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土壤灭菌的方法范文1
关键词：菌核；真菌；抑菌性；实验
中图分类号：S6 文献标识码：A文章编号：1672-3198（2011）05-0289-01
油菜菌核病又称菌核软腐病,俗称白杆、空杆、麻杆、烂杆、霉蔸等,是由油菜菌核病菌引起的一种真菌性病害。防治主要采用农业防治、化学防治等综合防治的方法,虽然对生物防治的研究报道较多,但大部分研究结果仍然停留在实验室阶段,对于利用生防细菌防治的研究主要为筛选试验,对其防病机理缺乏深入研究。本实验取样于不同油菜地的土壤进行病原物的分离与鉴定,弄清楚油菜地常见的几种真菌及其抑菌性,对于防治油菜相关病害很有意义。
1 实验内容
采集油菜地的土壤进行真菌分离纯化,通过实验结果分析对比它们之间的真菌种类有什么大同小异,分离出的真菌对油菜的生长有什么样的影响,有没有使油菜致病。
1.1 实验过程
（1）样本采集：采用五点采样法分别采集刚收获过后的菜地和表层1～35 cm深度范围内的土壤样品,充分混匀后取定量土壤样品制备土壤悬浮液。
（2）土壤悬浮液的制备：称取10g土壤置于盛有90mL无菌水的250 mL灭菌三角瓶内,充分振荡10min,制成10-1的稀释液,然后进行10倍倍比稀释至10-3。
（3）土壤真菌的分离：
①制备加有氯霉素和孟加拉红的马丁琼脂培养基。
②用稀释平板法,此种方法在土壤真菌分离中最常用,用无菌水将土壤稀释后得到的悬浮液,将一定量稀释悬浮液均匀涂抹于培养基上,菌落长成后,将单个菌落挑出。
③培养：将接种土壤浮液的平板倒置于28°的温度区培养3-5天。
④挑菌纯化：从长有单菌落的平板中选取菌落转接斜面。
（4）真菌鉴定：真菌培养基采用马铃薯葡萄糖培养基。
①制备平板：将15-20毫升溶化后冷却到50度左右的培养基倒入培养皿中。
②接种：在培养基表面划线接种。
③倒置平板：于最适温度下培养1-2天。
④观察菌落的形状、大小、边缘、表面、隆起形状、透明度及培养基的颜色等。
1.2 需重点研究的关键问题及解决思路
设4个处理：（1）土壤未灭菌与菌核表面消毒；（2）土壤未灭菌与菌核表面未消毒；①土壤灭菌与菌核表面未消毒；②土壤灭菌与菌核表面消毒。
孟加拉红琼脂培养基对于计数来说最常用,松膏培养基可兼顾计数、分离和鉴定,适用于大多数土壤真菌和植物病原真菌的分离,尤其适宜于木生真菌的分离,并且孢子与菌落同步形成,菌落不扩展,可获得较好的测数结果,是一种用途广泛的培养基。土壤真菌中,无性态真菌（半知菌）占很大比重。无性态真菌中又以丝孢纲真菌所占份额最大。由于基本上无法通过生殖隔离试验来测定无性态真菌成员之间的亲缘关系,在培养过程中,观察真菌的形态特征和性状,如菌落的颜色、分生孢子的形态和菌丝的颜色等。查看文献从中学习,思考每次的方案。
1.3 实验主要设备、仪器及药品
（1）设备、仪器。
天平,烧杯,电炉,试管,三角瓶,棉花,橡皮圈,标签纸,量筒,灭菌吸管,玻璃棒,镊子,漏斗,分装漏斗架,显微镜,玻片等。
（2）药品。
葡萄糖,蛋白胨,1/3000孟加拉红水溶液,链霉素,琼脂,KH2PO4,MgSO4.7H2O,等。
2 结果与分析
从未灭菌土壤与表面消毒菌核、未灭菌土壤与表面未消毒菌核这两个处理中从油菜菌核表面分别分离到4株和3株不同种类的真菌；其它两处理未能诱捕到任何真菌,表明以上真菌来自土壤而非菌核。7株菌株纯化后回接到表面消毒的菌核上。20d时从土壤中取出菌核,少数菌核破碎,大多数菌核变软,表面长有大量孢子,显示已经被分解。经鉴定,这三个菌株分别属于短帚霉、哈茨木霉菌和棘孢曲霉。
3 小结与讨论
本试验研究表明,短帚霉、哈茨木霉菌、棘孢曲霉（Aspergillus aculeatus）Asp－1对油菜菌核萌发有较强的抑制作用,致死率均在78%以上。木霉菌作为生防菌已有很多的报道,木霉菌生防作用的生化机制主要包括:代谢几丁质酶、β-1,3-葡聚糖酶、蛋白酶等多种胞外酶,强烈水解植物病原真菌的细胞壁,抑制病原菌生长与繁殖。但曲霉作为生防菌尚未见报道。将三述的三种真菌用于制作生防制剂,有助于肥田,提高土壤的活性,对保护农业环境和提高食品安全很有效果,生物防治前景广阔。
参考文献
［1］陈天寿.微生物培养基的制造与应用［M］.北京:中国农业出版社,1995.
