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细胞生物学特性范文1
【摘要】
为了研究多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）病人骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）的病理生物学特性，以探讨MSC在MM骨损伤发生中的作用，取11例初治MM病人和5例正常人骨髓，用贴壁法体外分离培养MSC 。应用流式细胞术分析MM骨髓MSC表型，MTT法检测MSC增殖能力，组织化学染色测定细胞向成骨细胞和脂肪细胞分化能力。应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定细胞培养上清液中白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor， SCF）浓度。收集MSC培养上清作为条件培养液，按梯度浓度加入人SKO007骨髓瘤细胞系培养体系中，MTT法测定细胞增殖能力差异。结果表明：与正常人骨髓MSC比较，MM患者骨髓MSC的表型无改变，均一表达CD29、CD73、CD166和HLA-ABC，不表达CD45和CD31； MM患者骨髓MSC增殖和分化能力正常，且具有相似的成骨和成脂肪分化功能； MM骨髓MSC分泌IL-6和SCF的水平均明显高于正常； MM来源的MSC培养上清显著促进SKO007细胞的增殖。结论： MM患者骨髓MSC的增殖分化功能正常，MM时骨损伤可能与MSC分化功能无关，而IL-6和SCF高表达为骨髓瘤细胞提供了必要的生存信号。
【关键词】 间充质干细胞; 多发性骨髓瘤; 细胞因子
Biological Properties of Mesenchymal Stem Cells Derived from Bone Marrow of Patients with Multiple Myeloma
AbstractThe study was purposed to explore the role of mesenchymal stem cells (MSCs) in the pathogenesis of bone disease particularly observed in multiple myeloma (MM)， the biological features of marrow derived MSCs from patients with MM have been investigated. Marrow aspirates were harvested from 11 newly diagnosed patients with MM and 5 normal adults and MSCs were isolated and culture-expanded by the cell properties of adherence to plastic flasks， The phenotype was analyzed by flow cytometric technique. The proliferation of MSCs was observed by MTT assay and their differentiation capacities into osteoblasts and adipoblasts were assessed with lineage-specific histochemical staining. The concentrations of IL-6 and SCF in the culture supernatant were detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). MSC culture supernatants were collected and MTT assay was performed to evaluate their support on the proliferation of an MM cell line SKO007 cells. The results showed that bone marrow-derived MSCs from MM patients were homogenously positive for CD29， CD73， CD166 and HLA-ABC and negative for hematopoietic cell marker CD45 and endothelial cell marker CD31， the phenotype of which was similar to that of marrow counterparts from normal adults. MTT assay indicated that MSCs from MM patients or normal adults proliferated at similar rates. MSCs from MM patients occupied in vitro osteogenic and adipogenic capacity as those from normal adults. The levels of IL-6 and SCF in culture supernatant were greatly up-regulated in MM patients by ELISA assay. Furthermore， MSC culture supernatants from MM bone marrow displayed enhanced activity to promote the proliferation of SKO007 cells. It is concluded that marrow-derived MSCs from bone marrow of MM patients are normal in their proliferation and differentiation capacities， and myeloma bone disease may not be ascribed to the differentiation of MSCs while the elevated secretion of IL-6 and SCF may provide necessary cues for the survival of malignant myeloma cells.
Key wordsmesenchymal stem cell; multiple myeloma; cytokine
多发性骨髓瘤（multiple myeloma， MM）患者呈现特征性的骨质破坏。这种骨质损伤与破骨细胞数量增加，成骨细胞数减少，从而导致骨吸收与成骨之间失平衡有关［1］。间充质干细胞（mesenchymal stem cells， MSC）是存在于骨髓的结缔组织干细胞，不但可以向成骨细胞、成软骨细胞和成脂肪细胞分化，而且是骨髓基质细胞的前体细胞［2］。骨髓基质细胞为骨髓瘤细胞提供了必需的生存和增殖支持，并由此促进破骨细胞的增殖分化，导致溶骨性损伤［3］；而骨髓瘤细胞可通过细胞因子分泌和(或)细胞间的直接接触，引起成骨细胞的凋亡［4］。但是，以上这些病理改变是否涉及MSC本身，抑或MSC的某些改变促进了疾病进程尚不清楚。为此，我们对骨髓瘤MSC的特性进行了研究。
材料和方法
材料来源
11例MM均为初治患者，男7例，女4例，平均年龄59.4岁; IgG型6例， IgA型3例， κ轻链型2例。对照骨髓来源于骨髓象和血象检查正常的健康人，共5例，其中男3例，女2例，平均年龄51.7岁。SKO007 MM细胞株为本研究所传代的细胞株。
骨髓MSC的分离和培养
按参考文献［2］的方法，取肝素抗凝的骨髓，α-MEM稀释2倍后Percoll梯度密度离心收获单个核细胞。将细胞接种于含10%人骨髓MSC专用培养血清的α-MEM中（血清为Stem Cells公司产品），培养48小时后去除非贴壁细胞，继续培养至贴壁细胞约80%融合，收集培养上清于-70℃冻存备用。0.05%胰蛋白酶消化传代培养。第3代细胞用于以下实验。
细胞免疫表型分析
胰蛋白酶消化收集MSC，加入FITC或PE标志的小鼠源抗人CD29、CD31、CD34、CD45、CD73、CD166、HLA-ABC和HLA-DR单克隆抗体（eBioscience公司产品），室温下避光反应30分钟。用PBS洗涤2次后，FACSCalibur (Becton Dickinson， USA)收集细胞参数，用流式细胞仪检测，WinMDI 2.9软件分析结果。
