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细胞生物学的任务范文1
[关键词]干细胞；人牙周膜干细胞；免疫磁珠；流式细胞计量术；免疫细胞化学
[中图分类号]R783.5 [文献标识码]A [文章编号]1008-6455（2008）05-04
Isolation, identification and bionomics of human periodontal ligament stem cells
PAN Feng1,DING Yin1,WANG Guang1,ZHAO Yu2,NI Hua2
(1.Department of Orthodontics,Stomatology Hospital,The Fourth Military Medical University,Xi'an 710032,Shaanxi,China; 2.Center of Tissue Engineering, Stomatology Hospital,The Fourth Military Medical University)
Abstract:ObjectiveTo isolate and identify the periodontal ligament stem cells and demonstrate its bionomics. MethodsPDLSCs were isolated by immunomagnetic method. The flow cytometry and immunocytochemistry procedure were used to disclose the cell cycle and surface marker of the PDLSCs.Osteoinduction and adipoinduction were done to conform the multidirectional differentiation of PDLSCs. ResultsThe acquired cells had clonality and low proliferation. Most of the cells were in phase G0 /G1 and there were high expression of CD146 and CD44 on these cells, meanwhile, CD34 and CD45 were of low expression. The cells were Vimentin and STRO-1 positive while their multidirectional differentiation ability was confirmed in vitro. Conclusionimmunomagnetic method was an effective way to isolate and purify the PDLSCs. The acquired cells showed the characteristics of stem cells.
Key words:stem cell;human periodontal ligament stem cell;immunomagnetic beads;flow cytometry;immunocytochemistry
研究证实牙周膜内存在具有横向分化能力的干细胞(牙周膜干细胞)，在体外微环境作用下还可分化为成牙骨质细胞或成骨细胞[1-2]。因此，牙周膜干细胞（PDLSCs）作为一种新发现的干细胞，在牙周组织工程研究中有较大的应用前景。但是牙周膜组织量小、分离困难，一直成为制约牙周膜干细胞研究的重要原因。已有的克隆筛选法操作程序繁琐，周期较长[1]，因此需要寻找简便、快捷的筛选方法来分离牙周膜干细胞。本研究应用免疫磁珠技术对人牙周膜干细胞进行筛选，并扩增培养，通过对牙周膜干细胞生长曲线、克隆形成率、细胞周期、细胞表面抗原标记物测定及多向分化能力的研究对其生物学特性进行研究，以期建立一种便捷有效的分离方法并明确牙周膜干细胞的生物学特性，为进一步研究牙周损伤的发病机理及临床治疗提供基础。
1材料和方法
1.1实验材料和设备：α-MEM培养基（Gibco，美国），羊抗小鼠磁珠试剂盒（Dynalbiotech，美国)，基质蛋白-l单克隆抗体(STRO-1，R&D，美国)， ABC型免疫组化检测试剂盒(Dkao，美国)；小鼠抗人波形丝蛋白单抗(Vimentin，Dkao，美国)；CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人单克隆抗体（Beckmen Coulter，美国）；CO2孵箱(Heraeus，德国)；YJ-875型超静工作台(苏州净化设备厂，中国)；流式细胞分析仪(Beckmen Coulter，美国)；倒置相差显微镜及照相系统(Olympus，日本)。
1.2实验方法
1.2.1 取材及细胞培养：收集临床拔除的正常人牙周健康、无龋的新鲜第3磨牙，刮取根中1/3牙周膜组织，移入10cm无菌培养皿内，滴加少许α-MEM培养液保持组织湿润，锐性分离牙周膜组织约1mm3组织块，将分离的组织块以1mm间距平铺于6孔板内，以无菌盖玻片覆盖组织块，加入培养液(含100ml/L 胎牛血清，100μmol/L2抗坏血酸，2mmol/L2谷胺酰胺，100U/ml青霉素，100μg/ml链霉素的α-MEM 培养液)，置入37℃、50ml/L CO2的孵箱中培养，待多数组织块周围有细胞游出后去除盖玻片，常规培养，每3天换液1次，细胞生长达80%汇合时传代。
1.2.2磁珠分离筛选牙周膜干细胞：将5μl磁珠剧烈振荡后移入离心管内，加入5ml含1％胎牛血清的PBS冲洗，放置于磁力架上静置2min后去上清，重复一次后重悬，置4℃备用。收集第4代人牙周膜细胞1×108个，以含1％胎牛血清的PBS重悬，加入小鼠抗人STRO-1抗体，4℃孵育60min，每隔10min轻振以防沉淀。以含1％胎牛血清的PBS清洗3次，去除残留抗体后重悬并加入磁珠，4℃孵育30min，每5min轻振一次。离心，去除含空白磁珠的上清液，以含1％胎牛血清的PBS重悬，将离心管置于磁力架上2min，缓慢弃除上清及未与磁珠结合的细胞。以含1％胎牛血清的PBS再次重悬并清洗与磁珠结合的细胞2次，弃上清，加入磁珠分离液，轻晃均匀2min后置于磁力架上2min，取上清液，重复2次以去除残存磁珠，离心，加入5ml含10％胎牛血清的α-MEM培养液，重悬，调整细胞浓度为1×104/ml接种于6孔板内，37℃、50ml/L CO2的孵箱中培养。
1.3 牙周膜干细胞生物学特性的研究
1.3.1细胞生长曲线测定：分别取筛选培养的牙周膜干细胞及牙周膜细胞，以1×103cells/孔接种于96孔塑料板，每组3孔，隔日换液。每天取一组，MTT法测各孔OD值，连续测10天，以时间为横轴、细胞数为纵轴绘制生长曲线。
1.3.2 克隆形成率测定：将收集的对数生长期牙周膜细胞的培养上清1 500rpm离心10min，经0.22μm直径的小滤器过滤后，与培养基以l:l比例混合作为适应性培养基。取筛选培养的牙周膜干细胞，调整细胞密度至10～15个/ml，100μ1/孔接种于96孔培养板中，培养12h后标记单个细胞孔，并补液至200μ1/孔，5天换液，光镜下观察克隆形成情况。
1.3.3 流式细胞仪分析
1.3.3.1细胞周期分析：取筛选培养的牙周膜干细胞，胰酶消化，调整细胞密度为1×107/ml， PBS清洗2次，加入0.01mol/LPBS重悬，再加入预冷的无水乙醇2ml吹打混匀，4℃过夜，离心弃乙醇，0.01mol/LPBS清洗2次，加入5ml/L碘化丙锭1ml，4℃30min，过300目的尼龙筛网，流式细胞仪上机，进行细胞周期检测。