［2］中国科学院南京土壤研究所微生物室.土壤微生物研究法 ［M］.北京:科学出版社,1985.
［3］周德庆.微生物学教程［M］.北京：高等教育出版社,2007.
土壤灭菌的方法范文2
1.药剂消毒法。在夏季闲茬时期，在未揭棚膜的情况下对栽培地块或苗床土壤进行消毒；首先将土壤翻松后，用40%甲醛稀释100倍均匀的喷洒土壤上，然后将所喷过药的土壤重新深翻后使药土均匀混合，用废旧薄膜全部覆盖后密闭温室45天，然后揭去薄膜并再次松动土壤，打开通风口通风，15天后即可进行播种或栽植。
2.高温消毒法。在春茬蔬菜拉秧后，把病株残体清除到室外集体烧毁。清洁温室后，若将土壤呈酸性，则施如少量的生石灰，若将土壤呈碱性，需加入碎稻草或麦秸500千克，再混入牲畜粪后深埋土壤50厘米然后开沟，沟内注入大水至沟满，在太阳下密闭暴晒15～50天，使10厘米土壤内温度在50～60℃，可有效防线虫病、枯萎病、青枯病、软腐病等。
二、种子消毒
播种前对种子进行消毒。主要有温汤浸种，药剂消毒和干热消毒。有效杀死种子表面的病菌。其中干热消毒法对种子进行消毒处理是消灭种皮带菌的最好方法，利用夏季高温季节对种子进行充分的晾晒，也属于干热消毒的一种。具体做法为：在播种前35天左右，选择晴天将种子平摊于温室中干净的播种盆或纸盆中，在高温条件下予以20天左右的充分晾晒，晾晒后放于恒温箱再进行干热消毒以此来消毒种子表皮的细菌、病毒。
三、棚室灭菌
1.烟剂熏蒸防治。通过点燃烟剂农药，使烟剂中的农药有效成分受热气化，遇冷形成微小颗粒，沉降于蔬菜作物表面进行杀虫灭菌。烟剂使用省工省时，不受天气影响，一般分两个时期进行：一是在蔬菜作物定植前或播种前施用；二是在蔬菜作物生长期进行施用。主要有硫黄烟剂、百菌清烟剂、速克灵烟剂、杀虫烟剂等种类。如：秋冬茬素菜育苗前一周，可用硫黄粉熏蒸消毒的方法对温室空间和农具进行消毒。具体方法：每667平方米用硫黄粉1千克加锯末混合，拌匀后分防在温室各点，暗火点燃密闭温室熏蒸12h，或用45%百菌清烟雾剂每亩用药1千克熏蒸温室，熏蒸后仍密闭温室7～10天灭菌消毒，定植或播种前1～2天打开通风口通风。
2.粉尘剂施药防治。通过喷粉器把粉尘剂农药喷到空中，其农药微粒再沉降到蔬菜作物表面进行杀虫杀菌。其与烟剂熏蒸区别就是即使棚室封闭不严也可进行，其防治效果可比常规喷雾施药提高防效40%以上。
土壤灭菌的方法范文3
关键词 鸡腿菇；木薯酒精废渣；栽培技术
中图分类号 S646 文献标识码 B 文章编号 1007-5739（2013）02-0117-01
鸡腿菇又名鸡腿蘑，因其外形似鸡腿，肉质肉味似鸡丝而得此名，被誉为“菌中新秀”。分析表明，鸡腿菇鲜菇水分含量为92.2%；每100 g干菇中含粗蛋白、脂肪、总糖、纤维、灰分分别为25.4、3.3、58.8、7.3、12.5 g；鸡腿菇含有20种氨基酸，其中包括8种人体必需的氨基酸。营养丰富，可炖食、炒食、煲汤，市场前景广阔，深受菇农喜爱。
广西已成为我国最大的木薯种植省区，其木薯酒精产量变性淀粉、山梨醇等产量均居全国前列。木薯酒精废渣是一种良好的适合鸡腿菇栽培的原料，其含有粗蛋白15.13%、粗纤维49.62%。解决木薯淀粉加工企业大量木薯酒精废渣对环境的污染，是当前亟需解决的问题。利用木薯酒精废渣栽培鸡腿菇既降低了生产成本，又可变废为宝[1-2]。配以适当的原料，鸡腿菇的转化率可达到100%以上。能够有效延伸木薯产业链，促进广西地区木薯产业的发展，又能够解决鸡腿菇生产用料与林业资源保护的矛盾，还可以提高鸡腿菇产量，创造更高的经济效益，具有明显的社会效益、经济效益与生态效益。
