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编号合同范文1
1、合同编号:每个公司有不同的规定,主要便于归档和查询。合同编号一般由合同拟定方确定,无所谓甲乙。如果双方都坚持由自己拟定合同,只有一方选择让步,否则合同无法签署。
2、合同:是当事人或当事双方之间设立、变更、终止民事关系的协议。依法成立的合同,受法律保护。广义合同指所有法律部门中确定权利、义务关系的协议。狭义合同指一切民事合同。还有最狭义合同仅指民事合同中的债权合同。合同又称为契约、协议,作为一种民事法律行为,是当事人协商一致的产物,是两个以上的意思表示相一致的协议。只有当事人所作出的意思表示合法,合同才具有法律约束力。依法成立的合同从成立之日起生效,具有法律约束力。
3、编号:动词:给顺序号作为一种识别的方法,如给房间编号。名词:利用有序或无序的任意符号按顺序编号数或者编定的号数。
(来源:文章屋网 )
编号合同范文2
经回民区人民政府及有关部门同意,面向社会招聘劳务派遣制和合同制工作人员。
通过社会公开询价方式最终确定委托内蒙古力援人力资源管理服务有限公司,面向社会公开招聘。现将有关事项公告如下:
一、招聘
计划本次计划公开招聘劳务派遣制工作人员 139 名和卫计系统合同制工作人员 27 名。岗位详情请阅读《呼和浩特市回民区 2017 年公开招聘劳务派遣制工作人员岗位需求表》(以下简称《岗位需求表》1,见附件 1)和《呼和浩特市回民区 2017 年卫计系统公开招聘合同制工作人员岗位需求表》(以下简称《岗位需求表》2,见附件 2)。
二、人员管理及薪酬待遇
(一)人员管理
本次招聘人员实行劳务派遣制和合同制两种方式管理,不占编制。凡违反法律、单位纪律、劳动合同及自身原因等不能胜任工作的,随时解除劳动合同,取消聘用人员资格,按考试成绩由高到低依次递补。
(二)薪酬待遇
考试合格后试用期为两个月,期间发放试用期工资 2000 元,试用期结束后经考察合格者,签订劳动合同。试用期满后工资标准为 2600 元/月(含“五险”个人承担部分),缴纳五险,缴费基数和比例参照企业标准予以缴纳,相应的费用按规定比例由个人和单位承担。
三、报考条件
(一)报考者应具备以下条件:
1.具有中华人民共和国国籍;
2.拥护中华人民共和国宪法,遵守国家法律法规,品行端正;
3.现户籍地为呼和浩特市范围(在回民区服务期满的六类基层项目人员户籍地可放宽至内蒙古地区),户籍迁入时间截止到 2017 年 12 月 1 日;
4.年龄在 18 周岁(含 18 周岁)以上,30 周岁以下或 35 周岁(含 30 周岁和 35 周岁)以下(1987 年 12 月 15 日或 1982 年 12 月 15 日至 1999 年 12 月 15 日期间出生),具体要求详见《岗位需求表》1、2;
5.具有正常履行职责的身体条件和心理素质,凡身体条件有残疾者或身体机能处于非正常情况者应在报名资格初审阶段通过公布的咨询电话向内蒙古力援人力资源管理服务有限公司办公室提前声明,经确认符合报名条件后,方可报名,凡未提前声明且经确认影响正常履行职责的,取消其聘用资格;
6.具有符合岗位要求的学历、专业和工作能力;
7.具备拟招聘岗位所需的其他资格条件。
(二)有下列情况之一的,不得报考:
1.曾因犯罪受过刑事处罚和曾被开除公职的人员;
2.涉嫌违法违纪正在接受审查,尚未作出结论的人员;
3.在公务员、事业单位等各类招考中被认定有舞弊行为且不得报考的人员;
4.现役军人和应聘到岗位后构成回避关系的人员; 5.法律规定的其他不得聘用的人员。
四、报名与资格初审
(一)报名报名一律在互联网上进行。报名网站:内蒙古力援人力资源管理服务有限公司(网址:nmglyrl.com)。
报名时间:2017 年 12 月 26 日 9 时---2017 年 12 月 30 日 17 时。
为避免网络拥堵,请报考人员尽可能提早报名。报考人员须在规定的时间内报名。
每名报考人员只能报考一个岗位(详见《岗位需求表》1、2),且必须用居民身份证(护照)报名。
报名时报考人员要详细、准确、如实地填写《呼和浩特市回民区 2017 年公开招聘劳务派遣制和合同制工作人员报名登记表》(以下简称《报名登记表》),并上传本人近期正面免冠 2 寸数码彩照(jpg 格式,大小为 20KB 以下),
