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细胞研究范文1
体内糖平衡主要由胰岛素(INS)控制，胰岛β细胞可释放INS调节餐后的血糖，也可通过β细胞的增长适应长期的INS需求，如果其中任一环节发生障碍，引起绝对或相对INS缺乏，则可引发糖尿病。有关INS的生物合成和释放调节已进行了广泛的研究，但对于β细胞再生研究直到近年方引起重视。
非INS依赖型糖尿病(NIDDM)发病机理并不十分清楚。但有证据表明：对葡萄糖的刺激反应INS分泌减少和β细胞增长不足易患此病〔1〕，而老年人存在胰岛再生能力低下，可能与糖尿病患病率高有关。Ⅰ型糖尿病是自身免疫引起β细胞损伤，致失代偿，此病初发时常有INS的短期恢复，说明缺损的胰岛细胞竭力满足体内INS的需求。研究β细胞增长的调节将有助于了解糖尿病发病机理，对糖尿病的治疗也将有重要的意义。本文对β细胞增长的难度，如何增长，调节因素等问题的研究做一简要综述。
1 β细胞生长能力与糖尿病
目前常用C57BL/6J小鼠作为研究NIDDM的遗传性糖尿病动物模型，该种系1988年由美国Duke大学培育成功，为单糖尿病遗传基因病鼠。此鼠在正常饲料喂养下不发病，在高脂肪(33%)，高单糖(38%)，低纤维素(＜3%)饲料诱导下，经过4 w(由4周龄开始至8周龄)发病。它与C57BL/KSJ鼠种的胰岛再生能力不同，即用葡萄糖刺激C57BL/6J小鼠胰岛，可增殖的细胞比率较C57BL/KSJ的多一倍。当发病时，C57BL/6J小鼠出现中度糖尿病、INS抵抗、肥胖和胰岛过度增生，C57BL/KSJ的早期症状与前者相似，但随后出现重度糖尿病，体重下降，β细胞破坏及死亡，这些观察表明胰岛素细胞再生能力决定了糖尿病的表现形式，支持人类Ⅱ型糖尿病是多因素致病的遗传观点。
另有证据表明，NIDDM患者的β细胞总量比相应对照组(体重匹配)少〔1〕。有人提出一种假设，认为肥胖者由于外周INS抵抗，β细胞总量应适应性地增加，假如β细胞没有增长，INS产生将不足，便会引发糖尿病。由于胰岛有生产INS的较大贮备，β细胞的适度减少不会引发糖尿病，然而长期持续增加功能负载，致β细胞总量减少，INS释放会逐渐减少。另外，胰岛也存在质的异常，如NIDDM患者血中INS原/INS比值增高，是否通过β细胞的增殖可遮掩质的异常也是今后寄望的研究课题。由此可见，除了INS分泌、抵抗外，还应研究β细胞的生长能力。
β细胞增长能力与Ⅰ型糖尿病的发病关系不大，它主要因自身免疫损伤胰岛，发病初期经历了INS的合成由增多到减少的变化过程，表明胰岛为满足机体对INS的需求进行了再生的努力，因不能充分代偿，必然引发糖尿病。如及时用免疫抑制剂中止β细胞损害，可不致于发生严重的糖尿病症状。由于β细胞可再生的部分有限，此种治疗需在自身免疫损伤β细胞的初期进行。
2 胰岛β细胞的生长
人到成年以后，有些细胞仍然进行着细胞分型，如表皮细胞、血细胞，有的不再进行分裂增殖，如神经细胞，即损伤后不能通过增殖来修复；有些细胞正常时并不进行分裂增殖，但当损伤后，细胞可旺盛地进行分裂，达到修复目的，如肝细胞。胰岛细胞平时也是处于相对静止期，并不分裂，但当损伤后需修复时只有很少一部分细胞可以进行分裂，且随年龄增长，可增殖细胞的部分也逐步减少。
β细胞增殖周期分裂过程同其它细胞相似，由G1期、S期、G2期和M期组成，整个细胞周期时间为14.9 h，平时处于相对稳定的G0期。分析葡萄糖对β细胞增殖的作用，见细胞周期各时期变化与葡萄糖无关，说明葡萄糖是调节部分细胞进入“可增殖部分proliferative compart，PC)”，使之进入细胞循环进行增殖。这与一般的调节机制相同，即进入细胞周期后是由与启始刺激因子不同的一系列调节物调节。用不同刺激条件观察细胞周期，可估计最大PC，即能够再生的部分细胞，胎鼠的胰岛约为10%，到成年时减到不足3%，而剩余大部分胰岛处于不可逆的G0期，不能进行细胞增殖〔5〕。以上研究说明胰岛再生能力受能够再生细胞的存有量和刺激因子的双方约束。
3 β细胞的增长方式〔2，3〕
β细胞的增长包括三方面：由β细胞前体衍变，即增生或化生；β细胞体积增大——肥大，β细胞数目增多——再生。
给正常成年大鼠注射链脲佐菌素(STZ)破坏胰岛，可造成永久性糖尿病模型，而给刚出生的大鼠注射STZ14 d后血糖恢复正常，此时可见管状上皮存在，含有INS的细胞，另外胰岛随胰管的生长而增长，表明胰岛细胞可增生。虽然缺乏β细胞前体的形态标志物，不能直接测定前体，但间接证据表明存在在此过程。
关于β细胞肥大的研究较少，它主要由营养素刺激，适应INS增加的需求，致β细胞体积增大，INS产生增多，但在β细胞生长方面此种方式有限，只是部分质(INS分泌增多)上的修复。
4 β细胞生长的调节因子
4.1 营养素调节 胎儿和新生儿胰岛发育变化较大，尤其是出生后受营养素的刺激，在妊娠20 d前的胎鼠胰岛主要由混合必需氨基酸刺激再生，葡萄糖不起作用，而妊娠末期为对葡萄糖敏感，氨基酸降到次要地位。此种转变似乎是为出生后作准备，何种因子调节此变化尚不清楚。氨基酸的促进作用，可持续到成年，但不再起主导作用〔4〕。
D-葡萄糖、D-甘露糖或混合必需氨基酸由β细胞代谢刺激再生，用甘露庚酮糖抑制葡萄糖代谢，刺激作用消失。不能代谢的糖类，如L-葡萄糖、3-0-甲基葡萄糖或果糖不能促进再生。这些研究表明，β细胞再生与INS合成和释放一样，与刺激物的代谢相关。也有报道游离脂肪酸可促进再生。