1 季节选择
鸡腿菇属中温型菌类，出菇温度15～28 ℃，可利用拱棚、大棚等栽培。一般春季、秋季分别在1月初至3月初、8月初至9月底栽培。
2 栽培场地的选择与处理
场地可以因地制宜，可利用林场、休闲田整畦搭棚、果园、屋房以及室外小搭棚、冬暖式大棚等栽培鸡腿菇。在栽培前4～6 d，将棚内地面清理干净、整平，灌足1次水，同时要进行消毒处理，喷洒5%甲醛溶液杀菌，用量为25 g/m2；喷洒稀释800倍的辛硫磷杀虫剂，用量为15 g/m2。
3 原料的处理
木薯酒精废渣取自广西北海中粮酒精厂，系木薯酒精废液经离心压滤干燥后获得。运回场地后，用粉碎机粉碎备用。
4 配方
木薯酒精废渣50%，棉籽壳30%，麸皮8%，石灰8%，石膏2%，过磷酸钙1%，碳酸氢铵1%[3]。木薯酒精废渣堆料时使得原料酸度较大，调配时需将pH值调至9～10。
5 配料与装袋
原料按配方准备好后，将石灰、石膏、碳酸氢铵直接拌入木薯酒精废渣中，然后与棉籽壳充分拌匀，加水混合时注意控制木薯酒精废渣的黏稠度，含水量达到50%后即可停止加水。堆积5～8 h进行装袋。菌袋采用常规的22 cm或23 cm聚乙烯菌袋，装袋要求松紧适当，在有些地方也可以让其培养料自然发酵，以利于含水量均匀，培养料更加松软，便于装袋。
6 灭菌
将装袋完毕的菌袋迅速地放入灭菌锅内进行灭菌，料袋装锅时要留一定的空隙，便于空气的流通，一般常压灭菌达到100 ℃后，保持10 h，中途不可降温熄火[4]。
7 接种发菌
将灭菌后的培养袋移入经过消毒灭菌的接种室，让其自然冷却，当菌袋温度降到30 ℃以下进行接种。接种可采用一头接或两头接的方法，为促进菌丝较快生长，采取两头接种的方法。发菌时，用层架安置菌袋并堆码成“井”字形。还要随时注意发菌室的温度，及时检查，每隔2 d要开窗进行适当的通风透气，以利于菌丝的快速生长，一般情况下菌丝40 d即可长满菌袋。
8 脱袋覆土
菌丝长满菌袋后还要再过几天的后熟，才可脱去塑料袋，覆土进行出菇管理。覆土前，先将栽培场地打扫干净，用消毒剂和杀虫剂彻底地消毒和杀虫后再将菌袋搬入栽培场。用地膜铺设宽1.2～1.3 m、长5～6 m的地块，用火砖掀起固定膜边，即围成菇床[5-7]。撒适量石灰或草木灰后，把后熟期的菌棒脱袋，横或竖卧于床内，要求排放均匀，菌棒之间尽量不留空隙。然后覆4 cm厚的经灭菌、杀虫、堆制的菜园土，重喷1次水，再补土修整床面即可。
9 出菇管理
经过10 d的培养，菌丝从覆土层长出，此时要求通风量减少，同时注意湿度管理，采取菇蕾禁喷、空间勤喷、幼菇酌喷、成菇轻喷的原则，从而使鸡腿菇出菇期间的温度、湿度分别达到13～26 ℃、85%。
10 采收
采收在鸡腿菇子实体7成熟时进行最好，由于菌盖还紧包菌柄，产量和质量较好。采收时用手捏住基部左右转动后轻轻拔出，不要带出基部土壤。采收后对床面的老化菌根、残菇进行清理，为使土壤湿润，向床面喷水1～2次/d。用此法培植鸡腿菇，一般可采收4～5茬，生物转化率在100%左右。
11 加工与销售
在鸡腿菇栽培规模较小时，以新鲜出销为主要销售方式。鸡腿菇易出现腐烂、破碎，保鲜时间较短，为提高产出，采收后应尽快销售。对于销售市场较远的鸡腿菇栽植地，可将鸡腿菇的菇蕾切成薄片、碎块，用电热鼓风干燥机脱水烘干，每120～180 g分装于包装袋中。
12 参考文献
[1] 万四新，赵启光，常艳丽，等.鸡腿菇不同培养料配方栽培比较试验[J].安徽农业科学，2006（22）：5820-5821.
