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微生物多样性分析范文1
一、变性梯度凝胶电泳（DGGE）和温度梯度凝胶电泳（TGGE ）
1993年Muyzer等将DGGE技术引入环境微生物学多样性的研究。随后该技术被广泛用于比较不同生态系统中的微生物群落的多样性及监测特定微生物种群的动态变化，DGGE和TGGE的原理是根据含有不同序列的DN段（16S rRNA基因扩增产物）在具有变性剂梯度或温度梯度的凝胶上由于其解链行为的不同而导致迁移率的不同，部分解链的DN段在凝胶中的迁移速率低于完全螺旋形式的DNA分子，从而含有不同碱基序列的DN段就得到有效分离。结合PCR扩增标记基因或其转录物（rRNA和mRNA）的DGGE方法能直接显示微生物群落中优势组成成分。由于它可同时对多个样品进行分析，使之非常适合研究微生物群落的时空变化，而且可以通过对酶切条带进行序列分析，或通过与独特的探针杂交鉴定群落组成，可以方便地了解环境扰后的微生物群落变化或某种指示微生物的命运。Oliver等用DGGE方法考察了农田微生物的变化情况，认为环境变化对农田微生物的多样性有很大影响。但是DGGE/TGGE技术也存在一定的局限性。
其缺陷之一是只能分离约500 bp大小的DN段，这限制了作为下一步用于杂交分析的探针设计。并且研究报道有些种类细菌16S rDNA在DGGE上不只显示1条带，而不同种细菌的16S rDNA序列在DGGE上也可能因为具有相同的解链行为而不能被分开。即便存在以上的一些局限性，DGGE/TGGE仍是分析微生物群落多样性较为敏感的方法之一。
二、单链构象多态性（SSCP）
SSCP是对16S rRNA基因扩增产物进行分析的另一种简便有效的方法。该技术最初用来检测人类DNA的基因多态性，Lee等在1996年首次报道将SSCP技术应用到环境样品微生物群体多样性分析。不同碱基序列的单链DNA分子构象不同，DN段变性成单链后受到凝胶不同分子筛作用力最终使不同DN段得到分离。电泳结束后可以将不同的条带切下并测序，或采用特异性探针进行杂交，进而显示该特定微生物类群的动态变化。Holly等利用SSCP技术研究发现在植物根际土壤中大量存在古菌Crenarchaeot，该类微生物以往一直被认为只存在于极端嗜热环境当中。但是SSCP技术重现性较差，易受胶浓度和电泳温度等条件的影响。另外，SSCP能够有效分离的DNA序列过短，为150-400 bp。
三、随机引物扩增多态性DNA（RAPD ）
由Williams建立的RAPD技术，因具有操作简便、快速和经济等优点而得到了广泛应用。该技术以随机寡核苷酸（5-10 nt）作为引物，扩增得到的多态性片段较短，更方便检测两个同源或异源等位基因的有无，适用于种内和亚种更为细致的分类。张峦等在室内培养条件下，采用RAPD分子标记技术研究了重金属镉和多环芳烃菲复合污染对土壤中微生物群落DNA序列多样性的影响。结果表明，培养15 d和30 d后，镉-菲单一和复合污染均导致土壤微生物群落DNA序列的丰度、均度和多样性指数增加。重复性不好是该技术存在的主要问题，而DNA模板的质量与数量、MgCl2和引物浓度的变化都有可能导致得到不同的图谱。另外，从条带图谱中无法得到任何微生物系统发育信息。
四、限制性片段长度多态性（RFLP ） 和扩增核糖体DNA
限制性分析RFLP方法和ARDRA方法也常用于微生物群落的分析。通常用引物PCR扩增得到16S rDN段，被限制酶切割，然后再进行电泳形成不同长度的片断进行分析。其所获得的谱带更为简单，易于分析，不受菌株是否纯培养的限制，不受宿主的干扰，具有特异性强，效率高的特点。广泛应用于新物种的发现、微生物分类及鉴定、共生菌、病原菌的微生物遗传多样性的检测等。后来有人利用ARDRA方法考察两种不同农田土壤的微生物群落时，发现两者无显著差异。张于光等利用RFLP方法对三江源地区不同的植物类型的土壤中固氮微生物群组成进行了研究，发现所有土壤样品中分别具有1-2个优势微生物种群。但是该技术所能获得的信息量相对较少，并且难以用来评估物种的丰度和均度。
微生物多样性分析范文2
（贵阳职业技术学院，贵阳 550081）
摘要：采用T-RFLP法实验研究贵州省特有药用植物根际丛枝菌根真菌（arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）的多样性。结果表明： 4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。植物种类不同，对应的AMF群落多样性有较大差异，证明了宿主植物对根际微生物群落结构多样性的影响；同时，有机质、pH和速效磷对根际AMF群落多样性影响较大。
关键词 ：丛枝菌根真菌；贵州特有药用植物；群落多样性
中图分类号：S567 文献标识码：A 文章编号：1006-4311（2015）17-0219-02
作者简介：封晔（1981-），女，陕西绥德人，贵阳职业技术学院讲师，研究方向为微生物应用。
0 引言
贵州特有药用植物是指目前在贵州省境内发现有分布并具有药用价值，但是在贵州以外的其它地区都没有分布的物种，其代表种类有：银背叶党参、梵净山小檗、梵净山蒲儿根、梵净山冠唇花、梵净山火绒草、梵净山紫苑、短茎羊藿等[1]。
菌根真菌（Mycorrhizal fungi）在自然界中有着重要的生态作用，它可以与世界上大多数的维管植物根系形成互惠共生体。丛枝菌根真菌（Arbuscular mycorrhizal fungi，AMF）是菌根中分布最广泛的一类。研究表明，AMF因其能扩大植物根系吸收面积、加快养分运输速率、分泌活化物质、提高光合速率等直接和间接作用，改善宿主植物的矿质营养，增加植物中的碳积累，进而促进植物生长[2]。