4.2 生长因子的调节 现已知体内含有一组多肽生长因子，其结构与激素相似，通过特异性膜受体传递生物学信息，称之为生长因子。根据生长因子产生细胞和支配细胞间的关系，主要有下列三种模式：(1)内分泌型：产生生长因子的细胞分泌出来的生长因子，通过血液携带作用于远处的细胞；(2)旁分泌型：产生生长因子的细胞分泌出来的生长因子作用于邻近的细胞；(3)自分泌型：产生生长因子的细胞所分泌的生长因子作用于细胞本身，其本身有相应的受体〔6〕。
生长调节素或INS样生长因子(IGFs)由生长激素刺激生产和释放，它通过自分泌或旁分泌机制促进局部细胞增殖。鼠胰岛可释放IGFⅠ和IGFⅡ，外源性IGFⅠ和IGFⅡ的加入促进胰岛细胞再生，另外用IGFⅠ抗体可抵消部分生长激素(GH)，促进增殖作用。这些研究表明，IGFs中介了GH促生长作用，INS可与Ⅰ型IGF受体作用促进胰岛再生。
血小板衍生长因子(PDGF)和成纤维细胞生长因子(FGF)对某些细胞的作用，可称为“支配”因子，因它们本身并不进入细胞循环，而是通过其后的“执行”因子，如INS、IGFs或表皮生长因子(EGF)使细胞再生。
4.3 激素的调节 已知生长素(GH)对β细胞再生和INS的合成有促进作用，与此密切相关的催乳素和胎盘催乳素也促进再生，鼠β细胞有催乳素受体，在许多组织GH是通过刺激IGFs的产生和释放而起到促进细胞增殖效应的〔7〕。
胃肠(GI)肽类激素除调节消化器官本身的活动外，还具有促激素和促生长等生理机能。GI肽类中的胃泌素、缩胆囊素、促胰液素和抑胃肽均刺激INS释放。有报道促胰液素和缩胆囊素可促进胰岛素细胞再生，但此方面的研究较少，需进一步证实。
类固醇激素对胰岛作用的研究，体内与体外的实验结果不一致。体内给予糖皮质激素促进β细胞肥大、增殖、血中INS浓度升高；而体外实验为糖皮质激素抑制INS释放和细胞再生，也有报道不抑制，但未证实其促进作用。
4.4 基因的调控 为提高胰岛细胞再生能力，许多学者从基因调控方面进行了探索。大鼠经90%去胰岛术在数周内发生糖尿病，再用DNA修复酶多聚(ADP-核糖)合成酶抑制剂尼克酰胺治疗可诱导胰岛细胞再生，减低糖尿病的发病率。已鉴定其作用是由一种仅在增生的胰岛表达，而正常胰岛不表达的特异再生基因(regenerating gene，Reg gene)所致〔8，9〕，由此生产的Reg蛋白参与β细胞的再生增殖〔10〕。人类Reg基因也已鉴定，其结构同大鼠的相似。另外正常的胰腺泡细胞也可产生Reg蛋白，以前由人体胰石和胰液分离的胰石蛋白(Pancreatic stone protein，PSP)以及由人胰腺分离出的胰线蛋白(Pancreatic thread protein，PTP)均为由Reg基因产生的同一种蛋白〔11，12〕。Reg蛋白的作用可以看作为胰岛β细胞的自分泌型生长因子，最近有人观察到用不同营养因素和激素作用培养的大鼠胰岛细胞，可见β细胞的增殖与Reg基因的表达有相关性〔13〕。用Reg蛋白治疗90%去胰岛大鼠，β细胞增加，血糖显著降低〔14〕。另外Reg蛋白促进离体β细胞核中3H-TdR的掺入增多。这些结果表明，Reg蛋白有望开辟治疗糖尿病的一种新途径。
另外许多其它因子，如cAMP、胰岛素原、糊精、热休克蛋白(Heat shock protein，HSP)和超氧化物歧化酶均有报道与胰岛的修复相关〔3〕。转贴于 参考文献
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细胞研究范文2
1DPSC的定义和基本生物学性质
成牙本质细胞是一种终末细胞，不具备进一步分化的能力，因此，一般认为成牙本质细胞在遭受损伤后，牙髓内的某些具有分化功能的前体细胞可进一步分化为成牙本质细胞，并分泌相关细胞基质，修复受损组织，这种前体细胞即为DPSC。DPSC具有较强的增殖能力和较高的分化潜能，正是这两种生物学性质，决定了DPSC在牙源组织修复和骨性修复方面具有重要的作用〔2〕。Gronthos等〔3〕在2000年首次正式提出了DPSC的概念，把牙髓内可以快速增殖并且具有一定克隆形成能力的牙髓细胞命名为DPSC，研究人员应用酶消化法对成人第三磨牙的牙髓细胞进行培养，并与骨髓间充质干细胞进行比较，结果显示:这两种细胞具有极为相似的免疫学特性，并且，该研究进一步证实DP-SC经体外诱导后，可形成高密度的钙化小结，将DPSC与羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)支架复合后移植到小鼠背侧皮下，经过一段时间后，能观察到类似于牙本质-牙髓复合体样的结构。
2DPSC的多向分化潜能
作为一种成体干细胞，DPSC具备多向分化的潜能，这种潜能不仅仅局限在骨性分化方面，研究人员在成脂分化、神经分化等方面均取得了一定的研究成果，在再生医学研究领域有着重要的指导意义。
2.1DPSC的骨性分化DPSC的骨性分化是关于DPSC定向分化研究较早的一项内容，近些年来，又有了进一步的发展。Mori等〔4〕采用成骨分化培养基进行对DPSC的骨性诱导分化，结果发现，某些典型成骨细胞基因，如:碱性磷酸酶、I型胶原、骨桥蛋白等均大量表达;应用微阵列及RT-PCR技术进一步研究发现，在成骨分化过程中，胰岛素样生长因子结合蛋白5基因(IGFBP-5)、JunB原癌基因(JUNB)和核受体相关基因(NURR1)均发生表达上调现象，这一机制在成骨分化过程中有着重要的意义。D''''Alimonte等〔5〕在人源DPSC正常成骨诱导过程中，加入血管内皮生长因子，结果显示:这种方法可以刺激DPSC的增殖分裂的速度加快，而且促进了成骨分化的进程。