[2] 王尚堃，于醒.鸡腿菇塑料大棚栽培培养料配方对比试验[J].长江蔬菜，2009（18）：51-52.
[3] 王尚堃，米青山，秦新建，等.鸡腿菇两种栽培方式产量与效益的比较[J].中国蔬菜，2004（6）：31-32.
[4] 姜秀云，邱成书，王娟，等.鸡腿菇高产栽培技术初步探索[J].中国食用菌，2011（4）：26-28.
[5] 林如海.提高鸡腿菇产量的栽培方法探讨[J].宁德师专学报：自然科学版，2005（3）：277-279.
土壤灭菌的方法范文4
关键词：多肉植物；养护管理；注意事项
一、浇水
多肉植物浇水的一般的原则就是“见干见湿”。“见干”就是指上一次浇水后土里的水分消失，但也不能干透。可以用手指或牙签来检查干湿程度。如果只是表土干而底层湿润时，就不宜浇水。“见湿”就是指浇水要浇透，土不能上湿下干。因为植物根系位于底部，如果只是上层土湿润，根本不能供给植物利用。因此浇水要浇透。浇水可以选择直接浇灌，也可以选择浸盆的方式。浸盆的好处就是浇的水一定能保证根系吸收，既满足了植物生长所需的水分，还不易造成土壤板结，满足透气性。浇水的时间也有限制。禁止在阳光强烈的中午浇水。浇水的最佳时间为下午的6～8点，浇水后应当放置在通风良好的地方进行管理。
二、施肥
多肉植物其实是可以不施肥的，它们可以从土壤中汲取养分，还可以进行光合作用，所谓“万物生长靠天气”，环境好，多肉自然也就长得好。想要多肉长得更加健壮，可以进行施肥。肥料大致分三种：氮肥、磷肥和钾肥。其中氮肥以促进植物枝叶生长为主，磷肥可以促进开花结果，而钾肥的主要作用是促进根茎健壮。因此在购买时要看清成分。
多肉植物在上盆前需要在盆底放上缓效花肥就可以作为基肥了。除此之外，多肉还可以考虑追肥。对于一些生长旺盛的多肉如仙人掌和仙人球等就需要薄肥勤施。但是对于生长缓慢的品种就基本不需要施肥了。还有就是植物开花的时候需要施肥。由于植物开花需要消耗大量的营养，如果植物吸收到的营养不足以支持开花，就会消耗自身的营养。消耗自身的营养后就会使植株瘦弱，状态差。因此在多肉开花时就要使用一些肥料，供给植物开花。常见的花肥主要有：花友等专业花肥，还可以直接施用稀释后的磷酸二氢钾来补充磷肥和钾肥，效果都很不错。
三、除虫杀菌
多肉植物的叶片鲜嫩，人们十分喜爱。然而虫子和病菌也很喜欢，因此在养多肉的过程中还需要进行除虫杀菌。常见的虫害主要有粉虱、介壳虫、红蜘蛛和小黑飞等。它们有的通过吸食多肉的叶片存活，例如红蜘蛛，介壳虫。还有的幼虫危害多肉植物的根系，如小黑飞的幼虫对多肉的根系危害极大。在害虫少或者刚刚开始时尽量不用药剂除虫，可以手动去除。如果发现害虫数量多，可以使用一些除虫药物，例如土虫丹，呋喃丹，小绿药等，将它们拌人土中，可以起到除虫防虫的作用。当多肉植物受到菌类侵染时就会造成腐烂，直至整株死亡。防止菌类危害需要对土壤进行灭菌处理，物理方法可以在种植前进行高温杀菌或直接在太阳下暴晒。在种植植物后，可以使用药物灭菌的方法。常用的灭菌药物有多菌灵，百菌清和甲基硫菌灵等，进行稀释后喷洒或浇灌在土中进行杀菌，效果都可以起到灭菌的作用。
四、换盆换土
多肉植物在生长过程中会长大和分头，因此就需要进行换土和换盆。盆的选择上以透气性好为主，透气性好的花盆有利于植物根系呼吸，防止烂根。花盆美观也是重要的因素。美丽的多肉植物再配上美观的花盆才更加恰当。
五、多肉植物的休眠与养护
