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微生物多样性研究范文1
（保山中医院高等专科学校，保山 678000）
（Baoshan College of Tranditional Chinese Medicine，Baoshan 678000，China）
摘要： SARS之后，中央空调系统可能成为传染病的一种空气传播渠道引起公众和政府的重视，而其独特的设计结构亦为滋生各种微生物提供环境，所以加强对中央空调系统的卫生评价和卫生管理对于传染病防控非常重要。本文阐述了保山地区疾病预防中心开展在进行中央空调系统卫生状况调查的同时开展其微生物多样性研究的意义。
Abstract： After SARS, that central air conditioning system may became an air spread channel of infectious diseases caused attention of public and government, and its unique design structure also provides environment for breeding various microorganism, so it is very important for infectious diseases control to strengthen the health evaluation and health management of the central air conditioning system. This paper expounds the meaning of microorganisms diversity research while investigating the hygienic condition of central air conditioning system in disease prevention center in Baoshan.
关键词 ： 中央空调；微生物；多样性
Key words： central air conditioning；microorganisms；diversity
中图分类号：R122.1 文献标识码：A
文章编号：1006-4311（2015）02-0297-02
公共场所是人群密集场所，其卫生状况与人体健康密切相关。中央空调现在广泛应用于写字楼、宾馆、医院等公共场所，通过对室内空气的温度、湿度风速等微小气候进行有效调节，给人们的工作、学习和生活提供了舒适的环境，同时如果空调通风系统在设计、安装或者运行管理等的过程中存在不合理的地方，很容易滋生室内的空气污染物，并且已经成为了一种主要的建筑物室内空气污染。空调系统对人体健康构成的最大危害就是空调系统引发的传染性疾病，其中“军团病（Legionettosis）”是最具代表性的，曾在世界上很多国家引起50多起爆发流行；“不良建筑综合症（Sick Building Sgndrome，SBS）”是空调系统污染造成人体健康危害范围最广的，因此，全世界都很关注中央空调系统的卫生问题。
我国政府和公众在2003年发生“SARS”后一直非常重视中央空调系统的卫生问题。卫生部首先在2003年8月颁布了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》，之后又在2006年2月颁布了《公共场所集中空调通风系统卫生规范》等四项规章制度，并于2006年3月1日起开始实施，不仅规范了空调系统卫生技术要求，也加强了空调系统卫生评价规范与卫生管理
在这一系列的卫生法规和标准的支持下，各地的疾病预防中心都开展了相应的工作[1]，对当地公共场所的中央空调进行了卫生状况的调查,调查结果根据相关规定列出细菌总数、真菌总数和检出嗜肺军团菌、b-溶血性链球菌的情况，其中无一报告在进行微生物检验时，通过培养获得的细菌和真菌具体有哪些种类及其数量分部。但是，建筑物内的真菌孢芽、毒素的刺激能够引发的病症包括眼球和喉咙的发痒、充血以及头痛、呼吸困难，甚至哮喘等其他严重的疾病。有研究[2]表明，真菌是已与供暖、通风和空调（HVAC）系统的污染相关的生物，它还可能导致生活在该环境下的人得传染疾病。Somers等实验发现吸入污染空气颗粒的小鼠发生基因突变，这为空气中的真菌可能导致肺癌提供了间接证据。室内空气生物污染不仅危害人体的呼吸系统和免疫系统，Anyanwu的研究证明产毒真菌的长时间暴露可能影响到儿童神经生理功能，上述研究部分揭示产毒真菌可能对人体神经系统的健康也存在威胁，许多细菌的细胞成分（如内毒素、β-葡聚糖）也是重要的病原，Huttunen[3]等研究发现，室内空气中的细菌都显著的诱导鼠巨噬细胞的肿瘤坏死因子-α、细胞白细胞介素-6的产生。而这些文献中提到的微生物没有在相关的检测法规中作为需要检测的对象出现。
所以仅仅调查和报告规定的细菌、真菌数量，只关注法规中提到的致病菌检出情况就对一家公关场所中央空调的卫生状况进行评价是不够全面的。