2.2DPSC的神经分化DPSC来源于胚胎时期的神经脊，在神经分化方面具备一定的潜能。Király等〔6〕采用低温损伤的方法制备3日龄Wistar大鼠脑缺损模型，于颅内注入DPSC进行修复，研究发现:DPSC趋向分布于室下区、胼胝体下区等神经系统祖细胞区，并表达微管蛋白(N-tubulin)、胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)等神经细胞标志，对损伤部位有一定的修复作用，并且具有神经系统相关细胞的电压依从性。因此，该结果进一步显示，DPSC在脑损伤体内修复方面，可以作为一种有效的修复细胞。Karaz等〔7〕研究表明:DPSC不仅可以分化为神经干细胞，而且在分化能力方面，高于传统的骨髓间充质干细胞。
2.3DPSC的成脂分化除成骨分化、神经分化方面，成脂分化也是DPSC的一项重要潜能。Nozaki等〔8〕于成脂培养基中加入胰岛素、地塞米松等诱导成脂，经过一段时间的作用，可见细胞中有脂滴的形成，并且在分化过程中多能性标记转录因子(Oct3/4、Sox2)均呈现下调趋势，Nanog基因无显著变化;通过基因微阵列分析，研究人员进一步发现:过氧化物酶体增生物激活受体信号通路的多种组分，均发生变化。所以，对这些基因的调控，在细胞成脂分化过程中有着重要意义。
3DPSC的分化诱导因素
在细胞分化的过程中，分化方向、分化程度、分化速度均会受到一系列物化因素、生物因素的影响，协调各方面因素对控制细胞定向分化有着重要意义。Ito等〔9〕将犬类的DPSC与不同的支架材料相结合，并用这种结合物治疗骨缺损，结果发现不同的支架材料，修复效果会有较大差异，其中DPSC/富血小板血浆(PRP)复合物具备较好的修复效果。Galler等〔10〕将DP-SC接种于水凝胶支架上，并将复合物移植到经过次氯酸钠(NaClO)、乙二胺四乙酸(EDTA)处理过的牙本质内部，培养6w后，发现经NaClO处理的牙本质与复合物结合较好，接触面形成大量细胞陷窝;经乙二胺四乙酸(EDTA)处理的牙本质可以诱导进一步DPSC向成牙质细胞分化，进一步表达牙本质涎蛋白，提高牙本质的修复速度。Yang等〔11〕以大鼠DPSC为研究对象，在常规成骨分化培养基中添加白细胞介素β(IL-1β)，结果显示，细胞的骨唾液蛋白、牙本质基质蛋白等矿化物质的表达均上调，体内实验也得到了相似结果，可见，IL-1β在成骨矿化过程中有一定的促进作用。骨形态发生蛋白在诱导成骨方面有着重要作用，Liu等〔12〕分离扩增家兔DPSC后，将这种种子细胞接种在羟基磷灰石、胶原等支架材料上，并用骨形态发生蛋白II进行刺激处理，结果成骨速度明显提高，最后制备的复合物更有利于体内移植和组织修复。
4DPSC的重编程与再分化
2006年，Takahashi等〔13〕将4个转录因子(Oct4，Sox2，cMyc和Klf4)导入已处于终末分化状态的小鼠成纤维细胞中，从而获得了一种类似于胚胎干细胞的多能性细胞，称为“诱导性多能干细胞”(inducedpluripotentstemcells，iPScells)。这种方法可以非常稳定的制造多能干细胞，引起了极大的关注。继此之后，人类体细胞被成功诱导为iPS的报道〔14〕和老年人皮肤成纤维细胞被诱导为iPS细胞亚群的报道〔15〕相继出现，这种细胞被认为是一种极具前景的干细胞。体细胞通过一定诱导方式，转变为iPS细胞亚群的过程称为“重编程”;iPS经过定向诱导，再次分化为其他种类细胞的过程，称为“再分化”。DPSC作为一种可以快速自我更新的成体干细胞，同样具备重编程和再分化的潜能。Yan等〔16〕采用逆转录病毒介导法，将4个因子(Lin28/Nanog/Oct4/Sox2或c-Myc/Klf4/Oct4/Sox2)导入DPSC中，将DPSC重编程为iPS细胞亚群。DPSC来源的iPS细胞亚群表达阶段特异性胚胎抗原-4(SSEA-4)、肿瘤坏死因子受体相关蛋白(TRA)-1-60、TRA-1-80、TRA-2-49、Nanog、Oct4、Sox2等表面标记，具备多向分化的潜能，可分化成3个胚层的组织，而且可被定向诱导分化为神经干细胞和神经元。Tamaoki等〔17〕对多株DPSC进行重编程诱导，结果显示不同株的DPSC在重编程效率方面会有很大差别，不同株DPSC来源的iPS细胞亚群的再分化能力也有较大不同。因此，建立一种高效安全的重编程模式和再分化方法，仍是干细胞领域的研究热点。
细胞研究范文3
【关键词】肺癌;干细胞;肿瘤干细胞
【中图分类号】R725【文献标识码】A【文章编号】1005-0515(2011)02-0227-02
目前，肺癌已成为世界上发病率和死亡率增长最快，严重危害人类健康和生命的恶性肿瘤，5年生存率低于15%。科学家们通过总结大量肿瘤细胞和干细胞的生物学相似性后，提出“肿瘤干细胞” (TSC)理论。该理论的提出为肺癌的治疗带来曙光。
1 干细胞
干细胞(SC)是指具有自我更新和分化潜能的细胞。干细胞的自我更新和分化在其内在机制和周围环境中的信号调控下处于动态平衡状态,维持了干细胞的数量稳定。一旦干细胞发生基因突变或信号传导途径发生错误,将导致这一平衡被打乱,引起高度协调的干细胞分裂增殖过程失调,导致肿瘤发生。
2 肿瘤干细胞