根据多肉植物的不同的生态习性，可将它们分成春秋型、冬型和夏型。春秋型即指春秋生长而夏季和冬季休眠的多肉；冬型，即为冬天生长夏季休眠的多肉；夏型，即是夏季生长冬天休眠。根据它们休眠的时间不同，养护要点也不同。
土壤灭菌的方法范文5
关键词：灵芝；栽培技术；拉萨地区
中图分类号：S56731文献标识码：A
灵芝（Ganoderma lucidum）被誉为“仙草”，现代研究表明具有抗病毒、抗氧化、抗肿瘤、镇静等多种生理活性和药理作用。灵芝菌丝喜偏酸环境，最适pH值为60左右，最佳温度为25℃左右，子实体生长最佳空气相对湿度为80%左右。近年来，拉萨地区阳光温室大力建设为灵芝在该地区的人工栽培创造了良好条件，4月中旬白天温室内可达到25℃，室内温度可达18℃，通过实验室和阳光温室互补使用可有效提高灵芝栽培成功率；拉萨地区干燥日照时间长蒸发量大，因此在温室内应配备小拱棚及水幕带，而在实验室可用加湿器保持空气相对湿度；可充分利用拉萨地区木材加工厂及农业生产下脚料配制培养料，配制培养料时加入适量石膏或生石灰粉灭菌后呈弱碱性，随着菌丝生长时有机酸积累会逐渐中和碱性最终达到最佳pH值，而弱碱性培养料还可抑杂菌生长，保证灵芝栽培高产。
1菌种制备
11母种制备
一般为组织培养也就是切取部分新鲜灵芝子实体组织，用75%酒精或01%高锰酸钾水溶液浸泡15min消毒，如果组织块漂浮，可用火焰灼烧消毒过的镊子将其压入消毒液中；用无菌操作法将其切成花生粒大小的小块，并接种土豆葡萄糖琼脂平板培养基上，或接种在土豆葡萄糖琼脂试管斜面培养基上；放置于培养箱25℃避光培养3～4d有白色菌丝生长。为防止杂菌污染需及时进行分离培养，用接种针等工具挑取纯净菌丝接种于新培养基中，培养约1周，观察无杂菌生长，菌丝干净洁白即可作为灵芝母种。如果分离效果不理想，可再次分离培养。
12原种制备
将母种接种于新的培养基中扩大培养，即为原种。一般1支试管斜面母种可接种20～30支试管斜面原种，琼脂平板转接扩繁量相当。放置于培养箱25℃避光培养至菌丝长满斜面或平板。
母种和原种培养基配方一致，配制1L如：马铃薯（去皮）500g切片，水煮至绵软，过滤所得液体备用，加葡萄糖20g，磷酸二氢钾10g，硫酸镁10g，维生素B1约005g（口服维生素B1约1片），用氢氧化钾调节pH值至65～75，最后加入20g琼脂粉搅匀。115℃或121℃，015MPa，灭菌15～30min备用。
此外，还可购买商品培养基如马铃薯葡萄糖琼脂培养基，来进行培养。菌种制备方面，如果没有条件，可向专业机构购买品质好的灵芝母种或原种使用。
13栽培种的制备
培养基配方可因地制宜的选用农林业下脚料。实验室选用的培养基配方为：阔叶树木屑70%，青稞粉20%，玉米（粉碎）5%，葡萄糖2%，磷酸二氢钾1%，硫酸镁1%，维生素B1约001%，加水搅拌均匀，用1%石膏或生石灰调pH至65～75，水分则以手握紧成团指缝间无水滴下为宜。用菌种瓶或菌种袋分装，115℃或121℃，015MPa，灭菌15～30min备用。将原种接种于其中，25℃避光培养至菌丝长满菌种瓶或菌种袋即成栽培种。
如果培养时没有培养箱，则可选用干净且保暖好的房间培养，可加装加热保温装置缩短培养周期。如果接种时没有超净工作台，可用自制简易工作台进行接种，但要注意无菌操作；接种前需要进行甲醛加高锰酸钾熏蒸或安装杀菌紫外灯消毒，甲醛熏蒸消毒则应等甲醛散尽后工作，紫外灯消毒至少15min后方可使用，操作者的手部要用75%医用酒精消毒，接种工具用酒精灯火焰灼烧消毒。