增殖能力的MTT法测定
收集MSC，按750个细胞/孔接种于含MSC完全培养液的96孔培养板中，每组6孔；将SKO007细胞按1000/孔接种于不含血清的RPMI 1640 培养液的96孔培养板中，培养体系中分别加入10%、20%和40%的MSC培养上清，每组4孔。细胞培养72小时后加入10 μl MTT（1 g/L），继续培养4小时。离心去除培养液，加入二甲亚砜裂解细胞，以未加MTT孔为本底，570 nm波长下测定OD值。
多系分化的鉴定
成骨分化将细胞按5×104/孔接种于6孔培养板，或1×104/孔接种于24孔培养板中，加入地塞米松（10-7mol/L）、维生素C（50 mg/L）和β-磷酸甘油（10 μmol/L），培养12天，期间换液2次。应用白细胞ALP染色试剂（Sigma公司产品）进行碱性磷酸酶原位染色。
成脂肪分化将细胞按2×104/孔接种于24孔培养板中，次日加入地塞米松（10-6mol/L）、IBMX（0.5 mmol/L）和消炎痛（10 μmol/L），连续培养7天后去除培养基，用PBS洗涤2次后多聚甲醛室温固定1小时，1%油红O染色，光学显微镜下观察。
MSC的细胞因子分泌功能测定
消化传代细胞培养至贴壁层致密时，更换无血清的α-MEM，培养48小时后收集培养上清，于-70℃冻存备用。按照试剂盒（Bio-Rad产品）操作说明，应用酶联免疫吸附实验（enzyme-linked immunosorbent assay， ELISA）测定，依据由重组人白介素-6（interleukin-6，IL-6）和干细胞生长因子（stem cell factor， SCF）（Peprotech产品）所作的标准曲线，测定培养上清IL-6和SCF浓度。
统计学处理
试验数据以平均值±标准差（±SD）表示，以t检验进行数据分析，P值
结果
MM患者与正常人骨髓MSC免疫表型的比较
体外培养的MM患者和正常人骨髓MSC均一地表达间充质细胞标志CD73和CD166，表达黏附分子CD29，不表达造血细胞标志CD45和内皮细胞标志CD31。此外，细胞表达HLA-I类分子(HLA-ABC)，不表达HLA-DRII类分子。MM骨髓MSC表型与正常人来源MSC相似， MM患者骨髓MSC表型无改变（图1）。
MM患者骨髓MSC增殖能力分析
利用MTT法检测第3代细胞增殖速率。MM患者骨髓MSC与正常人骨髓MSC组比较没有显著差异，OD值分别为0.46±0.11与0.39±0.08 (P>0.10) ，MM患者骨髓MSC增殖能力正常（图2）。
MM患者与正常人骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力比较
MM患者和正常人骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，细胞形态均发生了明显的变化，部分细胞由纺锤形转变为多边形或不规则形状；12天后经NBT-BCIP染色显示细胞碱性磷酸酶（ALP）活性，MM患者骨髓与正常人骨髓组细胞显色强度比较无明显差别（图3A、B），显示MM患者骨髓MSC成骨能力并没有减低。应用成脂肪诱导体系作用7天，油红O染色显示两组细胞体外成脂肪性能未见明显差别，MM患者骨髓MSC体外成骨和成脂肪能力正常（图3C、D）。
MM患者与正常人骨髓MSC的IL-6和SCF表达量比较
1×106 MM患者骨髓MSC细胞48小时分泌的IL-6总量显著高于正常人骨髓MSC，分别为(9.36±2.11)ng 和(4.72±1.64)ng（P
MSC培养上清对SKO007细胞的增殖支持作用
将SKO007细胞用无血清体系培养，加入不同浓度的MSC培养上清，72小时后MTT法测定细胞活力。结果表明：未加条件培养液组大部分细胞死亡；加入10%和20%条件培养液后，两组细胞增殖能力无差别；浓度升至40%时，MM患者骨髓MSC培养上清明显促进SKO007细胞增殖，两组比较差异有统计学意义（P
讨论
MM是B细胞克隆性疾病，肿瘤细胞刺激骨吸收，促进血管形成，导致溶骨性骨损伤，即使化疗成功实施后，骨损伤仍然存在，提示骨髓中成骨细胞的干细胞—MSC可能存在本质的异常。MSC是存在于骨髓的结缔组织干细胞，是骨髓基质细胞的前体细胞。骨髓基质细胞与骨髓瘤细胞相互影响，促进破骨细胞的增殖分化和成骨细胞凋亡。为此，我们分离培养了初治MM骨髓MSC，并与来自年龄相近正常人骨髓的MSC比较，观察MM患者骨髓MSC是否存在生物学特性的异常。结果表明，体外培养的这两种来源MSC表型一致，均不表达造血细胞和内皮细胞的标志，提示MM血管形成可能与MSC向内皮细胞的分化无关。MM患者骨髓MSC不表达HLA-DR，提示MM病人骨髓微环境中炎性因子或相关的调控因素使MSC维系了固有的表型。MSC具有很强的体外增殖和多向分化能力。MM病人骨髓中成骨细胞数量减少［4］，可能与 MM骨髓MSC的增殖分化能力有关。本研究采用MTT法检测MSC细胞增殖速率，结果显示MM骨髓源MSC增殖能力与正常骨髓源MSC比较没有显著差异，提示MM病人的MSC增殖能力正常。在体外，MM骨髓MSC经成骨诱导体系培养后，具有正常的体外成骨能力，且与正常人骨髓MSC相似; MSC体外成脂肪能力与正常骨髓MSC亦相当。本研究表明，MM病人MSC体外增殖分化能力维持在正常水平，骨髓瘤细胞没有改变MSC固有的自我更新和多向分化能力。然而研究已发现，骨髓瘤细胞与成骨细胞系共培养后成骨细胞株Runx-2基因表达下调，从而抑制成骨细胞向骨细胞分化成熟［5-7］。因此，骨髓瘤骨疾病涉及的病理改变可能发生于成骨细胞阶段，而与MSC分化能力无关。研究已经表明，MSC和骨髓基质细胞可分泌G-CSF、GM-CSF、VEGF、SCF及IL-6等多种细胞因子［3，8， 9］，这些因子相互影响，形成网络调节骨髓瘤细胞的生物学特性［10］，促进骨髓瘤细胞增殖和存活。人骨髓瘤细胞也表达成骨细胞特异性转录因子Runx2，并分泌骨桥蛋白（osteopontin， OPN）［7］。研究发现OPN也与胃癌的侵袭转移有关［11］。骨髓基质细胞分泌IL-6等细胞因子，促进骨髓瘤细胞分泌与成骨发育相关的因子，以抑制成骨新生，促进骨溶性损伤［3，12］。骨髓瘤细胞是骨髓中碱性成纤维细胞生长因子（basic fibroblast growth factor， bFGF）的主要来源。bFGF促进骨髓组织新生血管形成、刺激基质细胞分泌IL-6［13］。人骨髓MSC也表达bFGF受体。骨髓瘤病人MSC细胞分泌异常可能与体内异常细胞因子网络调节有关。本研究发现，在体外，MM患者骨髓MSC分泌的IL-6和SCF量明显高于正常人骨髓MSC，而细胞培养上清促进骨髓瘤细胞SKO007增殖。MM患者骨髓MSC表型和增殖分化功能与正常MSC相当，这提示骨髓MSC在MM病人体内受到骨髓瘤细胞的直接刺激作用后，高表达IL-6和SCF，并以旁分泌的形式维系瘤细胞的恶性表征，从而间接影响成骨和骨吸收过程，这可能是骨髓瘤并发骨疾病的原因之一。
总之，多发性骨髓瘤病人骨髓MSC生物学性状与正常骨髓MSC比较无明显变化，而其高表达IL-6与SCF可能与骨髓瘤细胞的直接作用有关。本实验研究了骨髓瘤MSC的表型、增殖分化、功能等特征，其结果为MM骨损伤的发生机制及其干预治疗等的研究提供了重要信息。
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细胞生物学特性范文2
1.1细胞活力测定
采用Trypanblue拒染试验检测冻存前及复苏后细胞的存活率。将待检细胞制成细胞悬液，取细胞悬液与04％台盼蓝溶液以9∶1混合均匀（使台盼蓝溶液终浓度为004％），3min后观察，并用血球计数板计数。镜下观察可见健康活细胞胞体完整、细胞透明、不着色，凡着色呈蓝色者均为死细胞。计数1000个细胞，计算细胞活率。
1.2生长曲线绘制
向24孔培养板每孔内接种1mL密度约为1×104个／mL细胞，从接种之日算起，每隔24h计数2个孔内的细胞密度，算出平均值，连续测定12d，以培养时间为横坐标，以细胞密度为纵坐标，绘制细胞生长曲线。
1.3细胞染色体分析
选取第4代生长良好的新生昆明犬成纤维细胞，按照常规方法［9］进行染色体制片，Gimesa染色后选择染色体分散与形态良好的分裂相在油镜下观察拍照，作核型图，对50～100个分裂中期细胞进行染色体数目统计。
2结果与分析
2.1细胞的形态学观察