在填写个人简历时,报考人员须完整填写本人就读高中、中专、大学专科、本科和研究生的学习经历(填写上学起止年月,所读学校、院系、专业);须完整填写工作经历(填写工作起止年月,工作单位,所从事的主要工作,包括服役经历)。否则,可不予审查通过。
在反复核对所填每一项信息均准确无误后点击提交(特别提醒报考人员:姓名和身份证号提交后将无法修改,其他信息在资格审查通过后也将无法修改)。报考人员要认真阅读本简章和《岗位需求表》,仔细鉴别个人是否符合报考条件;
报名系统登录用户名及密码是报考人员确认是否成功报名、下载打印准考证和查询成绩等事项的重要依据,请务必牢记;报名与参加笔试、面试所使用的证件必须一致;报考人员须对网上所提交材料的真实性、准确性、完整性负责,凡因所提交材料不真实、不准确、不完整而影响报名、考试或聘用的,责任自负。报考人员在报名时提供的个人联系方式要在整个招聘过程、特别是在资格复审期间保持畅通,以便于重要事项的通知。
(二)报考资格的初审报考资格的初审工作在网上进行。
资格初审由内蒙古力援人力资源管理服务有限公司负责,资格审查人员在报考人员网上报名后的 2 日内提出审查意见。对符合报考资格条件的,不得拒绝报名;对不符合报考资格条件而未通过审查的人员,应及时在资格审核栏中简要说明理由;对填报信息不全或有疑问的,应及时退回报考人员补充或说明。
资格审查时间:2017 年 12 月 26 日 9 时--12 月 31 日 17 时。
报考人员对《岗位需求表》中的专业、学历、学位、其他条件以及备注的内容等信息需要咨询时,请直接向内蒙古力援人力资源管理服务有限公司咨询,电话 0471—5224222。
(三)报名结果的确认
报考人员在网上成功提交报名信息后,及时登陆报名网站查询自己的资格初审结果,初审通过的,不能再改报其他岗位。初审通过者应通过网上报名系统提示进行缴费,完成缴费即报名成功。未完成缴费者视为报名不成功。报考费为 100 元。
缴费截止时间:2017 年 12 月 26 日 9 时--12 月 31 日 24 时。
在截止时间前未完成缴费的视为自动放弃。缴费后请在报名网站自行下载并打印《报名登记表》一式两份,以备资格复审(请考生务必及时下载后保存,缴费截至后报名网站即关闭,如其他环节需要提供《报名登记表》,但考生因个人原因未下载打印,一切后果由考生自行承担)。
(四)同一岗位招聘计划数与实际报考人数比例应达到 1 ︰4 方可开考,未达到开考比例的岗位,将取消或削减该岗 6 位招聘计划数,由回民区公开招聘工作人员考务工作领导小组调整其招聘计划。
调整后的岗位,将在报名网站上及时公布。报考未达到开考比例岗位并已完成交费的报考人员,由内蒙古力援人力资源管理服务有限公司通过网上银行自动将报考费退到报考人员的银行卡里。根据报名情况,对于用人单位急需的高层次或短缺专业人才,用工单位急需的关键岗位,经用工单位主管部门书面申请,回民区公开招聘工作人员考务工作领导小组批准,可适当降低开考比例。
(五)报考人员务必于 2018 年 1 月 8 日 9 时--1 月 9 日 17 时登录报名网站打印准考证。
五、笔试
(一)笔试科目为《综合素质测评》,满分 100 分。
考试内容为机关、事业单位工作人员应该具备的知识水平和基本能力,不指定参考书目。
(二)笔试采用闭卷方式进行,仅提供汉文试卷。考生必须用汉文作答。对试卷出现不按规定语言、文字答题的按零分处理。
(三)笔试时间:2018 年 1 月 14 日,笔试地点:见准考证
(四)笔试分数线划定及成绩公布:
内蒙古力援人力资源管理服务有限公司根据笔试总成绩划定笔试最低合格分数线。
报考人员笔试成绩、笔试最低合格分数线在报名网站上公布。
六、资格复审
(一)进入资格复审范围人员的确定资格复审工作由内蒙古力援人力资源管理服务有限公司负责。
根据笔试总成绩,按各类岗位招聘计划数 1∶3 的比例从高分到低分确定进入资格复审范围的人员。
(二)资格复审
1.进入资格复审的报考人员须根据资格复审通知,携带相关证件在规定日期内(具体时间请考生笔试结束后随时关注内蒙古力援人力资源管理服务有限公司官网进行查询)到指定地点进行资格复审并打印《面试准考证》,未经内蒙古力援人力资源管理服务有限公司同意且未在规定时间结束前参加资格复审的,取消进入下一环节资格。
2.报考人员参加资格复审时须提交以下材料:
(1)《报名登记表》(一式二份);
(2)本人居民身份证(护照)、毕业证及报考岗位所需的其它证件原件及复印件;
(3)专科及以上学历的报考人员参加资格复审前 10 天内登陆“中国高等教育学生信息网” 8 (chsi.com.cn/)下载打印《学历证书电子注册备案表》一份;