2灵芝栽培方法――瓶栽
该方法简单易行，且占用空间少。当菌丝长满菌种瓶或菌种袋时，表面可见子实体原基（白色疙瘩状凸起物），打开瓶盖或菌种袋，在培养架上卧放，温度以25℃左右为宜，空气相对湿度则以80%左右为宜，此时子实体将迅速生长。确保温湿度时可适当的通风促进灵芝菌盖生长和喷射担孢子；培养室内可有一定散射光促进子实体生长，光线强度以在培养室内刚能看清报纸为宜。
3灵芝栽培方法――段木培养
31段木的选择
实验室选用拉萨地区易得的青木等硬杂木，在拉萨没有开通暖气之前藏族同胞主要用其烧火取暖。现在选用直径15cm左右的青木，锯成40cm长的木段，无需去皮直接码放干燥。可根据实际栽培场地确定段木长度，以方便操作为原则来确定直径。
32接种与管理
菌种活力从强到弱依次实体原基、母种、原种、栽培种。实验室选用栽培种接种于段木两端。接种前段木需装入两头开口的菌种袋中，扎紧开口（开口中间可放置棉塞以便通气），115℃或121℃，015MPa，灭菌15～30min以备接种。可在相对洁净的房间内进行接种，2人配合，一人打开菌种袋，另一人迅速接种并扎紧开口，同法进行段木另一端接种。将接种好的段木放置于培养箱或培养室内培养，25℃避光培养至菌丝长满段木时，在阳光温室内覆土栽培。拉萨地区适合在4月下旬覆土栽培，如果温室夜间温度过低，可在可在温室内设小拱棚并配以水幕带，保持温度及土壤湿度，待芝蕾长出时，空气湿度须保持在80%左右，可对芝蕾进行适当修剪保证品质，约2个月后芝蕾长成成品灵芝即可采收。
此外，还可用电钻在段木上打孔接种。钻头直径和打孔间距以方便操作为宜，一般选用1cm左右钻头打1cm深的孔；间距一般约25cm，钻孔排列呈三角形。打孔后立即接种入切割好的大小合适的实体原基（1cm2）。接种1个月后可见开孔四周形成棕色菌圈，此时可将段木埋入土壤中覆土栽培，土壤以微酸性为宜。4月前在实验室培养好段木，之后白天拉萨地区阳光温室温度可达25℃左右，便进行覆土栽培。但4～6月昼夜温差仍较大，夜间应注意温室的保温。
段木栽培灵芝可连续采收2～3a，每吨段木可收15kg干品。一茬采收完毕后，及时清除段木表面污物，去除畸形芝，再补充水份，在适宜条件下约1周又可长出芝蕾。拉萨地区温室内段木栽培可采收到10下旬，若在配有保温加热设施的室内栽培可延长1个月。
4病虫害防治
41杂菌
杂菌主要有青霉、曲霉等，无菌操作不严格或高温高湿环境容易造成杂菌污染。防治方法：培养基必须彻底灭菌，严格遵守无菌操作方法；对培养箱或培养室需定期消毒，消毒液可选用新洁尔灭、多菌灵、绿霉净等；在保持温度和湿度时，要加强通风；污染严重的则立即淘汰，污染较轻的可去除污染部分后灭菌补充接种再培养。
42地螨
地螨等害虫可用氯氰菊酯等药物进行杀灭。此外，应当加固温室（或培养室）和放置捕鼠夹等预防鼠害。
5采收
当灵芝子实体菌盖边缘由白色变为褐色，菌盖下的管孔向外喷射孢子时，即可采收。直接采收整个子实体，晾晒或低温（不超过50℃）烘干以防止灵芝中易挥发的有效成分丧失；采收后需及时烘干严防堆焐发霉。充分干燥后（含水量低于10%）放入塑封袋中4℃低温保藏。子实体一般以身干、盖厚、柄壮、质实、色亮且具漆样光泽者为上品。
孢子粉的收集则在子实体下方放置干净的塑料布，用刷子轻轻收集；也可以套袋收集。孢子粉需经干燥才能用塑封袋包装，4℃低温保藏。
参考文献
[1]闫和健.灵芝丰产栽培技术[J].农业技术与装备，2014， 285（05）：61-62.