新生昆明犬耳缘皮肤组织经胶原酶分离培养3～4d后，镜下观察可见有少数细胞沿组织块边缘慢慢贴壁伸展，细胞形状不规则，且其组织块的生长晕形成时间较长。经8～10d培养才出现大量成片生长的优势细胞，此时观察细胞的形态呈长梭形、多角形或扁平星形，为典型的成纤维细胞形态。后再经3～4d细胞生长至汇合，并长满整个细胞培养瓶表面（图1A），此时可进行传代和冻存。传代后的细胞生长旺盛，在形态上与原代细胞无明显差异，经2～3d即可长至近100％汇合，此时细胞呈放射状或涡旋状走势（图1B）。待传代时，加入消化液后显微镜下可见细胞回缩，呈圆形（图1C）。
2.2成纤维细胞冻存前和复苏后的活
耳部成纤维细胞冻存前和复苏后的活率分别为933％，908％（图2）。冻存前与复苏后的细胞存活率差异不显著（P＞005），说明原代细胞和传代细胞生长状态良好，培养条件适宜，且冻存和复苏的过程对细胞活力状况损害较小。
2.3生长曲线
根据昆明犬耳部成纤维细胞接种于24孔板连续培养12d的细胞计数情况，绘制出了成纤维细胞的生长曲线（图3）。昆明犬耳部成纤维细胞的生长曲线呈典型的“S”形，即经过了潜伏生长期、对数生长期、平台期以及衰亡期。其表现为1～2d的潜伏生长期细胞总数基本保持不变，从第3天起，细胞数量开始增加，3～8d左右细胞明显地进入对数生长期，细胞数量快速增长，第8～9天，细胞由于缺乏足够生长空间而增长放缓，开始进入平台期。第9天后，由于细胞数量的急剧增加、生长空间的极大限制，经过短暂的平台期后，细胞发生接触抑制快速进入衰亡期，细胞生长几乎停止，随后细胞逐渐脱落死亡，此时镜下可见有大量凋亡细胞漂浮。由生长曲线上的数据分析，耳部成纤维细胞群体倍增时间约为32h。
2.4核型观察分析
昆明犬耳部成纤维细胞中期染色体分裂相与核型分析如图4所示：染色体数目2n＝78（XX）。计数80个4代细胞的染色体数目，总数2n＝78的细胞数约占总细胞数的90％，达到了建立细胞系75％～80％的要求，说明所建细胞系为稳定的二倍体细胞系。39对染色体中有38对常染色体均为端着丝粒（T）染色体，长度逐渐递减；性染色体X，Y均为中央着丝粒（M），X染色体的长度最大。
3讨论
目前，国内已有一些研究报道建立了比格犬胎儿成纤维细胞系［10］、德国牧羊犬耳部和腹部成纤维细胞系［11］及杂交犬皮肤成纤维细胞系［12］等，但利用犬类的这些细胞遗传资源进行更加广泛深入的研究（如医疗和动物模型的建立、体细胞克隆等）还十分欠缺。在国外，已有较多使用所建立的犬胎儿或成体成纤维细胞系进行体细胞核移植（SCNT）的研究［13－16］。值得注意的是，在警用工作犬领域，7头世界首批体细胞克隆警犬于2007年底在韩国诞生［17］，2009年韩国克隆专家根据美国911英雄警犬“特拉克”的遗传信息，再次利用体细胞克隆技术成功获得了5头牧羊犬（http：／／wwwcnwnewscom／html／tech／cnkpzs／20090621／122171html）。LEE等［18］将曾服役于韩国国家紧急事务管理署（NEMA）具有6年全球救援经验的退役搜救犬进行克隆，最终获得2头克隆犬。这些克隆后代中大多数工作犬已服役并具备与父辈同样卓越的工作性能。同时，OH等［19］的研究也表明，利用SCNT技术将能使一头优秀的检验检疫犬复制出一群同样优秀的检验检疫犬。体细胞克隆技术最大的优势在于克隆出生的动物与供体细胞来源的动物具有几乎100％相同的基因，即能完全保持亲代优异的先天特质。要成为一只优秀的警犬，就必须要具备高智商、敏锐的嗅觉、良好的亲和能力等警犬所必备的各种特质。按照传统的警犬繁育方式，培育出一头优秀警犬至少需要3～4年时间，花费约10万元，期间要消耗大量的人力、物力和时间，且培训的优秀率低，不超过12％；而要培养出一头功勋级的警犬需要付出的代价就更大，最少需数10人，4～5年时间，约50万元的费用，且培养出一头功勋级警犬的效率很低，约8‰。而动物体细胞克隆技术可以批量复制优秀、功勋级的警犬，可以大大降低培育成本，提高培养功勋警犬的培育效率。因此，体细胞核移植技术在警犬繁育中具有广阔的应用前景。然而，体细胞核移植技术首先必须要解决的是供体细胞的来源和体细胞分离培养的问题。本研究利用胶原酶消化法建立了新生昆明犬耳部成纤维细胞系，并对其体外培养的生物学特性也进行了初步的分析与探讨。在动物成纤维细胞的体外分离培养中，分离组织可以取自胎儿、新生幼仔及成体动物［20－22］。其中，胎儿取材不仅难度大、成本高，且对优良品种的保存也十分不利。相反地，新生幼仔或成体动物耳部、腹部及腹股沟等部位皮肤组织的取材则显得十分便捷，且不影响动物的健康成长。本试验取材自新生昆明犬耳缘皮肤组织（＜1cm2），对于新生仔犬，其伤口愈合快、皮肤组织修复能力强，应激性小且容易护理。另外，新生幼犬较成犬组织分化程度低，其成纤维细胞理论上应具有较强的增殖能力、易培养及适于进行相关基因操作研究。本试验所建立的新生昆明犬耳部成纤维细胞具有典型的成纤维细胞形态，如细胞呈梭形或星形，当生长至汇合时细胞会平行排列，呈涡旋状和放射状生长。其冻存前和复苏后存活率差异不显著（P＞005），细胞复苏后增殖快、生命力旺盛，且形态未发生变化。这表明冻存和复苏过程中的各项条件对细胞活力影响较小，试验中采用的冻存和复苏的方法是可行的。
细胞生物学特性范文3
【摘要】 目的 建立次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶（HGPRT）基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9，进行细胞形态、生长特性及致瘤性等生物学特性检测。方法 应用N-甲基-N′-硝基-N-亚硝基胍（MNNG）诱导骨肉瘤细胞系LM8突变，用8-单杂鸟嘌呤（8-AG）筛选HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9；观察细胞形态、细胞核型分析、细胞生长周期等生物特性，接种C3h鼠观察致瘤性。结果 突变后细胞仍具有典型的成骨肉瘤细胞特征，细胞异型性明显，染色体众数为64-66，接种鼠具有成瘤性，成瘤率为100%。结论 本实验建立了HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞系LM9，具有典型的鼠源性骨肉瘤细胞特征，可用于杂交瘤、肿瘤疫苗等多方面的研究，是一个较好的实验工具。
【关键词】 次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖基转移酶基因缺陷型 骨肉瘤 细胞系
The establishment of hypoxanthine-guanine phosphoribosyl transferase-genedefect osteosarcomma cell lineage and assessment of its biological characteristics
【Abstract】 Objective To establish the HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage，and determine the ability of sarcomagenesis and fusion.Methods N-methyl-N′-nitro-N-nitrosoguanidine(MNNG) was used to induce the mutation of an osteosarcoma cell lineage(LM8)，then culturing mixed with 8-azaguanine killed those cells of HGPRT positive，We got the HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage LM9. The LM9 cells were observed on cells biology characteristic such as morphous and cell cycles biology inoculated into mice and their growths were surveyed in the mice.Results The LM9 cell lineage has typical characteristics of osteosarcoma cells and it is sarcomagenic to C3h mice.Conclusion The LM9 cells lineage was obtained by method of mutation， it is typical of osteosarcoma cells characteristics and has a prospect of being used in tumor vaccine and other researches.