中央空调中的绝大多数微生物主要来源与空气微生物，极少部分特别是条件致病菌或者病原微生物来源与入住的宾客或者工作人员。空气微生物主要来源于土壤、水体表面、人体以及生产活动等。其组成浓度不稳定，种类多样[4]。空气微生物的种类随调查地理位置、调查季节的变化而有所不同。王春华[5]对东莞市5个不同的公共场所进行空气微生物监测，细菌和真菌含量的季节更迭而变化。细菌以革兰阳性菌为主，其中芽孢杆菌和葡萄球菌占多数；真菌以青霉和曲霉为主。而中央空调的微生物多样性调查结果尚无报道。
大多数空调系统在晚上停止新风进入后，整个风道内的湿度可达80甚至100，这样一个特殊条件，为滋生各类微生物提供了适宜的生存繁殖环境，条件致病菌甚至是致病微生物都有可能在这样的条件下得以生存。保山属低纬山地亚热带季风气候，气候类型的多样化，生物种类繁多，微生物种类也很丰富，但其空气微生物多样性尚无相应研究报道。曾有新闻报道，二战期间，日军在保山县境内发动的细菌战，曾引起霍乱、鼠疫、炭疽的爆发，这些都给保山的疾病预防和控制带来了挑战。对于人群集中的公共场所，容易引发、传播传染性疾病的空调系统的卫生状况调查和其中微生物多样性的调查、研究都是刻不容缓的。所以结合本地的地理气候、生态环境等因素，调查、研究哪些种类的微生物能够在公共场所的中央空调中生存、繁殖或者是以孢子、芽孢等形式留存在中央空调中，中央空调中的微生物哪些可能是致病菌，哪些是可能条件致病菌，哪些仅仅是与空气中的背景微生物。
检测室内空气微生物，传统的方法是利用生物粒子重力随机沉降到培养皿上的暴皿沉降法，这种方法虽简单容易操作，但因为是一个被动捕获的过程，所以结果波动很大，准确度和重复性都较差。对于中央空调的微生物采样，现在更多采用为主动抽取空气的撞击式采样器，在计算微生物总数和对其进行形态学鉴定的同时测定其粒子大小分布规律。
传统的培养计数法只能培养可培养的微生物，而不能在培养基上生长或有其他生长需求的微生物就不能获得。另外，在进行可培养微生物鉴定时费时费力而且不够准确，所以现在有生物发光法、免疫法等新方法引入到微生物多样性的检测中，其中分子生物学的方法具有宽阔的应用前景。
中央空调微生物多样性的研究不仅可以为制定更加全面的卫生标准提供微生物学的依据，还可以在空调系统样品采集的方法、微生物种类的卫生标准、中央空调清洁的方法、频率和注意事项、易感人群的感控提示等方面并提出微生物学的建议和意见。
参考文献：
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微生物多样性研究范文2
关键词：土壤微生物；PCR-DGGE；聚类分析；香浓威尔指数
中图分类号 S15 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2013）24-65-04
在土壤养分循环的过程中，土壤微生物发挥着积极的作用，是土壤肥力的重要指标[1]，土壤微生物几乎是全部土壤生物化学过程的参与者，不但能提升土壤中有效养分的含量，还为作物生长和产量提供必要的物质保障[2]。由于人们长期对土壤进行农事操作，改变了土壤物理生物化学属性，因此对农田土壤微生物的主要类群和重要功能群的数量影响也愈见强烈，进而可能影响耕地质量保育与生态环境安全[3-4]。大部分土壤微生物对耕作措施很敏感，会表现出不同的反应[5-6]。其多样性对生态系统的稳定性、生产力和应对压力与扰动的恢复力方面有着重要的影响[7]。Al-Kaisi和Liebig等研究都表明，保护性耕作较传统耕作更有利于增加土壤中微生物多样性和生物量且更集中于地表，进而提高土壤系统稳定性。加之长期高强度的农药化肥大量投入使用也极易降低土壤中微生物群落多样性，导致微生物功能丧失，进一步影响土壤质量，使得土壤障碍频发[8-9]。研究结果表明恰当的管理制度能够增加土壤微生物种群数量，进而有利于作物产量的提高，土壤质量也会随之改善[10-11]。Schutter等利用PLFA法对保护性耕作和传统耕作下土壤微生物多样性进行了研究，发现对比传统耕作，保护性耕作更能增加土壤微生物种群数量。
1993 年，Muy zer 等首次将PCR-DGGE（Polymerase chain reaction-denaturing gradient gel electrophoresis）技术应用于微生物生态的研究，这一技术的出现克服了传统微生物培养技术的限制，由于PCR-DGGE 具有可靠、方便快捷、重现性好等优点，迅速成为微生物群落多样性和动态分析的强有力工具[12]，它利用PCR扩增产物中G+C含量的rDNA组分在电泳凝胶中移动的位置上的差异，不同G+C含量在胶中移动的速度不同，因此产生不同代表微生物群落组成的条谱带。本试验通过测定不同耕作方式下土壤微生物数量以及在分子水平上利用PCR-DGGE技术研究不同耕作方式下的农田管理措施对土壤微生物群落多样性的影响，从理论上阐明适合的耕作方式和农田管理模式，为土壤质量的改善和生产力的提高，提供重要的理论基础。
1 材料与方法
1.1 试验区概况 试验在吉林省农田进行，试验地土壤为典型黑土。全省大部分地区年平均气温为2～6℃，全年日照2 200～3 000h，年活动积温平均在2 700～3 200℃，年降水量一般在400～1 300mm。受季风气候影响，吉林省四季降水量以夏季最多，占全年降水量的60%以上，对作物生长十分有利。