土壤灭菌的方法范文6
一、实验材料的选择和处理
该实验的目的是使用含有尿素的培养基分离有脲酶的细菌和利用指示剂颜色的变化检知脲酶所催化的反应;实验的内容是从土壤中分离出能利用尿素的细菌，观察菌落数，了解它在生态平衡中的作用，并以LB全营养培养基为对照，观察全营养生长细菌的菌落数。为了获得实验的成功，首先必须正确地选择和处理实验材料。[1]
（一）土样的获取
为了分离到能分解尿素的细菌，需要获取合适的土样。教材中只提到从有哺乳动物排泄物的地方获取，具体的方法并未说明，操作过程中由于实验材料获取不当很容易导致实验的失败。土壤中的微生物数量繁多、种类复杂，在富含有机质的土壤表层，有更多微生物生长。细菌适宜在中性环境的潮湿土壤中生长，且绝大多数分布在距地表约3～8cm的土壤层。因此在土壤取样时，可以从施用人畜粪便的农田等环境中选择肥沃、湿润的土壤，先铲去表层土3cm左右再取样，将样品装入事先准备好的信封中备用。
（二）制备土壤稀释液
教材中只说明了制备土壤稀释液的过程要在无菌条件下进行，实际上土样的称取也应该无菌操作，在超净台上酒精灯火焰旁进行。
在无菌条件下，称取1g土样，加到99mL无菌水的三角瓶中，振荡，即成10-2稀释液，从该稀释液中取0.5mL悬液加到4.5mL无菌水的试管中，经振荡制成10-3 稀释液，再依次制备10-4、10-5土壤稀释液。实验要求每次稀释后都要振荡10min，在实际教学中很难有那么长的时间给学生操作，可以适当缩短振荡时间，混匀即可。
二、尿素固体培养基的配制
该实验中分离以尿素为氮源的微生物所依据的原理是在氮源只有尿素时，这些微生物能利用尿素获得氮源而存活，其他微生物则因为缺乏氮源而死亡，因此尿素固体培养基的配制是本实验的关键。
（一）用琼脂糖代替琼脂
其他版本的教材中配制尿素固体培养基时添加的是琼脂，浙科版教材改为琼脂糖。琼脂在制作固体培养基时可作为凝固剂，但它是一种未被纯化的混合物，里面有一定量的含氮化合物。
琼脂糖是琼脂进一步纯化，去除了含氮化合物后的产物。利用琼脂糖作凝固剂，能防止含氮化合物对实验的干扰，有利于以尿素为氮源的细菌的筛选。
（二）适当降低尿素的浓度
教材中配制尿素培养基时，25mL培养基溶液中是加入了10mL含有2g尿素的尿素溶液，质量分数达到了8%，实验研究发现，经这种培养基培养长出的细菌含量很少，10-2的稀释度下也只是偶尔能看到1个菌落，高的稀释度下更难有结果出现。文献资料表明，尿素可在脲酶的作用下水解成碳酸铵进而生成氨，尿素浓度过高，产生的氨太多会导致培养基pH增大，不利于细菌生长。[2]若尿素浓度过低，产生的氨太少，酚红的显色现象则不明显。
为了确定尿素溶液的最佳比例，笔者配制了不同浓度梯度的尿素溶液进行实验，在25mL培养基溶液中分别加入10mL含有0.25g、0.5g、1g、1.5g、2g尿素的尿素溶液，结果表明，添加0.5g尿素的培养基中细菌生长较多，显色现象较明显。由此可见，适当降低配方中的尿素浓度，有利于实验效果的改善。
（三）尿素溶液的灭菌方法
尿素加热后会分解，因此不能使用高压蒸汽灭菌，一般采用的是过滤除菌法，可以使用G6玻璃漏斗或针头式过滤器过滤。教材中采用的是G6玻璃漏斗过滤的方法。玻璃漏斗使用前要先在121℃下用纸包好灭菌，使用后需要用1mol/L的HCl浸泡，并抽滤去酸，再用蒸馏水洗至洗出液呈中性，干燥后保存，操作起来非常烦琐，且过滤耗时很长。目前实验室中广泛采用的过滤处理装置为针头式过滤器。一次性针头式过滤器可与一次性注射器配套使用，过滤尿素时，一般选择孔径为0.22μm的针头式过滤器。这种方法不需要换膜和清洗滤器，省去了复杂、费时的准备工作，使用起来快速方便。
也可以使用化学灭菌法对尿素灭菌。取麝香草酚结晶一块，在烧杯中用蒸馏水反复洗涤三次，然后置于一定量的尿素溶液中，在冰箱内保存24小时后即可使用。由于麝香草酚对霉菌的抑制力较差，故配好后应在冰箱中保存，以免受到霉菌污染而使尿素失效，同时可以长期使用。这种方法非常简便，效果也较好，在医院中经常使用。
三、稀释涂布分离法的操作
分离以尿素为氮源的微生物需要使用稀释涂布分离的方法，教材中只是简要介绍了稀释涂布的内容和程序，对于移液枪的正确使用和涂布法的操作都没有说明，对于首次使用涂布分离法的学生来说困难很大。
（一）移液枪的使用方法
