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纳米抗体技术范文1
1.1细胞分离
生物细胞分离是生物细胞学中一个十分重要的技术,它关系到研究所需要的细胞标本能不能快速获得的关键问题。以往的细胞分离技术主要采用离心法,利用密度梯度原理,时间长效果差。80年代,人们开始利用纳米微粒进行细胞分离,建立了用纳米SiO2微粒进行细胞分离的新技术。其基本原理和过程是:先制备纳米SiO2微粒,尺寸控制在15~20nm,结构一般为非晶态,再将其表面包覆单分子层,包覆层的选择主要依据所要分离的细胞种类而定,一般选择与所要分离细胞有亲和作用的物质作为附着层。这种纳米SiO2微粒包覆后形成复合体的尺寸约为30nm。第二步是制取含有多种细胞的聚乙烯砒咯烷酮胶体溶液。适当控制胶体溶液浓度。第三步是将纳米SiO2包覆粒子均匀分散到含有多种细胞的聚乙烯砒咯烷酮胶体溶液中,再通过密度梯度原理,使所需要的细胞很快分离出来。
1•2细胞染色
纳米微粒的出现,为建立新的细胞染色技术提供了新的途径。最近比利时的DeMey博士等人利用乙醚的黄磷饱和溶液、抗坏血酸或者柠檬酸钠把金从氯化金酸(HAuCl4)水溶液中还原出来形成金纳米粒子,粒径的尺寸范围是3~40nm。接着制备金纳米粒子-抗体的复合体,具体的方法是将金纳米粒子与预先精制的抗体或单克隆抗体混合。不同的抗体对细胞内各种器官和骨骼组织敏感程度和亲和力有很大的差别。可以根据这些差别制备此种金纳米粒子-抗体的复合体,而这些复合体与细胞内各种器官和骨骼系统相结合,就相当于给各种组织贴上了标签。由于它们在光学显微镜和电子显微镜下衬度很大,这就很容易分辨各种组织。这就是利用纳米粒子进行细胞染色技术。大量研究表明,纳米微粒与抗体的结合并不是共价键而是弱库仑作用的离子键,因此制造稳定的复合体工艺比较复杂,但选择适当条件是可以制造多种纳米微粒-抗体的稳定复合体。细胞染色的原理与金属的超微粒子光学特性有关,一般来说超微粒子的光吸收和光散色很可能在显微镜下呈现自己的特征颜色,由于纳米微粒尺寸小,电子能级发生分裂,能级之间的间距与粒径大小有关,电子从低能级的跃迁很可能吸收某种波长的光,纳米微粒的庞大比表面中原子振动模式与颗粒内部不同,它的等离子共振也会对某种波长光的吸收产生影响,由于上述几种原因,金纳米粒子-抗体在白光或单色光照下就会呈现某种特定的颜色。试验已经证实,对10nm直径以上的金纳米微粒在光学显微镜的明场下可观察它的颜色为红色。
2纳米微粒在抗菌杀菌材料上的应用
近年来对半导体光催化材料的研究[5,6]表明,半导体材料(如TiO2,ZnO,CdS,ZnS,Fe2O3)由于具有满的价带和空的导带,当受到能量大于半导体能隙的光照射时,会吸收光使价带电子激发到导带上形成导带电子,同时在价带上产生空穴,分离的电子和空穴可分别与吸附在半导体表面上的水和氧反应,产物为O-2和•OH,O-2是强还原剂,•OH具有几乎能使全部有机物分解的氧化力,可以氧化分解构成细菌微生物主要成分的各种有机物,干扰细菌蛋白质合成,从而有效抑制细菌等微生物的繁殖,达到抗菌净化目的,可用于杀菌除臭防霉及消毒,比常用的氯、次氯酸、H2O2等具有更大效力,因此半导体材料将会成为最具希望的环境友好光催化抗菌杀菌材料,目前已成为物理学家、材料学家和生物学家的热点课题之一。但传统的光催化材料,由于光产生的电子-空穴对极易复合,导致其光催化活性低,而且反应过程中需紫外光照射,因而很难在工业化实践中得到应用。纳米材料由于尺寸小、比表面积大,使得表面原子配位不饱和,同时存在很多表面缺陷成为光生电子和空穴分离的有效位置,使得纳米半导体材料具有高的光催化活性。对纳米微粒,当粒子细化到纳米尺度时,具备很多优异的特征[7],如(1)通过量子尺寸限域造成吸收边的蓝移。(2)由离散的能级和跃迁选律造成光谱吸收及发射行为结构化。(3)与体材料相比,量子阱中的热载流子冷却速度下降,量子效率将提高。(4)光生电子和空穴的氧化还原能力增强。(5)室温下激子效应显著。这些特征将使得纳米微粒成为高效的光催化抗菌杀菌材料。作者近来的研究结果表明,纳米TiO2微粒对大肠杆菌、金黄色葡萄球菌具有高的抗菌杀菌性能,其抑菌率均在99%以上。
3纳米微粒在药物上的应用
3•1纳米微粒药物
目前肝动脉栓塞化疗(TAE)已成为治疗肝癌的有效方法,拴塞物有明胶海绵、碘油-药物乳剂及各种微米级含药微囊(如白蛋白、葡聚糖、聚乳酸等),他们的不足之处在于(1)药物缓释后造成肝癌细胞耐药、而载体对耐药性无对抗作用;(2)微囊材料生物相容性差引起肝细胞的不良反应;(3)大部分微球粒径较大,肝靶向性差。针对上述情况,吴道澄等人[8]采用小粒径(纳米级)脂质体-碘油乳剂及聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒-碘油乳剂用于肝癌的拴塞化疗,经动物(白鼠)试验,与各种微米级含药胶囊相比,由于它们具有良好的肝靶向性、缓释性及可生物降解性,还具有抗耐药性,因而纳米阿霉素微粒-碘油乳剂对肝癌具有良好的疗效。光照条件下纳米TiO2粒子具有高的氧化还原能力,能够分解组成微生物的有机物(蛋白质)从而杀死微生物,且经动物试验证实TiO2微粒对动物无生理毒性[9,10],因此Cai等人[11]将其用于癌细胞治疗实验中,实验结果表明紫外光照射(10min)下TiO2微粒能全部杀灭癌细胞,目前该实验正在进行中。
3•2表面包覆的磁性纳米粒子药物[12]
磁性纳米粒子表面涂覆高分子,在外部再与蛋白相结合可以注入生物体中,这种技术目前仅处于实验阶段,已通过了动物临床试验。这种载有高分子和蛋白的磁性纳米粒子作为药物的载体,然后静脉注射到动物体(小鼠、白兔)内,在外加磁场下(2125×103/π(A/m))通过纳米微粒的磁性导航,使其移向病变部位,达到定向治疗的目的。这就是磁性超微粒子在药物学应用的基本原理。这里最重要的是选择一种生物活性剂,根据癌细胞和正常细胞表面糖链的差异,使这种生物活性剂仅仅与癌细胞有亲和力而对正常细胞不敏感,表面包覆高分子的磁性纳米微粒载有这种活性剂就会达到治疗的目的。动物临床实验证实,带有磁性的Fe3O4纳米微粒是发展这种技术的最有前途的对象,纯金属磁性纳米Ni、Co粒子由于有致癌作用,不宜使用。例如10~50nm的Fe3O4的磁性粒子表面包覆甲基丙烯酸,尺寸约为200nm,这种亚微米级的粒子携带蛋白,抗体和药物可以用于癌病的诊断和治疗,这种局部治疗效果好,副作用少,很可能成为癌病的治疗方向。但目前还存在不少的问题,影响这种技术在人体的应用,如何避免包覆高分子层在生物体中的分解,是今后应该加以研究的问题。磁性纳米粒子在分离癌细胞和正常细胞方面经动物临床试验已获成功,显示出了引人注目的应用前景。通常情况下,癌病、肿瘤手术后要进行放射性辐照,以杀死残存的癌细胞,与此同时大面积辐照也会使正常细胞受伤害,尤其是对生命极端重要的具有造血功能和免疫功能的骨髓干细胞很可能受到更为严重的伤害,通常的做法是,为了避免骨髓细胞受到损害,在辐照治疗前将骨髓抽出,辐照后再重新注入,但在较多的情况下癌细胞已扩散到骨髓中,因此在把癌细胞从骨髓液中分离出来是至关重要的,否则将含有癌细胞的骨髓液注回辐照治疗后的骨髓中还会旧病复发。磁性纳米粒子分离癌细胞的技术主要采用约50nm的Fe3O4纳米粒子,包覆聚苯乙烯后直径为3μm,用于小鼠骨髓中癌细胞分离试验。首先从羊身上取出抗小鼠Fc抗体(免疫球蛋白),然后与上述磁性粒子的包覆物相结合,如图1所示,将小鼠带有正常细胞的骨髓取出,加入小鼠杂种产生的抗神经母细胞(尚未彻底分化的癌化神经细胞)单克隆抗体,此抗体只与骨髓液中的癌细胞结合(见图中B),最后将带抗体和包覆层的磁性粒子放入骨髓液中,它只与携带抗体的癌细胞相结合(见图中C),利用磁分离装置很容易将该细胞从骨髓中分离出来,分离率达99•9%以上。最近伦敦的儿科医院、挪威工科大学和美国喷气推进研究所利用这种技术成功地进行了人体骨髓液癌细胞的分离来治疗癌病患者。
纳米抗体技术范文2