(4)行政事业或企业职工并签有劳动合同的,须提交本人所在单位同意报考的证明;
(5)提供户口簿原件及复印件或户口所在派出所出具的户籍证明原件及复印件;
3.资格复审将重点审核报考人员所填报的信息是否真实准确;凡所填报信息与所持证件不符、不符合报考条件、弄虚作假、因个人错填信息的,一律取消面试资格;
4.对资格复审后出现缺额的岗位,按照笔试总成绩从高分到低分的顺序依次递补,并由内蒙古力援人力资源管理服务有限公司电话通知递补的报考人员参加资格复审;
5.对于用人单位急需的高层次或短缺专业人才,用人单位急需的关键岗位,资格复审及递补后达不到面试比例的,经用人单位主管部门书面申请,回民区公开招聘工作人员考务工作领导小组批准,可适当降低面试比例;
6.通过资格复审的报考人员进入面试环节。
七、面试
(一)面试采取结构化面试,主要测试面试人员的综合分析能力、语言表达能力、应变能力、仪表仪态等,满分 100 分。
(二)考生面试必须用汉语回答。 面试时对不按规定语言回答的按零分处理。
(三)对面试时实际到场参加面试人数与招聘计划数比例为 1︰1 及以下的岗位,该岗位报考人员的面试成绩须达到本人参加面试时所在考场(同一试题、同一考官组)的面试成绩平均值,方可进入体检环节。
(四)面试时间、地点:见《面试通知单》。
(五)考试工作结束后,按照每个岗位报考人员考试总成绩从高分到低分的顺序和该岗位计划招聘人数,等额确定进入体检和考核的人选,并将考试总成绩及进入体检和考核人员名单在报名网站一并公布。
(六)同一岗位招聘计划内最后一名报考人员考试总成绩出现并列的,并列人员以笔试总成绩高低排序,笔试总成绩也相同的,通过加试成绩高低排序,等额确定进入体检和考核范围。
八、考试总成绩计算
考试总成绩=笔试总成绩×50%+面试成绩×50%
九、体检
体检由内蒙古力援人力资源管理服务有限公司组织实施。
体检项目或标准参照《公务员录用体检通用标准(试行)》 (国人部发〔2005〕1 号)、《关于修订<公务员录用体检通用标准(试行)>及<公务员录用体检操作手册(试行)>的通知》 (人社部发〔2010〕19 号)、《关于对<关于明确公务员录用体检中肝脏生化标准的请示>答复的函》(国公考录函〔2010〕 10 13 号)和《关于印发〈公务员录用体检操作手册(试行)〉有关修订内容的通知》(人社部发〔2013〕58 号)等相关规定执行。
报考人员无正当理由不按时参加体检、体检不合格、在体检过程中弄虚作假致使体检结果失真的,取消其聘用资格并依次递补。体检费用由考生自行承担。
十、公示与聘用
(一)对拟聘用人员在内蒙古力援人力资源管理服务有限公司官网(网址:nmglyrl.com)进行公示。公示期间接受社会监督举报,期限为 7 日。监督举报者应以真实姓名实事求是地反映问题,并提供必要的调查线索。公示期满,对没有问题或反映问题不影响聘用的,办理聘用手续;对有严重问题并查有实据的,取消其聘用资格,按相应程序进行递补;对有严重问题但一时难以查实或难以否定的,暂缓聘用,待查实并作出结论后再决定是否聘用。
1、拟聘用人员应在规定时间内报到,否则视为自动放弃,取消其聘用资格,所空缺岗位依次递补。
2、2018 年应届毕业不能按时取得毕业证(学位证)的;在本次招聘通知下发前被其他单位录用的;聘用通知下发前考上全日制研究生、本科生、专科生并已到录取院校报到注册的拟聘用人员,取消其聘用资格,依次递补。
3、对与行政事业单位或企业签订劳动合同尚在合同期内的拟聘用人员,如原所在单位不同意与其解除合同的,取消其聘用资格,依次递补。
(二)本次聘用人员的用工形式分为派遣制和合同制两种用工性质。
派遣制用工形式是本人与指定的派遣公司签订劳动合同,拟聘用人员须服从用人单位岗位调剂和调配,否则不予聘用;
合同制用工形式是本人与报考的用人单位签订劳动合同。本次招聘信息均以网上为准,其它未尽事宜,以招聘方解释为准。
十一、纪律和监督
招聘工作实行回避制度。招聘工作人员和报考人员在本次招聘工作中违纪违规行为的认定与处理,参照《公务员录用考试违纪违规行为处理办法(试行)》执行。
十二、建立报考人员考试诚信档案
为强化报考人员的诚信意识,杜绝考试替考、舞弊等违纪行为,确保本次招聘工作公平、公正进行,报考人员在考试报名前须签订《报考人员考试诚信承诺书》,并建立报考人员诚信档案。对报考人员的资格审查贯穿招聘工作全过程,任何阶段发现报考人员弄虚作假的,一经查实,即取消其相应资格。