1.2 供试土壤与样品采集 本研究选择4种处理：（1）陶家子（TH）：玉米收割后根茬还田，次年旋耕四位一体机进行播种施肥一次性作业；（2）永发乡（YH）：玉米收获后秸秆全部粉碎回田，两年播种前深翻一次后持续免耕；（3）农安（NH）：玉米收割后1/3秸秆粉碎还田，次年深翻；（4）公主岭（AH）：深翻配施有机肥。各处理设置的同时均有农民现行耕作对照。土壤样品采集于2011年10月中旬，供试土壤为中上层黑土，试验采取3点取样法，去除土样杂质、细根，将鲜土保存在4℃冰箱中待测。
1.3 土壤DNA提取与PCR扩增 采用FastDNA SPIN Kit for Soil土壤DNA提取试剂盒。按试剂盒规定的实验步骤进行土壤DNA的提取，所提取的DNA用试剂盒纯化后保存。每个样品3次重复，以341f，758r（生工合成）为引物，在PTC-200PCR仪（Bio-Rad，美国伯乐公司）上进行扩增。PCR反应体系为50μL，包括10×buffer 5μL，10mmold NTP 4μL，10pm正反引物各1μL，taqDNA聚合酶0.4μL，无菌水37.5μL，模板1μL。（大连宝生物公司）。PCR扩增程序为：94℃预变性5min；94℃变性1min，65℃（-0.5℃ per cycle）退火1min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性1min，55℃退火1min，72℃延伸1min，12个循环；72℃延伸10min。
1.4 样品的DGGE分析 用扩增的PCR产物进行DGGE分析，所用仪器为D-Code Universal Detection Mutation system （Bio-Rad，美国伯乐公司），凝胶成像系统（Bio-Rad，美国伯乐公司）。DGGE的凝胶浓度为6%，变性梯度为30%～60%，在60℃，180V条件下电泳6h.电泳胶片用Genefinder荧光染料染色。
1.5 数据处理 试验数据采用Quantity One4.2.3软件，采用非加权成对算术平均法（UPGMA）对所有土壤样品进行聚类分析。
2 结果与分析
2.1 不同耕作方式对农田耕层土壤微生物多态性的影响 对耕层土壤微生物的PCR扩增产物进行DGGE电泳，分别得到不同地区土壤细菌的DGGE图谱。从图1中能够清晰的看出菌群的整体分布多样性和优势菌的分布和数量。各样品的细菌DGGE图谱的条带数、条带位置和亮度呈现明显的差异。DGGE凝胶电泳能够分离长度相同而序列不同的DNA条带，条带越多说明生物多样性越丰富，条带信号越亮表示对应该条带的细菌数量越多，从而可反映出微生物的数量和种类[13]。不同处理间有很多共有条带，说明处理间微生物群落结构具有很强的相似性，然而这些共有条带粗细强度的差异，说明同一种微生物在不同处理内丰度不同。不同处理间出现的条带的增加或缺失现象，说明不同处理间微生物多样性存在一定的差异。图1显示，3种处理耕作方式TH/YH/NH都较它们的传统方式TS/YL/NL土样条带数量多，亮度强。其中NH/NL组条带数目差异明显，NH较NL条带数量变化最多；TH较YL条带亮度变化最强；TH较TS在数量及亮度上也有变化，但是变化幅度较小。表明不同耕作处理下的农田土壤微生物多样性较农民常规耕作下土壤微生物多样性丰富。
图1 不同耕作方式下耕层土壤细菌DGGE图谱
进一步利用Quantity One4.2.3对DGGE图谱进行数字化处理，通过UPGMA方法进行聚类分析，得到不同耕作下土壤微生物组成的聚类分析系统树。结果如图2所示，图2中处理分为2个族群，NL点处为一个族群，其余TH/YS、YH/TL和NH为另一个族群。说明深翻结合秸秆还田能够改变土壤中微生物组成。说明细菌群落结构类型因耕作方式不同，表现出明显差异。聚类分析系统树显示TH/TS、NH/NL均首先聚类，表明其土壤中微生物种群结构较为接近；YH/YL未首先聚类，说明深翻配施秸秆还田促进土壤微生物种群结构的多样性。
图2 不同耕作处理与传统耕作耕层土壤微生物组成的聚类分析
2.2 不同耕作方式对农田犁底层土壤微生物多态性的影响 应用PCR扩增产物对土壤犁底层微生物进行DGGE电泳分析，分别得到犁底层细菌DGGE图谱条带，如图3显示。同样，从图3中能明显看出，犁底层中TH/YH/NH的条带数量及亮度方面要较TS/YL/NL等传统耕作土壤中微生物数量大，亮度强。
图3 不同耕作方式下犁底层土壤细菌DGGE图谱
图4聚类分析系统树中显示，TH/NH和TS/NL首先聚类，说明四位一体耕作方式和深翻结合1/3秸秆还田对土壤微生物种类结构没有影响；并且NL/TS以及NH/TH的聚类结果显示不同样地同一深度的犁底层土壤微生物具有较高的相似性。
图4 不同耕作方式下犁底层土壤微生物组成的聚类分析
2.3 不同耕作方式对农科院试验田耕层和犁底层土壤微生物多态性的影响 通过Quantity One软件包对农科院试验站的土样进行DGGE图谱分析发现，如图5所示，C点耕层（0～20cm）条带数较传统耕作的耕层A点（0～20cm）条带数多且条带明亮，D点犁底层（20～40cm）条带数较传统耕作B点犁底层（20～40cm）条带数多且条带较亮，说明施入的有机肥能增加土壤中微生物的种类和数量。
注：A=Al（0～20cm）；B=AL（20～40cm）；C=AH（0～20cm）；D=AH（20～40cm）。
图5 不同耕作方式下耕层与犁底层土壤细菌DGGE图谱
从图6的聚类分析系统树看出A、B、D三点首先聚类，而C点未能与其聚类，由此可以说明深翻配施有机肥同样能够促进耕层土壤微生物种群结构的多样性。
图6 不同耕作方式下耕层与犁底层土壤微生物组成的聚类分析