2001年，科学家们提出了TSC理论，认为肿瘤组织由异质性的细胞群体组成，其中很小部分细胞具有干细胞特性，决定肿瘤的发生、侵袭、转移、播散和对各种治疗是否敏感[1~3]。TSC的最早报道见于白血病。Ai-Hajj等发现乳腺癌干细胞,首次证明了在实体瘤中TSC的存在。目前已成功分离并鉴定的实体TSC包括脑肿瘤、结肠癌、前列腺癌、黑色素瘤及胰腺癌等,肺癌TSC的研究也取得很大进展。
3 肺癌干细胞
3.1 肺癌干细胞的发现 2005年Kim等从大鼠细支气管、肺泡管结合部分离出Sca-1+CD45-Pacam-CD34- 细胞,其有很强的自我更新和分化能力, 称之为支气管肺泡干细胞(BASCs)，并认为BASCs可能是肺腺癌的起源细胞。2006年,黄盛东等发现,A549细胞悬浮培养可形成3种类型的克隆集落,其中Holoelone型克隆体具有干细胞特性。2007年,Summer等从鼠的肺组织中分离出肺内源的间充质干细胞。Ho等发现肺癌SP细胞较非SP细胞具有更强的致瘤性, 表达乳腺癌耐药蛋白(ABCG2)等多种ABC家族膜转运蛋白。Eramo等在人的肺癌组织中发现一群具有自我更新、多向分化能力的CD133+细胞，其具有肿瘤细胞的恶性特征，被命名为肺癌干细胞。
3.2 肺癌干细胞的分选方法:肺癌干细胞的分选主要采用三种方法:A.应用细胞表面特异性标记进行分选;B.根据SP表型进行TSC的分选;C.利用干、祖细胞中ALDH的含量较高进行分选。
细胞表面标志物是分选肺癌肿瘤干细胞的关键。Kim等应用流式细胞仪分选出Sca+/CD45-/Pecam-/CD34+的支气管肺泡干细胞，肺腺癌肿瘤干细胞亦存在与BASCs相似的表面标志物。另一表面标志物是CD133。Eramo等发现CD133+细胞在肺癌标本中普遍存在，但含量较低。科学家们还发现，CD133+肺癌细胞可无血清悬浮培养，含血清培养出现分化； CD133+细胞比CD133-细胞更易形成与原发瘤表型一致的肿瘤，更具耐药性。上述研究显示CD133+细胞可能包含了肺癌干细胞，且和肺癌化疗耐药密切相关。但Meng等[19]对肺癌细胞株中的CD133+及CD133-细胞进行对比，发现二者均可形成移植瘤，故CD133+细胞是否代表肺癌干细胞，仍存在争议。
人们发现造血干细胞具有将荧光染料泵出细胞外的特性,即SP特性[23]。目前利用这一特性进行纯化 已成为一种常用的分离方法。SP细胞表面表达ABCG2等ABC家族膜转运蛋白,因此,也可应用ABCG2作为标记分选TSC。
利用干、祖细胞中ALDH的含量较高进行分选肺癌干细胞。在造血系统、神经系统的干、祖细胞、乳腺癌中ALDH含量很高。在乳腺癌中发现ALDH1+肿瘤细胞具有干细胞特性，且与乳腺癌不良预后相关。美国学者应用流式细胞仪从人类肺癌细胞系中分选出ALDH1阳性细胞，发现其具备诸多干细胞特征，并表达CD133，并与肺癌患者的预后呈负相关。
3.3 肺癌干细胞的鉴定方法:目前研究认为TSC鉴定必须通过一些经典的干细胞实验进行鉴定。自我更新是干细胞的三大重要特性之一,如 CD133+肺癌细胞能够在含生长因子的无血清培养基中以细胞球的方式悬浮生长,这是鉴定其具有自我更新的能力,也是鉴定其是为TSC的重要方法。致瘤能力是鉴定TSC的最重要环节,目前多通过裸鼠致瘤实验进行检验。分化潜能是TSC的重要特征之一，可通过单克隆实验进行检验,以此鉴定其干细胞特性。
4 肺癌干细胞的展望
进入21世纪以来，肺癌的治疗已经进入分子时代,对肺癌干细胞的研究越来越受到重视。直接靶定肺癌干细胞，通过寻找特异性的表面分子标志识别肺癌干细胞，制备单克隆抗体，携带放射性物质或化疗药物，靶向放化疗，最终促使肺癌干细胞凋亡，使肿瘤失去生成新的肿瘤细胞的能力，争取达到根治的目的。这些方法将为肺癌的治疗带来了新的曙光。
参考文献
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细胞研究范文4
1结果与分析
1．1预处理和制片条件采用4种低浓度预处理液：0．02％秋水仙素、0．05％秋水仙素、0．002mol／L的8－羟基喹啉水溶液、0．02％秋水仙素与0．002mol／L8－羟基喹啉的混合液，预处理1、2、3、4h。结果表明，4种预处理液中以0．05％秋水仙素、0．02％秋水仙素与0．002mol／L8－羟基喹啉的混合液作用效果较好，预处理时间1、2h时分裂相多处于前期和前中期，3h时中期分裂相较多且缢缩程度恰到好处，4h时染色体缢缩为难以计数的小点状。此外，预处理时应保持稳定的低温环境，温度稳定在18～20℃时，中期分裂相较多，而在不稳定的条件下分裂相较少。因试验材料为木本植物，所需解离时间较长，解离20min以下时胞质和染色体均染色较深；解离30min以上时均着色很浅；解离25min时，解离较充分，染色效果最好，胞质不着色或呈淡红色，而染色体着色较深。本试验最终确定野牡丹属植物预处理和制片条件为环境温度稳定在18～20℃，使用0．02％秋水仙素与0．002mol／L8－羟基喹啉的混合液预处理3h，解离25min。
1．2染色体数目从每个种的7～8个样品的根尖中选取4～5张质量较好的压片，选择染色体染色清晰、分散较好的30个细胞进行观察、记数。发现5个种的细胞染色体数虽然均有一定的变化范围，但基本都集中在一个数量上，因此将出现频率最高的这个数量作为该种的染色体数目。如表1所示，野牡丹2n＝24占70．0％，细叶野牡丹2n＝24占60．0％，多花野牡丹2n＝24占66．7％，地菍2n＝24占63．3％，展毛野牡丹2n＝24占86．7％。由此可认为，野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹染色体数目均为2n＝24。每个种中还有其他较小比例的染色体数目，这可能与野牡丹属的无性繁殖存在染色体数目的变异或染色体过小有关。