对违反规定的已受聘人员,一经查实,解除聘用合同,予以清退。
十三、其他
(一)内蒙古力援人力资源管理服务有限公司是唯一授权委托组织报名机构,不指定考试辅导用书,不举办也不委托任何机构举办培训班。/nmglyrl.com)公布,请报考人员及时登陆网站查询。
三)咨询和监督举报电话
咨询电话:0471—5224222(网上报名技术支持咨询电话)
监督举报电话:0471-3820056(回民区人力资源和社会保障局人事科)
(四)回民区人力资源和社会保障局对此次招聘全程监督
附件一:呼和浩特市回民区2017年公开招聘劳务派遣制工作人员岗位需求表
附件二:呼和浩特市回民区2017年卫计系统公开招聘合同制工作人员岗位需求表
编号合同范文3
我国的留守儿童数量随着外出务工人员的增多而逐年加大。他们长期与父母分离,再加上正处于身心发展的关键时期,这种与父母在时空上的隔断很容易使其思想发生转变,进而影响到学习和生活。在这种情况下就需要教师针对留守儿童的心理发展特点采取针对性的措施转变其思想,更好地促进教学。课堂教学是促进学生发展的基本教育途径,在课堂教学中,教师不仅要传授给学生知识,同时还有教会他们正确的学习方法,促进其心理健康的发展。[1]
1.运用课程中的心理健康教育资源,促进留守儿童的心理发展。
新课程理念提出教师在设定教学目标的时候要设定三维教学目标,即知识与能力、过程与方法、情感态度与价值观。这就要求我们在进行教学的时候要考虑到学生的心理健康教育。在实际的教学过程当中,不同的学科中的心理健康资源又各不相同,我们要根据学科特点制定出符合学科知识教学要求的教学目标。初中语文是重要的人文学科,我们在设定教学目标的时候要和课文的内容联系起来。比如在《从百草园到三味书屋》一文中,我们可以设定这样的情感目标:"理解鲁迅在永别故乡和流离颠沛中,追忆童年生活时的一种惆怅的失落感。引导留守儿童理解远离家乡的父母对家乡和亲人的思念之情,从而让学生明白要学会关心父母、理解父母。"
不同的学科有不同的教学内容,这些教育内容的挖掘都是进行心理健康教育的方式。《思想政治》课中就有许多相关的教育内容。在进行调节情绪的教学中,可以指导学生在遇到不良情绪时学会正确地调节自己情绪的方法,比如,大声呼喊、把自己的情绪写出来、画出来、给自己的好朋友讲等。在《历史》教材中有许多古代名人,他们能够战胜困难和挫折,最终坚持走向成功,自己在学习和生活中遇到不如意的事情时应该多想一想他们。数理化虽然是理科的教学科目,但是也有可以利用的心理教育内容,比如在各种演示环节培养学生敏锐的观察力、对科学的兴趣、克服困难的勇气等。体音美科目是培养学生审美能力的科目,教师可以引导留守儿童把自己对父母的思念融入到音乐美术的作品创作之中,在体育活动中进行合理的发泄。[2]
2.增强学生的自信心,提供成功机会,提高其学习的内在动机。
自信心不足是许多农村留守儿童的共同特点。他们由于长期得不到父母的疼爱,感觉自己在许多方面不如别人。在这种情况下,教师为学生提供成功的机会,让他们认识到自己存在的价值就显得非常重要了。在课堂学习的过程当中,教师要针对学生的学习能力提出不同的问题,对于成绩较差的学生可以提一下简单的问题。让他们获得成功的喜悦,久而久之就可以产生自己也能够学会的信心。当学生在学习遇到困难时,教师可以鼓励他们正确面对失败,客观地分析产生失败的原因,并帮助其制定具体的学习步骤。从而让学生形成正确的自我意识,愿意接纳自我、欣赏自我、完善自我。学习动机是一个人原因克服困难,追求成功的根本原因。留守儿童在初中阶段的辍学率较高,据调查,他们辍学的主要原因并不是家庭经济困难,上不起学,而是因为自己认为读书无用,丧失了对学习的兴趣。因此,教师激发留守儿童的内在的学习动机对于就显得非常重要。对学生学习动机的激发可以从丰富教学内容,吸引学生对学科知识的兴趣,也可以监督其养成良好的学习习惯、勇于探究的科学精神等。
3.鼓励留守儿童与同伴进行交往,积极参与课堂学习的讨论环节。
留守儿童因为缺乏与亲近的人交流讨论的机会,内心的苦恼无人诉说,所以就导致了他们对整个世界产生怀疑,不愿意与人进行交往。这样的自我封闭的心理会对他们成年后的心理发展也产生不同程度的影响。我们教师在进行教学的时候可以利用课堂教学这一主阵地,利用课堂讨论的环节引导学生进行相互交流。在学生之间进行交流的时候,教师要指导学生进行讨论的正确方式,要认真倾听别人的发言,对他人的发言可以进行补充或反驳,但要注意讲话的语气要和蔼,有理有据,尊重别人的发言。教师要为学生的讨论提供一个和谐、宽松的氛围。当学生的发言出现错误的时候,不要进行批评,以防其出现畏惧情绪,不敢畅所欲言。良好的教学氛围是建立学生进行有效沟通的剂,是培养学生创造力的摇篮,同时也是提高留守儿童自信心的温床,可以让学生在一个愉悦的环境中得到身心的发展,消除自卑情绪。