目前对药用植物AMF的研究主要集中在菌根多样性或接种菌根真菌对植物的影响。李品明等对重庆市13种中药材植物的AMF物种多样性进行了研究，结果表明，从中药材植物根际土壤中分离出了10种菌根真菌，隶属三个科[3]。王森等以山西历山自然保护区暴马丁香、连香树、南方红豆杉和领春木4种珍稀药用植物为材料，从4种植物根际共鉴定AMF 27种[4]。在国内因药用植物种质资源丰富，宿主范围十分广泛，目前已经对上百种药用植物进行了研究。
长久以来，中药材大多来自野生药用植物，但随着对药用植物需求的不断增加，野生药用植物已经无法满足人们对药用植物的需求，甚至濒临灭绝，加之人工栽培技术落后、栽培措施不配套等原因，导致药用植物种质退化、质量下降、入药性质不稳定等。本课题主要是通过对贵州特有药用植物根际土壤采集和分析，研究药用植物根际AMF种质资源及多样性，以期为充分发掘和利用AMF资源，筛选AMF优势菌，利用菌根生物技术提高药用植物产量、品质和扩大人工栽培区提供材料和依据。
1 材料与方法
1.1 研究地概况
采样地位于贵州东南部茂兰保护区及织金县牛场镇。本区处于温暖湿润的中亚热带气候区，区域内有雷公山和月亮山，分布着适宜常绿栎林及热带常绿阔叶林生长的红壤和红黄壤，海拔最高处为2178．8m，最低处137m。区域内有中草药资源十分丰富。
1.2 样品采集
2014年10月在贵州省茂兰保护区及织金县牛场镇采集铁皮石斛（Dendrobium officinale Kimura et Migo）、黄连（Coptis chinensis Franch.）、太子参（Pseudostellaria heterophylla(Miq.) Pax）、丹参（Salvia miltiorrhiza Bge.）根系及根际土。每株按东西南北4个方位，除去5cm厚的表层土后，挖10～20cm深的土壤剖面，剪取带有细根的根系，用塑胶袋存放根系和根际土样品。经检测，土样基本性质如表1所示。
1.3 AMF的形态观察及其侵染能力的检测
采用Philips和Haymay染色方法进行观察和计算。
1.4 分子生物学方法分析样品多样性
1.4.1 总DNA的提取和纯化
采用Zhou 等[5]的酶裂解法提取土壤总DNA。
1.4.2 PCR扩增
采用由大连宝生物公司合成的引物AM1 和NS31扩增18SrDNA施测。反应体系为20ml.PCR扩增产物用1.0 %琼脂糖凝胶电泳检验。
1.4.3 群落多样性分析
采用T-RFLP方法分析样品，以图谱中每一个限制性片段（T-RF） 为一个OTU，测定OTU数目即为物种丰富度指数（S），峰高值低于100荧光单位的峰不计入分析范畴。根据丰富度指数（S）和相对峰高值（Pi）测定均匀度指数（E） 和Shannon多样性指数（H）。
相对峰高值（Pi） ：Pi= ni/ N
均匀度指数（E）：E＝H/lnS
Shannon指数（H）：H＝－∑PilnPi
式中，N为该样品所有累计峰高，ni为第i个T-RF峰值。
1.5 数据分析
用表3中的实验数据代入EXCEL（2003）、spss（V17.0）软件系统进行汇总和分析。
2 结果与分析
2.1 根际AMF的形态及其侵染率
从表2中可见，不同宿主植物根系菌根真菌侵染率不同，四种植物中铁皮石斛的菌根侵染率最高，丹参最低。对比采样环境可以看出，侵染率与土壤性质有一定相关性。其中pH越高侵染率越高；侵染率与速效磷和速效钾呈反比。
2.2 群落多样性
2.2.1 样品总DNA提取和基因的扩增结果
从土壤中提取出的总DNA粗提样品中有大量黑褐色杂质，基因组片段大小为20 kb，用1%琼脂糖电泳检测，条带明亮齐整，这说明所得到的微生物总DNA比较完整。扩增的18 SrDNA基因片段长度为550 bp。
2.2.2 群落多样性指数
表3可见，4个样品的根际AMF多样性存在明显的差异。其中，丰富度指数和Shannon指数最高的是黄连，最低的是太子参，表明植物种类的差异对根际AMF群落多样性有影响。
3 结论和讨论
根际微生物活性及群落结构的变化是评价土壤生态系统的重要指示因子，通过观察其变化能够发现植物和土壤质量[6]。本研究表明，4种贵州省特有药用植物根际AMF种类丰富，数量较大。由于植物种类的不同，AMF群落多样性也存在很大的差异。由此可见，宿主植物也会影响根际微生物群落结构多样性。但Oehl具有不同意见，他认为土壤类型和土地利用模式决定了AMF的群落结构[8]。
对于根际微生物来说，很多的环境因子都对其群落多样性影响很大，如有机质、pH和速效磷等，这是因为土壤微生物中的养分越高，营养物质就越多，这有利于其活性的增加。卜洪震等发现使用肥料后可以促进土壤微生物的活性，并且不同施肥处理对土壤微生物量碳和微生物多样性有着重要影响[7]。本研究中速效磷是影响AMF群落多样性的一个主要因素。而从O’Donnell 等[8]学者的研究成果来看，土壤pH值也是一个重要的土壤微生物群落多样性影响因子。徐辉[9]在现有研究成果的基础上展开进一步研究，发现速效磷也直接影响刺槐和沙棘根际AMF侵染率。在自然环境中随着环境因子的变化，土壤微生物群落的形成和变化也会随之调整，这说明土壤微生物的生长和环境因子有着直接关系。通过研究土壤微生物群落动态变化，也就为了解生态系统的土壤健康状况和植被发育阶段提供了可能。
参考文献：
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微生物多样性分析范文3
关键词:宏基因组;不可培养微生物;筛选系统
中图分类号:Q75 文献标识码:A 文章编号:1674-0432(2010)-06-0044-3
0 引言
Woese和Pace基于16S rRNA或DNA基因序列分析的先锋研究工作给微生物生态学领域带来了革命性的变化。在此之前,人们完全没有意识到真实存在于自然界和在实验室能培养的微生物数量之间重大的差别。伴随着克隆和测序技术的发展,细菌通用引物对环境中生物群落总DNA的直接PCR扩增,产生了大量的数据并重新定义了原核生物的多样性。近年来一些学者对微生态学和宏基因组进行了研究。以下是近几年报道的关于不可培养的大多数微生物的新的见解和技术。