1．3染色体大小野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹染色体组总长度分别为27．86、23．44、17．09、39．86、46．84μm；绝对长度范围依次为0．82～1．67μm、0．71～1．45μm、0．43～1．26μm、1．01～2．36μm、1．49～2．99μm；相对长度为2．93～5．67、3．09～5．87、2．64～7．14、2．62～5．92、3．18～6．12，最长染色体与最短染色体的比值为2．0、2．0、2．9、2．3、2．0。
2结论与讨论
本研究中，野牡丹属的5个种染色体数均为2n＝24，这与Almeda［7］所研究的野牡丹科其他属的染色体可能为n＝9到n＝12基本一致。根据染色体分类的标准［8］，野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹、地菍、展毛野牡丹均为小染色体类型，不易分辨着丝点，无法作核型分析。目前，对小染色体尚无明确的分析标准，Almeda［7］在对野牡丹科其他属植物的研究中，只分析了小染色体减数分裂的行为，但未作具体分析。最长染色体与最短染色体的比值可作为核型对称与否的分类标准之一［9］，本研究中野牡丹属5个种的比值为2．0～2．9，说明野牡丹属的核型比较对称。根据李懋学［8］的染色体相对大小差别愈大，核型越不对称的观点，比较5个种的染色体相对长度的标准差，野牡丹为0．86、细叶野牡丹为0．92、多花野牡丹为1．21、地菍为0．84、展毛野牡丹为0．87，说明5个种中地菍的核型较对称，而多花野牡丹的核型对称性较差。由于整个植物界的核型进化趋势是由对称向不对称发展，所以可认为5个种从原始到进化的顺序可能为：地菍、野牡丹、展毛野牡丹、细叶野牡丹、多花野牡丹。
细胞研究范文5
【关键词】 肝，人工；肝/细胞学；肝细胞株；永生化程序
0引言
肝细胞是生物人工肝支持系统的核心原材料，生物人工肝对肝衰竭患者的肝支持作用依赖于所用肝细胞的生物学功能. 无论是动物肝细胞还是人肝细胞，在体外培养时均存在生长条件要求严格、存活时间有限、传代困难等缺点. 采用永生化程序建立肝细胞株就成为解决生物人工肝细胞来源的重要途径，而永生化的人肝细胞株则可为生物人工肝提供取之不尽的细胞源. 现就这一方面的研究进展综述如下.
1肿瘤来源的肝细胞株
肿瘤来源的肝细胞株是指由肿瘤组织分离、克隆而来的具有某些正常肝细胞功能的细胞株. 其中HepG2细胞具有某些类似于正常肝细胞的代谢解毒功能，但细胞的分化功能和分化程度均较低. Khalil等［1］发现，将HepG2细胞包裹于海藻酸珠内，形成内聚性球形集落后可培养20+d，其合成与解毒功能均显著加强，细胞增殖明显，活力显著增强，白蛋白、纤维蛋白原、凝血酶原等成倍增加，细胞色素P450活性显著高于单层培养(4倍以上)，雄烯二酮代谢的5种酶活性明显上调. 形态观察见HepG2细胞在海藻酸盐珠内增殖成内聚性集落，保持正常的细胞形态与结构. 最近，他们利用HepG2细胞(包裹于海藻酸珠内)构成的生物人工肝治疗兔肝衰竭模型，显示能有效地改善其肝衰系统参数(如舒张压、血氧饱和度等)［2］.
考虑到生物人工肝所用细胞材料的转化代谢功能较生物合成尤为重要，特别是在治疗肝性脑病中，去除血氨的作用更为关键. Omasa等［3］将构建的谷氨酰胺合成酶(GS)基因质粒导入无氨清除能力的HepG2细胞，用含甲硫氨酸亚枫(MSX)的培养液选择性培养，获得新的MSX抗性GSHepG2. 该细胞株的氨清除能力可达原代肝细胞的四分之一，若提供适量锌离子可使其氨清除能力进一步提高近50%. 并且可在循环流式反应器长期培养，细胞数量由107增至109，去氨能力大大增强［4］. GSHepG2细胞型生物人工肝可明显延长肝衰竭动物的存活时间，并可用于长期反复治疗［5］. 另外，Yang等［6］将连接蛋白32(Cx32)基因转染到HepG2细胞内，使新的细胞株之间的缝隙连接加强，同时也使其白蛋白分泌和氨清除能力提高2倍以上. Naiki等［7］利用腺病毒将肝细胞核因子4(HNF4)基因导入无氨清除能力的细胞. 在新的细胞中，细胞色素P450、谷氨酰胺合成酶、α抗膜蛋白酶、载脂蛋白等基因的表达增加，特别是其氨清除能力提高明显.
C3A细胞是从肝母细胞瘤分离获得的类似但分化程度高于HepG2的肝细胞株，在空心纤维生物反应器中接种2gC3A细胞，可在1周内增殖到200 g，并具有良好的肝细胞特异功能. 但与猪肝细胞相比，C3A细胞株的P450IA1活性、氨清除以及氨基酸代谢等均较低. Filippi等［8］研究显示，利用UoE培养基预处理的C3A后，能显著提高其尿素、白蛋白、葡萄糖等的合成以及半乳糖的清除能力. C3A是目前唯一用于人工肝临床研究的肝肿瘤细胞株，且己有10年之久，取得了较好的效果［9］，但至今未能进一步扩大应用，可能仍主要与安全考虑有关. 除了上述细胞外，肿瘤来源肝细胞还有HuH6， JHH2等，也开始了用于生物人工肝的基础研究［10］，二者均能高分泌AFP，白蛋白，表达鸟氨酸氨甲酰基转移酯mRNA和乙醇脱氢酶mRNA.