2.4 不同耕作制度下土壤微生物香浓威尔多样性的影响 根据土壤在DGGE图谱上的条带信息，计算出的Shannon-weiner多样性指数，如表1所示。从表1中看出，4种不同耕作处理下的土壤微生物香浓指数都较农民常规耕作下微生物香浓指数高，说明4种耕作方式都能促进土壤微生物种群结构的多样性。这可能是由于4种耕作处理可以为土壤微生物提供相应的养分和适宜的生存环境，促使各类微生物很好的生长，因而微生物多样性指数较高。四位一体耕作方式下土壤微生物的香浓指数增幅最大，耕层和犁底层分别为23.2%和15.5%，
表1 不同耕作与常规耕作耕层土壤与
犁底层土壤香浓威尔多样性指数
[耕作＼&1＼&2＼&3＼&4＼&4种耕作＼&耕作层＼&2.39＼&2.38＼&2.36＼&2.63＼&＼&犁底层＼&2.00＼&2.04＼&2.25＼&2.38＼&常规耕作＼&耕作层＼&1.94＼&2.30＼&2.25＼&2.48＼&＼&犁底层＼&1.70＼&1.92＼&2.01＼&2.29＼&]
3 结论与讨论
黑土土壤中的微生物具有数量大、种类繁多等特性，因此本实验采用了16S rDNA扩增的DGGE方法研究不同耕作制度下土样微生物群落的多样性。通过分析农民常规耕作下农田土壤与不同耕作处理下农田土壤中微生物组成的DGGE图谱，显示了不同样地或同一样地不同深度土层土壤微生物组成的多态性。微生物是农田土壤中的核心组成部分，不但能为作物提供营养元素和最佳的生长环境，还能保持土壤的基本生产力。有研究表明，腐解的秸秆扮演着养分和载体的角色[14]，能够增加有机碳含量进而改善土壤环境，显著降低土壤pH值，增加土壤微生物数量。因此，对于促进作物生长、改善和提高土壤质量具有重要作用[15]，施肥可以增加根系的分泌物，给土壤微生物提供能源物质，进而提高土壤微生物量[16]。从DGGE图谱中看出（图1、图3、图5），耕层土壤微生物组成中TH/YH以及AH的电泳条带都较TS/YL和AL电泳条带数量多，亮度强；对犁底层来讲，同样是不同耕作措施下土壤微生物要较传统耕作下土壤微生物类群丰富，种类繁多。这说明了增施有机肥或秸秆还田都能明显增加土壤微生物类群和数量。这与施用有机肥可以维持较高的土壤微生物活性，保持微生物多样性与生态稳定性相一致[17]。秸秆还田可以为微生物的生长活动提供必要的能源和营养物质，加快刺激土壤中微生物的活性，从而加快土壤中微生物的自身物质合成，并利用外源养分进行新陈代谢[18]；有结果表明农民常规耕作模式下土壤微生物的DGGE条带数明显少于适宜的耕作模式处理，说明农民常规耕作降低了土壤细菌群落的多样性[19]。利用Quantity One4.2.3软件对土壤DGGE图谱进行的聚类分析显示，无论是传统耕作还是不同耕作制下同一地区不同深度土壤的微生物组成具有多态性。
就Shannon-Weiner指数而言，不同耕作下的土壤耕层香浓指数都较农民常规耕作下耕层香浓指数高，这是由于秸秆还田可以直接为土壤微生物提供充足的有效养分，改善土壤微生物栖息环境[14]，提高了耕层土壤生态环境的缓冲能力。而犁底层可能是由于养分运输的限制，微生物不能得到充足的营养和适宜的生存环境，所以在类群功能和数量上不能像表层微生物那样丰富。通过对比不同耕作措施下的微生物香浓指数，发现陶家子耕作方式下土壤微生物多样性变化最高，耕层和犁底层增幅分别为23.2%和15.5%。推测其可能原因是根茬还田补充输入了有机碳源又改善了土壤物理性状，有利于维持土壤微生物的多样性及活性[20]，另外旋耕增强了土壤的通气能力，同时也使土壤的孔隙度增加，因此微生物的活动能力也相应的增强。
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微生物多样性研究范文3
关键词：有机农业；生态环境；生物多样性；土壤改良；保护
环境农业是人类有意识改造大自然以获得食物来源的一种生产活动，是承载着人类文明延续与发展的根基。但发展到现代农业之后，农药和化肥的过度使用在生产出大量农产品的同时，也造成了严重的食品安全隐患以及土壤肥力下降、自然环境污染严重、生物多样性被破坏等严峻的环境问题[1]，人们必须要意识到现代石油农业并不是解决人类温饱问题的最佳途径，应该寻求一种对环境友好的农业生产方式。而有机农业在保障农产品安全、防止水土流失、改善生态环境等方面都能起到积极的作用[2]，是一种可持续发展的环境友好型农业生产方式，应该得到大力推广。但在传统农业种植区域，政府与农民在应用和推广有机种植模式上的积极性不高。鉴于此，本文综述近年来有机农业生产活动对生态环境积极影响的相关文献，以期为我国有机种植模式的进一步推广提供科学依据。
1有机农业的概念界定与生产准则准确地界定