扫描探针显微镜,其探针可以沿样品表面逐点扫描,针尖能随样品的高低起伏作上下运动,用光学方法测量针尖的运动,就可以得到分子的图像。目前已经用于人体多种正常组织和细胞的超微形态学观察,而且可以在纳米水平上揭示肿瘤细胞的形态特点。通过寻找特异性的异常结构改变,以解决肿瘤诊断的难题。另一种新型的纳米影像学诊断工具———光学相干层析术(OCT)已研制成功,OCT的分辨率可达纳米级,较CT和核磁共振的精密度高出上千倍。它不会像X线、CT、磁共振那样杀死活细胞。通过应用纳米技术,在DNA检测时,可免去传统的PCR扩增步骤,快速、准确。美国NASAAmesCen-terforNanotechnology与中南大学卫生部纳米生物技术重点实验室合作,将碳纳米管用于基因芯片,可以在单位面积上连接更多的更高,样本需要量低于1000个NDA分子(传统DNA检测的样本需要量超过106个DNA分子);需要的样品量更少,可以免去传统的PCR扩增步骤;结果可靠,重复性好;操作简单,易实现检测自动化。其基本原理是:连接在碳纳米管上的DNA探针通过杂交捕获特异性的靶DNA或RNA,靶DNA或RNA中的尿嘧啶将电荷转到碳纳米管电极,电荷的转移通过金属离子媒介的氧化作用变成信号并放大。国外在80年代末开始着手研究超顺磁性氧化铁超微颗粒的研究,90年代把这种造影剂应用于临床。
其技术要点是:制备出高顺磁性氧化铁纳米颗粒,在其表面耦连肝癌组织靶向性物质(如肝肿瘤特异性单克隆抗体、肝肿瘤细胞表面特异性受体的配体)制成特异性的MRI造影剂。我国科学家也成功开发了应用超顺磁氧化铁脂质体纳米粒进行肝癌诊断的技术,可以发现直径3mm以下的肝肿瘤,还能发现更小的肝转移癌病灶。目前不加造影剂的磁共振检查能发现直径1.0cm的肝癌病灶,因此该成果大大提高了肝癌早期诊断的敏感性。国家863资助课题“纳米复合包裹生物微系统制备、超声造影和控制释药”,研制了纳米包膜微米微泡超声造影剂与包裹药物和气体的微球,造影后对比效果明显增强,有利于疾病的早期诊断和鉴别诊断。目前利用磁性纳米分离癌细胞在动物实验上已获得成功。其方法是:在直径为50nm的Fe3O4纳米粒表面包覆聚苯乙烯,将特异抗体连接其上,此抗体全只与骨髓中的癌细胞结合。因此,利用磁性分离技术装置很容易将癌细胞从骨髓中分离出来,分离率达99.9%以上,其意义重大。肿瘤切除术后加放疗,为目前肿瘤治疗的一种方案,但放疗的同时也会使正常细胞受到伤害,尤其是杀伤骨髓细胞,从而产生造血功能障碍,因此在放疗前将骨髓抽出,并分离出肿瘤细胞,将极大的提高放疗的疗效。
二、在治疗技术方面的应用
纳米生物材料可以作为基因治疗药物携带材料或靶向材料。通过纳米材料的筛选、纳米粒径的控制及靶向物质的加载,可大大提高药物载体的靶向性,降低药物的毒副作用。用于研究的模型药物包括阿霉素(ADM)、米托蒽醌和单克隆抗体以及近年来迅速发展的反义药物。我们可将药物包埋在纳米粒内部,也可吸附或偶联在其表面,通过血管内注射纳米粒后,纳米粒主要被网状内皮系统吞噬,肝脏中有数目众多的网状内皮细胞,且位置固定,因此药物能在肝内聚集,然后逐步放入血液循环,使肝脏药物浓度增加,对其他脏器不良反应减少,对肝脏有被动靶向作用;当纳米粒足够小(100~150mm)便可逃过kupffer细胞的吞噬,可将其表面覆以特殊包被后,靠其连接的特异性抗体等物质定位于其他靶向器官发挥作用。
肿瘤基因治疗是近年来基因治疗和肿瘤治疗领域内研究的热点,肿瘤基因治疗的方法主要有:①肿瘤抑制基因疗法;②肿瘤免疫基因疗法;③“自杀”基因疗法;④耐药基因疗法;⑤其他基因疗法。尽管基因治疗在基础研究取得很多成绩,然而临床试验研究的结果尚不令人满意。造成这种现象的原因是多方面的。这些问题主要有:①肿瘤基因治疗缺乏靶向性;②基因转移载体的效率、安全性及容量等问题;③绝大多数治疗方案目的基因只有一个。传统的DNA传递系统分为病毒载体介导系统和非病毒载体介导系统。病毒性载体在体内、体外均有高效表达,但是病毒性载体具有抗原性,体内应用诱导免疫反应和炎症反应;而且病毒性载体有可能将外源性病毒基因插入人的基因组中,引起严重的毒副作用。非病毒性载体一般不会造成基因的永久表达、无抗原性、体内应用安全;组成明确,易大量制备,但传递效率低。研制具有高效转染、安全低毒和器官甚至肿瘤细胞特异性的基因载体已成为制约基因治疗药物发展的瓶颈。纳米技术的出现为解决基因转移载体提供了新的思路。采用纳米载体转运核苷酸有很多优越性:①有助于核苷酸高效率转染细胞;②能够靶向定位输送核苷酸;③能有效保护核苷酸,防止体内生物酶的降解;④无机纳米粒本身具有杀伤癌细胞的作用,且对正常细胞无损害。纳米生物材料亦可应用于制造各类组织的支架(如血管、气管、输尿管、韧带与肌腱),组织工程用支架材料,内固定件,骨组织缺损修复材料。卫生部纳米生物技术重点实验室与美国合作开发的具有自塑能力的可吸收注射型纳米骨浆,已在美国、中国等多个国家开展临床实验,疗效显著,该纳米骨浆具有高度生物相容性且无致热源性。
卫生部纳米生物技术重点实验室还与美国匹滋堡大学组织工程中心合作,已开始出骨组织工程纳米生物活性材料,该材料由氨基酸及其他无毒的生物活性物质构成(如:葡萄糖、甘油、胶原蛋白、聚二醇等),采用国际上称为“绿色化学”技术进行合成。并且材料中含有骨生长因子可促进新骨的生成及骨组织功能的恢复,从而缩短骨修复周期,增强再造骨的功能,提高再造骨的质量,而且可以修复大面积的骨缺损。同时在成骨过程中,纳米材料亦可作为填充物质和骨生长因子的载体起着桥梁的作用。伴随着新骨的生长,生物材料逐步降解,待新骨形成时,纳米材料将被组织安全吸收。该材料的下一步开发计划是使材料携带骨生长因子基因,纳米材料既作为填充物质,又是基因转染的载体。纳米机器人是几百个原子、分子组成的颗粒,尺寸只有几十个纳米,表面活性很大,可进入血管中。科学家设想将这些机器人放在血液、尿液和细胞介质中工作,例如可以专门清除血管壁上的沉积物、疏通脑血管中的血栓。
纳米抗体技术范文3
【关键词】 纳米颗粒探针; 蓖麻毒素; 核糖体失活蛋白; 场流分离; 扫描电镜; 聚苯乙烯
1 引 言
核糖体失活蛋白(Ribosomeinactivating proteins， RIP)存在于许多植物中，植物核糖体失活蛋白的生理功能是起防御作用，即抵抗病虫害或者恶劣的环境[1]。根据蛋白质的一级结构，RIP 可以分成两类：Ⅰ型，由一条多肽链组成;Ⅱ型，是双链蛋白。Ⅱ型双链RIP 由2条或者4条多肽链组成，分子量约为60 或120 kDa，其中一条是A (Active)链，具有N糖苷酶活性;另一条是B (Binding)链，这两条链通过二硫键和非共价键连接[2，3]。蓖麻毒是一种典型的核糖体失活蛋白，由于蓖麻毒来源广泛，禁止化学和生物武器公约把蓖麻毒列为最为严格的控制对 [4，5]。因此，开展对蓖麻毒等核糖体失活蛋白的检测研究具有重要意义[6～8]。目前，检测核糖体失活蛋白的方法有免疫分析法和生物质谱法[9～11]。纳米材料因具有颗粒尺寸小、比表面积大、表面能高、表面原子所占比例大等特点而被广泛应用于蛋白检测中[12，13]。场流分离(Field flow fractionation， FFF)是Giddings提出的一种新的分离分析理论[14，15]，它将流体与外加场联合作用于样品，实现样品组分的分离。场流分离技术可分离提纯、收集流体中范围为0.02～1 μm的悬浮物颗粒， 也可作为一种表征技术对样品中纳米颗粒的质量、密度、电荷及其它物理参数的准确测定。场流分离技术根据外加场的不同，可分为沉降场、流体场、热力场、电场和磁场等多种分支，其中沉降场流分离(Sedimentation field flow fractionation)技术较为完善且应用较多[16，17]。
本研究建立了纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白的方法。以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异性单抗，利用沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征，测量出单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分子数目，并利用扫描电镜比较聚苯乙烯纳米颗粒的形貌变化。通过扫描电镜图片能够观察到聚苯乙烯纳米颗粒表面结合的蛋白，此纳米颗粒探针能够与核糖体失活蛋白的特异性结合，可应用于目标蛋白的检测。
2 实验部分
2.1 仪器与试剂