1 宏基因组的研究
1.1 DNA的分离
环境样品DNA的质量直接关系到宏基因组分析的质量。Tiedjie等发展了从不同类型的土壤中直接分离DNA 的方法,但是这些方法仍然不能确定在所有的具有代表性的高度复杂的生物群落中能够获取全部的总DNA。尽管Coutois等人发现,从土壤中直接提取DNA和先从土壤分离细胞再从中提取DNA所得到的细菌多样性范围并无重大差别,但是Luna等人证实,在检测海水沉淀物时,只用单一的DNA提取方法严重低估了细菌多样性。不同的方法适用不同的环境。比如,Fortin等人发现,在细胞裂解前冲洗被碳氢化合物和重金属严重污染的土壤和海水沉淀能改善DNA的质量。
选择一种DNA提取方法用于宏基因组分析需要分析样品的信息。在预测一个生态环境中不同的微生物群落成员的潜在功能的时候,分辨DNA来自样品来自可培养的微生物还是来自死细胞是很有价值的。Nocker和Camper表明,用ethidium monoazide(EMA)的衍生物分析成熟的生物膜16S rRNA基因指纹图谱,提取处理过的样品和未经处理的样品的DNA有重大的区别。对环境中的活体,很有必要区分DNA来自胞内还是胞外。水沉淀中包含了大量来自胞外的DNA,Corinaldesi等人改进了一种允许同时提取胞内和胞外DNA的方法,这些DNA可能对细菌的新陈代谢起着重要的作用。
1.2 系统发生和宏基因组的分析
DNA提取方法的改进、测序手段的进步和测序成本的降低使我们能够解决以下问题:在一个群落中不连续的单元里共生多少种类的细菌以及环境中是什么因素影响着群落的组成和多样性。Acinas等运用不同的PCR扩增方案建立了两个独立的沿海浮游生物的16S rRNA文库。这两个文库的比较表明了PCR扩增可能会高估文库中独特的rRNA序列。尽管如此,PCR的误差仍然不能说明样品中的所有16S rRNA基因的微小差异(1%的序列差异)。97种已完全测序细菌全基因组比较表明,它们包含242种属于非同源多操纵子的不同16S rRNA基因。序列分析还表明任何基因组中的16S rRNA内部操纵子的差异在1%以内。引入一个修正参数2.5(242个rRNA操纵子和97个基因组相除)到浮游生物样品待测序的序列中,以99%的相似性(1113)为标准,Acinas等预测这些样品中至少包含了446种紧密相关的基因组。因此这些数据间接的表明了这个种群内部包含有大量相似的种类。基因序列也开始用于推断一个群落中各个体的角色和功能,这比仅确定群落中的种类更有意义和更具挑战。
在低度多样性环境中,普通的测序就能得到环境中的微生物信息。比如在一个种群细菌复杂程度不高的酸性矿井排水装置中的生物膜中,可以对单个菌株的代谢途径进行分析。在Tyson等人的研究中,细菌种群只由五种主要的种类组成,而且其中两种几乎存在所有的覆盖面积内。而许多自然环境中种群结构高度复杂,不能采用现在的方法。据估计在一份农场土壤样品中有超过5000种,104-105株的细菌。要得到这些复杂环境中占有最优势地位的细菌种类的八倍的覆盖量,必须产生二十亿到五十亿个碱基对的序列。为了避免对全基因组集合,Tringe等大量使用未集合的序列来读取一定时期内环境中标记基因。基因定量包括对特定生态环境能反映已知环境特点的环境样品的分析。以基因比较为中心对特定环境中基因定位给我们更好地认识和解释环境带来了新的机遇,也提出了新的问题。
处理复杂环境的另一条途径是将许多种类混合的16S rRNA基因克隆到单一的载体里面。其中,SARST(serial analysis of ribosomal sequence tags)发现了V1或V6高变区。这些位于核糖体小亚基rRNA上的高变区(叫做V1或V6区)长度大约为17-55bp,这些复杂的生物体中的片断可以连接到单个的克隆里面去。用这种方法,单个测序反映能达到的序列标记可达20个。这种方法可以鉴定菌群可达到属的水平。van der Lelie等人报道了一种改变的序列标记方法,用于基因组中短的保守序列,结合限制性内切酶消化产生标记,可以区分亲缘关系很近的菌株。一些细菌的保守基因已经鉴定出来,包括rpoC,uvrB, recA 和16S rRNA 基因。在这些基因中,16S rRNA是差别最大而且可以应用于所有的原核生物种类分析的基因,可以达到属的水平,很大一部分还可以分辩到种的水平。
近年来,以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列已经成为鉴定微生物区系的最有力的方法。这种微生物分类阵列由大量不同门类的细菌的标记探针组成。不同原型的阵列已经发展并开始用于估计环境种群中微生物的多样性。这种以16S rRNA基因为基础的微生物分类阵列将成为监测各种复杂环境中微生物多样性的一个最重要的工具。
复杂环境中微生物区系指纹图谱和宏基因组分析将来可能发展为基因芯片。一个完全的综合芯片到目前为止仍然是一个对未来的展望。Hong等人描述了一种基因芯片的概念,这种芯片通过分离不同种类和数量的细菌或哺乳动物的细胞并裂解提纯DNA或者mRNA来实现。基因芯片的研究对我们认识和监测一定的微生态环境中微生物种群结构的认有着非常重要的意义。
直到今天,宏基因组的研究还只在生物量相对较高的环境中进行。在对细胞、量很少的环境进行宏基因组的分析还需要一种新的文库构建方法。Abulencia等描述了一种多态性扩增严重污染的土壤中有机体基因组的方法。从严重污染和细胞密度极低的地表下土壤样品中提取DNA,￠29DNA聚合酶用于扩增总基因组。通过第一次基因组DNA的扩增,污染的土壤中细菌多样性分析,和细菌基因组文库构建是可能的。尽管存在扩增的偏好现象,在一个微小的细菌样品中扩增宏基因组DNA,仍然可以得到一些以前无法得到的基因组的信息。