【Key words】 HGPRT-defect osteosarcoma cell lineage
肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。常将其作为一种辅助疗法与手术、化疗、放疗等常规疗法联合应用。先用常规疗法清扫大量的肿瘤细胞后，再用免疫疗法清除残存的肿瘤细胞，可提高肿瘤治疗的效果［1］。建立各种肿瘤细胞系是研究肿瘤细胞生物学特性有力工具，本文构想建立一种HGPRT基因突变型的骨肉瘤细胞系，它具有原亲本瘤细胞的免疫原性而在代谢上有较大的改变［2］，根据这一特性，可利用它更有效的进行细胞融合，筛选及制备肿瘤表面抗原多肽疫苗。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 骨肉瘤细胞 LM8细胞系购自Rich cell bank ，系C3h鼠源性骨肉瘤细胞系，含100ml/L小牛血清的RPMI 1640完全培养液放在37℃，50ml/L CO2孵箱中培养，对数生长期时，用2.5mg/L的胰酶（含2mg/L的EDTA）消化、离心、调整细胞数后传代、接种。
1.1.2 动物及饲养 4～6周龄C3h鼠8只（第四军医大学实验动物中心提供），雌性，体重17～25g。
1.2 方法
1.2.1 致突变及筛选 LM8系细胞取对数生长期1.0×106/瓶，单层，培养基为RPMI 1640，向瓶中加入2μg/ml的MNNG完全培养液作用15h后，除去致突变液，用PBS冲洗，胰蛋白酶(0.05%)+EDTA(0.02%)1:1混合消化，制备细胞悬液，接种1×103/瓶，培养10天，细胞生长汇合后，传代，以3×103数/瓶密度继续接种，24h后，向培养液中加10μg/ml的8-AG培养液，培养24h待细胞汇合，传代，更换不含8-AG的筛选液培养基继续培养，细胞接近半汇合时，冻存。
1.2.2 突变细胞系LM9鉴定 取对数生长期细胞LM8和LM9接种于培养瓶中，次日加入1% HAT完全营养筛选液，用倒置显微镜观察细胞的生长情况。
细胞形态观察：收集对数生长期细胞0.01M的PBS洗2次2000rpm×10min离心收集细胞，弃上清，以4%的pH7.4的戊二醛固定，按电镜标本常规制备方法，进一步固定，包埋，超薄切片，铅-铀染色JEM-2000型投射电镜观察。
1.2.3 细胞生长特征 调整突变细胞浓度按1×104接种于24孔板，置37．5℃ 5%孵箱培养，每个样品重复3次，连续计数8天，以培养时间为横坐标，细胞数为纵坐标，绘制细胞的生长曲线。
1.2.4 流式细胞仪分析细胞周期测定 培养细胞以0.1M PBS液(pH7.4)洗2次，悬溶于190μg结合缓冲液中调整细胞浓度为1×106/ml，加10μl异硫氰酸荧光素(PTIC)标记的连接素(Amexin)和10μl的20mg/L的普匹碘氨（PI），混合均匀，避光室温孵育10min，结合缓冲液洗1次后用 Couter Elite流式细胞仪（Coulter 公司）进行分析细胞周期情况。
1.2.5 体内致瘤性观察 调整细胞浓度为5×105接种于10只小鼠右下肢皮下待皮下出新肿瘤结节时，按文献［3］测量肿瘤大小并观察动物存活情况。
2 结果
2.1 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞筛选 培养瓶中细胞经突变筛选后细胞呈明显多角形态，细胞个体大而丰满、整齐，有个别巨大的细胞，可见有核分裂相，细胞生长良好。
2.2 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞形态特征 光镜下培养的细胞为多角形，核大可见分裂相，相差显微镜下细胞形态呈上皮样排列，生长的单层细胞有重叠生长的能力，细胞成圆形或椭圆形，核大，胞浆深染，且相对较少，核1～2个，细胞异型性明显，核丝分裂偶见，细胞呈弥散分布，组织属恶性肿瘤（图1）。
图2 电镜观察细胞核大有异型性，核眼明显，染色质分散，稍聚于核膜，胞浆较长，富含线粒体，溶酶体，线粒体肿大并增多，少量的粗面内质网，胞浆内有丰富的游离核糖体，细胞间排列紧密
2.4 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞鉴定 加入HAT后LM8 细胞生长良好，呈对数生长，第四天达到高峰，LM9 细胞在24h后即出现死亡，72h后细胞全部死亡。
2.5 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞生长曲线 见图3。细胞第四天进入对数生长期，生长迅速。
2.6 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞生长周期 流式细胞仪测得细胞G1=53.5，G2=19.5，G1/G2=1.837，为亚三倍体细胞，符合肿瘤细胞的特点。
2.7 HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞体内致瘤性 接种5×105的HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞后肿瘤的生长如图4，小鼠体内14天时全部成瘤，成瘤率为100％，随着时间延长肿瘤体积不断增加。
图4 接种LM9细胞后C3h鼠肿瘤的生长情况
3 讨论
肿瘤的免疫治疗是以激发和增强机体的免疫功能，以达到控制和杀灭肿瘤细胞的目的。虽然目前已经建立了多种免疫方法，但治疗的效果尚需进一步提高，给机体输入具有抗原性的瘤苗，刺激机体免疫系统产生抗肿瘤免疫以治疗肿瘤。该法应用的前提是肿瘤抗原能刺激机体产生免疫反应［4～6］。由于人肿瘤相关抗原的免疫原性很弱，不足以有效地刺激机体的免疫应答，因此单纯用自身或同种肿瘤细胞作瘤苗治疗肿瘤的效果不好。肿瘤免疫应答的主要效应细胞是TC细胞，TC细胞识别肿瘤表面的肽抗原（peptide）与MHCⅠ类分子的复合物，必需要有第二信号才能活化。这个第二信号可以由TC细胞表面的CD28分子与粘附分子B7的结合来提供。B7分子主要存在于活化的B细胞和抗原呈递细胞表面。大多数肿瘤细胞由于没有B7分子，因此肿瘤细胞虽具有肽抗原与MHCⅠ类分子的复合物，但由于不能提供第二信号，所以不能活化TC细胞［7，8］。因此肿瘤细胞与抗原提呈细胞的融合可以提供T细胞活化通路，这就为肿瘤疫苗的研制展示了光明的前景。
人和啮齿类细胞的HGPRT基因位于X染色体上，该基因在两性细胞中都呈半合子状态（单倍性），它的基因产物为次黄嘌呤鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（HGPRT），由2～4个蛋白亚单位组成，该酶能促次黄嘌呤和鸟嘌呤与磷酸核糖焦磷酸(PRPP)间的转磷酸核糖基作用而生成一磷酸次黄苷(IMP)，这是细胞合成的补救途径，但此酶特异性不强，也能把嘌呤拟似物6-巯基嘌呤(6-MP)和8-氮杂鸟嘌呤(8-AG)掺入DNA中引起细胞死亡，因此，当HGRPT基因突变时，细胞就表现为对6-MP或8-AG的抗性，在有6-MP或8-AG的条件下，它们能够生存，而野生型细胞即能够摄取6-MP或8-AG而死亡，以上特点是构成HGRPT突变细胞筛选的理论基础［3］。
本实验所筛选的突变细胞系，仍具有典型肿瘤细胞的生物学特性，细胞个体大而丰满，整齐，有个别巨大的细胞，可见有核分裂相，细胞生长良好。细胞核异型性明显，加入HAT后细胞在24h后即出现死亡，72h后细胞全部死亡。细胞周期G1/G2=1.837，为亚三倍体细胞，符合肿瘤细胞的特点。接种C3H小鼠体内14天后全部成瘤，成瘤率为100％。
HGPRT基因缺陷型骨肉瘤细胞由于HGRPT表达缺失，对HAT不敏感，能用HAT筛选出来。因此，在骨肉瘤细胞的免疫治疗研究中可作为一种简便的分离筛选手段。这种筛选方法以用于骨肉瘤细胞的融和，以筛选杂交瘤细胞，导致免疫学特性的变化，将有利于肿瘤细胞的更进一步的研究及研制更为有效的杀灭肿瘤细胞的生物治疗方法。