2病毒转染的肝细胞株
病毒转染是建立细胞株的常用方法之一，但所建细胞株的肿瘤性质较为突出. OUMS29是一株人胎肝细胞转染PSV3neo质粒获得的含有SV40LargeT肿瘤抗原(SV40Tag)的肝细胞株，表达许多特殊肝脏功能的基因，可明显降低血氨水平，改善肝性脑病，能够为急性肝衰竭模型动物提供代谢支持作用，提高短期生存率［11］. OUMS29细胞株移植入裸鼠并未显示恶性特征，无转移瘤形成，相比之下HepG2细胞可在2 wk内引起裸鼠多发性肿瘤，说明OUMS29细胞的恶性程度较低. 新近，Kobayashi等［12］为了使OUMS29细胞更接近于临床应用的要求，成功地通过逆转录病毒介导基因释放的方式，将单纯疱疹病毒胸苷激酶(HSVTK)自杀基因(suicide gene)转入OUMS29细胞，形成一种新的OUMS29/TK细胞，该细胞株具有高分化的肝细胞功能，在无血清培养基中生长良好，具有肝实质细胞的特征. 此外，采用MTT法检测发现该细胞对GCV(ganciclovir)的敏感度是OUMS29细胞的100倍. 作者认为OUMS29/TK细胞严格调控，具有无限活性，有可能用于生物人工肝.
尽管SV40Tag转染的肝细胞株能提高外科型急性肝衰竭鼠的存活率，能防治门腔静脉分流模型鼠血氨升高所致的肝性脑病，可纠正Gunn鼠胆红素结合缺陷. 但SV40Tag长期存在于永生化的肝细胞可增加移植受体肿瘤转移生长的危险性. 为克服这一缺陷，Cai等［13］对SV40Tag转染细胞株的建立方法进行了改进，建立了新的病毒转染肝细胞株CB8. 建株方法的第一步是将含SV40Tag单纯麻疹病毒胸昔激酶和潮霉素抗性基因侧面连接LoxP位点的重组SSR69逆转录病毒导入鼠肝细胞；第二步再用含有基因编码Cre重组酶的重组腺病毒(AdCre)，在特殊位点重组而将SV40Tag切除. 在第一步完成后，肝细胞得以永生化. 当SV40Tag被Cre重组酶切除后，细胞停止生长，DNA合成下降90%，多种肝特殊性mRNA表达出现或增多，形态和细胞极性表现出更多的分化肝细胞特征，在免疫严重缺陷鼠体内形成的肿瘤停止生长. 这种通过切割有害基因的办法，为肝细胞株的应用提供了新的安全保障.
Hep Z细胞株也是从肝活检标本中分离、经转染获得的人肝细胞株，该细胞株具有细胞色素P450活性等肝细胞特异性代谢功能，能永久传代且增殖能力强. 最近，Werner等［14］采用旋转培养系统和生物反应器分别对Hep Z细胞进行了大孔明胶型CultiSpher G微载体大量高密度培养，研究结果显示永生化的Hep Z细胞具有原始的肝细胞代谢功能，可大量培养，适用于生物人工肝系统.
3可恢复性肝细胞株
近年来，国外学者设计了一种可恢复性永生化程序，为解决细胞材料问题提供了新的思路及手段. 其基本原理实际上就是前述Cai等建立CB8细胞株的思路，即是先将永生化基因SV40T导入原代细胞以获得永生化细胞株，使其获得体外增殖能力，然后再以特异性位点重组技术切除SV40T基因，使细胞株恢复到永生化前的状态. 如Kobayashi等［15］对原代成人肝细胞进行可逆性永生化程序，建立了一株可恢复性的永生化肝细胞NKNT3(reverted NKNT3)，引起同行的极大关注，有可能为生物人工肝支持提供用之不竭的肝细胞材料［16］. NKNT3细胞很大程度上与CB8相似，系将连接有LoxP重组靶基因的SV40T逆转入正常原代人肝细胞而建立的，NKNT3细胞具有肝实质细胞的形态学特征，可表达SV40T，可在体外进行永生化培养. 尽管NKNT3细胞株也保持了表达肝脏代谢的关键基因(谷酰胺合成酶、GST等)，但当切除了SV40T基因后，上述基因的表达水平戏剧性地增加，而且也只有当SV40T切除后该细胞株的白蛋白、人血凝血因子ⅩmRNA才能检测出来. NKNT3细胞对SCID小鼠无致瘤作用. 经能表达Cre重组酶的复制缺陷重组腺病毒转导，NKNT3不再表达SV40T，且分化程度更高，核浆比及胞浆颗粒类似肝细胞. 动物实验己经显示将NKNT3细胞植入90%肝切除大鼠的脾脏可显著改善其生化指标与临床表现，残余肝叶增大并示明显肝再生，脾脏“肝化”，存活率达60%(空白对照组模型大鼠全部死亡). 他们在NKNT3细胞的基础上，将p21基因导入细胞内使细胞在GO/G1阻滞，进一步改善了肝细胞表型，提高了白蛋白和细胞色素P450的表达［17］. 同时，他们用几乎相同的方法构建了可恢复性人内皮细胞株HNNT2［18］和肝星型细胞株TWNTs， TWNT1和NKNT3细胞共同培养时可以加强NKNT3细胞的细胞素色P4503A4和2C9的表达［19］. 可恢复性NKNT3细胞良好的肝细胞功能和无致瘤及致病毒感染之虑，再加上可复性的肝非实质细胞株共同培养，将在今后生物人工肝中有着良好应用前景.
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细胞研究范文6
【关键词】小鼠GVHD模型;T淋巴细胞；增强型绿色荧光蛋白；巨噬细胞炎症蛋白
MigrationandDistributionofAllogeneicTLymphocytesinOrgansofGraft-Versus-HostDiseaseMouseModel
AbstractThisstudywasaimedtoinvestigatethemigrationanddistributionprocessesofallogeneicdonorTlymphocytesintheorgansofrecipientmice.GVHDmodelwasestablishedbytransfusionofthesplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6micetogetherwithbornmarrowcellsharvestedfromC57BL/6miceintoBALB/cmiceunderwent8.0Gytotalbodyirradiation.ThemigrationandhomingofeGFPcellsweretrackedbystereo-fluorescentmicroscopyorinvertedfluorescentmicroscopyandflowcytometry.Theenzymelinkedimmunosorbentassay(ELISA)wasperformedonsupernatantsfromthetissuehomogenatestodetecttheamountofMIP-1α.TheresultsindicatedthatGVHDclinicalmanifestationandpathologicalchangesoforgansappearedonday8posttransplantation.eGFP-positivedonorTcellsinrecipientorganswereobservedbyinvertedfluorescencemicroscopeinfrozensection,orbystereo-fluorescencemicroscopyinlivingorgans,suchasliver,spleen,skin,lungs,bowels,andtongue.ThehighestexpressionofMIP-1αwasonday7posttransplantationintheliver(491.3±32.1pg/ml),andday3posttransplantationinthespleen(881.5±45.2pg/ml)，respectively(P<0.05).ItisconcludedthatGVHDwasinducedbysplenocytesofeGFPtransgeneicC57BL/6mice.eGFPcellsintheorganscanbeobservedbyfluorescentmicroscopy.InthisGVHDmodel,donorTcellsproliferateandinfiltrateinliver,skin,bowels,aswellaslungsandtongue.MIP-1αmaybeinrelationwiththeinfiltrationofTlymphocytesinliverandspleen.