编号合同范文4
【关键词】:奢侈品;符号;历时性;重构
1奢侈品的涵义及其符号性
奢侈品的概念性意义在英文中的[luxury]一词源于拉丁文的[lux]和[luxus],前者意为“光”和“明亮”,后者原意指“极强的繁殖力”,后延伸为铺张浪费、聊无节制。现代也有许多权威机构给它下了定义,《汉语辞海》(2003),将奢侈品定义为“非生活必需的豪华消费品”,并解释“奢侈”就是“挥霍钱财,追求过分享受”。
符号学大师罗兰・巴尔特在《符号学原理》中认为,人们的衣装、饮食、汽车、家具等等商品,都属于语言系统,都是符号。让・鲍德里亚在著名的《消费社会》中也指出,商品及其形象己经成为“符号载体”,人们对商品的兴趣并不只是产品本身,而且还包括与产品相联系的“意义”(象征性价值),“意义的交换”成为商品交易的重要组成部分,奢侈品也是可以消费的商品品,因此同样不能例外。作为符号,“奢侈品代表的是美好的事物,是应用于功能性产品的艺术。就像光可以带来光明一样。它们提供的不仅是纯粹的物品,它们是高品位的代名词。”
“奢侈品”这一符号的正确表述:在符号的第一次序中,奢侈品的能指是其名称、声音、图像;奢侈品的所指是其产品实物。在符号的第二次序中,奢侈品的能指是第一次序中的符号全部一一特殊产品(原材料之珍贵与稀缺,设计方面之匠心与独特,制作工艺之精良,包装之精美等);奢侈品的所指则是其体现出来的品位(文化传承、审美指向、风格定位等)与功能(包括实物功能与象征)。实物功能即产品木身的物质性功用,象征又分为产品象征(品质卓越、价格昂贵等)和社会象征(阶级区隔及个人角色定位、自我价值实现等)。
无论是在古代还是现代,我们占有奢侈都是为了拥有其背后的符号意义,比如古代贵族享受皇室加官进爵时赏赐的黄马褂,跟普通高质量衣物其实没有使用上区别,但是却代表一种身份的象征,穿了黄马褂就就相当于有免死金牌,是一种地位权力的象征。又比如现代我们购买奢侈品牌的东西,是因为符合高端品位,该品牌拥有品牌历史,享受一种消费服务的体验,该品牌在给人的感知、叙述、仪式上的不同,也是购买了一种与众不同的象征符号。
奢侈品相对于别的商品、品牌有其特殊的传播言语,正因为自己所有的言语的特殊性,才构成了其不同一般消费品的意义。其内在的结构又是一套填密的语言结构,从其实物的设计、制造、广告传播途径、叙事方法、以及营造实践中的购买、消费仪式,都已形成了一套语言体系,同时遵循商品、品牌以及任何其它符号的传播语言规律。奢侈品符号语言化过程中,作为一种极具代表性的物品,不再是单纯的物品而是具有能指的符号,使用价值被趋边缘化,功能性要素退后,凸显符号图像视觉性,并引导整个会的价值走向。
2奢侈品符号的社会变迁及其特点
追溯历史,古代中国一度在政治、经济、文化、军事等各方面占领着世界领先的地位,在这样强大的综合国力下,我们的经济发展水平,资源开发、生产能力水平都很高,国富民强让我们无疑在很多时期都是最有奢侈品生产和使用能力的国家,那么研究奢侈品符号的产生、变化、发展,中国的奢侈品发展就应该是非常值得我们探究的一个重要环节。特别是在古代中国除了物化的奢侈品,与此同时,中国早期非物质性奢侈品亦随着早期社会对精神文化的需求而得以产生和出现,其具体的表现形态主要包括歌舞、乐典、仪仗等古老的文化艺术活动。
从上古社会稀缺的物品、技术难度大而产量低的物品古代封建阶级按宗法礼制分配的具有特殊权力地位象征的物品,到如今已经完全符号化的奢侈品牌商品,我们的奢侈品经历了一个符号意义被不断强化的过程,已经由以前的“物的依赖”当中慢慢脱离,成为了“符号的依赖”或者是一种“象征的依赖”,这跟奢侈品符号语言体系的“内部性”“外部性”影响相关,即政治、经济、文化的关系,以及奢侈品内部相关的要素之间关系相关。
奢侈品形态的变化是特定社会生产力中生产技术和工艺水平的集中体现,是当时社会经济发展水平的客观表现,它代表着特定时期社会物质生产工艺技术的最高水准。我国奢侈品形态的发展变化,反映了中国奢侈品发展从实物到精神、从有形到无形、从简单到复杂的历史过程,而早期奢侈品原始形态的发展历程,更是奠定了现代奢侈品,促进了后来的奢侈品从早期注重基本实物价值向延伸精神价值的功能转变的最终完成。