沉降场流分离仪(Postnova， UT， USA);Anton Paar DMA (60/602)振动管密度计(奥地利Anto Paar公司); 场发射扫描电镜 (LEO 1550 EDS/OPAL/EBSD/STEM， Zeiss， Thornwood， USA); Sputter Coater SC7640 离子溅射仪(Quorum Technologies， UK); NAP5及NAP10凝胶渗透柱(通用公司); 5417C离心机(德国Eppendrof公司)。
蓖麻毒素A链(Ricin A Chain， 纯度 98.99%)及其单抗IgG均由美国农业部西部研究中心友情提供;聚苯乙烯纳米颗粒 (240 nm，10%，w/V， Bangs Laboratories Inc. PA， USA);NH4HCO3 (>99.5%)、表面活性剂FL70(Fisher公司);实验用水为MilliQ超纯水 (> 18 MΩ)。纳米颗粒探针制备用试剂套装(含聚氧乙烯聚氧丙烯聚氧乙烯嵌段共聚物(F108PDS)、3(2吡啶二巯基)丙酸N羟基琥珀酰亚胺酯 (SPDP)、二硫苏糖醇(DTT)和磷酸盐缓冲液，pH 7.4)购自Sigma公司。
2.2 实验方法
2.2.1 离心沉降分离检测技术 场流分离技术可视为一种单相的色谱技术，其系统设计为在超薄的样品分离通道的垂直方向上引入一个可调控的外加场(如重力场、离心场等)[11～13]。含有纳米颗粒悬浮液样品在流动相的作用下流过分离通道。当样品进入通道后，样品将暂停一段时间(即Relaxation time，停留注射或松弛步骤)。此时样品中的不同组分由于物理性质的差异， 在外加场的作用下，靠近通道壁的流体比中心处流得慢，不同质量的纳米颗粒在通道中的流速差别会导致其相应的保留时间较大的差异，在流体及外加场的联合作用下，样品组分就得到了分离，沉降场流分离仪结构[18]及分离原理如图1所示。
分 析 化 学第38卷第5期全 灿等：纳米颗粒探针检测核糖体失活蛋白 图1 (a)沉降场流分离仪结构图[18]和(b)沉降场流通道分离原理示意图
Fig.1 (a) Structure diagram of the fieldflow fractionation(FFF) system[18]and (b) working principle scheme of FFF channel纳米颗粒在尺度为940 mm×20 mm×0.254 mm的线型光滑通道中进行，该通道的空隙保留体积为4.49 mL，死体积为0.439 mL，外加场为离心力场。检测时将线型光滑通道置于离心场中随离心机轴向旋转，距离离心机轴的径向距离为15.5 cm。流动相为流速为1.5 mL/min的0.1% FL70溶液。样品进样体积为10 μL，松弛时间为12 min以确保样品在分离通道中平衡，离心机转速500～2000 r/min，紫外检测器波长为254 nm。聚苯乙烯纳米颗粒的密度为1.053 g/cm3[19]。利用振动管密度计测定0.1% FL70的流动相密度为997.1 kg/m3 [20]。
2.2.2 纳米颗粒表面修饰 利用修饰剂F108PDS对聚苯乙烯表面进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂F108PDS (10 g/L)加入到聚苯乙烯纳米颗粒悬浮液中，在一定条件下使聚苯乙烯颗粒表面物理吸附足够量的修饰剂F108PDS，经分离机离心分离未结合或结合不紧密的修饰剂F108PDS，弃去上清液后用磷酸盐缓冲液重新稀释纳米颗粒，重复上述步骤3次并合并悬浮液涡旋混合，取10 μL纳米颗粒悬浮液样品进行离心沉降分析。
2.2.3 蓖麻毒单抗表面修饰 利用修饰剂SPDP对蓖麻毒单抗进行修饰，并利用离心沉降分离仪进行表征：按比例取适量修饰剂SPDP 加入到蓖麻毒单抗溶液(2.0 g/L)中，在一定条件下反应后，利用NAP5柱分离除去过量的修饰剂SPDP及一些小分子反应产物，再加入适量修饰剂DTT，再利用NAP10柱分离除去过量的修饰剂DTT。
2.2.4 纳米颗粒固定单抗 将端基化的抗体与经表面修饰后的聚苯乙烯纳米颗粒温和反应，离心除去未结合及结合松散的抗体上清液，用缓冲盐再次悬浮并涡旋混合，再离心沉淀的纳米颗粒，即得到具有特异性抗体修饰的纳米探针颗粒，取10 μL纳米探针颗粒悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体结合的程度。
2.2.5 蓖麻毒蛋白的检测 取5 μL蓖麻毒蛋白，加入到2.2.4节制备得到的纳米颗粒探针中，恒温反应。取10 μL纳米探针颗粒悬浮液进行FFF分析，测定其表面抗体与蓖麻毒蛋白的结合程度。
2.2.6 扫描电镜法 将固含率为1%的聚苯乙烯纳米颗粒悬浮， 液滴在带有碳膜的电镜用铜网上，待悬浮液中的载液用氮气吹干后，利用离子溅射仪进行离子溅射镀膜，最后将样品放入电镜样品台上进行扫描电镜观测。 图2 纳米颗粒探针制备机理
3 结果与讨论
3.1 实验机理
以聚苯乙烯纳米颗粒为载体，经表面修饰后在其表面固定特异性单抗，利用离心沉降场流仪对纳米颗粒探针进行准确表征，测量出单个聚苯乙烯纳米颗粒结合的目标分子的数目，实验机理如图2所示。由于聚苯乙烯纳米颗粒比表面积大，在溶液中分散性好，本实验中纳米颗粒的抗原包被、免疫反应均在准均相溶液中进行，反应更充分，反应物用量更少，反应更完全，可用于痕量、超痕量目标分子的快速检测。
3.2 沉降场流分离法
在2.2.1节的实验条件下，聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图如图3所示，保留时间约为46 min。 图3 聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图
Fig.3 Fractogram from typical FFF analysis of bare polystyrene(PS) particles
利用沉降场流分离技术测定纳米粒径的原理的报道较多，根据在外加力场作用下，不同质量的纳米颗粒在分离通道中具有不同的保留时间进行分离。在一定实验条件下，通过测定的纳米颗粒的保留时间Tr， 计算纳米颗粒的水力学粒径d， 如式(1)：R=V0/Vr=6λ[coth0.5λ-2λ](1)
Vr=TrF(2)其中，V0为分离通道空隙体积(Void volume)，Vr为一定粒径的保留体积，F为流动相流速，根据实验测得的保留体积值，由式(1)计算出λ，同时λ=KT/[ma(1-ρc/ρα)Gw]=6kT/d3(ρa-ρc)πGw(3) 其中，d为聚苯乙烯纳米颗粒的粒径，k为玻尔兹曼常数(k=1.3806503×10-23)，T为实验温度(K)， ρc为流动相密度(997.1 kg/m3)， ρa聚苯乙烯纳米颗粒的密度(1.053 g/cm3)，w为分离通道的厚度(0.0254 cm)， G为外加离心力场，由式(3)得出: G=2πv602×dc(4)其中v为离心机的转速， dc为分离通道距离离心机轴的径向距离，本仪器中为dc=15.5 cm。
由式(3)和式(4)可计算出粒径d，经多次重复测量，聚苯乙烯纳米颗粒的粒径为246 nm。
3.3 反应条件的影响
实验研究了反应条件的影响，考察反应时间以及搅拌对纳米颗粒表面修饰效果的影响。利用沉降场流分离仪进行测定，保留时间越长，表明聚苯乙烯纳米颗粒的表面修饰效果越好。沉降场流分离谱图如图4所示。由图4可知， 在24 h的反应时间中，通过搅拌可以增强表面修饰效果，保留时间从46.9 min 增加到50.1 min。在表面修饰反应过程中，不论是否搅拌，延长反应时间均有利于改善表面修饰效果，保留时间有显著增大趋势;反应6 d后进一步延长时间则无显著性效果。通过优化实验，本实验反应时间选择24 h，并伴随搅拌。
图4 聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图
Fig.4 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles
A. 聚苯乙烯祼珠(Bare PS particles， RT=45.288 min); B. 1天没有搅拌(1 Day without stiming， RT=46.860 min); C. 3天没有搅拌(3 Days without stiming， RT=48.368 min); D. 7天没有搅拌(7 Days without stiming， RT=53.556 min); E. 1天有搅拌(1 Day with stiming， RT=50.060 min); F. 6天有搅拌(6 Days with stiming， RT=54.220 min)。3.4 纳米颗粒探针的准确表征
图5 聚苯乙烯纳米颗粒典型的沉降场流分离谱图
Fig.5 Fractogram from FFF analysis of 240 nm polystyrene particles
A. Bare PS particles; B. F108; C. F108IgG; D. F108IgGRicin.制备得到的纳米颗粒探针基体为聚苯乙烯纳米颗粒、依次包被了F108PDS、蓖麻毒抗体以及蓖麻毒蛋白。图5为聚苯乙烯纳米颗粒及其经过多层包被的沉降场流分离谱图，各层的密度均大于沉降场流分离过程中流动相的密度，各层吸附在聚苯乙烯纳米颗粒上使其总质量增大，表现为沉降场流分离过程中保留时间的延长。
吸附各层的质量可通过各自的保留时间计算，结果见表1。单个纳米颗粒的粒径为246 nm; 根据其密度可以计算出单个聚苯乙烯纳米颗粒的质量为9.4×10-18 g/PS; 根据吸附各层的质量可计算出每个聚苯乙烯纳米颗粒上结合约16510个F108PDS分子，923个IgG抗体分子和1665个Ricin 蛋白分子。表1 纳米颗粒探针多层表面组成沉降场流分离计算结果
3.5 扫描电镜法测定结果
图6A和6B分别为聚苯乙烯纳米颗粒及其结合了蛋白的扫描电子显微镜图。图6A可见清晰的球形聚苯乙烯纳米颗粒，而图6B则非常模糊，包被有其它物质，且纳米颗粒也略呈椭球型不规划颗粒，表明聚苯乙烯颗粒在探针制备前后其形貌有显著性变化。但鉴于仪器的分辨率限制，本实验中未能观测到聚苯乙烯颗粒在探针制备前后纳米颗粒粒径的显著性变化。
研究结果表明，研制的纳米颗粒探针能够与蓖麻毒蛋白等核糖体失活蛋白的特异性结合，可应用于目标蛋白检测，对于痕量、超痕量的核糖体失活蛋白的检测具有重要意义。
参考文献
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纳米抗体技术范文4
生物传感器是由生物活性单元(如酶、抗体、蛋白质、核酸和细胞等)和信号转换器组成并利用生物识别原理来进行检测的一种装置［1］。它是一种由生物、化学、物理、医学和电子技术等多种学科互相渗透成长起来的高新技术，具有选择性好、灵敏度高、分析速度快、成本低、在复杂的体系中进行在线连续监测，及其易于自动化、微型化与集成化的特点。特别是近年来分子生物学、微电子学、光电子学、微细加工技术及纳米技术等新学科和新技术的进展，使生物传感器的研究蓬勃发展，成为新兴的高技术产业的重要组成部分。根据分子识别元件与待测物结合的性质可将生物传感器分为生物催化型(代谢型)和生物亲和型(受体型)。生物亲和型传感器是利用分子间特异的亲和性，即生物活性物质对底物的亲和或键合作用而建立起来的，如免疫传感器、受体传感器和DNA传感器等。根据生物反应产生信息的物理或化学性质，可采用电化学、光谱、热、压电和表面声波等技术进行检测［1］。本文按照传感信号方式的不同，对近年来亲和型生物传感器在生物医学上的进展予以综述。
1免疫传感器
癌症是人类健康的杀手，是否能较早诊断出癌症的前期征兆是影响癌症患者恢复的关键因素。众所周知，在肿瘤发展的过程中，肿瘤组织或细胞会释放出一些特异性的蛋白质进入循环体系，而这些特异性蛋白在血液中的含量水平标志着肿瘤发展的阶段，所以在生物医学上常将这些特异性蛋白称为肿瘤标记物。临床医学上常将这些肿瘤标记物的检测作为临床检验和诊断的重要依据［1］。生物化学、酶联免疫和分子生物学等多种方法已用于肿瘤标记物的检测，虽然这些方法具有较高的选择性、准确度，但是存在辐射威胁、耗时和费用较高等缺点。由于免疫传感器结合了免疫反应的特异性分子识别和便利的检测技术而得到研究者的普遍关注，故开发快速而准确的肿瘤标记物的免疫传感器成为生物医学检测的研究热点。肿瘤标记物一般分为以下几类:酶、糖蛋白、粘糖蛋白、激素、免疫分子和癌基因等。临床医学实践表明，甲胎蛋白(AFP)、降血钙素(CT)、癌胚抗原(CEA)、人绒毛膜促性腺素(hCG)、前列腺特异抗原(PSA)、鳞状上皮细胞抗原(SCCA)、神经元特异性烯醇酶(NSE)和CA(CarcinomaAntigen)等均是典型的肿瘤标记物［1］。如肠癌的肿瘤标记物为CEA、CA19-9和CA24-2;前列腺癌的肿瘤标记物为F-PSA、PSA和PAP。按照免疫传感器检测信号的不同，可分为电化学型、光学型和质量敏感型等。
1．1电化学免疫传感器
电化学免疫传感器可再分为电位型、电容型和电流型。电位型传感器在免疫传感中应用不多。梁茹萍等［2］利用戊二醛交联CA15-3抗体的电位型免疫传感器用于乳腺癌CA15-3的检测，获得了良好的检出限(5U/mL)和稳定性(30d)。Fu等［3］制备了40nm的氧化铁纳米柱修饰碳糊电极，用于固定CEA建立了测定CEA的电位型免疫传感器。其线性范围为1.5～80μg/L，检出限为0.9μg/L。对临床血液样本的检测结果与酶联免疫法相符合。Zhou等［4］将纳米金吸附在溶于PVC的邻苯二胺的氨基上，制备了一种增塑的PVC膜的电位传感器用于α-AFP的检测。该传感器的响应时间短(4min)、检出限低(1.6μg/L)。但电位型免疫传感器的不足之处在于:信噪比较低，线性范围窄，非特异性抗体-抗原作用及背景信号较高。电容型免疫传感器是一种高灵敏非标记型免疫传感技术。在电容型免疫传感器的制作中，传感界面的构建和生物识别层的固定是影响其性能的重要因素。可采用半导体氧化物膜、自组装单分子膜、电聚合膜、溶胶凝胶膜和等离子体聚合膜等来构建电容型免疫传感器。Fernandez-Sanchez等［5］研制了可以用于检测PSA的免疫传感器。他们将对pH敏感的聚合物附着在电化学传感器的表面，用于快速而灵敏地检测亲和反应过程中的电容及阻抗变化，实现了对PSA的灵敏检测。Quershi等［6］在纳米晶钻(NCD)-interdigitatedgold(GID)电极表面固载抗体，进而通过电容法测定心血管标记物CRP。结果表明，电容器的灵敏度表现在两个方面，一是当抗体与抗原结合后，极化常数和弛豫时间常数明显增大，二是传感器的灵敏度与抗体浓度及施加频率紧密相关。袁若等［7］报道了一种在玻碳电极表面修饰金纳米粒子，进而吸附CEA抗体，用铁探针离子的阻抗特性来检测CEA，获得了良好的检出限和灵敏度。
Rajesh等［8］在ITO修饰电极上利用自组装膜固定α-CRP，利用电化学阻抗法检测α-CRP抗体与抗原的亲和作用，其检出限达到3.5μg/L。由于电容法和阻抗法可以获取直接、非标记的亲和信号，所以在临床诊断上具有良好的发展前景。但电容法存在的问题在于响应电容易受到非特异性吸附的影响，其重现性不如法拉第阻抗法与伏安法。所以如何优化传感界面，改善响应电容的重现性和稳定性仍是电容型免疫传感器发展中的关键问题。电流型免疫传感器备受研究者的关注。由于大多数待测物不能直接参与电化学反应，常采用加入电子媒介体和标记酶来催化底物转化为电活性物质来制备传感器。虽然加入电子媒介体会降低检出限，但其分离和洗涤步骤限制了它在生物医学上的广泛应用。而基于标记酶的直接电子传递的免疫传感器则简化了分离和洗涤步骤，在生物医学上的应用更有吸引力。鞠幌先研究组曾对肿瘤标记物的电流型传感器进行了深入的研究［9-12］。如将硫堇和HRP标记的CEA抗体通过戊二醛交联在电极表面，制成了一种具有良好稳定性的传感器。该传感器减少了加入电子媒介体的麻烦，并且不需乳化和洗涤，线性范围为0.5～3.0和3.0～167μg/L，检出限为0.1μg/L，重现性良好［10］。他们还研究了基于HRP的直接电子传递的免疫CEA传感器，对CEA的检出限为0.3μg/L，并将实际样品的检测结果与临床检测方法相比照，获得了满意的结果［12］。除此之外，研究人员还结合纳米粒子的电子传导、丝网印刷技术、微流控装置、毛细管电泳和流动注射等技术对肿瘤标记物的检测进行了研究。