1.3.3.2表面抗原测定：取筛选培养的牙周膜干细胞, 弃去培养液，PBS清洗两次，以含0.25% 胰蛋白酶的PBS液消化5 min，制成单细胞悬液，再以含2%牛血清白蛋白和0.1%偶氮钠的磷酸盐缓冲液(流式缓冲液)冲洗细胞, 调整细胞密度为3.0×109/L，每个Eppendof管加100μL细胞悬液，室温下分别与CD44-FITC、CD146-FITC、 CD34-FITC、CD45-FITC小鼠抗人单克隆抗体5μL避光孵育15min，再以流式缓冲液清洗细胞，1 000rpm离心5min，将细胞重悬于含1%多聚甲醛的流式缓冲液0.5ml固定。使用同型对照单克隆抗体确定背景标记。用流式细胞仪分析荧光细胞，专用配套软件计算细胞表面抗原阳性率，单位用%表示。
1.3.3.3 免疫细胞化学染色：取筛选培养的PDLSCs制备细胞爬片， 免疫细胞化学ABC法进行STRO-1及Vimentin染色，阴性对照以PBS替代一抗，进行细胞来源及表达检测，光镜下观察。
1.3.3.4体外多向诱导分化：①矿化诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为2×104/ml接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培养24h后换矿化诱导液(100μg/ml链霉素、100U/ml青霉素、10mmol/Lβ-甘油磷酸钠、50μg/ml维生素C、1×10-8mol/L地塞米松、10ml/L胎牛血清、α-MEM培养液)培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液, PBS清洗, 95%酒精固定10min ,PBS清洗2次,加入0.1%茜素红(Alizarin Red-S)室温染色30min，去离子水清洗3次，光镜下观察。②成脂诱导：取筛选培养的牙周膜干细胞制成细胞悬液，调整细胞密度为1×105/ml接种于6孔板中，以含10%胎牛血清的α-MEM培养24h后换成脂诱导液（地塞米松10-6mol/L、3-异丁基-1-甲基黄嘌呤0.5mmol/L、胰岛素10mg/L、消炎痛100mmol/L、α-MEM培养液）培养，隔日换液。培养3周后吸弃培养液，PBS清洗，10％中性甲醛固定10min，PBS清洗2次，油红O染色10min，去离子水清洗3次，镜下观察。
2结果
2.1形态学观察：所筛选细胞大部分呈类梭形，核为卵圆形、位于胞质中央，似成纤维样细胞（如图1）。
2.2 细胞生长曲线测定：牙周膜细胞及牙周膜干细胞生长曲线均呈倒“S”形，在接种后1天两者细胞量均减少，自第2天起，细胞生长均加速，第8天达到生长高峰，进入“平台期”，此后，细胞生长速度减慢。总体而言，干细胞生长速度明显低于牙周膜细胞（如图2）。
2.3 牙周膜干细胞生物学特性研究
2.3.1 克隆形成率：10～12天有细胞克隆形成，镜下观细胞呈集落状生长，细胞形态成梭形，体积较小，排列紧密，中心细胞界限不清，呈圆形或不规则形状，周边细胞呈梭形或多角形。共获得克隆株43株，克隆形成率为14.93％。
2.3.2细胞周期分析：细胞周期动力学结果显示：大多数细胞处于G0/G1期(78.2％)，即静止期和DNA合成前期。G2期为2.3％，S期为19.5％。表明细胞增殖缓慢，大多数处于静止期或缓慢增殖期(如图3)。
2.3.3 细胞表型特征鉴定：表面抗原CD146和CD44检测阳性率为92.8％及91.7％，CD34和CD45阳性率为1.6％及2.3％ （如图4）。
2.3.4 免疫细胞化学染色：筛选培养的牙周膜干细胞中STRO-1及Vimentin均为阳性染色，具有间充质干细胞的特征（如图5～6）。
2.3.5 成骨诱导：成骨诱导液继续培养8天后，细胞呈复层生长，局部增厚，12天左右中央出现许多颗粒样改变，并逐渐连接成片，密度增高。21天左右孔板底部出现肉眼可见针尖大小灰白色小结节，并逐渐增大。茜素红染色可见红色矿化结节（如图7）。
2.3.6 成脂诱导：经成脂诱导液培养至第10天左右，可见细胞形态发生改变，较培养初期更为饱满，至21天时油红O染色阳性，细胞胞浆内有大量脂滴形成（如图8）。
3讨论
以往成体干细胞的分离纯化常用方法有密度梯度离心法、贴壁培养法、克隆化培养筛选，但这些方法操作繁琐，且所需时间较长，不利于临床应用。根据干细胞表面特异性受体能选择性结合或粘附其它信号分子的原理，采用免疫磁珠筛选、流式细胞分选法分离和鉴定干细胞己广泛开展[3,9]。Seo[1]的研究结果显示人牙周膜干细胞表达间充质干细胞的特异性标志STRO-1，并利用免疫磁珠筛选首次成功获得人牙周膜干细胞。Gay等[4]使用STRO-1抗体对牙周膜细胞进行标记后，通过流式细胞仪对其进行筛选，获得27％STRO-1阳性细胞。在本实验中，我们通过使用包被二抗的免疫磁珠对复合STRO-1的牙周膜细胞进行分离纯化，获得牙周膜干细胞，筛选程序简单、迅速，细胞活性保持较好。经细胞生长曲线测定，牙周膜干细胞较同一来源的牙周膜细胞生长慢，符合干细胞慢增殖周期的特点。
克隆形成能力是干细胞的特点，高秦等[10]对人牙周膜细胞进行了克隆化培养，结果显示细胞培养10～15天有克隆形成，克隆形成率为0.62％。Gay等[4]对牙周膜干细胞及骨髓基质干细胞的克隆形成情况进行了比较，发现牙周膜干细胞有50个克隆形成，骨髓基质干细胞有35个克隆形成，证实牙周膜干细胞有较强的克隆形成能力。成体干细胞处于由周围间质细胞及其所分泌的相关生长因子或配体形成的微环境中，这些生长因子或配体与干细胞相互作用，控制干细胞的更新和分化。故为提高克隆形成率并尽可能的保持纯化后的细胞的未分化状态，本研究借鉴了高秦等[10]人牙周膜干细胞克隆化培养的方法，收集了牙周膜细胞的培养上清与普通培养基以一定比例混合，制备成适应性培养基，对所筛选的牙周膜干细胞进行了克隆化培养，共得到43个克隆，克隆形成率为14.93％，证实所获得细胞具有干细胞自我更新的特性。
细胞周期是反映细胞增殖动力学的重要指标。干细胞是处于相对静止状态的一群细胞，这种慢周期的特点是大多数成体干细胞的共同特征[11-12]。但在外界因素作用下，干细胞周期也会相应变化[13-14]。本研究对所筛选牙周膜干细胞的细胞周期分析显示，与高秦等[10]的结果有一定差异，可能原因有：①细胞来源不同，因不同个体的干细胞状态不会完全一致；②细胞获取方法不同，高秦等通过克隆化培养获取牙周膜干细胞，而本研究采用的是免疫磁珠直接筛选，不同的方法导致细胞所受外界条件刺激的不同，进而可能影响到细胞周期的变化。
目前，学者们还未找到牙周膜干细胞的特异性表面抗原标记物。Seo等[1]的研究结果显示牙周膜干细胞表达间充质干细胞表面抗原STRO-1及血管周围细胞表面标记物CD146及CD44。Nagatomo等[15]发现牙周膜干细胞表达细胞表面抗原CD105、CD166及STRO-1。Ivanovski等[16]发现牙周膜干细胞或骨髓基质干细胞均无CD14、CD45和CD34表达。高秦等[10,21]研究结果显示人牙周膜干细胞波形蛋白（Vimentin）及STRO-1呈阳性表达。在实验中我们对分离培养的细胞进行了表面抗原测定及免疫细胞化学染色，结果显示：Vimentin及STRO-l染色阳性，显示其间充质干细胞来源，此外，流式细胞分析结果显示间充质干细胞标记物CD44及CD146在牙周膜干细胞中高表达，而内皮细胞标记物CD34，造血系细胞标记物CD45的表达极低，从正反两方面证实了以往学者的结论。而多向分化研究结果也证实牙周膜干细胞可以经诱导分化为成骨细胞及脂肪细胞，符合干细胞特征。