3奢侈品符号的不断解构与重建的原因
奢侈品是阶级身份的象征――奢侈品是财富等级的象征――奢侈品是品位审美的象征,在研究奢侈品的过程中,我们常常能发现中国人的心理始终存在着一种通过消费符号,特别是奢侈品符号的占有达到一种自我认同、拯救和一种趋同化的差异性的需求,正是因为有这样的心理,形成了奢侈品符号语言的不断解构和重建。
编号合同范文5
【摘要】 本研究探讨细胞外信号调节激酶(ERK)通路在丁酸钠(NaB)诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化中的作用,阐明丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的分子机制。用Western blot方法检测总ERK和磷酸化ERK的表达水平;将ERK特异性的抑制剂PD98059与丁酸钠联合应用,观察它们对SKM-1细胞生长曲线的影响及分化效应,并用Western blot方法检测P21和组蛋白脱乙酰酶(HDAC)蛋白质的表达水平。结果表明:SKM-1细胞经1 mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK的表达水平下降;丁酸钠及丁酸钠+PD98059均可以上调P21和HDAC蛋白质的表达水平,且丁酸钠联合PD98059的作用强于丁酸钠单用。结论:ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制。
【关键词】 丁酸钠
ERK Pathway Change in the Differentiation of Human MDS Cell Lines SKM-1 Induced by Sodium Butyrate
Abstract
The study was purposed to investigate the role of extracellular signal-regulated kinase (ERK) pathway in the differentiation of human MDS cell lines SKM-1 induced by sodium butyrate (NaB),and to elucidate the molecular mechanism of differentiation in SKM-1 cells induced by NaB. The expression levels of total ERK and phosphorylated-ERK were determined by Western blot. The effect of NaB in combination with the ERK inhibitor PD98059 on the proli-feration/differentiation of SKM-1 cells was studied,and then the expression levels of the P21 and HDAC protein were detected by Western blot. The results showed that the expression level of phosphorylated ERK was down-regulated by the 1 mmol/L NaB,and the level of total ERK had not changed. NaB or combination of the MEK inhibitor PD98059 with NaB could increase the differentiation of the SKM-1 cells and up-regulated the levels of the P21 and HDAC protein,but the effect of combination of NaB with PD98059 was higher than that of NaB alone. It is concluded that the inhibition of ERK may be involved in sodium butyrate inducing differentiation in SKM-1 cells.