KeywordsmurinGVHDmodel;Tlymphocytes;splenocytes;enhancedgreenfluorescenceprotein;macrophageinflammatoryprotein-1（MIP-1α）
移植物抗宿主病（graft-versus-hostdisease,GVHD）是异基因造血干细胞移植（allo-HSCT）临床应用的主要并发症之一。目前公认GVHD是由供体T淋巴细胞在宿主体内被激活,并攻击靶组织所引起，但对异基因T淋巴细胞在受体体内的迁移、组织分布及激活过程仍不甚清楚，GVHD累及器官的范围也存在一定争议。我们建立了增强型绿色荧光蛋白(enhancedgreenfluorescenceprotein,eGFP)标记供体淋巴细胞的GVHD小鼠模型，观察了GVHD模型中eGFPT淋巴细胞的分布与激活，为GVHD防治研究提供基础资料。
材料和方法
实验动物
BALB/c（H-2Kd）雌性小鼠、C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb）均为6-8周龄，购自上海生命科学院实验动物中心。eGFP-Tg-C57BL/6雄性小鼠（H-2Kb），6-8周龄，由第二军医大学细胞生物学教研室提供。
实验材料
PElabeledanti-mouseCD4，PE-cy5labeledanti-mouseCD8为Biolegend公司产品。小鼠MIP-1αELISA检测试剂盒为R&D公司产品。
供体小鼠骨髓、脾细胞悬液的制备与检测
颈椎脱位法处死C57BL/6及eGFP-Tg-C57BL/6小鼠，无菌取其双侧的股骨和脾。用不含有牛血清的RPMI1640培养液制备骨髓细胞悬液及脾细胞悬液。以PBS重悬细胞，调整浓度至107/ml。0.4%台盼蓝染色提示骨髓细胞悬液及脾细胞悬液中活细胞在95％以上。流式细胞术检测骨髓细胞和脾细胞中CD4T、CD8T淋巴细胞百分比。
GVHD模型的建立
用60Co-γ线全身照射受体BALB/c雌性小鼠(8.0Gy,剂量率为0.5Gy/min)，于6-12小时内每只鼠经尾静脉输入8×106骨髓细胞(BMC)15×106脾细胞(SC)。分组如下：A组18只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMCeGFP-Tg-C57BL/6鼠SC；B组5只BALB/c鼠，输C57BL/6鼠BMC；C组BALB/c鼠5只，输eGFP-Tg-C57BL/6鼠BMCC57BL/6鼠SC。
造血重建
移植后第1、3、5、11、13天，检测外周血细胞数。移植后第13天，制备骨髓细胞悬液片，在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察。骨髓细胞悬液染色体检查采用短期培养法，显微镜下计数Y染色体的分裂相比例，共观察10个分裂相。
GVHD观察
死亡时WBC<0.5×109/L为移植失败，WBC>1.0×109/L并具有以下症状者为GVHD发生:倦怠、纳差、体重减轻、弓背、乱毛、脱毛、腹泻甚至死亡。以25天为观察期限，观察小鼠的GVHD发生情况和生存时间。取肝、肠、皮肤组织,用4%中性甲醛固定,石蜡包埋，常规切片,HE染色,光学显微镜下观察。
eGFP淋巴细胞在小鼠体内的分布
取A组小鼠，麻醉后，去毛，切开鼠胸腹部，暴露肝、脾、肠、肺、肾，皮肤、舌、脑、骨等。用LeicaMZFLⅢ立体荧光显微镜观察，拍照，曝光时间0.4-1.9秒。取A组小鼠，麻醉，PBS灌注后，切取小鼠的肝、脾、单个肾脏、肠、皮肤、肺、脑实质、舌、肾脏等，冰冻切片（厚10μm），在OlympusⅨ70倒置荧光显微镜下观察绿色荧光。以未输入eGFP细胞小鼠的各组织及冰冻切片分别作对照，排除背景荧光。
MIP-1α水平和T细胞亚群检测
取肝、脾、单个肾脏，置于200目不锈钢网中轻轻碾碎，以1mlPBS分别收集细胞，500×g离心6分种，取上清，行MIP-1αELISA检测，按试剂盒说明书操作，测450nmOD值。采用CurveExpert1.3软件作标准曲线，计算样本OD值对应的浓度值。流式细胞术检测肝、脾、肾细胞悬液中eGFP细胞百分数及以eGFP细胞设门的CD4、CD8细胞百分数。
统计处理
数据用SPSS10.0统计软件处理,生存分析采用Kaplan-Meier分析方法；样本均数间比较采用独立样本t检验。
结果
小鼠骨髓细胞和脾细胞中CD4、CD8细胞百分比
检测结果见表1。由表1可见，eGFP-Tg-C57BL/6小鼠脾细胞（SC）悬液中CD4T或CD8T淋巴细胞含量与C57BL/6小鼠相似，CD4T均在20％左右，CD8T均在13％左右。据此推测两种小鼠在引发GVHD方面没有区别。这两种小鼠骨髓细胞中T淋巴细胞含量均极少，约为2％。因此，单输骨髓细胞可能不足以引发GVHD。
移植后造血重建
移植后第3天WBC降至最低值，第8天后WBC恢复至大于1.0×109，第13天WBC恢复至3.0×109以上。移植后第13天后C组鼠的骨髓细胞大多为eGFP细胞(图1)，说明其来源于供体eGFP-Tg-C57BL/6鼠。染色体检查显示受者雌性小鼠骨髓细胞10个分裂相中，8/10-10/10可见Y染色体。Table1.PercentagesofCD4,CD8cellsinbonemarrowcells(BMC)andsplenocytes(SC)ofthemice（略）