在设定容量时先通过粗调将容量值迅速调整至接近自己的预想值，再将移液枪横置，水平放置在自己的眼前进行细调，慢慢将容量值调至预想值，从而避免视觉误差。需要特别注意的是，从大值调整到小值时，刚好就行;但从小值调整到大值时，需要调超1/3圈后再返回，这是因为计数器里面有一定的空隙需要弥补。在该过程中，不能将按钮旋出量程，否则会卡住内部机械装置而损坏了移液枪。将移液枪垂直插入枪头中，稍微用力左右微微转动即可使其紧密结合。
在吸取液体之前，应该先预吸取、排放三次，让吸头内壁吸附一层液膜，确保移液的精度和准度。吸液时，先将移液枪排放按钮按至第一停点，再将吸头垂直浸入液面2～4mm以下，然后慢慢松开按钮回原点。放液时，先将按钮按至第一停点排出液体，稍停片刻后，继续按按钮至第二停点吹出残余的液体，最后松开按钮，确保吸头内无残留液体。整个过程应保持慢吸慢放，避免速度太快而产生反冲和气泡，导致移液的体积不准确，同时还要注意是否会有漏气现象。
（二）涂布分离的操作
涂布分离时，若平板不干燥，会影响涂布的效果，有时会因涂布不均匀使某些部位的菌落不能分开，或在培养基上出现一层薄膜。因此涂布前可将制备好的平板预先放在培养箱里培养一段时间，待表面水分蒸发后再进行涂布。取0.1mL 10-4、10-5土壤稀释液加入尿素培养基和全营养LB培养基中，右手持玻璃刮刀平放在培养基表面，将菌液沿同心圆方向轻轻地向外扩展，可以先按一条线轻轻地来回推动，使菌液分布均匀，然后再按其垂直方向来回推动，平板边缘可弧线推动。需要注意的是，涂布完成后不宜立即将培养基倒置，而应先在室温下静置5～l0min，使菌液渗透入培养基内，再将培养基倒置培养。
此外，玻璃刮刀在使用前保存在70%酒精中，使用时先将玻璃刮刀在酒精灯火焰上引燃，待酒精燃尽、火焰熄灭后，先在培养皿盖内侧稍作冷却后再进行涂布。切忌将刚刚灼烧过的玻璃刮刀立即放入酒精中，以免高温引起酒精燃烧，造成危险。更换稀释度时，需要将玻璃刮刀灼烧灭菌并更换玻璃刮刀，若由低浓度向高浓度更换，也可以不更换。因此，建议先进行10-5土壤稀释液的涂布，再进行10-4土壤稀释液的涂布，这样在使用移液枪滴加液体时可以不用换枪头，玻璃刮刀也可以不用更换，省去了许多麻烦。
四、培养时间的调整
该实验中利用酚红作为指示剂检测脲酶所催化的反应，细菌培养时间为24～48h。
酚红是一种酸碱指示剂，显色范围为pH6.4～8.2，酸性条件下显黄色，碱性条件下显红色。细菌培养后，产生的脲酶将尿素分解成氨，从而使酚红由黄变红，从而可以检测出细菌是否已将尿素分解。随着培养时间的延长，红色区域的面积越来越大，据此也可以判断细菌分解尿素能力的强弱。
实验研究发现，在含有酚红的培养基中细菌生长会较缓慢。在没有添加酚红的尿素培养基中，培养24h后即可看到明显的菌落产生;添加了酚红的培养基中，则要到48h后才能看到菌落出现，若要观察到显色反应，时间则更久，至少需要72h，甚至一周左右。因此，建议可以将培养时间相对延长至72h以后，红色也会越来越明显。
五、改进后的实验效果
根据预期的实验结果，有脲酶的细菌菌落周围应出现着色环带，但教材中的实验结果图片只能显示出两种培养基上细菌数量的不同，并没有清楚地看见红色环带，学生很难产生直观的认识。经过反思和改进后，取得了较好的实验效果，如图1所示。
实验结果显示，在相同的稀释度下，全营养培养基中有较多菌落，尿素培养基中只有少量菌落;全营养培养基中菌落种类多样，尿素培养基中菌落种类较单一;有脲酶的细菌菌落周围出现红色环带，菌落较多的尿素培养基逐渐变红。值得注意的是，理论上尿素培养基中分离出的只有以尿素为氮源的细菌，但实际上尿素培养基中分离出的细菌不一定全都是以尿素为氮源的，有些细菌会利用其他微生物代谢的产物为氮源，如尿素分解后产生的氨就可为硝化细菌提供氮源，[3]因此还需要通过进一步的检测确定细菌的种类。
六、小结与反思
“分离以尿素为氮源的微生物”的实验教学不仅有助于学生更深入地认识微生物的利用，拓展生物科技视野，增进对生物科技与社会关系的理解，还有助于提高设计实验、动手操作等科学探究的能力。充分的实验准备和良好的实验效果是提高实验教学有效性、达成教学目标的基本途径和重要手段。
经过改良后的实验方案，既提高了实验的效率，又能取得较好的实验效果，学生们基本都能培养分离得到以尿素为氮源的细菌并观察到红色环带的现象。成功的实验结果更能激发学生学习的兴趣和动力，增强实验的自信心和积极性，提升对生物学科的热爱，有助于知识的意义建构，大大提高了实验教学的有效性。
参考文献：
[1] 李其安.高中生物实验教学中存在的问题及解决策略[J].中学生物学，2012（9）：13-14.