Key words differentiation; SKM-1; sodium butyrate; ERK
大量研究显示,肿瘤细胞分化与丝裂原活化的蛋白激酶(mitogen-activated protein kinases,MAPK)信号转导途径密切相关。MAPK属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶,可被多种刺激所活化,活化后可磷酸化核转录因子和其它蛋白激酶等多种底物,调节相关基因的转录,进而参与细胞生长、发育、分裂等多种生理过程。细胞外信号调节激酶 (extracellular signal-regulated kinase,ERK)通路是MAPK系统主要的和经典的通路,主要传递细胞丝裂原信号,参与调节细胞周期及促进细胞增殖分化[1]。有研究表明[2]在丁酸钠诱导人大肠癌细胞分化过程中有ERK通路的抑制,但有关丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞分化的ERK信号转导途径尚无报道。我们前期的研究结果表明[3]:小剂量的NaB可促进SKM-1细胞的分化,将细胞周期阻滞于G0/G1期,其机制可能是通过上调P21 的表达和下调细胞周期蛋白-D (cyclin D)与依赖细胞周期蛋白激酶(cyclin-dependent kinase,CDK)的表达实现的。本实验是在我们先前研究的基础上,进一步探讨ERK 通路在丁酸钠诱导人骨髓增生异常综合征细胞株SKM-1分化中的作用,阐明丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的分子机制。
材料和方法
细胞株及细胞培养
SKM-1细胞由日本Ryuji Kawaguchi教授惠赠,Ryuji Kawaguchi教授建株于患有MDS-转为RAEB-T后转为AML 70岁男性的外周血[3],并在1993年交于日本JCRB细胞库保存。它是一个研究MDS发生、发展、DNA重排改变以及基因不稳定性的非常好的细胞株,呈淋巴细胞形态,强烈表达髓过氧化物酶。采用含10%胎牛血清的RPMI 1640培养液(含有100 U/ml青霉素和100 μg/ml链霉素),在37℃、5% CO2、饱和湿度下培养,取对数生长期细胞进行实验。所有实验均重复3次。
主要试剂
ERK1/2 特异性抑制剂PD98059溶于DMSO中,置于-80℃冰箱;丁酸钠(sodium butyrate,NaB)溶于PBS中,置于-20℃冰箱,ERK抑制剂(PD98059)与NaB应用时均用RPMI 1640稀释到工作浓度。PD98059、NaB及DMSO均购自Sigma公司,RPMI 1640和胎牛血清购自Gibco公司。
药物对细胞生长影响的检测
将对数生长期SKM-1细胞以2×105/ml浓度接种于6孔培养板上,PD98059以5、10和15 μmol/L 加入培养体系中,分为3组,然后每组再分为加和不加NaB(1 mmol/L)组,PD98059提前1小时加入培养基中。每种药物浓度设平行3孔,培养4天后取样进行台盼蓝染色,光镜下计数,连续3次。
氮蓝四唑(NBT)还原试验
将对数生长期SKM-1细胞以2×105/ml浓度接种于6孔培养板上,分为NaB组、PD98059组、NaB+PD98059组及对照组(未加任何药物处理)组。 NaB的浓度为1 mmol/L,PD98059的浓度为5 μmol/L,PD98059提前1小时加入培养液中,作用5天后,收集细胞,用RPMI 1640液洗涤2次,再用2 ml RPMI 1640液重悬细胞,内含0.1% NBT,100 ng/ml PMA (Sigma公司),37℃温育20分钟后,离心弃上清,加入100 μl DMSO溶解沉淀,在光镜下观察胞浆含有灰蓝色颗粒的细胞(阳性细胞),计数200个细胞,计算阳性细胞百分率。
Western blot分析
丁酸钠对SKM-1细胞ERK蛋白表达的影响
收集1 mmol/L NaB作用不同时间后的各组SKM-1细胞,PBS洗2次,用三去污试剂提取总蛋白质,Bradford方法测定蛋白质浓度,取等量蛋白质采用12% SDS聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,然后转至PVDF膜上;室温下摇动封闭(TBS-T+5%脱脂奶粉)2小时后,加入鼠抗-ERK1/2磷酸化抗体(Calbiochem产品,1∶1 000稀释)和抗-ERK1/2 抗体(Sigma公司产品,1∶1 000稀释),4℃过夜;室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联兔抗鼠IgG(1∶8 000稀释),最后用化学发光底物进行发光显迹。
丁酸钠和(或)PD98059P21对SKM-1细胞P21和HDAC的表达的影响
实验分为PD98059组、NaB+PD98059组及对照组(未加任何药物处理),NaB的浓度为1 mmol/L,PD98059的浓度为5 μmol/L。PD98059提前1小时加入培养基中,作用36小时后,收集细胞。用三去污试剂提取总蛋白质后测定浓度,垂直电泳进行分离之后转至PVDF膜上,封闭2小时之后,加入鼠抗人P21单克隆抗体和兔抗人HDAC多克隆抗体(均购自为Santa Cruz公司,1∶1 000稀释),4℃过夜,室温下洗膜后加入辣根过氧化物酶(HRP)偶联兔抗鼠IgG或辣根过氧化物酶(HRP)偶联羊抗兔IgG(1∶8 000稀释),显迹。
统计学处理
两组间连续变量比较用t检验,多组间连续变量比较用方差分析,协方差校正,以均数±标准误( X埂繱E)表示。
结 果
药物对SKM-1细胞生长的影响
PD98059可以抑制SKM-1细胞的生长。组2(5 μmol/L PD98059)、组3(10 μmol/L PD98059 )及组4(15 μmol/L PD98059)与组1(未加任何药物处理)比较,SKM-1细胞的数目明显减少,有显著差异性(P0.05) (图1)。因此在下面的研究中我们选用5 μmol/L PD98059处理细胞。