1.3 筛选宏基因组表达文库
另外一种方法是通过构建和筛选宏基因组表达文库,或者通过测序和限制性内切酶的方法来筛选。直接筛选宏基因组文库的一种局限就是需要超高通量的筛选系统,或者大量的可用的筛选的阵列。可以通过富集基因的方法来筛选由数百万个基因组成的宏基因组文库中的稀有基因。其中一种富集的方法是底物诱导表达筛选(substrate-induced gene expression screen,SIGEX)。Uchiyama等完善了一种高通量的SIGEX筛选方法,他们将目的基因和绿色荧光蛋白(GFP)连接起来,转到表达载体内,通过检测激发的荧光来检测相应的克隆。宏基因组DNA被克隆到gfp基因序列的上游后,通过FACS方法来排除所构建文库中组成型表达gfp的克隆。再将未表达gfp的克隆转移到含有靶标底物的培养基中,通过诱导gfp基因表达来筛选克隆子。这种筛选体系的机理是:分解代谢相关的基因能够在特定代谢物的作用下被诱导表达。
1.4 通过培养方法获取不可被培养的大多数微生物
要大量精确测序复杂环境中的微生物DNA样品,不是一件很容易的事情,这也说明了全面的获取微生物信息的方法的重要性,可以通过这些信息来理解微生物间及微生物与环境间的相互作用。尽管“环境基因组”能够提供大量的信息,但对生理学,生态学和进化学有重要影响的分类单元中可培养微生物单菌落的会给生态小环境的研究带来深远影响。Proteorhodpsin的发现及它的编码基因存在于Pelagibacter ubique证明了获取可培养单菌落的作用。Proteorhodpsin编码基因是在海水和环境微生物宏基因组的克隆测序过程工程中第一次被发现的,但是我们不能确定不可培养的微生物基因组中包含Proteorhodpsin基因。通过培养Pelagibacter ubique,我们就有可能将Proteorhodpsin与固定的种类联系起来。
许多研究者们正在努力研究与模拟专一的可培养的微生物,并且利用将这些微生物来研究它们环境中所处的地位和发挥的作用。基因组测序已经为我们提供了大量的信息并了解这些微生物在环境中的作用。
经典的微生物培养策略都是一贯地给微生物系统提供过量的营养,从而导致能形成菌落或薄膜的和快速生长的细菌富集。对于依赖稀释培养基或模拟自然环境培养基才能生长的细菌,Ferrari等人描述了一种模拟自然环境条件的用于培养土壤微生物的新颖方法。他们研究组所采用的泥浆膜系统中,一种聚碳酸酯是作为生长培养支持物,土壤提取物作为培养基。研究结果是长出了大量的未被鉴定的微型菌落。Koepke等人将多种不同的培养方法应用到沿海地表下的沉积物,研究发现多数情况下没有一组微生物能够在几种培养方法中都被培养出来。他们的研究肯定了这个观点:没有一种单一的培养方法或者培养基适用于分离专一样本中的多种多样的微生物。同时采用低营养条件富集和分子方法,在冰岛富含中性硫化物的热温泉中得到了具有一种高度差异型的淀粉酶基因。使用热温泉水的微生物富集方法采用低浓度淀粉和长时间温育,最后选育出能够降解淀粉但生长缓慢的微生物。
在培养之前,将样品中的多种特定的微生物选择性地分离出来可以降低微生物群落的复杂性。Miteva和Brenchley的过滤培养,结合长时间温育,使一些新颖而极小的细胞菌落得到富集。这种方法对于研究极端条件下的微生物的代谢特性及长时间存活机制是很有益的。
2 结语
要得到不可培养的大多数微生物的信息,还有很漫长的路要走。在不久的将来,使用更便宜更快捷的测序方法,环境工程测序技术将会产生更加多样的数据和信息。然而,测序并非我们认识环境微生物的唯一方法。我们需要一种新技术,它能够针对直接分析和估量环境和培养条件下的微生物细胞,并且尽可能地和自然界真实的状况接近。对于单个微生物细胞进行完全的特征分析也是一项很有意义的工作。虽然在当今的条件下还没能实现,但是关于单细胞微生物学已是一个很明显的趋势,能让我们解决更多悬而未决未的环境微生物的问题。总之,在工程学,生物地球化学,生物化学,生物信息学,生理学和生态学等多种学科快速发展的基础上,宏基因组学的研究将会使我们进一步加强对于环境对微生物多样性分析的理解和对微生物环境功能的认识。
参考文献
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微生物多样性分析范文4
1材料与方法
1.1供试材料
1.1.1供试土壤
供试土壤采自西北农林科技大学试验田,土壤塿类型为土,土壤肥力中等,其主要理化性质为:pH8.32,有机质13.20g•kg1,全氮、全磷、全钾含量分别为0.79g•kg1、0.61g•kg1和11.14g•kg1,碱解氮、速效磷、速效钾含量分别为61.03mg•kg1、16.67mg•kg1和154.40mg•kg1。土样风干、混合均匀后过筛备用。
1.1.2供试肥料
供试肥料包括尿素、磷酸二氢铵、硫酸钾、有机无机复混肥、生物复混肥。有机肥为将猪粪、小麦秸秆等调节到合适的C/N、pH和含水量后经高温堆制发酵腐熟制作而成,其主要养分含量为N18.6g•kg1、P2O59.0g•kg1、K2O12.2g•kg1。生物复混肥是在有机肥的基础上加入少量的无机肥,无机肥配比为N4%、P2O52%、K2O3%[10],然后将液体芽孢杆菌复合菌剂(固氮菌Azotobacterchroococcum、解磷菌Bacillusmegaterium、解钾菌Bacillusmucilaginous由西北农林科技大学资源环境学院微生物实验室提供,已鉴定各菌株间无拮抗)与蛭石按1∶2混合吸附,均匀掺入上述有机无机复混肥中。有机无机复混肥是添加等量灭菌的蛭石,其中的有机肥、无机肥及其配比均与生物复混肥完全相同。肥料均为自制,配制完成后保存1个月再施用。生物复混肥和有机无机复混肥中氮磷钾含量均为N55.5g•kg1,P2O518.7g•kg1,K2O36.9g•kg1,有机质360.8g•kg1,功能芽孢杆菌总量为0.21×108cfu•g1。