eGFP淋巴细胞在小鼠体内的分布
立体荧光显微镜、荧光倒置显微镜观察显示，A组小鼠肝、皮肤、肠、脾、肺、舌有eGFP细胞浸润(图2)；肾、脑、骨、心肌、骨骼肌等组织中均未见eGFP细胞浸润。可见肝、皮肤、肠、肺、舌等组织第13天eGFP细胞多于第3天。而脾组织第13天eGFP细胞少于第3天(图3)。
GVHD表现及转归
A组小鼠移植后第8天开始出现GVHD表现,主要为消瘦、弓背、脱毛、乱毛、体重减轻和腹泻,最后全部在25天内死亡。出现GVHD表现小鼠的肝、肠符合急性GVHD的病理改变:肝组织显著水肿，细胞浊肿、变性,可见灶性坏死，汇管区淋巴细胞浸润；肠组织学表现黏膜脱落，腺体及绒毛水肿、坏死、糜烂，可见淋巴样圆形细胞浸润（图4）。单输骨髓细胞的B组小鼠无GVHD表现，肝、肠结构基本正常。A组、B组小鼠生存曲线比较表明，A组小鼠生存率明显小于B组小鼠(图5)(P<0.05)。
第3、7、13天，eGFP细胞比例，在肝细胞悬液中逐渐增多，从18.4±3.4%升高至70.8±5.3%；脾细胞悬液中逐渐减低，从60.7±8.3%降低至27.8±4.3%。肝、脾eGFP细胞中CD4T、CD8T淋巴细胞比例均逐渐升高（表2）。Table2.PercentagesofeGFPcellsinthecellsuspensionsandpercentagesofCD4,CD8cellsineGFPcells(略)
肝、肾及脾脏中MIP-1α的表达
与肾脏中MIP-1α水平相比，肝、脾中MIP-1α水平显著升高（P<0.05）;移植后第3天脾MIP-1α水平最高，为881.5±45.2pg/ml，肝中MIP-1α高峰水平出现在第7天，达491.3±32.1pg/ml(图6)。
讨论
本研究将C57BL/6鼠骨髓细胞与转eGFP基因的C57BL/6鼠脾细胞一起植入经8.0Gy照射的BALB/c鼠体内，成功建立了GVHD模型。eGFP可作为标记，用荧光显微镜或流式细胞仪可以直接检测供体T淋巴细胞在受体鼠体内的浸润、扩增情况。本实验系统可用于观察供体细胞的分布及动态变化，为GVHD的发生机理及防治研究提供了方法平台。目前认为，激活的CD4T淋巴细胞分泌免疫应答发生必需的细胞因子，激活CD8T淋巴细胞，使其成为细胞毒性T淋巴细胞，从而攻击受者细胞引发GVHD［1，2］。在本实验模型中，由于供者小鼠骨髓中T淋巴细胞含量极少，单纯输注供者骨髓细胞，虽然也能实现植入和供者型造血重建，但无GVHD发生。同时输注异基因脾细胞可使受者小鼠发生GVHD，在GVHD靶器官中出现受者T淋巴细胞的浸润和增殖。我们观察到受者脾与肝中eGFP细胞呈现不同的动态变化：肝中eGFP细胞逐渐增多，而脾中eGFP细胞逐渐减少。这一结果提示，供体T淋巴细胞在移植初期可能先进入脾等淋巴器官，在异基因抗原作用下，激活、扩增后，离开脾，进入肝、肠等GHVD靶器官。但不能排除肝、皮肤、肠等GHVD靶器官中存在供体T淋巴细胞的激活与扩增。例如最近有学者研究表明，供体T淋巴细胞可在肝、脾、肺中直接与抗原呈递细胞相互作用而激活、扩增［3］。经典GVHD靶器官主要是肝、肠和皮肤组织，GVHD的临床分级也主要根据这3个组织的损伤程度。临床资料表明，GVHD与移植后的许多并发症均有联系，如间质性肺炎、黏膜炎症或溃疡、出血性膀胱炎、味觉丧失等。有研究显示，脑、肾、牙龈、结缔组织、舌、鼻腔等组织中均可见供体淋巴细胞浸润，并将它们称之为非经典GVHD靶器官［4-6］。本研究采用荧光显微镜观测eGFP细胞的分布，在肝、肠、皮肤、肺、舌中发现eGFP细胞浸润，这提示除肝、肠和皮肤等传统GVHD靶器外，肺、舌也是潜在GVHD靶器官。我们在肾、脑、肌肉等组织中未观察到明显的eGFP细胞浸润，可能与肾、脑中供体淋巴细胞浸润较少或实验观测方法的敏感性有关。MIP-1α是一种重要的趋化因子，活化后的T淋巴细胞、B淋巴细胞、单核细胞和肥大细胞均可产生MIP-1α。T淋巴细胞有MIP-1α的受体CCR5、CCR7等的表达，MIP-1α对T淋巴细胞有趋化作用［7］。有研究表明，异基因造血干细胞移植的动物的肝、脾组织中MIP-1α,MIP-2和MIG水平升高；皮肤组织中可见MIP-1α,MIP-2,MCP-1和MCP-3水平升高［8，9］。本研究发现，GVHD模型中肝、脾组织的MIP-1α水平升高，表达高峰分别出现在第7天和第3天。国外有研究也显示，移植后第3天淋巴组织中趋化因子MIP-1α表达上调，在脾中MIP-1α由激活的T淋巴细胞产生。肝中MIP-1α表达晚于淋巴组织，由激活的T淋巴细胞产生，并与供者T淋巴细胞浸润一致，用MIP-1α单克隆抗体或输入MIP-1α-/-供体T淋巴细胞的方法,均可减少受体肝中CD8T淋巴细胞浸润，而且血清丙氨酸氨基转移酶(ALT)水平和肝GVHD特异性病理表现均较轻［9-12］。这说明可能存在一个反馈机制，肝浸润T淋巴细胞产生MIP-1α，吸引CD8T细胞毒性T细胞进入肝脏。
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