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细胞生物学特性范文4
[关键词] CIK细胞;扩增;杀伤活性
[中图分类号] R392.12 [文献标识码] A [文章编号]1673-7210（2007）12（c）-019-03
The study of the expansion in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells
WANG Jia-lie, MA Guo-qiang, BAO Li-qing, LIU Yan-ru
(Study Center of Respiratory Disease, Inner Mongolia Hospital, Huhhot010017,China)
[Abstract] Objective: To observe the proliferation ability in vitro and its biological characteristics of cytokine-induced killer cells. Methods: PBMCs were isolated with successive non-adhere method fromvenous blood ,then were induced to be cytokine-induced killer cells by ficoll density gradient centrifugation in the presence of IFN-γ，IL-1β，IL-2 and anti-CD3 antibody. LAK (lymphokine activated killer) cells were prepared as control. The proliferation ability of CIK cells was measured by calculation , the phenotype of CIK cells was analyzed by flow cytometry（FCM）and the killing tumor cell activity of CIK cells was tested with MTT method. Results: After 16 days of induction the proliferation rate of CIK cells reached a high peak, possessing strong proliferate ability with over 100 times expansion after 21 days culture; In comparison with LAK, CIK cells had no difference in early stage, but onday 18,21 the multiplicationability of CIK cells was higher than that of LAK cells markedly (P
[Key words] Cytokine-induced killer cells; Multiplication ability; Killing ability
细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine-induced killer，CIK)是将人外周血单个核细胞(PBMC)在体外经过多种细胞因子作用后培养获得的一群异质细胞。它同时表达CD3和CD56两种膜蛋白分子[1，2]，兼具有T淋巴细胞强大的抗瘤活性和NK细胞的非MHC限制性杀瘤特点，被认为是增殖速度最快，杀瘤活性最强，杀瘤谱最广的效应细胞。过继性免疫治疗是治疗恶性肿瘤的一个重要辅助治疗方法，用于过继性免疫治疗的免疫活性细胞必须具有较强的扩增力和杀伤性。本实验通过对CIK细胞的体外培养及其生物学特性的研究，以寻求用于过继免疫治疗的高效免疫活性细胞。
1 材料与方法
1.1实验材料
人外周血样品取自中心血站12例健康成人自愿者的静脉血50 ml。男6名，女6名，年龄20～50岁。人肺腺癌细胞株A-549购自南京凯基生物科技发展公司。
1.2主要试剂和仪器
RPMI1640培养基(美国GIBCO公司)；特级无支原体无热源胎牛血清(美国TBD公司)；人淋巴细胞分离液(密度：1.077 g/cm3 ，TBD生物技术发展中心，天津)；二巯基乙醇(美国TBD公司)；台盼蓝（美国Sigma公司）；二甲亚砜（美国Sigma公司）；青霉素，链霉素（华北制药有限公司）；胰蛋白酶（南京凯基生物科技发展公司）；乙醇、谷氨酰胺、PBS、EDTA等购自北京化学试剂公司；MTT试剂盒（南京凯基生物科技发展公司）；重组人白细胞介素-1β(interleukin-1β，IL-1β)、白细胞介素-2(IL-2)和干扰素-γ(interferon-γ，IFN-γ)(PEPROTECH公司)、CD3mAb（美国Stem Cell Technologies公司）；CD3-FITC（异硫氰酸荧光素）、CD4-PE（藻红阮荧光素）、CD8-PE、CD3-FITC、CD56-PE和鼠抗人IgG荧光抗体（美国eBioscienc公司）；流式细胞仪(美国BD公司)；550酶标仪（美国Biorad公司）。
1.3实验方法
1.3.1 PBMC的分离(密度梯度离心法)及LAK、CIK细胞的诱导将人外周抗凝血用淋巴细胞分离，吸取白膜层细胞即PBMC，PBS洗涤3遍，加入含10%无热源胎牛血清RPMI1640（1 mmol/L丙酮酸钠、2 mmol/L谷氨酞胺、10 mmol/L Hepes、89 mmol/L NaHC03、50 μmol/L巯基乙醇、0.1 mg/ml链霉素、100 U/ml青霉素培养基），调整细胞浓度，接种于25 cm2培养瓶中，1.0×107个/（10 ml・瓶)，置于37℃、5% CO2饱和湿度培养箱内静置2 h，可见分为黏附于瓶壁的细胞和非黏附细胞。取非黏附细胞分成2组。LAK组:加入500 U/ml IL-2，每3天换液1次并补加500 U/ml IL-2。CIK组:第1天加入IFN-γ 1 000 U/ml、IL-1β10 U/ml，24 h后加入IL-2 100 U/ml、CD3mAb 50 ng/ml，此后每隔3 d换液1次，并补加IL-2及CD3mAb。
1.3.2LAK、CIK细胞表型的检测在培养1，4，7，10，13，16，19，22 d取培养的细胞，用PBS洗涤两遍，调整细胞浓度为5.0×106个/ml，取100 μl悬液加入流式专用试管中，加入FITC、PE标记的鼠抗人单克隆抗体CD3-FITC、CD4-PE、CD8-FITC、CD3-FITC、CD56-PE，对照为IgG1-FITC、IgG12PE，25℃下避光孵育0.5 h，用PBS液洗涤3遍，洗去多余的抗体。并用同型无关阴性抗体做对照，在流式细胞仪（美国BD公司）上检测分析，至少分析1.0×105个细胞。
1.3.3 LAK、CIK细胞杀伤活性的检测取对数生长期的肺癌细胞A-549作为靶细胞，用RPMI1640培养基稀释成1.0×105个/（100 μl・孔），接种细胞于96孔培养板中，然后取出培养两组效应细胞，把效应细胞加入靶细胞孔中混合，另设单独靶细胞和效应细胞组，每组设3个复孔，放置培养箱中培养24 h，每孔加入MTT(5 mg/ml)测仪于570 nm处测OD值，按下面公式计算各组LAK的杀伤活性。
1.4统计学处理
数据采用SPSS12.0统计软件包处理，数据以均数±标准差（x±s）表示，多个均数间使用单因素方差分析，两样本均数的比较用t检验，P
2 结果
2.1 CIK细胞的增殖情况
实验表明PBMC在细胞因子作用下均能增殖，镜下可见细胞饱满透亮、聚集成团，呈集落样生长。与LAK比较，在前期无明显差异，至19、22 d时扩增能力显著高于LAK细胞的扩增倍数(P