综上所述，本实验所筛选培养的人牙周膜干细胞为多角形、成纤维型细胞外观，具备克隆形成能力及慢细胞周期特点，免疫细胞化学染色及流式细胞术检测证实所培养细胞表达CD44、CD146、Vimentin、STRO-1，不表达CD34、CD45，均与文献报道一致。此外，经诱导培养，所培养细胞可分化为成骨细胞及脂肪细胞，进一步证实牙周膜干细胞具有多向分化能力。
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细胞生物学的任务范文2
【关键词】 种子细胞
【Abstract】 AIM: To purify and culture human bone marrowderived endothelial progenitor cells (EPCs) in vitro and to observe their biological characteristics. METHODS: Mononuclear cells were isolated from bone marrow suspension by density gradient centrifugation and EPCs were harvested in the endothelial growth medium (EGM2). EPCs were observed under microscope， the cell growth was calculated by cell counting and the cells were identified by electronic microscope examination and immunofluorescence staining for the expression of Ⅷ/vWF， vascular endothelial growth factor receptor2 （VEGFR2）. RESULTS: The culturedishadherent EPCs uniformly had a round or spindle shape and reformed clones with cobblestone morphology. The cells could be identified by the positive staining for VEGFR2 and Ⅷ/vWF. WeibelPaladle bodies could be seen under transmission electron microscope. CONCLUSION: EPCs are one group of stem cells in the bone marrow with the capacity of differentiating into endothelial cells. They can be purified and cultured by density gradient centrifugation and subjected to culture in vitro with endothelial growth medium (EGM2 MV). These findings suggest that EPCs may be a new seed cell of tissue engineering.
【Keywords】 bone marrow; endothelium/cytology; stem cells; tissue engineering; seed cells
【摘要】 目的： 体外分离纯化人骨髓内皮前体干细胞，研究其基本生物学特性. 方法： 利用密度梯度离心法分离成人骨髓得到单个核细胞，再用内皮细胞条件培养基培养得到内皮前体干细胞，观察细胞生长特性，通过检测细胞血管内皮生长因子受体2（VEGFR2）、Ⅷ因子相关抗原抗体表达和透射电镜对培养细胞进行鉴定. 结果： 原代培养后细胞贴壁生长，7~10 d形成集落或融合呈卵石形，免疫组化荧光染色后结果显示VEGFR2， Ⅷ/vWF 阳性，透射电镜显示细胞内具有特征性的WP小体. 结论： 用密度梯度离心法和条件培养可以从骨髓得到高纯度内皮前体干细胞，该细胞具有与血管内皮细胞共同的特征，可以进一步分化为血管内皮细胞，是理想的组织工程种子细胞.
【关键词】 骨髓；内皮/细胞学；干细胞；组织工程；种子细胞
0引言
随着干细胞研究的深入，研究者发现，内皮前体细胞（endothelial progenitor cells， EPCs）是具有活跃分化潜能的干细胞，具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞.它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用，可以作为种子细胞用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化的研究与应用［1］. EPCs的研究愈来愈受到关注，但分离相对困难，关于其培养及生物学特性研究少见报道. 为进一步探讨EPCs作为组织工程种子细胞的可能性与优越性，我们进行人骨髓内皮前体细胞的分离培养和生物学特性的研究.
1材料和方法
1.1材料
骨髓取自健康志愿者. 内皮细胞生长培养基（EGM2， Clonetics， USA），内皮细胞生长培养基补充物（EGM2 MV SingleQuots， Clonetics， USA），其中包含有胎牛血清（FBS）、血管内皮生长因子(VEGF）、成纤维细胞生长因子2(FGF2）、胰岛素样生长因子1(IGF1）以及抗生素等，黏连蛋白（FibronectinFn，Sigma），淋巴细胞分离液与PBS液（TBD公司），胰蛋白酶（Gibco），Hanks平衡盐液（Gibco），VEGFR2兔抗（NeoMarkers，USA），第Ⅷ因子鼠抗(北京中山公司），二抗（FITC羊抗鼠与Cy3羊抗兔，Sigma），FITCconjugated CD34鼠抗（R & D公司）.
1.2方法
1.2.1骨髓中单个核细胞的分离［2］无菌条件下，取人骨髓液5 mL，加入肝素，用PBS液充分混匀，转入离心管，轻轻地层加到1077 g/L的淋巴细胞分离液上，2000 r/min离心20 min，收集中间的单个核细胞层，用PBS液1000 r/min离心洗涤2次×10 min以洗除残余淋巴细胞分离液，然后收集细胞备用.
1.2.2EPCs的培养收集骨髓中单个核细胞，用含胎牛血清和多种生长因子的内皮细胞生长培养基混匀，制成细胞悬液，接种于以黏连蛋白（Fn）包被的培养瓶中，置37℃含50 mL/L CO2孵箱中培养，第4日换液，去除非贴壁细胞，此后每3~4 d换液1次. 相差显微镜下观察细胞形态，待细胞长满瓶底的80%，用0.125 g/L胰酶消化，并以2×107/ L细胞数传入24孔培养板中，每日取4孔细胞进行计数并求均数，绘制细胞生长曲线，计算细胞群体倍增时间.
1.2.3流式细胞仪检测取对数生长期骨髓EPCs， 以0.125 g/L胰酶消化后制备单细胞悬液，测定细胞生长周期；同时，检测细胞表面抗原CD34表达，鉴定所得细胞纯度.
1.2.4EPCs细胞表面抗原免疫荧光染色检测培养10 d的细胞进行免疫荧光化学染色，检测细胞表面抗原VEGFR2与Ⅷ/vWF等表达情况，选取培养10 d的成纤维细胞进行免疫荧光化学染色作为对照组. 过程如下： 细胞片用PBS液洗，然后用40 g/L多聚甲醛常温处理30 min，再用含50 mg/L马血清和50 mg/L小牛血清的PBS液浸泡30 min，去除非特异性标记，再加入VEGFR2， Ⅷ因子mAb （1∶100），37℃孵育过夜，用PBS液洗3次，加入荧光标记二抗，37℃摇床孵育1 h，荧光显微镜下拍照.