Jin等［13］结合毛细管电泳和电化学检测技术，对肿瘤标记物CA125进行了检测。Kojima等［14］设计了一种包含36个Pt微电极的阵列，运用不同的抗体来捕获肿瘤标记抗原，采用电化学免疫检测技术实现了多标记物的同时检测。Wilson等［15］采用双电极的免疫传感器同时采用安培法测定了CEA和AFP，获得了1μg/L的低检出限，并有效抑制了交叉干扰。研究表明，这些新技术在免疫传感器中的引入，不仅降低了待测物的检出限，而且可以有效降低共存物质的干扰，并可实现多通道同时检测多种肿瘤标记物。由于纳米材料的独特性质，使其在实时、灵敏检测标记物方面具有广泛的应用前景。如Zheng等［16］利用抗体功能化的二氧化硅纳米线制备了一种新型传感器，用于在血浆中的癌症标记物的非标记实时监测。Ramanathan等［17］和Willner等［18］曾报道利用聚合物纳米线和碳纳米管进行相关生物亲和体系内标记物的检测。Wu等［19］将CEA/纳米金通过壳聚糖固定在丝网印刷电极上，结合流动注射法建立了一种快速而方便的CEA电化学免疫传感器，CEA检测的线性范围为0.50～25μg/L，检出限为0.22μg/L。该传感器通过流动注射HRP-anti-CEA，故可以控制乳化时间，并易于自动化。Wang等［20］将聚鸟嘌呤功能化的二氧化硅纳米粒子标记坏疽抗体的夹心型传感器用于坏疽因子的电化学测定，可直接用于生物样品中坏疽因子的检测，检出限为2.0pmol/L。Chen等［21］在玻碳电极表面气相沉积纳米金/硅溶胶，将HRP功能化的hCG抗体固定于其上，建立了一种无试剂的电化学免疫传感器用于hCG的灵敏检测，其检出限为0.3mIU/mL。Wang等［1］对近年来功能化碳纳米管在肿瘤标记物上的应用进行了综述。#p#分页标题#e#
1．2光学免疫传感器
由于光学免疫传感器具有非破坏性操作、快速获取信号及使用可见光辐射等优势，故在肿瘤标记物的检测中占有重要地位。根据其检测原理，光学免疫传感器可分为荧光、化学发光和表面等离子体共振等类型。近年来，荧光检测在临床诊断和检测中获得了很大的进展。Nakamura等［35］结合流动注射系统和阳离子交换树脂毛细管柱制备了hCG免疫传感器。利用离子交换柱来分离FITC-IgG和FITC-IgG抗体，然后利用荧光检测hCG，其线性范围为25～1500mIU/mL。Yan等［36］将免疫亲和反应柱与流动注射体系相连接，然后通过时间分辨荧光免疫检测法进行CEA的测定(如图1所示)。纳米材料特别是量子点的引入，使荧光型生物传感器的发展尤为引人瞩目，Zhong［37］对近年来基于荧光生物传感中纳米材料的应用进行了综述。Hong等［38］对纳米金、溶剂对荧光团的荧光效应进行了比较研究，发现纳米金试剂的荧光增强效应可以使肿瘤标记物的检出限降低10倍，并且对心血管标记物CRP的检出限可低至数10pmol。化学发光免疫传感器多采用直接化学发光、化学发光基底标记和酶标记等3种技术。但大多数化学发光免疫传感器是利用酶增大检测信号，并与流动注射系统相结合来提高其检测自动化性能。Ju等［39］对化学发光免疫传感器的自动化进行了较多研究，并对近年来电化学发光传感器在肿瘤标记物方面的应用进行了综述。
Jie等［40］首次以gold/silica/CdSe-CdS杂交纳米结构制备了灵敏的电化学发光生物传感器，用于测定CEA，获得了良好的效果。虽然化学发光免疫传感器的灵敏度高，选择性好，但是改善肿瘤标记物的固定化技术和传感器的微型化、集成化仍是化学发光免疫传感器的发展方向。表面等离子体共振(SPR)是利用金属膜/液面界面光的全反射来分析生物分子相互作用的一项新兴技术，生物传感芯片是SPR传感器的核心部分。它对免疫特异识别、蛋白质折叠机理、生物特异相互作用的结合位点及浓度分析上具有独特的优势，并且可以获得很低的检出限(10－13～10－9mol/L)。可实时监测生物大分子之间的相互作用及其影响因素的作用环节，成为疾病诊断和机理研究的有效工具。Chou等［41］将抗人铁蛋白单克隆抗体固定在SPR敏感的金表面，建立了人铁蛋白的SPR免疫传感器，可以测定非特异性肿瘤标记物人铁蛋白。Yu等［42］基于表面等离子体的衍射建立了hCG的免疫传感器。Corso等［43］将抗体通过自组装膜固定在金表面，建立了一种实时灵敏监测胰腺癌的肿瘤标记物间皮蛋白的声波免疫传感器，可以检测纳克级的间皮蛋白(mesothelin)。近年来，诸多研究集中在如何克服SPR传感器检测小分子灵敏度低的问题，相信随着SPR传感器在肿瘤标记物研究上的深入，其在生物医学领域的应用将更为广泛。
1．3质量型免疫传感器
石英晶体微天平(QCM)型免疫传感器由于其非标记和实时监测的特点使其在肿瘤标记物的检测中也有较多应用。Zhang等［44］制备了一种2×5模式的多通道压电QCM用于检测血液和尿液中的hCG，其检测效率高，比单通道检测的速度快8倍以上。Kim等［45］在微芯片上制备了检测心血管标记物CRP的QCM免疫传感器，对CRP的检测线性范围宽，达到0.13～25016μg/L，检出限为0.13μg/L。
1．4免疫传感器在多分析物同时检测中的应用
在医学临床诊断中，某一种非特异性肿瘤标记物的值升高并不能确诊癌症，常需要进行多个肿瘤标记物的同时检测，才能获得准确的诊断结果［1］。Matsumoto等［46］报道了一种利用时间分辨荧光免疫传感器同时测定α-AFP和CEA，他们采用Eu标记的抗AFP抗体及Sm-标记的亲和素来测定α-AFP和CEA，获得了较低的检出限，它们的检出限分别为0.07和0.3μg/L，并在实际样品的测定中获得了良好的准确度。Song等［47］用微分析系统荧光免疫传感器同时测定了CEA、AFP、β-HCG、CA125、CA19-9和CA15-3，均获得了较宽的线性范围，对于CEA、AFP、β-HCG为0～640μg/L，对于CA125、CA19-9和CA15-3为0～1280μg/L。Kojima等［14］将捕获抗体固定在双层硅氧烷层中，制备了微蛋白质芯片用于AFP和β2-微球蛋白的电化学免疫检测，由于采用了夹心型的结构，有效降低了酶催化产物的扩散而获得较高的灵敏度。Wu等［48］用醋酸纤维素共固定硫堇和2种抗原于丝网印刷芯片的碳电极上，用于CA19-9和CA125的电化学免疫测定，其检出限分别为0.2和0.4U/mL。Fu等［49］采用双通道体系化学发光免疫同时检测α-AFP和CEA，对α-AFP和CEA的检出限分别达到1.5和0.25μg/L。Wilson等［50-52］将微芯片技术与电化学免疫结合，分别进行了CEA、AFP，4种不同的蛋白质及7种肿瘤标记物的同时检测。他们采用多个IrOx传感器来降低酶催化产物的扩散，进而在电极上获得良好的电化学响应，并获得了较低的检出限。Qureshi等［53］利用GID电极电容法同时检测抗CRP、α-TNF和IL6，其检测范围为25pg/mL～25ng/mL，为心血管患者提供了良好的前期诊断。能同时检测多个肿瘤标记物的免疫传感器及微流控芯片系统的应用，在癌症的预期诊断方面是现今重点发展的方向。
2适体生物传感器
核酸适体是一种能够与蛋白质、小分子、离子、核酸、甚至整个细胞等目标分子结合，通过指数富集的配位系统进化技术(SELEX)经体外筛选的人工合成寡聚核苷酸或肽分子。适配体还具有分子量小、易体外合成和修饰、化学稳定性好等优点，常被称为“化学抗体”，故一经出现便成为化学工作者用于分子识别和靶标物检测研究的得力工具，为生物分析方法和传感器的设计开辟了新的思路［54］。核酸适体可形成一些稳定的三维空间结构，如发夹、假结、凸环和G-四链体等结构。分子识别时，在目标分析物诱导下单链核酸适体会折叠成特殊的二级结构。常见的适体与靶体之间的作用有单位点结合和双位点结合(夹心型)2种。研究表明，适配体的结构稍有差异，则靶分子与其结合就受到阻碍［54］。显然，适体的这些特点对于发展高灵敏、高选择性和快速高通量的靶标分子分析检测十分重要，并日渐成为分析化学领域的研究和应用热点。研究人员已经成功地创建了大量基于核酸适体的分析新方法，包括电化学法、荧光、比色法、压电和SPR等［55-57］。
2．1电化学适体传感器