1.1.3供试作物
供试作物为“郑单518”玉米,由西北农林科技大学种子公司提供。
1.2试验设计
试验采用盆栽的方式,于2011年6月在西北农林科技大学资源环境学院玻璃网室中进行。试验设置对照(CK,不施肥)、无机肥(T1)、有机无机复混肥(T2)、生物复混肥(T3)4个处理,4次重复。生物复混肥按0.20g(N)•kg1(土)施入,其他肥料均按生物复混肥中氮磷钾的量等量施用。将肥料与12.5kg土样充分混匀后装盆,浇透水至土壤含水量为田间最大持水量的60%。玉米催芽后直接播种,出齐苗后间苗,每盆保留3棵,并于定苗1d、15d、30d、45d、60d时采集土壤样品,在各个处理4次重复内随机取0~20cm的土壤各100g并置于4℃冰箱,用于分析土壤微生物学特性;取玉米生长60d时的土样在48h内进行土壤微生物群落功能多样性分析。试验设置保护行,试验期间根据实际情况定量浇水,并经常更换盆的位置,不同处理的盆栽管理措施均一致。
1.3测定项目和方法
土壤微生物群落功能多样性分析采用BIOLOGECO测试板进行测定[11]。土壤微生物量碳、氮、磷用氯仿熏蒸提取法测定[1112],采用重铬酸钾外加热法测定提取液中的可溶性碳,采用过硫酸钾氧化法测定提取液中的总氮,采用NaHCO3浸提钼锑抗比色法测定提取液中的总磷,土壤微生物量碳、氮、磷的换算系数分别为0.38、0.54、0.40。
1.4数据处理
采用微平板培养96h的数据进行数据统计分析,采用AWCD、Shannon指数和丰富度指数来表征土壤微生物群落代谢功能多样性[8,13]。数据经Excel2003处理后,采用SPSS16.0软件进行方差分析和主成分分析,主成分分析采用协方差矩阵为因子提取依据,其他参数选取系统默认值。
2结果与分析
2.1生物复混肥对土壤微生物群落功能多样性的影响
2.1.1土壤微生物群落多样性指数分析
土壤微生物群落功能多样性是土壤微生物群落状态与功能的指标,反映了土壤微生物的生态特征。表1为玉米生长60d时各施肥处理的土壤微生物群落功能多样性指数,从表1可以看出,BIOLOG微平板培养96h时,T3处理AWCD与其他处理间差异显著;微生物群落Shannon指数大小顺序为T3>T1>T2>CK,T3处理与其他处理间差异显著;T3处理土壤微生物群落的丰富度指数高于其他处理。以上结果表明,生物复混肥处理(T3)可以提高土壤微生物群落的功能多样性和种群丰富度,有利于提高土壤生态系统的稳定性。
2.1.2土壤微生物对6类碳源的利用
土壤微生物对不同碳源的利用情况反映了土壤微生物的代谢功能类群。从表2可以看出,玉米生长60d时,T1、T2、T3处理土壤微生物群落利用碳源的显著类型为糖类、羧酸类和氨基酸类,可能是因为这3类碳源是土壤微生物代谢最基本的物质,能够被大多数土壤微生物代谢利用。而对于多聚物类、多酚化合物类和多胺类这3类碳源,T3处理与其他处理间差异显著,表明T3处理的土壤微生物碳代谢群落结构与其他处理有所不同,该处理土壤微生物群落对多酚化合物类的利用明显高于其他处理,可能是土壤中施入的有机肥在微生物作用下,腐殖化过程中多酚类物质有一定积累,进而激活了能够利用多酚类物质的微生物的活性,从而提高了土壤微生物对多酚化合物类物质的代谢与利用。土壤中微生物对多酚类物质的利用显著提高的现象在其他研究中也有出现[14],具体原因还需要进一步研究。
2.1.3土壤微生物群落功能多样性主成分分析
为清晰地了解不同施肥处理对土壤微生物群落代谢能力的影响,利用培养96h后测定的AWCD数据进行主成分分析(PCA)。从表3可以看出,对PC1(第1主成分)贡献大的碳源(特征向量≥0.50)有17种,其中糖类占35%,羧酸类占24%,影响PC1的主要碳源为糖类,其次为羧酸类和氨基酸类;对PC2(第2主成分)贡献最大的碳源糖类占50%,其次为羧酸类(25%),因此,对PC1和PC2起分异作用的主要碳源是糖类和羧酸类。与PC1正相关程度较高的碳源有α-D-乳糖和L-精氨酸,负相关的碳源有D,L-α磷酸甘油和吐温40,不同施肥处理土壤微生物在碳源的利用上既有共同点又有差异,差异可能是由于不同处理土壤微生物群落有所差异,也可能是因为某些碳源是微生物生理代谢途径中的重要物质[15]。从不同施肥处理土壤微生物群落功能多样性的主成分分析可以了解各种处理土壤微生物群落功能的相似状况,结果如图1所示,PC1方差贡献率为27.640%,PC2为19.089%。不同处理土壤微生物群落在碳源的利用能力上存在明显差异,表现在它们在第1、2主成分上得分系数差异明显。CK、T1和T2处理的土壤微生物在PC1上的得分值分布一致,与T3处理区分明显,T3处理土壤微生物在PC1上的得分值均为正值,CK、T1和T2处理土壤微生物在PC1上的得分值基本为负值;T2处理土壤微生物在PC2上的得分值为正值,而CK和T1处理土壤微生物在PC2上的得分值基本上为负值,较难分开。这表明生物复混肥处理的土壤微生物群落代谢结构与其他处理具有明显差异,而无机肥和CK处理土壤微生物群落功能相似。施用生物复混肥能提高土壤微生物对不同碳源的代谢能力,提高土壤微生物群落功能多样性,为土壤提供一个良好的生态环境。
2.2生物复混肥对土壤微生物量碳、氮、磷的影响