表1不同培养天数LAK、CIK细胞的增殖情况(x±s，倍)
2.2 CIK细胞的表型分析
用流式细胞仪分析细胞表型，结果显示CIK细胞培养后，其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P
与培养前比较，*P
2.3 CIK细胞的杀瘤活性
CIK细胞在培养至第13天即有较高的杀瘤活性，为61.17%，显著高于LAK细胞的41.02%(P
与单纯的LAK对照组比较，*P
3 讨论
近年来恶性肿瘤的发病率呈逐年上升的趋势，随着细胞免疫学和分子生物学的发展，细胞免疫治疗成为除化疗、放疗之外的又一重要辅助治疗手段，副作用轻微，安全性较好[3]。过继免疫治疗(ALT)是恶性肿瘤生物治疗的一个重要手段，是通过直接向肿瘤患者输注具有抗肿瘤活性的免疫活性细胞，在体内发挥抗肿瘤作用，以此来达到治疗肿瘤的目的。淋巴因子诱导的杀伤细胞（lymphokine activated killer，LAK）是由IL-2激活的杀伤细胞，具有广谱杀伤肿瘤的细胞活性，其较早用于临床肿瘤免疫治疗并取得了一定疗效。细胞因子诱导的杀伤细胞(cytokine induced killer，CIK)是一种非MHC限制性的高效溶解肿瘤的细胞毒性T细胞，其主要效应细胞表面既有T细胞表面标志CD3，也有NK细胞表面标志CD56[4，5]，因而兼有T淋巴细胞抗瘤活性和NK细胞非MHC限制性杀瘤的特点。CIK 细胞是一类非主要组织相容性复合物(MHC)和非T细胞受体(TCR)限制性的免疫活性细胞，在培养过程中，一些非活性细胞在多种细胞因子的共同刺激下，激活为有细胞毒作用的CIK 细胞。这些活性细胞发挥抗肿瘤作用的机制很可能是通过黏附分子LFA-1/I、CAM-1相互结合后，能够分泌大量的BLT 酯酶的细胞质颗粒，这些颗粒能够直接穿透封闭的靶细胞膜进行胞吐，从而导致肿瘤细胞的裂解[6]；同时，CIK细胞自身还能分泌IL-2、IL-6、TNF-α和GM-CSF等一些细胞因子，提高细胞毒作用。是目前最新、杀伤肿瘤效果最佳的生物免疫治疗方法。Lanier于1986年首次发现这种异质细胞群(主要是CD3+CD56+细胞)，其在外周血淋巴细胞中的比例为1%～5%[7]。经过多年的实践，科学家们找到了体外大量扩增CIK细胞的方法，即应用细胞因子IL-1β，IL-2，IFN- γ和CD3单抗共同培养产生CIK。我们在实验中采取此方法，在分离外周血单个核细胞中先加IFN-γ，24 h后加入抗CD3单抗、IL-1β与IL-2，培养22 d，每3天换液和补加细胞因子，培养13 d时即有25%左右的细胞是CD3+CD56+细胞，具有典型的CIK细胞形态和生物学性状。CIK具增殖速度快、杀瘤活性高、杀瘤谱广、毒副作用小等优点，目前自体及异体外周血CIK细胞已被用于一些实体瘤和恶性血液病的治疗，并取得了较好的疗效。我们的实验结果表明，与LAK 细胞相比，CIK细胞具有更强的增殖能力，培养至22 d时体系中总的细胞数可增加100多倍。用流式细胞仪分析细胞表型， 结果显示CIK细胞培养后， 其主要效应细胞CD3+CD56+ 细胞较培养前显著增加(P
综上所述，本研究采用IFN-γ、抗CD3单抗、IL-1β和IL-2等多种细胞因子成功从健康人非贴壁PBMCs中诱导出大量的具有典型形态和免疫表型的CIK细胞，且具有较高的杀伤活性，为下一步临床治疗肿瘤奠定了基础。
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细胞生物学特性范文5
【摘要】 目的： 研究人胃癌细胞SGC7901中多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶2 (ppGalNAcT2) 基因表达与肿瘤转移相关基因MMP2，TGFβ1表达的相关性，以及对细胞增殖和形态生物学特性的影响。方法： 用两个已构建好的反义表达载体转染胃癌细胞SGC7901，通过G418筛选，建立一系列旨在封闭胃癌细胞SGC7901 ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆。通过共聚焦显微镜，RTPCR检测反义封闭ppGalNAcT2基因RNA表达后，胃癌细胞SGC7901中TGFβ1，MMP2表达水平，细胞增殖以及形态的变化。结果： 反义封闭ppGalNAcT2基因表达后， 胃癌细胞SGC7901 ppGalNAcT2的表达水平明显降低，细胞的形态发生改变，分裂增殖减慢。结果还显示，反义封闭ppGalNAcT2基因表达可使TGFβ1，MMP2基因在mRNA表达水平均增加，提示ppGalNAcT2基因表达可能对胃癌细胞SGC7901浸润转移产生影响。 结论： ppGalNAcT2可能在肿瘤的增殖、浸润和转移中发挥作用。
【关键词】 SGC7901细胞； 多肽N乙酰氨基半乳糖转移酶; 基质金属蛋白酶; 转化生长因子β1
［Abstract］ Objective: To study the effect on the cell proliferation and the level of MMP2 and TGFβ1 in the SGC7901 cells caused by antisense blocking ppGalNAcT2 gene expressionMethods： The antisense expressing vectors of two different length ppGalNAcT2 gene segments were constructed and transfected into SGC7901 cells.A series of subcellular clones aiming at blocking of ppGalNAcT2 gene expression of SGC7901 cells were established by G418 selection.After antisense blocking， the cells were first tested with fluorescent microscopy.Then the expression of ppGalNAcT2，MMP2 and TGFβ1 gene cells growth were studied with RTPCR.The effects of ppGalNAcT2 antisense RNA on the proliferation of SGC7901 cells were tested by MTT. Results： The results showed that ppGalNAcT2 level in SGC7901 cells was obviously redudced and the cell proliferation was slower after antisense blocking.It indicated that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression had influence on SGC7901 cell proliferation.It was also revealed that the blocking of ppGalNAcT2 gene expression could increase the mRNA and protein level of MMP2 and TGFβ1. Conclusion： The result suggests that ppGalNAcT2 has an important role in the cell proliferation， invasion and metastasis of cancer.