1.2.5电镜检查体外培养10 d，离心收集EPCs，用3 g/L戊二醛固定过夜，细胞团用PBS 洗3 次×10 min，1 g/L四氧化锇4℃固定30 min， PBS洗3次×10 min，丙酮系列脱水，包埋并制作超薄切片，透射电镜观察拍照.
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2结果
2.1骨髓EPCs体外培养及扩增用梯度密度离心法从骨髓中分离出单个核细胞层后，用内皮细胞生长条件培养基培养，并通过换液去除非贴壁细胞，所得贴壁细胞即为骨髓内皮前体细胞. 原代培养4 d内，细胞呈圆形（Fig 1A）；培养7 d后，细胞铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，10 d后出现细胞融合呈“铺路卵石样”（Fig 1B），约14 d可传代. 传代后细胞于24 h内完全贴壁，接种后第1~3日为潜伏适应期，从第4日起细胞增殖迅速并进入对数生长期，第7日达高峰，此后进入平台期，细胞生长曲线如Fig 2所示. 同时，依据生长曲线计算细胞群体倍增时间约为36 h.
2.2流式细胞仪检测贴壁细胞消化后用流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34表达，结果显示细胞均一性较好（阳性表达率72%），说明采用本实验中分离细胞的方法可得到较高纯度的骨髓EPCs. 同时，流式细胞仪测定细胞生长周期，结果显示： G0/G1期细胞为71.1%，G2/M期细胞为14.7%，S期细胞为14.2%，说明EPCs细胞增殖比较活跃.
2.3骨髓EPCs表面标记的检测EPCs细胞均表达Ⅷ/vWF，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈绿色，胞核不染色（Fig 3A）；EPCs细胞均表达VEGFR2，免疫荧光染色呈阳性，细胞胞质呈砖红色，胞核不染色（Fig 3B）. 对照组成纤维不表达Ⅷ/vWF与VEGFR2，免疫荧光染色呈阴性，细胞胞质和胞核均不染色.
2.4骨髓EPCs超微结构观察细胞边缘可见较多绒毛状突起，胞质内还见一种短棒状小体，即Weibel Palade氏小体，是内皮细胞特征性的细胞器（Fig 4）.
3讨论
近年来研究发现，EPCs具有游走特征并能进一步增殖分化为内皮细胞，它不仅参与胚胎期的血管发育，也存在于成年机体的骨髓和外周血中，在成体血管内皮细胞发育中起重要作用. 1997年Asahara等［3］成功地在体外将CD34+细胞诱导生成血管内皮细胞，并于体内证明其生血管能力，说明EPCs是CD34+细胞重要亚群. 因此，EPCs有望成为血管组织工程内皮种子细胞的新来源.
EPCs是CD34+细胞重要亚群，多采用吸附单克隆抗体－磁珠分离系统(MACS)进行分离得到，此法所得细胞均一性好，纯度高，但价格昂贵，实用价值欠佳，同时，EPCs吞噬的磁性微粒也必然影响细胞的代谢及功能［4］. 本实验中，根据细胞密度的差异，针对EPCs属于单核类细胞的特点，抽取骨髓后，用密度梯度离心法分离出单个核细胞层，再利用内皮细胞生长条件培养基外加黏连蛋白黏附特性，最终所得贴壁细胞即为EPCs. 同时，我们对所得到的骨髓EPCs用流式细胞仪检测表面抗原表达，结果显示细胞均一性较好，CD34阳性表达率72%，也进一步鉴定了所得到的细胞为较高纯度的骨髓内皮前体细胞. 此方法简单、经济、高效，具用较高的应用价值.
VEGFR2是内皮细胞生长的早期表面受体，主要出现在内皮细胞诱导转化的早期［5］. Ⅷ因子是内皮细胞特异性抗原，可以通过vWF的测定对内皮细胞进行鉴定［6］. 本实验中人骨髓EPCs呈贴壁生长，随体外培养时间延长，其形态由早期圆形铺展呈椭圆形或短梭形，并迅速增殖，出现细胞融合呈“铺路卵石样”. 培养一定时间后，细胞增殖速度由快变慢，胞体变大、胞质疏松，提示EPCs增殖活力下降. 原代培养生长曲线显示，EPCs的体外培养经历了生长滞缓期、对数增殖期和生长平台期，其增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增. 此外，分离得到的骨髓EPCs具有与血管内皮细胞共同的特征，细胞呈鹅卵石状贴壁生长，均表达VEGFR2， Ⅷ/vWF，胞质内还可见内皮细胞特异性标记短棒状小体，即Weibel Palade氏小体.
EPCs存在于成年机体的骨髓和外周血中，可以自体取材，避免新的机体创伤和免疫排斥反应. 同时，EPCs增生分裂能力活跃，体外培养可以实现快速扩增，能进一步分化为内皮细胞，参与成体血管内皮细胞发育、创伤愈合、肿瘤生长等病理生理过程［7］. 因此，EPCs可以作为理想的内皮种子细胞来源，用于人工血管、组织工程瓣膜内皮化研究，具有潜在的临床应用价值.