有机农业的概念是研究有机农业的首要步骤，根据国家标准叶有机产品曳渊GB/T19630.1要2011冤，有机农业是指遵照有机农业生产标准，在生产中不采用基因工程获得的生物及其产物，不使用化学合成的农药、化肥、生长调节剂、饲料添加剂等物质，而是遵循自然规律和生态学原理，协调种植业和养殖业的平衡，采用一系列可持续发展的农业技术以维持持续稳定的农业生产体系的一种农业生产方式[3]。在有机生产体系中，以农业清洁生产为指导思想，核心要求是建立、恢复农业生态系统包括动物、植物和土壤微生物在内的生物多样性以及由这些生物参与、推动的物质和能量循环，以保持、提高土壤的长效肥力和易耕性[4]；具体的土壤培肥措施是激发系统内禀的自然肥力供给，如将作物秸秆、畜禽粪便和有机废弃物等腐熟还田以及轮作豆科作物、绿肥等，并采用农作物渊间冤轮作、耕种抗性作物品种以及物理措施、生物措施和生态措施作为控制农田病虫草害的主要手段，同时配合合理的耕作方式以保持水土，达到维护农业生产体系、保护生态环境的目的[5-7]。现代常规农业是目前我国耕作面积最大的农业生产方式，其长期、大量地施用农药、化肥等会抑制农田生物多样性的发展，而且残留在农田里的农药和化肥会严重污染、破坏土壤环境，并可能经淋失和径流进入地下水和河流、湖泊等水域环境造成严重的水污染[8-12]。而有机农业作为一种环境友好、可持续的农业生产方式，坚持不使用农药、化肥等物质，强调以自然、环保、不破坏农田生态的方式进行耕作、生产，避免了对水体、土壤及大气环境造成污染；而且有机农业重视科学、合理的耕作制度，采用间作、轮作等科学栽培法，不仅可以改善耕作土壤的理化性质，还能有效减少病虫害发生的机率，进一步达到保护土壤环境和生物多样性的目的[4-7，13]。总的来说，有机农业的生产过程对环境友好，能够控制农业生产过程中可能对水域环境产生的面源污染，促使土地肥力恢复，增加农业生态系统中的生物多样性，能够切实有效地保护和修复当地的生态环境。
2有机农业的生态效益
有机农业将动物、植物和土壤视作一个整体，强调在这个整体内部的资源循环利用，而且生产过程更注重保护自然环境及生物多样性，会充分考虑环境的承载力，使农业生产能与自然环境保护相协调，真正做到对环境友好。相关实践表明，开展有机农业可以使农业生产所造成的面源污染情况得到有效控制，包括动物、植物、土壤动物和土壤微生物在内的生物多样性也能迅速增加，同时减轻土地、水体和动植物界的受损程度，进而恢复和改善农业生产环境[14]。
2.1增加生物多样性
有研究表明，在过去40年内，集约化的农业生产活动是许多农田鸟类、杂草、土壤动物和土壤微生物等物种丰富度及多度下降的重要原因[8-9]。而有机农业拒绝使用农药、化肥，对生产区域内各种动物、植物、土壤动物与土壤微生物的危害极小，可以有效地恢复和保持生产区域内生物的多样性[15-16]。益鸟等动物天敌是有机农业体系中生物防治虫害的重要环节。与常规农田相比，有机农田中鸟类渊尤其是地面孵化的鸟类冤的种类和数量更高。如李现华等[17]对内蒙古磴口县境内常规农业系统和有机农业系统中动物多样性的调查结果表明，有机农业种植区的有益鸟类等生物的数量较多，而且有益昆虫渊尤其是七星瓢虫冤的数量也明显增加，而蚜虫等害虫的虫口密度则明显降低。节肢动物也是农田中数量较多的一类动物，根据相关的研究发现，有机农田内节肢动物的物种丰富度与多度都明显高于常规农田[18-19]，有助于实现对农田害虫的生态控制。与传统农业生产对杂草等植物的敌对态度不同，有机农业生产允许相对多样化的杂草生长，甚至在农田休耕时期还会轮作某些能起到绿肥作用的草类。有机农业对于杂草的态度较为温和，因而在有机农田中杂草密度、生物量或地面覆盖物通常高于常规农田系统[20-23]；还有相关研究发现，采用有机种植的农田内有较高的阔叶杂草[24]以及除草剂敏感型杂草[25]的物种丰富度和多度。有机种植方式下，农田中土壤动物的种类和数量也会有所增加，如蚯蚓就是土壤肥力的重要指示动物，蚯蚓的数量能反映土壤的结构、微气候、营养和毒性等土壤状况。
有研究表明，采用有机管理方式的农田中，土壤内蚯蚓的密度、数量均比常规农田高，如Brown[26]的研究报导发现，有机农田内蚯蚓的密度约为常规农田的2倍；还有其他相关研究也发现，有机农田较常规农田拥有较多的蚯蚓种群数量[27]。土壤中的微生物体渊细菌、真菌等冤在维持、增强土壤肥力方面发挥着关键作用，比如有益微生物群落会参与腐殖质的形成，能改善农田土壤的团粒结构，从而提高农田土壤的肥力状况。而有机农田拒绝农药和化肥的施用，减少了对土壤的破坏，在一定程度上改善了土壤微生物的生活环境。已有多项研究表明，采用免耕、轮作、施有机肥等有机种植模式的农田土壤微生物的生物量和生物活性均高于常规农田[28-32]。此外，秸秆还田作为有机农业种植体系中非常重要的土壤培肥手段之一，有大量研究发现，秸秆还田是有机农田中土壤微生物数量增加、活性增强的重要原因，如Ocio等[33]研究发现，在将秸秆翻压还田7d后，土壤中微生物的生物量增加了2倍；高美英等[34]对山西农业大学教学果园各层土壤中固氮菌数量的调查研究也发现，秸秆覆盖还田可明显增加果园各土层中固氮菌的数量，在整个0~60cm耕作层内固氮菌数量年平均增加95.47%，尤其在0~20cm土层中的固氮菌年平均增加量更达到了123.80%。总的来说，有机种植方式能有效提高种植区域内动植物、土壤动物和微生物的多样化组成，而生物多样性又具有重要的生态作用，有利于控制有害生物的发生，也有利于实现土壤营养的优化循环和保持土壤肥力等。因此，农业种植活动应采取对环境友好的技术措施，以保护种植区域内的生物多样性。
2.2改良土壤