［Key words］ SGC7901 cell; polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase; matrix metalloproteinase; transforming growth factorβ1
糖蛋白的糖链按照其连接方式的不同，分为两大类：一类称N连接型糖链，又称N聚糖，主要存在于血浆蛋白和细胞膜及胞质的糖蛋白中。另一类称O连接型糖链，又称O聚糖，主要见于分泌液中的糖蛋白，俗称黏蛋白［1］。肿瘤细胞含有富含O聚糖结构域的膜结合黏蛋白类糖蛋白，这些糖蛋白的基因表达具有细胞特异性并且在肿瘤细胞中常发生变异。有关糖基转移酶的研究，以往人们较多地关注参与N糖苷键连接有关的酶，近年来随着O糖基化相关酶新基因的发现和克隆，有关O糖基化产生的糖链结构和功能的研究受到广泛重视。多肽:N乙酰氨基半乳糖转移酶（polypeptide Nacetylgalactosaminyltransferase，ppGalNAcTs）是O糖链合成第一步的糖基转移酶，ppGalNAcT2是该家族中组织分布及底物谱较广的成员，很有可能是O糖链合成的限速酶，有着重要的生物学意义［2］。
为了深入研究ppGalNAcT2的生物学功能，我们成功地构建了ppGalNAcT2反义表达质粒载体，反义封闭ppGalNAcT2基因表达［3］；我们也成功地构建了ppGalNAcT2的RNA干扰真核表达载体，转染SGC7901细胞得到稳定的ppGalNAcT2基因剔除细胞株［4］。为探讨ppGalNAcT2在肿瘤细胞生长增殖及浸润转移中的作用，本研究将ppGalNAcT2反义重组载体运用脂质体介导转染人胃癌细胞SGC7901，得到封闭胃癌细胞SGC7901细胞ppGalNAcT2基因表达的亚细胞克隆，并对其生长繁殖及浸润转移相关基因基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase，MMP）和转移生长因子β1（transforming growth factorβ1，TGFβ1）的表达进行了初步研究。
1 材料与方法
1.1 材 料
人胃癌细胞株SGC7901为本室保存。反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2由本室构建保存。RPMI1640培养基购自Gibco BRL公司， RTPCR试剂盒购于Promega公司，转染试剂盒G418选择性抗生素购于Roche公司。PCR引物为上海博亚公司合成。NBT/BCIP染色试剂盒为华美生物工程公司产品，antihTGFβ1、antihMMP2及βactin 单抗均为R&D公司产品。
1.2 方 法
1.2.1 重组质粒转染SGC7901细胞 pEGFPFDT2和pEGFPFXT2重组载体分别是将T2全长序列1 716 bp和T2序列中的一片段753 bp经酶切后反向连接入pEGFPC1载体中，分别形成反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2。转染前将SGC7901细胞接种于24孔板，加入不同浓度的G418观察细胞的死亡情况，确定最低致死浓度。将处于对数生长期的SGC7901细胞接种于培养瓶(1×106/ml)，于37℃，5％CO2孵箱中孵育12 h后，按FUGENE6介导转染贴壁细胞的方法，将纯化的重组质粒和阴性空质粒转染SGC7901细胞。72 h后加入G418溶液至终浓度为600 mg/L，培养2周左右直到出现抗G418细胞克隆。
1.2.2 共聚焦显微镜观察 将盖玻片置于6孔板中，把转染过的细胞培养于其中，待细胞长到30%～40％的汇合度时弃去培养基，用PBS轻轻淋洗后，每孔加1 ml 4％低聚甲醛固定半小时后，吸出低聚甲醛，用PBS洗2遍，封片后置于共聚焦显微镜下观察转染进细胞的质粒所表达的GFP荧光。
1.2.3 细胞形态学观察 将未转染细胞、转染空载体的细胞及转染了反义重组载体pEGFPFDT2和pEGFPFXT2的细胞株分别命名为SGC7901，SGC79010，SGC7901FDT2，SGC7901FXT2，将4种细胞置于显微镜下，观察其形态的变化，并拍照记录。
1.2.4 相关基因的检测 细胞总RNA的提取采用Trizol一步法。以所得到的细胞总RNA为模板，使用Promega公司的试剂盒进行RT反应，得到cDNA。选用βactin为内对照，以各种细胞株的总RNA的RT产物为模板同时进行PCR扩增，检测转染反义ppGalNAcT2的SGC7901细胞ppGalNAcT2，TGFβ1，MMP2等相关基因表达的变化。PCR反应条件是94℃预变性4 min， 94℃变性50 s，55℃退火50 s，72℃延伸90 s，35个循环，72℃再延伸10 min。PCR引物序列及预扩增片段长度如下（表1）。
1.2.5 MTT法检测细胞增殖 取对数生长期细胞，胰酶消化成单个细胞悬液后，计数细胞，将细胞调整到一定浓度后，接种于96孔板上，每孔加200 μl细胞悬液，每隔24 h随机取4孔，各加MTT 50 μl，5 h后小心吸去液体，加二甲基亚砜(DMSO) 150 μl，待显色后转移到酶标仪上测定光密度值(490 nm)。以第1天的光密度值为1以后各天显示值为与第1天之比值，作生长曲线图，观察细胞增殖变化。
2 结 果
2.1 共聚焦显微镜观察结果
在共聚焦显微镜下观察到转染后的细胞发出绿色荧光（图1），并发现GFP绿色荧光都集中于胞质中，证实转染成功。表1 PCR引物序列
2.2 转基因细胞形态学观察结果
荧光显微镜下可以看到转染了反义RNA载体的细胞形态有所变化，相对于未转染的细胞及转染了空载体的细胞其形态更显得梭长，提示转染反义重组载体可能影响细胞的生长特性(图2)。
2.3 转移相关基因的变化
结果表明转染了pEGFPFDT2和pEGFPFXT2细胞ppGalNAcT2的mRNA表达明显降低，而TGFβ1和MMP2的mRNA表达水平均相对增加(图3)。显示ppGalNAcT2可能与肿瘤的浸润转移密切相关。
3 讨 论
ppGalNAcT及其家族作为黏蛋白O糖基化的起始酶，可能与肿瘤的生长和转移密切相关。我们观察了ppGalNAcT2在8种肿瘤细胞中的表达谱后发现［3，5］，在人胃癌细胞株SGC7901中，ppGalNAcT2的表达较其他细胞要高。本研究通过转染表达ppGalNAcT2反义RNA的质粒，成功获得了ppGalNAcT2表达受抑制的人胃癌细胞克隆，为研究该基因在肿瘤发生发展中的作用提供了实验模型。进一步的相关功能研究结果表明，转染了ppGalNAcT2反义RNA的质粒的SGC7901细胞ppGalNAcT2 mRNA表达水平降低，TGFβ1，MMP2的mRNA表达水平均相对增加。由于TGFβ1，MMP2都与肿瘤的浸润转移及增殖相关，因此推测ppGalNAcT2与肿瘤的浸润转移及增殖密切关联。
关于转移瘤生长相关的细胞因子，近年来研究较多的有IGFⅡ，TGFβ，EGF，IL6等。TGFβ1基因被认为参与了信号转导、细胞生长、转化和肿瘤发生等过程，在许多肿瘤组织中高表达。TGFβ1可促进某些肿瘤细胞的局部浸润或腹膜播散，并削弱免疫系统对肿瘤的排斥效应［6］。TGFβ mRNA表达受多种因素的影响，近年的研究发现TGFβ mRNA的水平升高似乎与高糖的程度呈正相关［7］，Ziyadeh等在体外研究中证实，高糖增强系膜细胞TGFβ mRNA的表达及活性，而在糖尿病研究中也发现非酶糖基化产物可促进TGFβ1 mRNA的表达。本研究中转染了表达ppGalNAcT2反义RNA的质粒的SGC7901细胞TGFβ1的表达明显高于未转染的细胞和转染空载的细胞。可能的原因是由于抑制了细胞内ppGalNAcT2的表达，酶促糖基化减少，而非酶糖基化增加，这样同时增加了糖浓度和非酶糖基化产物。这两个因素可促进TGFβ1 mRNA表达相对增加。而TGFβ1又与MMP的表达密切相关，TGFβ1能诱导人类细胞株转录出高水平的MMPs mRNA［8］。有报道称，在转基因小鼠的研究中发现TGFβ的过表达能抑制良性皮肤瘤的形成，而对于皮肤癌却能促进其浸润转移，并证实是MMPs合成增加所致［9］。在本研究中，ppGalNAcT2反义RNA能抑制ppGalNAcT2的表达，而ppGalNAcT2表达水平的降低促进了TGFβ1的表达，进而可能促进MMPs的合成。