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细胞生物学的任务范文3
1当前护理专业医学细胞生物学教学中面临的问题
尽管从教学内容、教学手段和实践环节等方面进行了一定的尝试，获得了良好的教学效果。但是，在教学过程中也碰到一些问题:①教学时数的限制。我院细胞生物学的教学理论时数为30学时，实验为20学时。如何在有限的时间内既要完成教学大纲规定的教学内容，又要适时补充前沿动态、保证教学质量是一个挑战。②医学细胞生物学不仅教学内容多，而且知识枯燥抽象，因此，如何把这些微观事物，生动形象地展现在学生面前是教师面临的关键任务。③鉴于部分护理专业学生在高中阶段没有接触或学习过生物学及其相关知识，而一进校就学习需要较高基础背景的细胞生物学，由于课时数的限制，在教学过程中显得很吃力。如何兼顾基础扎实和基础相对薄弱的同学，采取何种教学方法，值得进一步摸索。
2护理医学本科细胞生物学教学改革的探索与实践
2．1调整课程实施计划
由于细胞生物学的快速发展已广泛辐射医学及生物的各个学科，为夯实医学生的生物医学基础以适应现代医学更高要求，经学校批准，已将原有医学细胞生物学课程由40学时增加为50学时，其中理论课由原有的24学时增加为30学时，实验课由原有16学时增加为20学时。作为医学教育的基础学科，既往我校医学细胞生物学课程安排在第一学年的第二学期，即学生接触、学习的第一门生物或医学学科。细胞生物学课程的前导课程仅为高中生物学，并且护理本科专业一部分学生没有接触或学习过生物学及其相关知识。受其限定，既往细胞生物学课程的教学深度、广度显然已不能适应现代细胞生物学的发展，同时由于主要相关生物学科如生物化学、分子遗传学的课程均设置在第二学年，为逐步实现生物学科的系统教学，经相关学科一起反复论证，并经广泛调研国内、国际细胞生物学课程，经学校批准，已将医学生细胞生物学课程调整至第三学期(第二学年的第一学期)。
2．2针对专业特点，优化教学内容，改进教学方法，培养创新型人才
笔者在医学细胞生物学教学过程中，以突出护理医学专业特点为宗旨，一方面遴选合适的教材。目前我校使用的是卫生部规划教材《医学细胞生物学》(陈誉华主编)，该教材的优点是在保证细胞生物学基本知识、基本理论的前提下，与基础医学和临床医学的联系比较密切，删除了一些经典细胞生物学的内容，如有关低等生物细胞、植物细胞的结构及其功能(包括叶绿体等细胞结构)的描述等。另一方面，对教学大纲进行修订，以坚持“基础实、内容新、知识活”的原则，大胆对教材内容进行了合理的取舍、调整、深入或更改。鉴于细胞生物学教学内容多，知识枯燥抽象，笔者重新对教学方法进行了审视，作出了以下改进。除了讲述式外，还可以采用问题式、启发式或讨论式等多种教学方法。在教学过程中，注意启发学生，让学生多动脑筋，带着问题去学习。比如笔者介绍细胞信号转导一章，在导入的时候，先放几张临床病人的照片。如肢端肥大症病人和重症肌无力病人的照片，然后告诉学生这些人的患病是因为细胞信号转导机制出现了问题。通过学习这一章的内容，学生就可以利用所学知识来解决问题。为了改革传统的医学模式和教学方法，国内有一些院校也在尝试使用PBL，但在医学细胞生物学教学中还少有运用。我们正在尝试将PBL教学法引入医学细胞生物学的教学中，并且取得了一定成效。
2．3倡导多媒体教学
多媒体教学是建立在拥有大量动态图像(视频、动画)、静态图像(图片、图形)、文字、声音、电子模型等教学资料基础上，以电子技术媒体的研究和应用为核心，利用各种电教器材综合处理文字、声音、图像、图形、动画、电子模型等信息的技术［2］。多媒体教学具有形象、生动，感染力强，节省时间，容量大等优点，深受广大师生欢迎的教学方法。例如医学细胞生物学理论课中关于物质跨膜运输过程是学生较难理解的内容，在应用多媒体课件后，能展示不同物质在跨膜运输过程中的动态过程。学生容易理解，反应良好。在讲授有丝分裂和减数分裂这两部分时，利用多媒体静态图像、连续动画、片段动画、多侧面、多层次形象地模拟出染色体在整个细胞分裂过程中的变化，以及分裂过程的差错将产生何种遗传病及其病例照片，这种图文并茂的授课方式增强了教学的直观性、生动性，使学生印象深刻，从而提高了教学效率，起到事半功倍的效果。
2．4优化实验内容，培养学生动手能力
医学细胞生物学实验课教材使用的是本科室2007年编写的实验指导，并且在此基础上笔者不断充实、完善和更新实验内容。该实验指导详细介绍了常用的细胞生物学实验技术，增加了新实验以提高学生动手能力。针对医学护理专业的学生，实验也有所侧重，如除了让学生熟练使用普通光学显微镜，还让学生亲自动手制作各种涂片、滴片和压片等，并且能熟练运用光学显微镜对自己制作的标本进行观察，从而能认识常见细胞在光学显微镜下的一些基本形态，为其后续的学习、工作打下基础。另外还增加了骨髓细胞染色体制备、观察实验，锻炼了学生的动手能力。这些实验操作性强，动手较多，学生兴趣浓厚，教学效果好。
2．5充分利用网络资源，建立辅导网站
在课堂教学之后引入网络教学辅导，是对细胞生物学教学的有效补充［3］。教研室在2007年成功申报校级精品课程的基础上，制作了细胞生物学教学网站，该网站覆盖了讲授的细胞生物学理论课程，还包括学生练习自测、模拟实验。同时在授课过程中引导学生学会利用网络资源，给学生介绍一些生物方面的网站以及优秀杂志的网站，让学生及时了解在医学细胞生物学领域或生命科学领域最新进展或解决在学习过程中遇到的问题。学生通过浏览网站，查询、下载相关文献，完成作业，成为知识体系的主动建构者，提高了分析问题、解决问题的能力，同时还培养了获取信息、处理信息和应用信息的能力。
2．6采取多种形式，提高教师的教学、科研水平
细胞生物学的任务范文4
关键词：TBL；教学模式；细胞生物学；实验
中图分类号：G642.4 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）11-0257-03
细胞生物学不仅是生命科学的重要基础学科之一，也是现代医药学、生物技术领域、畜牧业、水产养殖等行业的重要基石。同时，它还是一门实验性较强的学科，通过实验可以让学生将理论知识融会贯通。一直以来，细胞生物学实验“以教师为中心，以验证为中心”的旧教学方式大大地阻止了学生实验的积极性和创新性。要怎样改变细胞生物学的实验教学来培养学生主动学习知识、独立思考问题，以及运用实验手段来探索生命的本质和现象，目前是细胞生物学实验教学改革需要思考的问题。以团队为基础的学习（team-based learning，TBL）是上世纪70年代的美国Oklahoma大学Larry K Michaelssen教授创立的。与传统的以授课为基础的学习（lecture-based learning，LBL）教学模式有着很大的不同。TBL不再是以教师讲授为中心，而是以学生自主学习为中心，以学生团队式合作学习为主，注重培养学生人际交往能力，培养主动发现问题并解决问题的能力，是一种有效促进学习的新型教学模式。目前，TBL教学模式已在我国中山大学、三峡大学等高校广泛应用，特别是在临床、解剖等医学基础课程和信息素质教育课程的教学中已得到普遍认可。虽然在我国已有很多院校在不同程度上开展了TBL教学法的探索和研究并得到不同程度的好评，但没有得到推广和应用。针对细胞生物学实验课程的性质，将TBL教学法应用到细胞生物学实验课程中，拟为TBL教学模式在《细胞生物学实验》课程中的推广进行一些探讨，提供一些思路。
一、TBL教学模式设计与实践
细胞生物学实验课程教学以理论课程为基础。理论与实践相结合，加深对所学知识的理解，对实验仪器要求较高，因此开设此课程的宗旨是使学生掌握细胞生物学实验设备的操作方法。使学生更加牢固地掌握基础知识，更重要的是培养学生动手和科研能力。