现代农业长期、大量地使用农药、化肥、植物生长调节剂等物质，在提高作物产量的同时也严重损害了土壤环境，造成了如土壤中有机质减少、土壤微生物活力下降、土壤的蓄水保肥能力降低等恶果；而土壤是农业生产的根基，没有健康、肥沃的土壤就没有健康、营养的农产品，农业可持续发展的第一个要求就是保护和改良土壤。有机农业作为一种环境友好型的可持续农业，其发展初衷即是改善现代农业生产所造成的环境恶化，因而有机农业对于培肥、改良土壤极其重视。有机农业的培肥理论认为土壤是一个有生命的系统，施肥是在培育土壤，进而由肥沃土壤为农作物提供所需养分。因此，有机农业种植的第一步就是采取各种措施渊如施用有机肥和合理轮作等冤改良、培肥土壤，激活土壤的生命。对于有机农业中培肥土壤的方式，欧阳喜辉等[35]总结了国内外多项关于有机农业的研究，得出有机农业通过施有机肥、秸秆还田、免耕和轮作等措施可以有效增加土壤有机质、促进土壤团聚能力以及提高土壤微生物活性，从而达到培肥土壤的目的。秸秆还田与轮作也是有机农业提倡的改良土壤、维持地力的重要手段，如王宁等[36]的研究表明，秸秆还田能改善土壤环境，而且还能减少土壤碱性物质的流失，可以在一定程度上减缓土壤的酸化，维持土壤肥力；杨景成等[37]的研究也发现，与传统种植制度相比，粮草轮作结合秸秆还田可以有效地降低对土壤有机质的衰减效应。土壤微生物量碳是土壤有机库中的活性部分，是表征土壤质量和肥力的一个重要指标。董博等[38]通过长期定位试验发现，长期施用有机肥渊或有机肥与化肥配施冤可以明显增加耕作层土壤中的土壤微生物量碳和土壤有机碳。胡诚等[39]通过多年施肥试验发现，随着有机肥施用量的提高，农田土壤中微生物量碳、土壤可溶性碳、总有机碳等含量都随之增加。改良土壤、保护土壤环境是有机农业能够持续发展的根本，而长期的有机种植反过来又能提高土壤肥力、增强土壤生产力，并通过改变土壤的通透性和孔隙度等自然结构性状改善土壤环境，同时还在一定程度上增强土壤生物与微生物的活性，这都说明了有机农业是对环境友好且可持续的一种农业生产方式。
2.3保护环境
现代农业生产过程中，农药、化肥的过度使用会破坏农田土壤的理化性质，加剧水土流失、旱涝灾害，加剧对水、土和大气环境的污染，威胁生态环境安全。而有机农业采取对环境友好的方式、措施进行农业生产，能有效地保护环境，众多学者通过调查研究认为，相较于现代常规农业，有机农业具有防止水土流失、减少土壤污染、保护生物多样性、减少地下水污染、保护地表水水质以及控制温室气体排放等良好的生态效益[40-45]。有机农业在改善土壤环境、保持水土方面具有重要贡献，如卢东等[46]在多个有机种植基地中的试验表明，在控制好有机肥原料的情况下，有机农业土壤重金属污染的威胁较常规农业小；许恒周等[47]通过试验研究得出了有机农业有利于防止水土流失及土壤沙化、有助于农业可持续性发展的结论；RigbyD等[48]关于有机农业的研究也显示有机农业可以改善土壤养分缺乏状况，实现土壤肥力的持续供应和永久利用；此外，杜相革等[49]也认为有机农业可以改善土壤环境及其中的营养循环、改善土壤动植物的生存条件等，能有效增加土壤生物多样性，进而促进整个农田生态系统的可持续功能。有机农业对水环境的保护则主要体现在减少农药和化肥对地下水和地表水的污染，据相关学者估测，全世界施用于土壤中的氮肥有30%~50%经淋失进入到地下水中[50]，而我国相关部门的统计也发现农业面源污染对河流和湖泊富营养化现象的贡献率达到60%耀80%[51]，可以说现代农业是造成地下水和地表水环境污染的主要原因。而有机农业采用了轮作和休耕培肥地力、拒绝施用农药和化肥等，减少农业生产对水环境的污染，有效地保护了地表水和地下水的水质安全，据席运官等[42]对有机稻田与常规稻田排水污染进行比较研究发现，有机水稻种植方式可减少农田排水中氮的排放量，还会降低排水中的总磷浓度；徐田伟[52]也发现了有机种植业的发展可以控制区域水土流失、降低非点源污染的水平，认为发展有机农业是我国控制农业面源污染的有效途径之一。
现代农田生态系统是主要的温室气体排放源，尤其是近年来CH4和N2O的排放量增加更是主要来源于现代农业生产活动[53]，而有机农业鼓励系统内的资源循环利用，减少了内部资源的浪费和外部资源的消耗，进而减少了温室气体的排放，改善了大气环境状况。在一项针对丹麦农业的研究中发现，如果将丹麦所有的农业用地全部转换成有机农业，则农业体系中的能量消耗和氮流通的减少可使丹麦全国温室气体渊CO2、CH4和N2O冤的排放量相应减少13%耀38%[54]。综合可知，有机农业可以不断改善农业生产环境，保护农业耕作范围内的土壤、水体和大气环境，尤其是在生态环境处于亚健康的地区发展有机农业还能够有效地减轻农业面源污染，加快地区生态环境的恢复，促进有机农业的可持续发展。
3结语
微生物多样性研究范文4
关键词：变性梯度凝胶电泳；微生物实验；实验教学改革
中图分类号：G462 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2013）39-0247-02
微生物学是高等院校生物类专业的一门重要专业基础课，是一门实验性和应用性很强的学科。微生物学实验是微生物学的重要组成部分，是现代生物学技术的重要基础，对于学生加深理论知识的理解，培养创新与实践能力具有非常重要的作用[1]。传统的微生物实验教学内容一般以验证性和演示性为主，注重培养学生的基本实验技能，但对学生综合实验技能和创新能力的培养有待提高。随着国家对创新人才的需求，适当增加综合性和研究性实验内容的比重是微生物实验教学改革的发展方向，对于提高学生的思维能力、动手能力有着积极的作用[1-3]。
