喜欢的项目，75%的15至24岁的年轻人说他们是篮球的热爱者，在北京、上海、广州这样的大城市，这个比例高达97%。“娱乐篮球”项目是针对15至24岁的年轻人，将在全国20个城市的赛场举行600多场包括“三对三”、“3分远投”、“扣篮”、“趣味投篮”、“花式篮球自选”等15项擂台赛的公开比赛。作为一个运动品牌，361°最大的消费群体是追求时尚、个性张扬的青少年，而娱乐篮球大赛的主要参与者也正是这个群体，二者将得到完美的结合。第三点是2005年席卷大江南北的超级女声，让业界看到娱乐和营销在加入媒体后的强大功效。娱乐篮球显然和超级女声有异曲同工之妙，同样采用选秀的方式、同样借助媒体平台。361°希望通过央视这个平台，搭起一座与消费者进行感情交流的桥梁。
事实证明，此次361°与CCTV-5的合作意义已完全超越了合作本身，更为重要的是打破边际效益递减的明星代言等旧模式，展示了一种体育营销的新模式，这不只是简单的促销和接触点的拓展，而是体育用品品牌建设思路的飞跃:由单打独斗向建设具有共同精神和共同主张的品牌阵营的转变。
在双方合作的过程中，央视给予了361°极大的品牌宣传空间，在每期90分钟的节目中，每一处细节都对361°完全开放。在比赛中，所有的选手也都必须使用由361°提供的全套篮球运动装备。在娱乐篮球从海选、路演、分赛区到全国总决赛的半年历程中，361°的4000多家店铺和销售网点都成了节目的报名点和宣传阵地；企业的公关、广告、路牌、海报等多种市场推广手段和媒介平台也都成为节目的宣传手段。对于361°的借力打力之举，不能不说是企业的大智慧。
361°重金投入来抢占稀缺资源，表明其扎根体育、打造专业体育运动品牌的战略思想更加清晰，而融入了娱乐篮球这一独特的大众篮球文化之后，其品牌比较优势更为明显。正如有媒体评价说，361°即将引领一场“篮球”，不仅为年轻一族带来一种全新的时尚文化，也为体育营销开创了“营销+娱乐+媒体”的新模式。
诠释品牌个性
国际著名广告人凯文.罗伯茨认为，一个好的品牌，关键是让消费者觉得这种商品有个性，在个性的纽带下让人与品牌之间产生一种爱，从而在情感上产生长期的认同与依赖。现在的消费心理，购买的不仅是实物，更是一种个人情感的表现物，哪个品牌能够与消费者的情感产生共鸣，哪个品牌才能在竞争中立于不败之地。
所以不管是耐克的“JUST DO IT”，还是阿迪达斯的“没有什么不可能”，都是通过励志式的品牌理念直击消费者的情感动脉，尤其是年轻一代的消费者。本土品牌已经意识到，必须要打情感牌才能提升品牌的竞争力。但如何摆脱品牌理念的同源尴尬，又如何将这种差异的品牌情感深入人心呢？
相较于耐克和阿迪达斯的品牌主张，361°并没有用一种教条理念锁住消费者的情感，而是创造性地提出了“勇敢做自己”。除了宣扬勇敢和坚韧的体育精神外，更多的鼓励消费者勇敢张扬个人情感，用自己的方式来诠释体育精神。这与当代青年注重个性，喜欢用自己的方式和理解事物的特点不谋而合，使361°品牌的情感价值得到了巨大的提升。也正是基于对品牌内涵与消费者心理的深刻理解，才留下了品牌情感营销的精彩一笔。
经过细心调研、精心策划。2006年岁末，在圣诞节与元旦到来之际，361°在北京、上海、广州等全国11个大中城市共同发起了“361°成年礼”活动。不仅为青年人送出了恭贺成年的特别礼物，而且发起“做件公益事，得份成年礼”的倡议，号召青年人勇于承担社会责任，以做公益事的方式让自己的成年礼更有意义。
“361°成年礼”系列活动一出炉，就吸引了众多青少年的参与。盛大的“成年礼”网络活动――征文和视频大赛也随机拉开大幕。网络活动从简单的宣誓、感言发展到动画、文章的征集，博得了时尚年轻一族响亮的喝彩。大多数青少年认为这次主题活动为他们讲出了心声。随后，赠送“成年礼”的活动更将活动推向，不少青年人都通过参与活动，得到了一份庆贺自己成年的礼物。在“做件公益事、得份成年礼”的主题下，青少年踊跃参与各种社会公益活动，让回报社会成为自己的“成年宣言”。
这一系列活动的成功举行，不仅点燃了众多青年的热情，为青少年搭建了一个表达自己心声的平台，也进一步拉近了361°与青年人心灵之间的距离。让361°名符其实成为青年人的好朋友、代言人，“勇敢做自己”的理念更是深入人心。“成年礼”话题经互联网热传，还引发了社会各阶层的讨论，361°品牌也因此广受追捧。
事实上，“成年礼”可以说是361°情感营销的一个缩影。在扩大专业赛事、专业媒体与品牌的融合的前提下，将情感营销纵深化，围绕“勇敢做自己”的品牌主张，通过张扬独特的品牌文化使其进一步走进消费者的心里，并获得消费者的情感共鸣。361°这种创新的品牌理念，不仅使其在品牌林立的运动装备市场上独树一帜，而且也为中国体育用品企业开辟了一条个性化的道路。
挖掘传播差异
有人说，北京奥运会是一次让中国品牌走向世界的历史性契机，也有人说奥运会将是中国运动品牌的大限。姑且不论奥运会是机遇还是挑战，一个不争的事实是，几乎每个行业都在想尽办法与奥运拉上关系，借助体育营销来推广自己。在这种情况下，简单的营销规划已无法适应奥运年的发展需求。如何适应奥运年的发展需求，如何更有效选择、利用各类媒体优势，抓住机遇并最终带动终端销售，对企业而言显然是道难题。
网络，无疑是企业必争的宣传阵地。虽然在体育营销领域，网络的力量早已得到认同，但由于起步较晚，网络技术和工具的更新又非常迅速，网络的价值和模式并没有充分被挖掘。因此无论是企业还是网络媒体，都在继续充分挖掘网络营销的特质和价值。具有敏锐市场意识的361°，早在2006年就携手腾讯网，对网络互动进行了初步尝试。从对体育频道冠名，到对客户端和进行广告投放，再到游戏平台的互动，并结合线下精彩的赛事等。通过与腾讯的合作，全方位地提升了361°品牌的曝光率与知名度。
当然，选择与腾讯合作显然是经过深思熟虑的。腾讯作为中国最大的互联网服务商，不仅拥有中国第一的即时通讯软件QQ，而且腾讯网的平台上还具有多元化营销的突出优势。更为重要的是，361°产品的消费群体与年轻的腾讯网用户群体相吻合，他们年轻、时尚，有一定的消费能力，喜欢尝试新鲜的事物，追逐潮流和品质，成为了这些行业最具价值的人群，这将直接加大361°品牌营销的命中率。