电化学适体传感器集合了核酸适体和电化学传感器的优势，成为近年来的一个研究热点。在阻抗型电化学适体传感器中，适体的固定化程序至关重要。通常有混合自组装膜和在自组装膜上共价固定等几种方法。Wang等［58］首次报道了识别诱导表面电荷转换的FIS适体传感器。结果表明，如果体系pH低于目标蛋白pI，则蛋白质的识别将扭转表面电荷状态，促进电子转移，因而会降低电荷转移阻抗。Liao等［59］将适体固定在硅电极表面，用于检测神经炎细胞因子PDGF，建立了一种无试剂的阻抗生物传感器，其检出限达到40nmol/L。Kwon等［60］以抗血管内皮生长因子(VEGF)适体与羧基聚吡咯纳米管构建了场效应晶体管用以测定VEGF，其检出限为400fmol/L，可用于实时检测VEGF。当核酸适体与特定的蛋白质结合时，有典型的构型变换，而抗体则没有这样的性质，利用这个性质可以设计构型变换型适体传感器。通常，将适体信标的一端修饰官能团用于电极表面的固定化，另一端修饰电活性标记物来产生电信号。电信号的大小是由活性标记物与电极表面之间的距离决定的。Xiao等［61］将亚甲蓝标记的抗凝血酶适体固定在电极表面，制备了一种基于电化学开关效应测定凝血酶的生物传感器(如图3A所示)，但该种传感器在靶分子与适体结合后信号减小。为了克服这个问题，Radi等［62-63］设计了另一种开关装置用于凝血酶的测定(图3B)。由于四链体的形成，二茂铁与电极之间的距离大大减小而显示出电化学信号。#p#分页标题#e#
由于适体的刚性较差，所以存在较大的背景信号，降低了信噪比和检出限。Zuo等［64］将二茂铁功能化的抗ATP适体固定在电极表面，在ATP存在下，互补序列解离而与ATP结合成三维的刚性结构，进而二茂铁与电极表面发生电子传递，显示出开关的作用，ATP的检测范围较宽(10nmol/L～1mmol/L)并具有高的灵敏度(图3C)。Fan等［65］将3'-端连有羧基二茂铁的发卡式结构DNA探针通过5'-巯基固定在金电极上，根据标记物杂交前后与电极表面距离的变化进行电化学检测，对目标DNA的检出限达到1.0×10－11mol/L。他们将该方法应用于PCR扩增产物的研究，该方法具有PCR扩增产物无需后续纯化、快速检测的优点。Chu等［66］提出了基于免疫-RCA的适体电化学传感器用于PDGF-BB的超灵敏检测。在电极表面形成抗体-PDGF-BB-适体-引物复合体这样的三明治结构后，引入一种与引物结合的“C”型挂锁探针。该方法结合了滚环扩增和酶催化两步放大，实现了PDGF的超灵敏检测，下限可达10fmol/L。Huang等［67］采用类似原理将PDGF-BB采用抗体和适体-引物捕获到电极表面，通过嵌入MB产生电化学响应，其检测限为18pg/mL。这种基于靶分子的结合而引起构型变换的电化学传感器，提供了一种无试剂、再生和灵敏的方法用于复杂样品中目标分析物的检测。一些平面分子如亚甲蓝、Ru(NH3)3+6、功能化二茂铁等也可以插入双链DNA中并经DNA碱基对π堆积实现电子转移而被氧化，进而利用特异性序列与蛋白质的作用进行电化学检测。Jin等［68］利用5'-SH的发卡式结构探针固定于金电极表面，用亚甲基兰为杂交指示剂检测P53基因，并对不同位置的单碱基错配序列进行了研究。该方法无需对发卡式DNA探针进行标记，实验证明发卡式DNA探针有很高的杂交特异性，可以识别单碱基错配序列，并且错配碱基位于环中央时对杂交效率影响最大。
Zhang等［69］在金电极阵列上分别自组装巯基发卡式DNA探针，采用亚甲蓝为杂交指示剂，方波伏安法检测了人体免疫缺陷蛋白HIV-1和HIV-2，对二者的检出限均达到了0.1nmol/L。Mir等［70］对凝血酶的不同适体生物传感器的制备方式对测定结果的影响进行了详细的比较研究。适体在与靶标分子特异性结合后，其三级结构将发生改变，随之发生变化的有适体的电荷密度、吸附性质和空间位阻等一系列因素。采用纳米材料不仅可以将上述这些变化因素转化为可检测的光学、电化学信号，而且还可以提高分析检测的灵敏度。Numunuam等［71］首次以CdS量子点标记二级适体，建立了夹心型电位法测定蛋白质的电位传感器，凝血酶的检出限为0.14nmol/L。Hansen等［72］利用CdS量子点修饰适体建立了7种不同蛋白质的同时电化学检测，其检出限为0.5pmol/L，而且具有良好的选择性。该方法为超痕量的生物标记物的检测及肿瘤的早期诊断提供了可能。Polsky等［73］利用Pt纳米粒子功能化的适配体进行了凝血酶的电化学检测。由于纳米粒子对过氧化氢的催化还原，放大了电信号而使凝血酶的检测限降低到纳摩尔的水平。He等［74］将含有聚腺嘌呤序列的抗凝血酶适配体对纳米金予以功能化，然后基于凝血酶与抗体的特异性作用固定在电极表面，然后腺嘌呤核糖酶降解释放而直接在热解石墨电极上检测。由于纳米粒子可以载带较多的适配体，所以检测灵敏度可以降低至0.1μg/L。Li等［75］在金电极上预先修饰2种分别含有腺苷酸和凝血酶的适体，捕获探针预先用纳米金及硫化物纳米粒子固定的DNA链杂交，构成了一种夹心型的传感器用于腺苷酸和凝血酶的阳极溶出伏安测定，其检出限分别为6.6×10－12和1.0×10－12mol/L。Velasco-Garcia等［76］和Hianik等［77］对适体电化学生物传感器的研究进展进行了评述，并对其发展前景进行了展望。总的来说，虽然报道的多种构建电化学适体传感器的方法获得了较为满意的分析性能，但对电化学适体传感器的分析性能和各项参数的研究和评价还不充分，在实际体系中的应用也还需要拓展。
2．2光学适体传感器
随着能与蛋白质等生物大分子特异结合的适体的筛选和发现，基于纳米材料的比色技术日渐成为生物大分子识别和检测的有力工具。由于适体-纳米粒子的比色检测灵敏度高、操作简单，因而对蛋白质分析和癌症的诊断具有重要意义。图4为比色法测定蛋白质的基本原理。Mao等［78］利用分子信标的特异性识别特性和金纳米粒子的光学特性，建立了快速、灵敏而价廉的检测DNA的方法。Liu等［79］报道了一种纳米粒子-适体的生物传感器可直接用于血液中癌细胞拉莫斯细胞的比色法检测，为循环系统的癌细胞提供了一种快捷灵敏的检测方法，对癌症的诊断和治疗具有较大的作用。Lee等［80］利用SPR适体生物传感器检测视黄醇结合蛋白4(RBP4)用于二型糖尿病的诊断。该种方法避免了传统免疫学检测的测定干扰，可直接用于血液中RBP4的检测。Huang等［81］采用适体-纳米金实现了对乳腺癌标志物PDGF-AA、PDGF-AB、PDGF-BB的检测，其检出限均能达到纳摩尔水平。Medley等［82］以适体修饰的金纳米粒子实现了急性淋巴细胞白血病CCRF-CEM细胞的检测，并使用伯基特淋巴瘤Ramos细胞做对比检测，探针对靶标细胞有特异识别，其检出限为90个癌细胞。该纳米比色探针的选择性和灵敏度令人满意。与传统方法相比，比色法用于蛋白质分子检测有明显优势，如所需药品及材料均较廉价，避免了生物分析中的复杂修饰和分离，不仅保证了适体与靶分子的高度亲和性，还极大地简化了分析检测步骤，能很好的满足对现场快速检测的需求。相信这种方法将以其高灵敏、低成本和较简便等优势在生物分析和医学检测等领域得到广泛应用。与比色法相比，荧光法由于灵敏度高、特征参数多、动态范围宽和适体与纳米粒子作用方式灵活多样等优点，而更具发展潜力。最常见的光学分子信标就是发卡式分子信标，即适体序列的两端分别标记一个荧光团和淬灭团，当靶分子与特异序列结合后，原本相近的荧光团和淬灭团分开，进而显示出荧光信号。