TGFβ1是具有双重调节作用的因子，体外实验证明TGFβ1是肿瘤细胞生长的主要负性调控因子，TGFβ1与细胞表面受体结合，通过p53和PRB的低能磷酸化，抑制cmyc的表达，使细胞分裂停止，抑制肿瘤细胞的生长［10，11］。在本研究中，推测ppGalNAcT2的减少导致TGFβ1的合成增加进而减慢了细胞的生长。
我们的工作还观察到ppGalNAcT2对胃癌细胞SGC7901对细胞外基质成分的黏附能力有影响［12］，因而有关ppGalNAcT2在整体动物肿瘤生长、浸润与转移过程中的作用值得进一步研究。
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细胞生物学特性范文6
关键词:细胞生物学;实验教学;教学改革
医学细胞生物学是当代医学科学的基本构成，通过从个体、细胞、亚细胞和分子等水平对细胞生命现象的规律和本质进行探讨，从而为个体发育、组织功能、疾病发展等生命现象及生物医学问题的认识提供理论支撑和研究平台［1］。而细胞生物学实验是医学细胞生物学课程不可忽略的实践教学部分，与理论课程相辅相成。其作为理论教学的延续和补充，是一种无法被替代的教学形式。实验课程在巩固和加深对知识点理解的同时，也培养了学生基本的实验技能，锻炼了提出问题、思考问题和解决问题的能力，培养了创新思维和专业素养，符合现代高等人才培养要求和教学改革的主流思路。医学细胞生物学和细胞生物学实验联合开展，作为医学本科生一年级的必修课程，是开启医学生涯的敲门砖。
1本校细胞生物学实验教学现状
细胞生物学实验是最受学生喜爱的实验课程之一。通过实践操作，利用显微系统可以直接将枯燥的理论知识形象、生动地展示在学生面前，有利于培养学习兴趣，增加积极性，帮助快速且充分地理解一些文字难以具体描述的知识难点，并能够实现理论知识的验证和补充。学生普遍反映，多边形的蟾蜍上皮细胞、椭圆形的肝细胞、不规则的细胞等、各类细胞的直观呈现对他们产生了很大的刺激，不仅加深了对细胞结构形态与功能之间相互关系的理解，同时满足了其自我成就感，增强了自信心。现阶段，我校细胞生物学实验教学包含了显微镜的使用、细胞基本形态观察、细胞生理、细胞化学、细胞融合、细胞分裂、染色体制备和细胞培养等内容，课程设置主要以基础性实验为主，实验类型单一(表1)。在多媒体教学改革的背景下，采用安装显微数码互动教学系统是我校重点学科建设的一大喜事。显微数码互动教学系统利用网络手段，将学生显微镜和教师显微镜连接成一体，突破了传统的“点对点”教学模式，初步实现了“点对面”教学。教师可以通过多媒体对学生进行实时监察，减轻了工作强度，还提高了解决学生问题的效率。学生与教师的互动和双向交流得到了很大程度的提高［2］。但是，由于系统终端连接数量的限制、系统成像清晰度局限、学生数量的壮大、传统教学方式的固化思想、数码互动教学作用发挥受限等因素，教学过程中仍存在一些问题。例如，学生显微镜下的视野无法高质量地投影到大屏幕，使得教学质量大幅度下降。特别是进行细胞细微结构定位分析的实验，学生显微视野下可清晰看到口腔上皮细胞经中性红－詹那斯绿B染色后，细胞核呈红色，核周围存在较多亮绿色的线粒体颗粒，但由于拍照系统和投影的局限，大屏幕上无法清晰分辨出线粒体。大班教学模式中，1名教师带领40名学生进行实验，即使利用数码互动系统，还是无法兼顾到所有学生，难免出现课堂偷懒、课下抄袭纸质实验报告等不良现象。
2细胞生物学实验教学改革思路
2．1创新教学模式
在传统封闭教学模式下，学生只是在规定的时间进入实验室，在教师的讲解下，按部就班进行规范化、简单化的实验［3］。该模式下，学生盲目地“依方抓药”，对实验的掌握程度不高，对实验内容、原理缺乏理解，导致对实验结果的分析也无法精确到位，同时学生能动性降低，自主创新能力难以得到培养。创新教学模式下，开放实验室，安排学生参与教学前准备，进行课前5min准备工作的展示和分享。参与教学前准备与课前展示，一是加强学生对实验和科学研究的整体认识，促进学生对实验原理和实验技术的掌握。二是调动学生对实验设计进行思考，形成学生主动查阅文献、分析资料的良好状态。三是锻炼学生演讲和表达能力，培养学生的思考能力和自主性。翻转课堂是提高学生自主能力的另一有效手段［4］。经过多次参与教学前准备和课前展示，学生初步掌握了基本的专业知识和掌握实验设计的一般方法。在此基础上，采用翻转课堂的教学模式，由教师提前告知学生实验内容。学生以小组为单位，通过查找资料，自行设计实验，进行课前准备和具体操作，并记录实验结果，撰写实验报告(表2)。最后在教师的指导下，讨论并解决实验中遇到的困难和分析讨论实验结果。翻转课堂使学生成为了教学活动的主体，加强学生的主动求知欲，调动科研热情，塑造自信心。此外，从教师角度出发，翻转课堂是一种新的挑战，它赋予了教师新的身份。教师成为教学活动的引导者。这对教师的教学能力和责任心提出了进一步的要求。因此，翻转课堂不失为加强师资队伍建设、增强教师自身素养的一剂良方。
2．2优化考核方式
当前医学细胞生物学课程考核方式由理论考核和实验课平时成绩两部分组成。实验平时成绩占比10%，主要根据学生的实验报告和实验操作表现来评定。而期末理论考核成绩占比90%，采取闭卷考核形式，卷面试题涵盖理论课程和实验课程两方面，各自占比为90%和10%。这种考核体系缺乏科学性，无法公正、客观地对学生的学习效果和学习的能动性进行评价。不乏学生仍然采取传统的应试考试方式，通过题库刷题和考前突击背诵重点而取得高分成绩，实际上对知识点并未理解到位，未构建基本的知识框架，仅仅形成应付考试的短时记忆。因此，我们可以将理论课程和实验课程分开独立考核。理论课程考核由平时课堂的问题回答、期中测试和期末理论考核来综合评定。而实验考核采取动态考核方法，注重对学生学习态度的引导以及科研素质和知识运用能力的培养。实验课考核不合格，给予一次重考和补修机会。实验考核成绩分3部分:平时成绩、课前展示与实验结果分析讨论和实验考核。平时成绩占15%，由教师根据平时考勤、实验课操作表现和实验报告记录情况等综合表现进行评定。课前展示与实验结果分析讨论占35%，由学生与教师根据学生的讲解和汇报的具体表现，进行客观、公正的学生自评和教员打分，最后取平均分。实验考核占50%，考核环节采取抽题回答和具体实验操作来体现，问答题以实验设计、结果讨论分析和实验问题解决方法为主，主要加强对实验原理、基本操作流程、重点操作细节和实验结果分析的考查，达到实践、思考和创新能力的提高。
2．3完善课程设置
传统的细胞生物学实验以单一的基础性实验为主，教学内容陈旧，与时展脱节［5］。对实验内容进行改革，去粕取精，将科研工作引入教学，增设综合性实验和创新性实验(表2)。例如，细胞分裂实验可以从原始简单的马蛔虫子宫和洋葱根尖切片观察改变为利用免疫荧光技术对染色质和细胞骨架进行颜色标记，观察细胞分裂的动态过程，而传统的马蛔虫子宫切片和洋葱根尖切片通过新媒体投影，以视频图片的形式展示，设计分裂时期判断的问题，通过教师提问、学生回答的模式展开。该模式不仅丰富了实验内容，增加课堂互动，且在引导学生运用理论知识的同时还引入了细胞时空动态特性的概念。细胞培养实验由简单的传代培养改变为细胞培养综合性大实验，包含细胞复苏、传代、冻存、细胞形态观察、细胞大小测量、细胞计数、活力测定和细胞衰老相关半乳糖苷酶活力鉴定等内容，让学生走进当代细胞生物学实验技术，充分体验科学研究的乐趣和价值。