1.团队组建。将我院2011级生物科学本科班60名学生分为15组，其中每组为4人。分组时对组内成员进行调配，以达到组与组之间的均衡，再由成员分推选出一名组长，小组必须合理组织，合理管理，组员需要有责任意识。分组时要遵循的原则是既要使小组内的各种资源均衡，还要保持小组内成员稳定不变，减少影响小组内部凝聚力的因素。
2.教学准备。根据《细胞生物学实验》教学大纲要求，教师将需要了解与掌握的内容提纲预先告知学生，在TBL教学之前让学生对将要开展的实验进行预习。运用TBL教学法，学生根据老师拟定的教学提纲，实验室具备的实验器材，结合课程内容，进行实验前的自我研读和仪器、材料准备。充分体现以学生为主体，提高学生主动性的要求。
3.教学实施。（1）个人测试。在课堂开始的前十分钟，给每位学生发放一份复选题，题目覆盖此次实验课的实验目的、实验原理、操作步骤及其注意事项，要求学生运用之前所学到的知识来完成。之后参照分组，各组共同回答同样的复选题测验，并交出共识建立之后的答案，最后老师来分析、总结。个人测试有助于教师了解学生学习知识的情况，有利于教师调整和安排教学进程。（2）组间交流。接着进行组间交流发言，其中某一小组选举一名代表，上讲台把本组觉得重要内容、必须重视的注意事项向其他组的同学汇报，其他组的同学与该组交换意见，共同寻求保证实验成功的可行性方法。教师在一旁听证，记录各小组在讨论中存在的问题、小组的发言次数及发言的质量。在此过程中，教师应鼓励不爱发言的学生发言，参与到讨论中，必要时对不发言的学生进行有针对性的提问。（3）实验进行。实验进行过程中教师要注意培养学生的创新精神和能力。及时指导学生对实验进行阶段性总结。教师总体掌控任务的执行，注意随时为学生调整实验任务，让学生就实验内容进行深入的思考，发现实验探索生命本质成功的关键。实验结束后，要求学生及时记录实验结果，最后各组选派一名代表展示实验结果，对实验结果进行分析，优秀学生带动差生，综合提高班级水平。评估提高实验结束后收集实验结果，要求学生对实验结果进行分析、讨论，最后撰写实验报告。
二、TBL教学调查研究
研究采用问卷调查。课程结束后对全班学生进行调查。教师参考相关研究后设计调查问卷。调查问卷包括：实验前是否进行课前预习；是否有利于提高文献检索能力；是否有利于提高人际交往能力；是否有利于提高学习主动性；是否有利于提高实验动手能力；是否有利于增强团队协作意识；今后是否继续使用TBL教学模式等问题。
三、结果
60份调查问卷全部收回，收回率100%，其结果见表1。调查结果98.4%的学生认同TBL教学法能调动学生学习积极性，98.4%的学生认为能提高文献检索能力，95.1%的学生认为能提高人际交往能力，96.8%的学生认为能促进课前预习，96.7%的学生认为能提高动手能力，96.7%的学生认为能增强团队协作意识，96.7%的学生认为能使他们建立自主学习的观念，96.8%的学生认为TBL教学法能使课堂教学气氛活跃，95.1%的学生认为能更好地使他们理解课堂内容，91.7%的学生认为TBL教学法能及时解决学习问题，95.0%的学生认为能提高学生运用所学知识的能力，98.4%的学生认为今后应继续使用TBL教学模式。
四、讨论
细胞生物学实验传统的教学主要以教师讲解理论知识，学生验证为主。学生被动地学习知识技能，不能激发学生的积极主动性。而采用TBL教学模式在教学中的优点与不足具体讨论如下：
1.使实验课教学能在更高层次提高学生的动手能力。调查结果表明有96.7%的同学对提高学生的动手能力表示认同。与传统教学模式相比较，TBL教学模式更注重学生的主体性，教师精心设计一系列必要的知识内容，促使学生课前预习实验内容、操作步骤、注意事项，查阅相关文献资料解答疑惑，使其理论知识得到不断巩固与加强。学生用更多的时间去验证实验，可以发现自己在实验中的不足，激发学生去改正并且提高实验操作能力。
2.向后进生提供帮助与支持。TBL教学模式以团队为单位，小组成员无论是理论还是实验操作技能存在不足的，都会在个人测试，团队交流、讨论中显现出来，发现有知识点或是实验操作有不足之处的，老师或者其他懂的同学可以及时指导。所以，TBL教学模式能给后进生提供支持和帮助，能获得较大容量的学习知识。
3.培养学生的团队协作和人际交往能力。调查结果表明有96.7%同学对能提高团队协作认同，有95.1%的同学对能提高人际交往能力认同。在TBL教学中，教学任务的完成主要是通过团队协作来完成，这有利于提高学生团队合作的精神。在整个过程中，小组的每个成员都需要参与到问题的分析和解决中去，并通过相互的沟通来达成共识[5]。TBL教学模式中，小组内成员合作学习，取长补短，共同完成组内任务，这一过程培养了学生团队协作意识[7]。
4.树立并保持教师的工作热情。采用TBL教学法对细胞生物学实验课进行教学，教师不仅要把需要讲解的知识点全部熟悉，还要理解相关的其他学科知识，花更多的时间去准备测试题和相关资料。对教师来讲，教师是引导者和组织者，通过与学生共同参与讨论，教师也从中获益，实现教学相长式的终身学习，从而提高了教学效率[6]，树立并保持了教师的工作热情。
5.真正让学生主动学习。调查结果表明有98.4%的同学对TBL能调动学生学习的主动性认同。在TBL教学过程中，学生以讨论式学习和互教式的拓展性学习，真正做到以学生为中心。例如学生从实验课开始之前就需要自己根据教师给出的学习任务，自我研读掌握知识。实验过程中亲自动手实验，不明白的地方由学生向老师提问。老师在回答之前，先请其他学生来回答，这样可以增加互动。
6.节省课时，提高课堂效率。TBL教学采用课前给学生下达学习任务，学生以团队合作方式进行自我研读，这一环节大大缩短了教师课堂上的讲授时间，留有更多时间让学生测验、团队合作学习、团队讨论，提高了课堂效率。
7.TBL教学法在细胞生物学实验教学具体实施过程中的不足及展望。TBL教学对教学设备、教学场所、教师个人素质等提出了更高要求，首先，要求教师对本专业知识融会贯通，教师个人素养高，教学技能出色，并要具备良好的组织管理能力以及控制实验进行的能力。其次，教师对学生的学习兴趣、学习态度、能力和责任感等很难在短期内较为全面和准确的把握。当发现一些小组成员搭配得不恰当时。已经来不及重新分组，这就会造成组间成绩有一定差异[5]。另外，TBL教学法的特点是以小组讨论形式开展教学，1位教师组织TBL教学，心有余而力不足，不能有效地参与到每一个小组的讨论和实验指导中去，这样也会影响到TBL教学的效果。虽然TBL教学在《细胞生物学实验》中推广还存在一些问题，还有待今后不断地探索和完善。但TBL教学模式教学有利于提高学生的学习积极性、主动性以及动手能力和科学研究能力，能有效促进学生培养团队协作精神，同时更新了教师的教学理念，促进了师生之间交流，提高了细胞生物学实验的教学质量[5]。调查表明有98.4%的学生赞同在今后教学中继续使用TBL教学法。
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细胞生物学的任务范文5
细胞生物学是研究细胞基本生命活动规律的科学，是当前生命科学领域中最活跃、最富有发展前景的学科，同时也是一门实验性很强的学科。细胞生物学实验不仅可以加深学生对细胞生物学基本理论和基本知识的理解，更能通过实验教学训练学生的操作技能，锻炼学生的实际动手能力，培养学生的科技创新意识，提高学生分析和解决问题的能力，全面发展学生的综合素质。目前，国内许多高校将细胞生物学实验作为一门独立的专业必修课程，细胞生物学实验教学也越来越受到人们的重视。本文结合近几年的教学实践，对细胞生物学实验教学改革有如下几点体会。