土壤微生物生物量是土壤有机库中的活性部分，是存在于土壤微生物体内或残体细胞中可供利用的养分的贮备库,是土壤养分转化的动力和中转站,与土壤中的C、N、P等养分转化和循环过程密切相关,反映土壤微生物活动的强弱和养分转化速率的快慢,从宏观上反映土壤微生物活性的总体状况,是土壤生物质量、土壤肥力变化的灵敏指标。研究表明,不同施肥制度对土壤微生物生物量也有显著影响[1618]。从图2可以看出,土壤微生物量碳、氮、磷的变化规律大体一致,土壤微生物量在玉米整个生长期中大致呈先升高后逐渐平稳的变化趋势,与王艳霞等[19]研究结果相似;且土壤微生物量碳、氮、磷的含量均以生物复混肥处理最高,最高值分别为333.21mg•kg1、53.02mg•kg1和22.20mg•kg1。在土壤微生物量碳变化规律中,生物复混肥处理在玉米生长第30d、45d时较高,并且显著高于其他处理。生物复混肥处理显著提高土壤微生物量碳的主要原因可能是生物复混肥中所添加的功能性微生物菌群施入到土壤中,能够使有益微生物在土壤中形成优势种群,很好地在植物根际成功定殖,发挥其生态功能;另一方面,生物复混肥本身带入的活性有机碳源促进了土壤微生物的繁殖,提高了土壤微生物活性。各处理土壤微生物量氮含量在定苗前期没有明显差异,在玉米生长第30d时显著升高,生物复混肥处理的微生物量氮含量与其他处理相比差异显著。反映出玉米快速生长期时由于根际活动等促进土壤微生物大量繁殖,生物复混肥处理提高了土壤微生物活性,氮素固定同化到微生物体内引起土壤微生物量氮含量升高。土壤微生物量磷的变化规律与土壤微生物量碳、氮不同,玉米生长前期各处理间差异不明显,在玉米生长第15d后生物复混肥处理的土壤微生物量磷显著升高,说明玉米快速生长期间,土壤微生物对土壤中有机态和无机态磷的同化作用加大,以微生物量磷的形式存在,土壤中微生物解磷与固磷作用也与土壤中可降解有机物的数量有关,有机或无机肥料中的磷素对土壤微生物量磷的增加有明显的贡献作用[2022]。本试验土壤微生物量磷的升高趋势比较稳定,与赵兰凤等[23]研究结果相似。
3讨论
不同施肥措施会导致土壤微生物功能多样性的系统变化,形成各自特定的土壤微生物种群,长期施用有机肥可明显增加土壤微生物种群的变异程度[24]。罗希茜等[25]研究稻田土壤微生物群落发现,施用化肥或配施有机肥可使黄泥土土壤微生物的碳源利用率显著高于对照,有利于维持土壤微生物的碳源利用能力。Wei等[26]研究长期不同施肥处理对黑土细菌群落结构和功能的影响,结果表明无机肥处理与有机无机复混肥处理土壤微生物在单一碳源利用率方面没有显著性差异,但在土壤微生物群落结构组成、功能稳定性上有差异,施用化学肥料会降低土壤微生物群落的稳定性,本研究结果与上述研究结果类似。徐华勤等[27]对茶园土壤微生物群落功能多样性的主成分分析表明,糖类和羧酸类物质是区分各处理的主要碳源。本研究主成分分析结果也表明,不同施肥处理土壤微生物功能多样性差异明显,起分异作用的主要碳源是糖类和羧酸类。Garland等[28]研究表明,样本在主成分轴上的分布与微生物对碳源底物的利用能力有关,PC1解释了大部分的变异,生物复混肥处理分布在PC1的正方向,结合生物复混肥处理对6类碳源的利用,进一步证实生物复混肥处理可提高土壤微生物的代谢能力。土壤微生物功能多样性变化不仅受施肥影响,还与土壤养分密切相关,但是这方面的研究还较少。孔维栋等[29]和区余瑞等[30]的研究表明,土壤有机质和全氮含量与土壤微生物功能多样性呈正相关。因此,为了全面表征土壤肥力的微生物指标体系,本研究将从土壤微生物多样性与养分的关系方面进一步探讨生物复混肥的施用效果。土壤微生物量能够快速反映土壤养分含量变化及植物根际活动带来的土壤微生物活性的变化。Masto等[17]认为微生物熵更能够反映出土壤微生物活性和土壤有机碳的动态变化。土壤微生物群落结构的变化可能是导致土壤微生物量变化的首要原因[31]。在本研究中,生物复混肥处理能够提高土壤微生物群落功能多样性,其土壤微生物群落结构也比较稳定,因此,在玉米快速生长期间生物复混肥处理的土壤微生物量显著高于其他处理,具有较大的N、P、K中转代谢库,能够为植株提供更多的有效养分。
微生物多样性分析范文5
【关键词】 环境污染 监测 基因
随着经济与人口的快速发展，环境污染导致生态系统功能退化，以致引起生物多样性降低，物种的分布与群落组成发生了巨大的变化。与此同时，分子水平上研究污染过程中污染物在生物体内的吸收与迁移不断受到人们的关注。PCR技术具有快速、灵敏、简便等优点，在环境监测领域方面的应用日趋显现。
1 PCR技术
聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction；PCR）是一种用于放大扩增特定的DN段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊DNA复制，PCR的最大特点，是能将微量的DNA大幅增加。目前PCR技术在微生物学、医学等方面已得到较好的应用[1]。这种技术具有简便、快速、灵敏的特点，已广泛应用于基因获取、基因定点突变、DNA序列分析、医学诊断、基因检测等方面。PCR技术也成为微生物领域重要的监测手段，在此基础上发展起来的Real-time PCR（实时荧光定量PCR技术），以Power SYBR Green（荧光标记染料）和熔解曲线为基础，可用于检测不同的核苷酸序列；相对于普通PCR，荧光定量PCR（RT-PCR）能对样品中的目标生物进行相对或绝对定量，且灵敏度高，可重复性强，便于实验结果的比较等诸多势。
近年来，实时定量PCR技术开始在环境领域中显示巨大生机。迅猛发展的PCR技术使生物监测深入到分子水平，形成了一系列可依据多种分子技术来进行生物监测的分子学方法。如荧光定量PCR可以用来检测环境中的微生物在河流中随季节的变化情况。荧光定量PCR还可以用来检测地表水和饮用水中致病菌的含量。对于微生物，特别能快速监测具有高效去除营养物质能力的微生物，荧光定量PCR能快速监测[2]。如利用PCR技术能定量污水处理厂一级硝化处理后混合液悬浮固体中总细菌、硝化螺菌属数量、氨氧化细菌数量，从而可以实时掌握污水处理情况。法国国家研究中心从活动热泉附近的一个沉积物核中提取DNA来研究原生动物物种进化关系，利用测得的DNA序列数据构建系统进化树时，发现沉积物中至少含有两种遗传组成上与已知原生生物差异极大的细菌，发现了许多新原生生物世系。这些发现为水生生物基因学分类开创了先河，也将推动基因学在更广泛的领域得到应用。2003年初，Hebert等[3]首次提出了DNA条形码的概念。DNA条形码技术（DNA barcoding）是通过对一个标准目的基因的DNA序列进行分析从而进行物种鉴定的技术，用DNA序列作为标记来与物种信息建立一一对应关系。DNA条形码是指利用短的标准DNA序列的核苷酸多样性进行物种的鉴定和快速识别。