本校非常重视实验教学改革工作，鼓励学生在掌握基本实验技能后，积极参加设计性、研究性实验，包括院校两级的大学生科研立项或教师的研究课题，并给予相应的创新学分。通过该项措施进一步激发了学生的学习兴趣，并有效提高了学生的实验技能及分析问题和解决问题的能力。目前微生物实验教学主要包括传统的微生物实验技术，随着分子生物技术的发展，微生物研究技术突破了以往主要依赖纯培养物的局限性，特别是在生态环境样品中的微生物群落结构分析中，基于PCR扩增的分子生物学方法逐渐取代了传统的培养方法，大大拓展了微生物研究的范围[4]。因此，我们在后续的研究性实验中引入了变性梯度凝胶电泳在微生物群落结构分析中的应用等创新型实验项目，使实验教学从基础性向综合性和研究性推进。
一、变性梯度凝胶电泳（DGGE）技术概述
由于自然环境中微生物生存条件的复杂性，大多数微生物以未可培养的形式存在。DGGE是一种不依赖微生物培养技术的研究方法，能快速、准确鉴定环境中微生物种群，在揭示复杂微生物群落演替规律和功能基因多样性方面具有独特的优越性，已被广泛应用于微生物分子生态学研究各领域[5]。DGGE技术的基本原理是在聚丙烯酰胺凝胶的基础上，加入呈梯度分布的变性剂（甲酰胺及尿素），双链DNA分子部分解链导致电泳迁移率降低，而序列不同的DNA分子解链行为不同，在凝胶中的移动速度也就不同，从而使得长度相同而序列不同的DN段分离。因此，通过测序分析凝胶上不同的谱带，可以检测微生物种群的遗传多样性和动态变化[6]。DGGE技术的工作流程主要包括以下几个步骤：（1）环境样品的采集；（2）样品中微生物基因组DNA的提取；（3）DN段的PCR扩增；（4）PCR产物的DGGE分析；（5）DNA条带的序列分析。
二、变性梯度凝胶电泳技术在微生物实验教学中的应用
变性梯度凝胶电泳技术是一项综合性较强的实验技术，涉及的知识面较广，要求学生既要有全面扎实的理论知识，又要求较强的实际动手能力。我校的微生物学实验安排在大学二年级的上学期，通过学习使学生掌握微生物学实验的基本原理和操作技术。此外通过后续的生化分析技术和分子生物学实验等课程，学生掌握了聚丙烯酰胺凝胶电泳、基因组提取和PCR扩增等实验技术。因此该项研究性实验项目主要面向大学二年级和三年级的学生，我们为学生提供开放的实验室环境，学生自己组成实验小组，可根据自己的实际情况安排时间。整个实验由学生实验小组开展并完成，同时在实施过程中配备指导教师进行随时指导。根据学生的学习兴趣并结合实验室的科研课题，我们近几年开设了多项DGGE技术在微生物研究中应用的实验，包括《氯嘧磺隆对土壤微生物类群的影响》、《SBR反应器中聚磷菌群的结构分析》、《不同森林土壤中产漆酶细菌群落结构的研究》和《厌氧污泥对偶氮废水的脱色及污泥菌群结构分析》等研究性实验项目。环境样品中DNA的提取是影响微生物多样性的DGGE检测结果的重要因素[7]，学生通过比较不同提取方法对DNA产量和纯度的影响，确定了针对不同的实验样品（土壤或污泥）的最佳提取方法，在这一过程中加深了对DNA提取原理和方法的认识。通过DGGE图谱的分析，学生可以直观地了解到污染胁迫等环境条件下微生物群落结构的改变及优势菌群形成的动态过程，更加深刻地理解富集培养技术在分离特定功能微生物上的应用。学生通过后续的序列比对分析，可以学习到相关环境中常见的微生物优势菌属，特别是一些非培养微生物序列的出现丰富了学生对微生物多样性的认识。通常面向本科生开设的微生物实验主要以好氧微生物为对象，因此学生接受的微生物学知识侧重于好氧微生物，对厌氧微生物的接触和认识较少。我们通过引入厌氧环境中微生物结构分析等实验项目，使学生有机会接触厌氧箱的使用，掌握厌氧微生物的培养方法等实验内容，进一步丰富实验教学内容，深化实验教学改革。
三、小结
分子生物学技术的发展，展示了一个更为丰富的微生物世界。与目前基于高通量测序的微生物多样性分析方法相比，DGGE技术具有快捷、方便、成本低等优点，适合应用于微生物创新实验教学。通过这些研究性实验的开展，使学生完成无法在正常教学时间进行的实验内容，拓展了与其他学科实验技术的综合应用，在激发学生学习兴趣的同时，不仅提升了学生的实验操作技能和团队协作能力，而且增强了综合思考及分析解决问题的能力，为独立完成毕业论文实验及今后从事科研工作打下了坚实的基础[8]。
参考文献：
[1]张萍华，蒋冬花.微生物学创新实验教学体系的构建与实践[J].微生物学杂志，2013，32（3）：107-109.
[2]袁生，徐旭士，戴传超，何伟，张茵，尚广东，戴亦军.微生物学实验课程的改革与实践[J].高等理科教育，2012，（2）：138-140.
[3]贾艳萍，张兰河，马姣.立足学科发展的微生物学实验教学改革研究[J].实验技术与管理，2012，29（12）：26-32.
[4]李晓然，吕毅，宫路路，柳陈坚.微生物分子生态学发展历史及研究现状[J].中国微生态学杂志，2012，24（4）：366-369.
[5]李琬，李景鹏.分子生物学技术在堆肥微生态研究中的应用研究进展[J].中国农学通报，2012，28（18）：20-25.
[6]王洋清，杨，李勇.DGGE技术在森林土壤微生物多样性研究中的应用[J].生物技术通报，2011，（5）：75-79.
[7]高慧琴，刘凌.PCR-DGGE技术中不同DNA提取方法综述[J].安徽农业科学，2011，39（1）：52，102.
[8]高健，周建良，蒋本桂，张洁.普通微生物实验教学全面开放理论的建构[J].当代教育理论与实践，2012，4（3）：113-114.