1 优化实验教学内容，更新完善课程体系
传统的细胞生物学实验教学常采取“封闭性、验证性”的教学模式，导致了学生难以提高对实验的学习兴趣，也降低了教师的积极性，对教学效果的提高收效甚微。由于细胞生物学实验课时有限，实验项目较少，难以增加一些设计性实验。如何利用有限的实验课时达到巩固基本知识、掌握基本技术和培养创新意识的目标就显得至关重要了。为此，可以将一些在步骤上有连续性或内容上有可比性的实验项目归并，提高实验效率。比如，细胞膜通透性的观察、细胞的凝集反应原本为两个实验，我们将它们并在一个实验中，既观察到了溶血现象的发生，还了解了凝集反应发生的原理，节省了实验材料，提高了实验效率。同时，合理开设综合性实验，将单一验证性的实验项目整合为系统化的综合性实验。比如动物细胞的原代培养及保存与复苏这个实验，包含了原代培养、细胞计数及观察、细胞的保存与复苏等小的实验项目。这样的实验不仅强化了学生的基本操作能力，而且培养了其综合运用实验技术的科研能力。更重要的是尝试开设了开放性实验，如细胞融合、PAS法显示多糖等实验项目，由学生自己选择感兴趣的实验，全部实验过程由学生独立完成。将基础性、综合性和开放性实验内容合理安排后进行实验教学，学生既扎实了基本知识，又体会到科学实验操作的系统性和严谨性。
2 改革实验教学模式，挖掘学生的科研潜力
长期以来，细胞生物学实验采取“封闭性、验证性”的教学模式，由教师准备实验、讲解原理、步骤和方法，然后学生按照教师讲的按部就班地完成实验。这种教学模式导致了学生无心做实验，变成了一种应付，更谈不上提高科研能力了。为此，必需改革实验教学模式，发挥学生的主观能动性，尽可能地挖掘学生的科研潜力。
首先，调动学生的实验积极性，提高实验效率，需要将学生从被动变为主动，做科研的主人。而要做到这一点，必须完全改变以往的“填鸭式”教学，运用问题教学法、讨论教学法、启发教学法等多种教学方法，引导学生主动学习、独立思考，注重培养学生的批判性和创新性思维[1]。教师可以利用课前、课后及实验进行中的空隙时间，提出与实验相关的问题，组织学生讨论，自由发言，最后由教师总结讨论结果。此外，教师需要精心设计实验，并提前告知学生，要求学生预习实验，对实验的原理、方法及预期结果进行分组讨论，制定合适合理的实验方案。在此过程中，学生处于主动地位，发挥主观能动性，尽可能挖掘自身的科研潜能，而教师仅起引导作用，使学生积极主动的完成实验。
其次，为了避免传统实验教学模式带来的弊端，我们对细胞生物学实验教学模式进行了尝试并改革，重点引入了开放性实验教学的方法。所谓的开放性实验教学是指学生不受时间、空间、实验项目、试剂和仪器的限制，自主进行实验设计，探究科学问题的教学模式[2]。我们从实验准备工作、实验内容及实验室的开放三个方面进行了探索：在开放性实验教学中，所有的实验准备工作全部由学生来做，而不是像以往一样由实验教师完成；对于实验内容的开放，教师提供尽可能多的实验项目，由学生自己选择感兴趣的项目，并完成查阅文献、设计实验方案、整理所需试剂和仪器、确定实验步骤，最后完成实验。在此过程中，教师只作技术性指导，由学生独立完成实验，并撰写实验报告；当然，实验室的开放是必不可少的，也是非常重要的实验场所。近几年的细胞生物学实验教学改革发现，实施开放性实验教学以后，学生的动手操作能力、分析解决问题的能力以及科研创新意识都比以往传统教学的学生提高很多。由此可见，开放性实验教学这种模式值得进一步推广。
再次，加强教师的继续教育，提高业务素质和思想素质也是教育改革的关键。“杨?重其德业，以为人之师表。”作为一名教师，要时刻加强自己的业务学习，扩宽知识面，跟紧时代的发展；同时，更要提高自己的思想素质和道德修养，这样才具备资格去教育学生，成为学生学习的榜样。
3 建立合适的考核体系，全面展现学生的综合素质
细胞生物学的任务范文6
【摘要】
目的：研究D葡萄糖衍生物2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖诱导人结肠癌细胞SW1116凋亡时，其形态学的变化. 方法： 选用不同浓度的2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖与人结肠癌细胞SW1116共同孵育不同时间后，采用倒置相差显微镜，荧光显微镜、透射电子显微镜观察人结肠癌细胞SW1116的形态结构变化. 结果： 经2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖的不同浓度作用24~96 h后，观察发现：人结肠癌细胞SW1116出现体积缩小，荧光染色增强，胞核或胞质中可见致密浓染的颗粒状黄绿色荧光染色. 细胞染色质固缩，积聚在核膜边缘呈新月状，内质网疏松并与胞膜融合形成空泡，并呈一定的浓度、时间依赖性. 结论： 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖在体外具有诱导人结肠癌细胞SW1116凋亡的作用.
【关键词】 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖；细胞凋亡；结肠肿瘤；SW1116细胞
【Abstract】 AIM: To investigate the morphological changes of apoptosis in human colon cancer cell line SW1116 induced by 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose. METHODS: Inverted phase contrast microscopy， fluorescence microscopy， transmission electron microscopy were used to observe the morphological changes of apoptosis in human colon cancer cell line SW1116 induced by different concentrations of 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose at different times (2496 h). RESULTS: The morphological changes of apoptotic cells were exhibited， including shrinkage of cell， condensation of chromatin， breakage of nuclear and formation of apoptotic bodies， and the number of apoptotic cells ascended with the increasing concentration of 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose and with the time going by. CONCLUSION: 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose can induce the apoptosis of human colon cancer cell line SW1116.