PD98059与NaB有协同性,同时应用对细胞生长的抑制明显增加。同一浓度梯度的PD98059,加用丁酸钠对SKM-1细胞的抑制均明显增加(P
氮蓝四唑(NBT)还原试验
SKM-1经NaB、PD98059及NaB+PD98059处理后,NBT还原试验发现阳性细胞百分率均较对照组明显增加(P
丁酸钠对SKM-1细胞ERK蛋白表达的影响
Western blot检测表明,SKM-1细胞经1 mmol/L的NaB作用后,总ERK1/2的表达水平未发生变化,而磷酸化ERK1/2的表达水平在6、12、36小时逐渐减少,说明NaB在其促SKM-1分化的过程中存在着一个持续去磷酸化的过程,ERK的活性受到抑制。由此推测,NaB可能是通过抑制了ERK1/2信号传导诱导SKM-1细胞分化(图3)。
丁酸钠和PD98059对SKM-1细胞的P21和HDAC表达的影响
Western blot检测表明,SKM-1细胞经1 mmol/L NaB及1 mmol/L NaB+5 μmol/L PD98059作用36小时后,P21和HDAC蛋白质的表达水平上升,且NaB+PD98059的作用强于NaB单用(图4)。
讨论
ERK属于MAPK超家族的经典成员,其在一系列反应如生长因子和有丝分裂等刺激中被激活,同时其持续活化最终促进细胞增殖和恶性转化;相应地,ERK的下调则可促进细胞生长和生长刺激基因转录的抑制。因此,丁酸钠抑制ERK转导通路可能是癌细胞在生物化学和形态方面逆转为良性表型的一个重要分子机制。
在本项研究中发现:SKM-1细胞经1 mmol/L的丁酸钠作用后,总ERK蛋白的表达水平无明显变化,而磷酸化ERK明显下降,说明丁酸钠在其促SKM-1分化的过程中存在有一个持续去磷酸化的过程,丁酸钠可能是通过抑制了ERK1/2信号传导诱导SKM-1细胞分化的。应用ERK的特异性抑制剂PD98059作用于SKM-1细胞,与丁酸钠在抑制细胞生长和诱导细胞分化方面有协同作用,且可上调HDAC 和P21的表达水平,也进一步说明了丁酸钠是通过抑制了ERK1/2诱导SKM-1细胞分化。而Witt等[4]在K562红白血病细胞株中的研究表明,丁酸盐诱导K562向红系细胞分化时有ERK通路抑制和P38通路激活的参与。Yen 等[5]的研究表明,维甲酸在诱导白血病细胞向髓系细胞分化中选择性地激活了ERK2,而不激活JNK/SAPK或P38。Nagata 等[6]的研究结果则提示,P38和JNK的活化对于促红细胞生成素诱导白血病细胞向红细胞分化是必需的。这可能与ERK1和ERK2广泛存在,在某种程度上它们被多种配体和细胞外界刺激所激活,具有细胞种类特异性有关[7]。
本实验的研究结果表明,ERK通路抑制是丁酸钠诱导SKM-1细胞分化的重要分子机制,然而细胞内存在着不同的信号通路,一定数量的信号蛋白以联合的方式相互作用,构成复杂的细胞内信号网络调控着不同的细胞生物学反应。是否还有其他的通路参与丁酸钠对SKM-1细胞的分化作用,尚需进行更深入的研究。
参考文献
1Steelman LS,Pohnert SC,Shelton JG,et al. JAK/STAT,Raf/MEK/ERK,PI3K/Akt and BCR-ABL in cell cycle progression and leukemogenesis. Leukemia,2004; 18: 189-218
2Orchel A,Dzierzewicz Z,Parfiniewicz B,et al. Butyrate-induced differentiation of colon cancer cells is PKC and JNK dependent. Dig Dis Sci,2005; 50: 490-498
3李春蕊,刘文励,黄梅等.丁酸钠联合全反式维甲酸对MDS细胞株SK M-1的诱导分化作用及其机制初步探讨.中国实验血液学杂志,2004; 12: 601-605
4Witt O,Sand K,Pekrun A. Butyrate-induced erythroid differentiation of human K562 leukemia cells involves inhibition of ERK and activation of p38 MAP kinase pathways. Blood,2000; 95: 2391-2396
5Yen A,Cherington V,Schaffhausen B,et al. Transformation-defective polyoma middle T antigen mutants defective in PLCgamma,PI-3,or src kinase activation enhance ERK2 activation and promote retinoic acid-induced,cell differentiation like wild-type middle T. Exp Cell Res,1999; 248: 538-551
编号合同范文6
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动产抵押合同立动产抵押合同人_________(以下简称甲方)_________(以下简称乙方)兹因甲方为担保乙方对于其所有的债权,将由甲方提供抵押物,为乙方设定抵押权,并约定条款如下:一、所担保的债权:包括本金_________元(在本合同有效期间内,得分次
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抵押担保合同合同编号:_________抵押权人(甲方):_________住所:_________法定代表人:_________联系电话:_________抵押人(乙方):_________住所:_________法定代表人:_________联系电话:_________债务人(乙方或者丙方):_________住所:
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