2 在水生生物监测领域的应用
目前水生生物监测主要包括水体中微生物、浮游动物、底栖动物等类群的监测，通过野外观测水体中指示物种、群落结构组成和多样性，了解和掌握实际水体中环境污染的状况。全世界每年有2亿5千万人感染水源性疾病，因此而死亡的人数为1千万-2千万。这要求对水体中致病菌进行准确检测，以保证后续工作的正常开展。研究者[4]发现PCR技术对星状病毒的检测比电镜技术更为灵敏，并可鉴定这一病毒的不同血清型。
随着高通量测序技术的发展，以及人们对PCR技术的研究的深入，PCR技术能够从单个环境样品中获取DNA。在水生生物监测方面，当前国际上美国EPA，加拿大环保署以及欧洲的一些科研单位正在开展PCR技术在水生生态监测中的应用研究；在我国，水生生物监测仍使用传统的形态学镜检，目前仅有少数研究利用分子生物学技术[5-6]，更没有形成一定的体系，以前行业规范。
3 PCR技术用于水生生物监测的优缺点
相对于之前的监测方法，PCR技术具有四大优势：（1）操作过程快速简便，非专业分类学者也可利用PCR数据库完成鉴定工作，（2）易于构建统一鉴定标准，（3）成本低，（4）易于质量控制。
相对于传统的监测方法，PCR技术的不足：（1）假阳性问题，当不相关的核酸分子中存在与模板非常相似的碱基序列时，PCR很可能做出假阳性的结果，这要求在引物的设计上要更为严格、更为细心。（2）质控问题，由于PCR灵敏度高，要求实验过程中不能带入干扰物质，无菌操作环境。（3）前期投入成本高，PCR鉴定水生生物多样性，需先构建本土物种PCR基因数据库，这要求投入大量的人力、物力、财力。
尽管如此，相信未来随着人们研究的不断深入，技术方法的不断优化，PCR技术将会给水生生物监测注入新的生命力。
参考文献：
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微生物多样性分析范文6
关键词：生物多样性；多样性功能评价；湿地保护；衡水湖湿地
Biopersity Function Evaluation of the Hengshui Lake Wetland
ZHANG Xue-zhi
(Hengshui Bureau for Hydrology and Water Resources Survey of HebEi Province，Hengshui 053000，China)
Abstract: The Hengshui Lake wetland，located in the hinterland of North China Plain，is a bio-intensive wetland in the North Temperate Zone，an intersection area for the different migratory birds，and the best habitat in North China Plain for many rare and precious birds.According to the survey data of the wetland biopersity，this study conducted a persity function evaluation on species persities and ecosystem persities in the wetland.According to the wetland biopersity criteria，the Hengshui Lake wetland biopersity is at a general level.Biopersity function evaluation of the wetland we can provide scientific basis for the wetland protection.
Key words: biopersity;persity function evaluation;wetland protection;the Hengshui Lake wetland
1 衡水湖湿地属性
按照国际湿地公约的湿地分类［1］，衡水湖湿地主要为湖泊湿地、沼泽湿地、水体沼泽化湿地、盐沼湿地、河流湿地和渠道湿地等。其中湖泊湿地、沼泽湿地是湿地的主体，类型与面积占据主要地位。其他类型湿地居次要地位。此外，还有少量人工湿地如沟渠、养鱼池等。各种类型湿地关系十分密切，它们相互依存，共同构成衡水湖湿地生态系统。任一类型湿地的退化都将对衡水湖湿地的生态与环境功能产生巨大的影响［2-4］。
1.1 生物多样性保护层次
衡水湖具有非常重要的湿地生态服务功能，是北温带野生动植物聚集地和候鸟南北迁徙不同路线的交汇处，这里有植物370种，鸟类286种，鱼类26种，昆虫194种，两栖爬行类17种，哺乳类17种，生物多样性非常丰富。
保护生物多样性和生态系统功能的完整性与保护珍稀动植物有着同等重要的意义。许多物种虽然未被列入国内外各种动植物保护名录，但其或为重点保护珍稀鸟类提供栖息地和繁殖地，或直接（间接）为这些珍稀鸟类提供食物，共同构成适宜的鸟类生境。所以保护这些物种，保护生物多样性对于珍稀鸟类的保护也是至关重要的。同时，保护生物多样性也就是保护湿地这一天然物种基因库，以利于我们子孙后代对物种资源的可持续利用，对人类生存和生活也都具有重要的现实和潜在的意义［5］。
1.2 湿地保护类型