微生物多样性研究范文5
[关键词] 马铃薯 连作栽培 土壤微生物 生物多样性 影响
[中图分类号] S435.32 [文献标识码] A [文章编号] 1003-1650（2017）05-0040-01
近年来，甘肃省临夏州临夏县把推广脱毒马铃薯新品种作为培育和发展壮大洋芋产业，促进农民增收 的一项主要措施，加强领导，加大投入，狠抓培训和技术指导，种植规模不断扩大，发展进程不断加快，临夏县农技中心针对全县洋芋品种出现的种性退化、块茎畸形现象以及马铃薯连续种植几年后常出现植株矮化、丛生、长势弱，叶片皱缩、变小、变脆或出现环斑条斑，叶子易脱落和全株枯死等实际问题，认真开展了调查。通过调查分析，找出了马铃薯种性退化的主要原因是受多种传染性病菌、病毒侵害所致。尽管更新品种对临夏县马铃薯产生积极促进作用，但是马铃薯连作问题如果得不到解决，将会严重影响到地区马铃薯种植产业的健康发展。
1 实验材料和方法
本次实验选择在麻尼寺乡进行，年降水为400mm左右，年平均气温在7度左右，供试土壤为黑垆土，其中连作0年、2年、5年和10年的土壤理化指标如表1所示。
1.2 试验设计
本次实验从2014年开始，在不同连作时间的地块中种植马铃薯，连作0年为对照组，连作2年、5 年和10年为试验组，马铃薯品种为陇薯3号，小区面积为9*25m，重复三次，马铃薯株行距为35*40cm。从实验开始，除了种植地连作年限不同之外，其他栽培条件均保持一致。在2016年马铃薯盛花期，取每个处理区域是马铃薯根部底层5cm以下的土壤，样品分成两份，一份进行土壤微生物分析，一份进行土壤AM真菌鉴定。其中土壤微生物分析采用平板计数法进行分析，细菌、放线菌和真菌培养分别采用牛肉膏蛋白胨培养基、高氏一号培养基和PDA培养基培养[1]。土壤微生物多样性采用Biolog Eco板测定，严格按照操作要求进行处理[2]。土壤AM真菌鉴定采用某种属孢子数和该地区土壤AM真菌孢子总数的比值进行计算。使用EXCEl2007软件进行数据收集并制作表格，使用DPS7.05进行方差分析，用Canoco4.5进行多元化分析。
2 Y果
2.1 马铃薯连作栽培对土壤微生物群落结构的影响
通过对表2数据进行分析发现，连作0年种植马铃薯土壤明显具有较高的总菌落数，而连作10之后，土壤中的微生物呈现下降趋势，各个处理区域的细菌数量表现为随着连作年限的增加，微生物数量总体呈现下降趋势。连作5年和10年之后，相对于连作0年的，土壤中微生物数量呈现明显下降趋势，但是之间的差异性不明显。由此可以看出去，随着连作时间的增长，连作会显著改变马铃薯根部土壤微生物的多样性，其中真菌、放线菌的群落结构数量变化最大。马铃薯长期连作容易形成单一的土壤环境，这种土壤环境有利于真菌和放线菌的生长，生长过程中产生大量化学物质，抑制细菌的繁殖，从而导致细菌数量下降。详细情况见表2所示。
2.2 马铃薯连作栽培条件下AM真菌多样性变化
通过对表3数据分析发现，AM真菌相对多度和出现频率随着连作年限的增加而呈现先上升后下降的趋势，连作5年后达到最高值，其中球囊霉属相对多度表现为连作5年>连作2年>连作10年>连作0年。其他菌属也表现为相同的规律。各种优势菌种也随着连作年限的增加而出现变化。由此可以看出，连作会显著影响AM真菌多样性变化，随着年限的增加真菌多样行减弱。真菌优势种群的变化直接影响到土壤微生物群落结构的变化。详细情况如表3所示。
3 结论
微生物在很大程度上会影响到土壤和植物的作用过程，对土壤结构的形成发育、有机物质的循环利用和土壤肥力会产生深远的影响。本次研究发现，随着连作时间的增长，马铃薯根部土壤的环境会发生变化，微生物的结构群路组成失调，土壤中细菌受到抑制，真菌数量增加，在这样环境下土壤肥力会持续下降。微生物群落是土壤生态系统的重要组成部分，结构复杂。土壤环境条件改变，导致土壤养分、微生物结构和功能多样性变化在很大程度上影响了AM真菌的多样性。
总之，持续连作影响到土壤根部真菌、细菌和放线菌数量，真菌群落中AM真菌种群的多样性受连作影响持续下降，优势种群发生改变，造成土壤微生物群落结构和功能出现变化，结构失调。
参考文献
微生物多样性研究范文6
1微生物指标监测湖泊环境的研究现状
在现阶段的环境评价中微生物指标已经得到广泛的应用。侯春良在唐海湿地生态系统服务功能价值评估和保护研究中表明微生物参与环境的净化,通过微生物的代谢和相互作用调控环境中氮磷浓度,有效降解有机物的浓度[3];丁忠良在黑龙江省湿地生态环境监测指标讨论中,指出微生物的指标包括微生物的种群分布、数量、季节变化、总数、酶类与活性等参数评价湿地的生物多样性具有客观性、实效性,微生物其生长繁殖速度快、适应能力强,所以这样的评估方式更能直观快速的反应湖体的变化[4];杨永兴在研究湖泊的特点时说明在水域变化的过程中有着适应不同变化的微生物群体,伴随这水域环境的变化微生物有这明显的潜育化过程[5]。
2微生物指标在分子水平上的研究
由于自然界中99％的微生物在目前的培养技术下还不能被培养[6],这就极大的限制了人们对微生物种类和数量的认识和了解,但目前分子生物学如16SrDNA技术、变性梯度凝胶电泳技术、宏基因组文库技术等,以及生物信息学应用于极大的促进了人们对于微生物遗传多样性及微生物种群和功能的认知。
PCR-RADP是采用对某一特定基因的非特异性的引物来扩增某些片断,操作简便,引物实用性广,对于结果准确性要求比较不高以及亲缘关系近的种属有较高的可信度。SSCP技术基因指纹技术(geneticfingerprinting)是近年来在微生物群落监测中的应用中迅速崛起的用于分析微生物群落的结构、动态等特征的技术,该技术不需要对微生物进行培养。rRNA基因同源分析方法是多种分子生物学技术的组合,它通过对微生物的rRNA进行分析揭示微生物的多样性是微生物分子生态学的重要方法,目前已经取得了大量的成果。