另一种是在一个已知DNA序列上分别配合带有荧光团和淬灭团的DNA序列，当靶分子与适体进行特异结合后，淬灭团序列离开，而显示出荧光，并用于检测靶分子［83］。Huang等［84］将与DNA具有亲和性的DMDAP加入到PDGF适体修饰的纳米金溶胶中发生荧光淬灭，靶分子PDGF的加入使DMDAP释放到溶液中，进而荧光恢复，实现了对PDGF的荧光检测，其检出限可达8pmol/L。量子点与适体的结合则大大提高了其在细胞研究中的功能，为癌细胞的影像诊断技术及细胞内的药物转运提供了可能。Bagalkot等［85］发展了由阿霉素、适体和CdSe/ZnS量子点组成的双荧光共振能量转移体系，并将其成功应用于体外前列腺癌细胞的影像、治疗和药物运输。由于荧光检测法固有的高度灵敏性和多种纳米材料技术的使用，荧光生物传感在生物医学领域的研究将有更大的发展和应用空间。Zhang等［86］将钌联吡啶衍生物作为标记物，连接到发卡式DNA上制成电化学发光探针，将其自组装到金电极上构成新型电化学发光传感器，根据杂交前后电化学发光信号强度的不同进行目标序列的检测。实验结果表明，该发卡式DNA电化学发光传感器有较高的杂交特异性，能够识别单碱基和多碱基错配序列，检出限为9×10－11mol/L。该传感器具有较高的检测灵敏度，且无需对目标分子进行标记，有望应用于疾病检测等医学领域。Huang等［87］将含有15个碱基的巯基适体固定在金电极表面，用以结合凝血酶;另以29个碱基的生物素修饰的适体与凝血酶杂交形成夹心型结构。用亲和素修饰的量子点对生物素-亲和素的作用进行检测，制备了一种新颖的化学发光适体传感器。该传感器对凝血酶的检测线性范围为0～20mUg/mL。Pollet等［88］首次将光纤SPR传感器与DNA适体相结合制备了一种可重复使用、经济而非标记的适体传感器用于研究DNA杂交及DNA-蛋白质之间的相互作用。该传感器不仅可对DNA和蛋白质进行定量，而且还可以用于研究它们结合的动力学常数。#p#分页标题#e#
2．3质量型适体传感器
质量型适体生物传感器是非标记的生物测定技术，包括微波传感器、石英晶体微天平、表面声波装置和微机械悬梁式传感器。微重石英晶体微天平常用于检测靶分子与适体之间的相互作用。Tombelli等［89］和Hianik等［90］将生物素化的适体固定在金/石英晶体表面用于测定凝血酶和HIV-1Tat蛋白，其检出限分别为1nmol/L和0.25μg/L。机械悬梁式生物传感器具有较高的分辨率和稳定性。Savran等［91］将2个相临近的悬梁臂上分别功能化相应的适体，一个用ssDNA阻塞，一个用以测定TaqDNA聚合酶。结果表明，聚合酶与适体的结合产生了3～23nm的悬臂弯曲，且弯曲的程度与聚合酶的浓度直接相关。Hwang等［92］用纳米机械悬梁式传感器研究了RNA适体与hepatitisCvirus解螺旋酶的相互作用，对HCV解螺旋酶的检出限达到100pg/mL。Yang等［93］将含有20个碱基的ssDNA通过巯基固定在金表面制备了悬梁式DNA传感器，用于研究DNA的杂交。结果表明，该传感器能区分靶分子并为高通量实时监测DNA提供了可能。Yao等［94］以QCM适体传感器测定人血浆中的IgE，其线性范围为2.5～200mUg/L。该传感器具有较高的特异性、低检出限、样品量少的优点，适于特异性蛋白质的检测。质量型适体生物传感器与传统检测方法相比，不需要任何标记，仪器简单、操作方便、响应灵敏、选择性好和便于自动化，将在生物医学领域的检测上发挥越来越重要的作用。
纳米抗体技术范文5
【关键词】量子点；生物医学；荧光；纳米粒子
1量子点的概念及特性
量子点(Quantum dots, QDs) 又称半导体纳米微晶体，是半径小于或接近于激子玻尔半径的一类无机半导体纳米粒子，主要由ⅡB - ⅥA (如CdSe，CdTe，ZnSe 等) ，ⅢA-ⅤA( 如InAs，InP 等) 组成的，粒径在1―10nm，能够光致发光的半导体纳米晶。
QDs具有一般纳米微粒的基本性质如表面效应、体积效应和量子尺寸效应,具有宽的激发光谱、窄的发射光谱、可精确调谐的发射波长，正是基于量子点独特的光学性质使得它克服了传统的用于标记或衍生的荧光试剂如荧光素类、罗丹明类等有机化合物存在荧光量子产率低、易光漂白及发射光谱宽等缺点。QDs 所具有的优异的光谱性能，在生物化学、细胞生物学、分子生物学、生物分析化学等研究领域显示出极其广阔的应用前景，并逐步地应用于蛋白质及DNA的检测、药物靶向治疗、活细胞生命动态过程的示踪及动物活体体内肿瘤细胞的靶向示踪等生物分析与医学诊断领域，并取得了丰硕的研究成果［1］。
2量子点的应用
2.1 量子点在细胞成像中的应用
对单个活细胞的一些活动进程进行高效、灵敏的监测将有助于阐明一些重要的细胞生理过程和药物代谢机制，有利于了解生物体的复杂性以及动力学特征。发展特异性和选择性的QDs 是细胞和生物分子标记的一大挑战。经巯基乙酸修饰的QDs 连接到转铁蛋白上后，再把QDs-转铁蛋白同表面存在大量转铁蛋白识别受体的HeLa 细胞一起培养，发现其可以被HeLa 细胞表面的受体识别并吞噬进入细胞内部，首次实现了QDs 应用于离体活细胞实验[2]。Tokumasu等［3］用偶联了抗体的QDs 标记血红细胞膜上的Band3 蛋白，实验中观察到了Band3 蛋白在细胞膜上的分布，证实了可以通过QDs 的标记观察在疟原虫入侵时红血球细胞膜的变化情况。Orndorff 等［4］使用具有高亲合性的神经毒素修饰QDs，然后标记了内在表达的癌细胞蛋白，揭示了经神经毒素修饰的QDs 可以作为一种鉴定癌细胞存在的评估标签。
2.2 量子点在活体成像中的应用
Sungjee等人[5] 将量子点注射到小鼠的前肢皮下和猪的腹股沟皮下，通过荧光显像系统就可以观察到前哨淋巴结的位置，为外科术中找到前哨淋巴结创造了便利的条件。
Gao等[6]研制了一种多功能QDs 探针，能够对动物活体内的肿瘤进行靶向并同时成像。该小组用QDs 成功实现了裸鼠前列腺癌模型的非损伤性成像,在活体模型中肉眼即可清晰观察到肿瘤的部位，这给前列腺癌的诊断和预后的研究开辟了一条新的思路。
2.3 蛋白质研究与分析
QDs在蛋白质检测与研究中的应用近年来引起了人们很大的兴趣。Chan等[7]发现在牛血清白蛋白（BSA）中，多克隆抗体能识别量子点标记的免疫球蛋白（IgG），使QDs聚集在一起；相反，若没有这种抗体，QDs-IgG 结合体就良好地分散于BSA中。这一试验结果证明用量子点标记的免疫球蛋白分子（IgG）能识别专一的抗原和抗体。Wang等[8]将红绿两种QDs分别标记BSA 和抗牛血清蛋白抗体（IgG），当两者形成免疫复合物时，BSA上的红色QDs荧光增强，IgG 上的绿色QDs荧光相应减弱。Ravindran等[9]将QDs用于植物黏附蛋白的定位，并通过与传统的免疫荧光染色技术的结果相比，证明了QDs在实际应用中的优势。张雨琴等[10]采用光度法研究了L-半胱氨酸修饰的ZnS纳米粒子与牛血红蛋白的作用及对蛋白质二级结构的影响，拓展了QDs在生物样品研究中的应用。
2.4 靶向药物传输
癌症早期检测治疗是目前医学界的重大课题。如果能够针对癌症的特异性分子变化给予有效的诊治，将会大大改善治疗效果。近年来，新型靶向药物在临床实践中取得了显著的疗效，已表明靶向治疗理论的正确性与可行性，把癌症的治疗推向了一个前所未有的新阶段。大分子药物要命中靶标需要有很强的透过和保留在细胞内的能力［11］。Shi等［12］研制出一种具有多种功能的纳米组合装置。这种装置以纳米管为基体，纳米管外表面经特殊处理后可偶联QDs，这种QDs 可应用于体内癌细胞的局部示踪。由于QDs 发光很强，可用于深度组织的显像和表征。纳米管外表面在经过特殊的等离子体镀膜后，连接上一种识别癌细胞的抗体，以完成靶向锚定。纳米管的空腔用于储存抗癌药物，这种抗癌药物可以被定向地输送至癌细胞附近，并且可控地释放，以杀死癌细胞，从而达到局部治疗的作用。这种方法明显优于传统的全身化疗，为靶向药物传输和治疗提供了一种新的方法。
3 展望
QDs作为一类较为理想的荧光探针,它在生物医学中的应用已显示出诱人的前景。相信随着QDs 制备和标记技术的不断成熟,它必将成为新一代生物荧光标记物,在细胞成像、体内成像、疾病诊断以及研究生物大分子之间的相互作用等方面发挥独特的作用。但要真正实现QDs 在活体的应用,需要解决的问题还很多，如低毒性或生物兼容性QDs性能的问题以及低毒性或生物兼容性QDs应用方面的问题。虽然低毒性或生物兼容性QDs有良好的生物相容性, 安全程度较高, 但是由于其使用过程将涉及到较多的生物环境问题,这些复杂环境将如何对QDs的荧光性能和稳定性产生影响，QDs在生物体内的代谢过程机理又是如何进行的也都需要作更深入的系统研究。随着量子点科学的进一步发展，量子点的制备工艺也会有更大的提高，量子点与生物医学之间的关系也必将更加紧密，必将为人类的生命健康事业做出应有的贡献。
参考文献
[1] Michalet X, Pinaud F F, Bentolila L A, et al. Quantum dots for moleculari maging and cancer medicine[J].Science，2005，307: 538-544.