湿地是位于陆生生态系统和水生生态系统之间的过渡性地带，在土壤浸泡在水中的特定环境下，生长着很多湿地的特征植物。湿地广泛分布于世界各地，拥有众多野生动植物资源，是重要的生态系统。很多珍稀水禽的繁殖和迁徙离不开湿地，因此湿地被称为“鸟类的乐园”。湿地强大的生态净化作用，因而又有“地球之肾”的美名。根据《自然保护区类型与级别划分原则》(GB/T 14529-93)，衡水湖国家级自然保护区属于自然生态系统类的湿地类型自然保护区［6］。从生态系统特征上看属于以华北内陆淡水湿地生态系统为主的平原复合湿地生态系统。
2 湿地生物多样性功能评价方法
生物多样性的3个主要层次是物种多样性、基因多样性和生态系统多样性。这是组建生物多样性的3个基本层次。基因多样性代表生物种群之内和种群之间的遗传结构的变异。每一个物种包括由若干个体组成的若干种群。各个种群由于突变、自然选择或其他原因，往往在遗传上不同。因此，某些种群具有在另一些种群中没有的基因突变，或者在一个种群中很稀少的等位基因可能在另一个种群中出现很多。在同一个种群之内也有基因多样性，在一个种群中某些个体常常具有基因突变。生态系统多样性既存在于生态系统之间，也存在于一个生态系统之内。总之，物种多样性是生物多样性最直观的体现，是生物多样性概念的中心。基因多样性是生物多样性的内在形式，一个物种就是一个独特的基因库，可以说每一个物种就是基因多样性的载体；生态系统的多样性是生物多样性的外在形式，保护生物的多样性，最有效的形式是保护生态系统的多样性［7-9］。
作为水陆相兼的生态系统，湿地的独特生境使它同时兼具丰富的陆生与水生动物植物资源，对于保护物种，维持生物多样性具有难以替代的生态价值。湿地生物多样性是所有湿地生物种种内遗传变异和它们生存环境的总称，包括所有不同种类的动物、植物、微生物及其所拥有的基因和它们与环境所组成的生态系统［12］。
物种多样性是群落生物组成结构的重要指标，它不仅可以反映群落组织化水平，而且可以通过结构与功能的关系间接反映群落功能的特征。
在湿地生态系统评价方法的基础上，结合生物多样性的理论和实践，将物种多样性和生物多样性作为一级指标，下设二级、三级亚指标，建立可操作性较强的湿地生物多样性评价指标体系［13］，见表1。
人类威胁程度分值
对资源保护部构成威胁5保护区与未开发生境毗邻5
资源的有效保护受到一定的威胁3保护区周边尚有未开发生境3
资源的有效保护受到较大的威胁1保护区被已开发的区域环绕1
根据湿地生物多样性现状调查结果，对照以上赋值逐项打分，将所得分数累加即得到该湿地生物多样性评价总分值。计算公式为：
R=∑3i=1Ai+∑3j=1Bj(1)
式中：R-湿地生物多样性总分值；A-物种多样性分值；i-物种多样性评价项目数；B-生态系统多样性分值；j-生物多样性评价项目。
根据R值的高低，将湿地生物多样性划分为5级，见表8。转贴于 3 衡水湖生物多样性评价
衡水湖是华北平原上第一个内陆淡水湖国家级自然保护区，同时也是华北平原唯一保持沼泽、水域、滩涂、草甸和森林等完整湿地生态系统的自然保护区［14］。丰富的生物资源是衡水湖的支柱。这里有绿藻、蓝绿藻和硅藻等在内的201种浮游植物、平均密度达到了4 000个/L，浮游动物174种、平均密度达到了4 000个/L；这里有芦苇等挺水植物，藕、睡莲属等漂浮有叶植物，眼子菜属、黑藻属等深水植物；这里有两栖纲、爬行纲、哺乳纲野生动物共30多种。所以，衡水湖被称作“物种基因库”。
根据调查结果，衡水湖湿地有维管植物366种，鸟类286种，分别占河北省物种总数的42.2%和57.2%。维管束植物有国家三级重点保护植物野大豆；鸟类有国家一级重点保护的7种，有黑鹳、东方白鹤、丹顶鹤、白鹤、金雕、白肩雕、大鸨。生物多样性评价结果为：
物种多度：A1=A11+A12=7.5+10=17.5
物种丰度：A2=A21+A22=10+7.5=17.5
物种稀有性：A3=A31+A32=2+4=6
则物种多样性为：
A=∑3i=1Ai=17.5+17.5+6=41
衡水湖湿地大多数植物属于世界广布种；在调查的鸟类中，广布种占总数的23.1%，古北种占种数的68.9%，东洋种占8.0%。衡水湖为沼泽芦苇香蒲生态系统，在华北属常见生境类型；生态系统的组成结构简单、类型单一。衡水湖受人类影响因素较多，对湿地内水体、生物等资源影响较大；湿地周围为村镇和农田，没有未被开发的区域。生态系统多样性评价结果如下。
生态系统多样性地区分布：
B1=B11+B12=4+4=8
生态系统多样性生境类型：
B2=B21+B22=2+6=8
生态系统多样性人类威胁评分：
B3=B31+B32=1+1=2
则生态系统多样性为：
B=∑3i=1Bi=8+8+2=18
湿地生物多样性评价总分为：
R=∑3i=1Ai+∑3j=1Bj=41+18=59
按照湿地生物多样性评分标准，衡水湖湿地生物多样性功能进行评价，评价结果为：物种多样性为41分，生物系统多样性为18分，衡水湖湿地生物多样性处于一般水平［15］。从分析结果可以看出，衡水湖湿地物种多样性占优势，而生态系统多样性占劣势，生态环境受人类活动影响因素较大。
4 结论
利用衡水湖生物多样性资料，对衡水湖生物多样性功能进行评价。分别对物种多度、物种丰度和物种稀有性进行分析，计算出物种多样性；对生态系统多样性地区分布、生态系统多样性生境类型和生态系统多样性人类威胁等指标分析，计算出生态系统多样性指标。按照湿地生物多样性评分标准，衡水湖湿地生物多样性处于一般水平。生物多样性是自然生态系统生产和生态服务的基础和源泉。生物多样性可提供多方位的服务。人类历史上大约有3 000种植物被用作食物，估计有75 000种植物可作食用。人类就是依赖这些植物得以繁衍。生物技术是以现有生物多样性为物质基础的工作，在解决粮食短缺、人类健康、维护生物物种和环境等诸多社会经济重大问题中将发挥重要作用，将成为21世纪国民经济的支柱产业。
参考文献
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