【Keywords】 2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDglucose; apoptosis; colonic neoplasms SW1116 cells
0 引言
甲壳素是1811年法国学者Braconno发现，1823年由Odier从甲壳类动物外壳中提取，并命名为CHTTIN. 化学名称：聚N乙酰葡萄糖胺，D氨基葡萄糖是甲壳素（chitosan）脱除乙酰基后降解而形成的单糖，甲壳素因为含有羟基，可通过酰化、羧基化、氰化等反应形成不同结构和不同性能的衍生物．常见的有磺化甲壳素、N羟乙壳聚糖、O羧甲基壳聚糖等. 本实验我们利用D氨基葡萄糖的最新衍生物2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖［1］对人结肠癌细胞SW1116的凋亡形态学进行了研究，以探讨该D氨基葡萄糖的衍生物诱导人结肠癌细胞SW1116凋亡的作用，以期为结肠癌的治疗提供新的理论途经.
1 材料和方法
1.1 材料
人结肠癌SW1116细胞购自中科院上海生化细胞所. 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖由中科院兰州化学物理研究所提供. 四甲基唑氮蓝（MTT）、RPMI1640为Sigma公司产品，倒置相差显微镜、荧光显微镜为Olympus产品，透射电镜为JEM100CX型产品. 2.5 g/L胰蛋白酶、0.1 g/L丫啶橙、100 mL/L小牛血清为上海生物工程有限公司产品.
1.2 方法
1.2.1 细胞培养将传代的人结肠癌SW1116细胞置于37℃含50 mL/L CO2 温箱内，在含100 mL/L小牛血清、10 g/L双抗的RPMI1640全培养液中培养，48 h换液一次，取对数生长期细胞进行实验.
1.2.2 MTT法将贴壁细胞用2.5 g/L胰蛋白酶消化后计数，调整浓度为5×108/L，接种于96孔板，试验时分成0.02，0.04，0.06 mmol/L 3个不同药物浓度组及空白对照组，每组5个孔，分别于加药后24， 48， 72和96 h测定各孔的A值. 测定前每孔加5 g/L的MTT 10 μL，温育4 h后弃上清，加100 mmol/L DMSO 150 uL/孔，溶解，用酶标仪在490 nm波长下测定，计算细胞生长抑制率（%）=（1-实验组A值/对照组A值）×100%.
1.2.2.1 倒置相差显微镜观察将不同浓度的D葡萄糖衍生物作用不同时间的SW1116细胞置于倒置相差显微镜观察其生长状况及形态学变化，同时注意观察其凋亡过程.
1.2.2.2 荧光染色细胞片的制备及观察取对数生长期SW1116细胞，制成细胞爬片，经0.04 mol/L 的D葡萄糖衍生物处理72 h后，甲醇冰醋酸固定20 min，加入0.1 g /L丫啶橙10 μL染色30 min，清水冲洗后置于荧光显微镜下观察.
1.2.3 透射电镜观察细胞片的制备及观察取对数生长期细胞贴壁生长至培养瓶1/2，弃旧培养液，加入0.04 mol/L的D葡萄糖衍生物作用72 h后，用2.5 g/L胰蛋白酶消化，置离心管中，24 170 g离心20 min后弃上清，收集细胞及空白对照组细胞，PBS洗涤两次，离心后弃上清，先加入30 mL/L戊二醛固定，后锇酸固定50 min，脱水、包埋、聚合、超薄切片，透射电镜下观察凋亡细胞超微结构形态特征.
2 结果
2.1 倒置相差显微镜观察对照组SW1116细胞贴壁生长良好，细胞轮廓清晰，形态规整，呈梭形或条索状，生长旺盛，几乎无脱落；试验组SW1116细胞生长受到抑制，表现为细胞贴壁能力减弱，由贴壁生长而逐渐脱落，悬浮于培养液中，细胞体积缩小，变圆；出现核固缩，核颜色加深，且有时间和剂量的依赖性，药物剂量越大，一定时间范围内作用时间越长，其生长受抑制就越明显（图1A，B）.
2.2 荧光显微镜观察对照组SW1116细胞呈黄色或黄绿色，胞核饱满，胞质表现为橘黄色荧光. 试验组细胞则出现细胞体积明显缩小，荧光染色增强，胞核或胞质中可见致密浓染的块状或颗粒状黄绿色荧光染色，有的可呈现新月形（图1C，D）.
2.3 透射电镜观察透射电镜下见对照组SW1116细胞的细胞膜完整，细胞核和细胞器等微结构清晰. 试验组细胞胞质出现明显浓缩，其内微绒毛减少，基质逐渐消失，内质网结构疏松并与细胞膜融合，出现空泡；胞核内的染色质固缩并凝集成块，聚集在核膜周边，出现环状或新月状（图2）
3 讨论
甲壳素不仅参与人体肝肾解毒，发挥抗炎、刺激蛋白多糖的合成，强化免疫和调节生理机能外，且可抑制肿瘤细胞的增长，其部分衍生物对肿瘤细胞具有更强的诱导分化作用［2］. Wu等［3］利用该衍生物通过体外实验已证实，该衍生物能够明显抑制人肝癌细胞株（HepG2）的生长，同时能诱导其发生凋亡，并且呈一定的浓度、时间相关性.
本研究用不同浓度的2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖处理体外培养的SW1116细胞，MTT法研究显示该衍生物对体外培养的人结肠癌SW1116细胞有明显增殖抑制作用，并随着时间和浓度的增加其抑制作用也随着增加，并且在一定的时间范围内有时间、浓度相关性，其中以0.04 mol/L的浓度作用72 h后的抑制作用最明显，出现的凋亡细胞最多；形态学研究时应用倒置相差显微镜、荧光显微镜和透射电镜可观察到凋亡细胞的形态学特征改变：细胞固缩，染色质凝集，细胞核碎裂，呈新月状或颗粒状以及凋亡小体形成；以上研究表明了2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖能诱导人结肠癌细胞SW1116发生凋亡.
最新研究表明细胞凋亡是一个多基因调控的复杂过程，主要由诱导基因、抑制基因和双向控制基因相互作用的结果［4］. 因此要诱导人结肠癌细胞的凋亡就离不开促细胞凋亡基因如Caspase3和抑制细胞凋亡基因如bcl2，bclx等之间的相互影响和相互作用，已有不少研究表明［5］以上基因均参与了结肠癌细胞的促凋亡及抑制凋亡的过程，而本研究只是从形态学的角度证实了2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖具有诱导人结肠癌SW1116细胞凋亡的作用，但其具体作用的相关机制、促凋亡基因和抑制凋亡基因如何发挥作用仍需进一步研究和探讨.
【参考文献】
［1］乔岩，王爱勤，王哲，等. 2（3羧基1丙酰氨基）2脱氧D葡萄糖的合成［J］. 化学试剂， 2004，26(2):107-108.
［2］王哲，乔岩，黄高升，等. 氨基葡萄糖及其衍生物诱导白血病细胞K562向巨噬细胞样分化［J］.中国药理学通报，2003，19(3):290-293.
［3］Wu J， Kou W， Gao MT ，et al. Effects of {2［(3carboxy1oxoprogy1) amino］2deoxyDGlucose} on human hepatocellular carcinoma cell line. ［J］ Acta Pharmacol Sin， 2005，26(5):635-640.