[2] Chan W C W, Nie S. Quantum Dot Bioconjugates for ultrasensitive nonisotopic detection[J].Science,1998,281(5385) : 2016-2018.
[3] Tokumasu F, Dvorak J. Development and application of quantum dots for immunocytochemistry of human erythrocytes[J].Journal of Microscopy，2003，211:256-261.
[4] Orndorff R L, Rosenthal S J. Neurotoxin quantum dot conjugates detect endogenous targets expressed in live cancer cells[J].Nano Lett., 2009, 9(7) : 2589-2599.
[5 ] Sungjee K,Yong TL ,Edward GS. Near-infrared fluorescent type II quantum dots for sentinel lymph node mapping[J]. Nature Biotechnology ,2004 ,22 :93-97.
[6 ] Gao XH ,Cui YY,Levenson RM,et al . In vivo cancer targeting and imaging with semiconductor quantum dots [J].Nature Biotechnology, 2004 ,22 :969-976.
[7] Chan W C W，Nie S M. Quantum dot bioconjugates for ultrasentitive nonisotopit detection[J].Science,1998, 281（25）:2016-2018.
[8] Wang S P, Mamedova N, Kotov N A, et al. Antigen/antibody immunocomplex from CdTe nanoparticle bioconjugates[J].Nano Lett., 2002, 2: 817-822.
[9] Ravindran S, Kim S, Martin R, et al. Quantum dots as bio-labels for the localization of a small plant adhesion protein[J].Nanotechnology,2005,16:1-4.
[10] 张雨琴，张友玉，叶敏，等. 光度法研究L-半胱氨酸修饰的ZnS纳米粒子与牛血红蛋白的作用[J].应用化学, 2008,（9）：1011-1016.
纳米抗体技术范文6
关键词 纳米技术 肿瘤 治疗
羧基磷灰石
近年武汉理工大学李世谱教授发现羧基磷灰石的纳米材料可杀死癌细胞，其委托北京医科大学等权威机构进行了细胞生物实验。结果表明，该纳米粒子可杀死人类肺癌、肝癌、食道癌等多种癌细胞；并且认为纳米材料具备杀死癌细胞而不伤害正常细胞的奇特功效，但必须具备2个条件：①纳米粒子具备一定的超微尺度，一般在20～100nm之间；②纳米粒子要呈均匀分布，才具有药效［1］。
磁性材料
德国柏林“沙理特”临床医院已经尝试借助磁性纳米微粒治疗癌症。研究人员将氧化铁纳米微粒注射到瘤体内，然后置于可变的磁场中，在磁场的作用下氧化铁纳米微粒可升温至45～47℃，这种温度下完全可以杀灭肿瘤细胞，而周围的组织中没有氧化铁微粒，所以周围组织不会受到明显的损伤，这样便达到了既消灭肿瘤又保存正常组织的目的。
纳米药物
纳米颗粒具有表面积大、表面反应活性高、活性中心多、吸附能力强等特性。但目前应用的微囊材料生物相容性差。特别是在肝癌的治疗上，目前采用纳米级脂质体-碘油乳剂及聚氰基丙烯酸正丁酯纳米微粒碘油乳剂，用于肝癌栓塞化疗，具有良好的肝靶向性、缓释性及生物可降解性，还具有抗耐药性，临床上用阿霉素纳米微粒-碘油乳剂治疗肝癌效果良好［2］。
另外，纳米粒子作为药物传递与控释的载体，是一种新的药物控释体系。纳米控释系统直径在10～500nm，可以通过人体最小的毛细血管。其控释机理可以是药物通过囊壁沥滤、渗透和扩散，也可以由基质本身的溶蚀而释放。该系统具有缓释性、靶向性、定时性、稳定性等优点，而且可减少药物使用剂量，减轻或避免其不良反应。
陷阱细胞
Tomalia等采用树形聚合物形成的纳米陷阱。此陷阱为超小分子，能够在病毒进入细胞前与病毒结合使病毒失去致病力。Tomalia把能够与病毒结合的硅铝酸位点覆盖在陷阱细胞表面，当病毒与陷阱细胞结合后，就不能再感染人体细胞了。陷阱细胞能够繁殖，生成不同的后代，体积较大的后代能够携带更多的药物，而且体积越大效果越好。目前体外实验证明，纳米陷阱能够在流感病毒感染细胞前就捕获它们。人们期待采用同样的方法捕获艾滋病病毒等更复杂的病毒。该细胞是由外壳、内腔和核3部分组成的；其内腔装载化疗药物，可直接送达肿瘤部位对肿瘤进行局部治疗［3］。
纳米“智能炸弹”
为了在形成致命性的肿瘤之前早期发现并杀灭癌细胞，美国密歇根大学的Baker博士正在设计一种纳米“智能炸弹”，此“智能炸弹”直径仅有20nm左右，可以识别出癌细胞的化学特征，能够进入并摧毁单个癌细胞。
纳米生物导弹
利用磁性纳米微粒表面包覆制造定向医疗药物已经成为目前医药学研究的一个热点。人们在磁性纳米微粒表面涂敷高分子层，再与特殊蛋白及药物结合，注入生物体后，此药物载体在外界磁场的作用下，通过磁性导航，到达靶器官或靶部位，此载体如携带抗体、受体和核酸等，通过抗原-抗体和受体配体特异性结合，便形成了“生物导弹”［4］，可定向治疗癌细胞。
纳米机器人
纳米机器人也称分子机器人，它是纳米机械装置与生物系统的有机结合，是纳米技术中最具有诱惑力的产品。纳米机器人凭借其特有的构造与性质在许多领域都替代了传统意义上的药物。如将纳米机器人注入血管中，它可以清除血栓和脂肪沉积物；在基因工程领域，它可以从病变基因中去除有害的DNA并把正常的DNA安装在基因中，使引起癌症的DNA发生逆转；纳米机器人还可以直接杀灭癌细胞。
纳米激光
该技术是新近研究成功的，主要应用于肿瘤的诊断与治疗。
参考文献
1李基文.21世纪纳米技术在医学应用中的展望.中国公共卫生，2001，17（8）：717-718
2韩本立，叶晟.21世纪的实验外科学展望.中华实验外科杂志，2002，19（1）：7-8
