前言：中文期刊网精心挑选了药品微生物研究范文供你参考和学习，希望我们的参考范文能激发你的文章创作灵感，欢迎阅读。
药品微生物研究范文1
在药品微生物限度检验工作中，由于受到药物自身性质、操作环境的影响，因此误差几乎是不可避免的，其中单因素占百分之二十五，多因素占百分之七十五，因此加强检验环境管理，降低`差率的发生，是相关研究人员应该考虑的问题，本文将立足于药品微生物限度检验的要求，深入研究影响药品微生物限度检验的因素，以供相关从业人员借鉴学习。
1 培养基的影响与控制方法
培养基是药品微生物限度检验的重要环节，因此会对药品微生物限度检验结果产生一定的影响，如果培养基的质量不稳定，或者没有按照使用条件进行配制与存放，都会导致药品微生物限度检验的误差，因此，为了确保药品微生物限度检验的准确性，需要加强培养基的质量检验，在灵敏性与有效性上评估培养基的使用效果。
1.1 已知菌对照试验
使用已知菌对照试验，是对初购的培养基进行质量检验的重要方式，一方面，已知菌对照试验，能够直观的检测出培养基的灵敏度。其次，已知菌对照试验的使用灵活，可以检验要求，使用不同的已知菌进行对照试验，从而通过培养基的反应结果，测定培养基是否适合进行药品微生物限度检验，减少药品微生物限度检验误差的产生。[1]
1.2 酸碱度测定
酸碱度测定也是减少培养基不良影响的重要方法，药品微生物限度检验的项目非常多，这是因为不同的细菌适宜生长的环境有所差异，因此为了确保培养基能够满足药品微生物限度检验的要求，必须对其进行酸碱度测验，可以使用盐酸来测验培养基内的PH值，如果培养基的PH值显示弱碱性，需要使用氢氧化钠进行调节，才能确保培养基的使用效果。此外，相关工作人员在调节过程中，需要耐心的操作，逐渐加氢氧化钠，以防止过量的情况发生。在进行培养基实验之前，相关研究人员也应该测试培养基的酸碱度，以防培养基内的酸碱度低于药品微生物限度检验最终要求。
1.3 制备后应该及时灭菌
此外，为了提高药品微生物限度检验的准确性，相关研究人员应该按照相关规定，对培养基进行灭菌工作，以免影响到后续的微生物限度检验工作。许多研究人员为了方便，对所有的实验对象都进行低温处理，从而达到灭菌的效果，虽然低温灭菌是一种高效的灭菌方式，并且在大多数的实验中都适用，但还是由部分细菌在低温时还能存活，因此研究人员应该在灭菌之前，先增加培养基内的酸碱度，然后用供试品稀释，确保培养基内的细菌都能受损或者致死，在实验之前，相关工作人员也应该使用高倍显示镜，来观察培养基内的情况，确保培养基内的环境适合药品微生物限度检验。[2]
2 设备的影响以及控制方法
在药品微生物限度检验过程中，使用到的设备较多，包括温度计、玻璃容器、培养箱、容量仪器，因此加强设备的管理，是减少药品微生物限度检验的重要途径。
2.1 计数误差
计数误差是药品微生物限度检验误差最常见的形式，造成这种现象，有主观原因，也有客观原因。主观原因是相关研究人员的疏忽，或者违规操作造成的，在细菌鉴别的过程中，需要按照一定的流程进行操作，并且为确保实验环境的纯净，需要事先对玻璃容器与容量容器进行消毒处理，确保容器内没有抑菌物质，由于专业素质的不足，经常会发生实验流程上的失误，从而导致计量误差，对药品微生物限度检验结果产生了不良影响。客观原因是因为菌落生长小而密集，这在一定程度上给计数工作提出了一定的难度，同时，随着培养时间的延长，菌落还会在边缘生长，这些客观原因都会导致计数误差的产生。[3]
2.2 控制方法
为了方便微生物菌落的鉴别，可以通过增加稀释液的方式，这样不仅有利于菌落的计数，还有利于菌落的对照试验。对于一些难以计数的菌落，相关研究人员可以适当的延长培养时间，从而增加细菌菌落，为了防止菌落沿着培养基的边缘生长，可以加入TTC营养琼脂，从而保证菌落与培养皿中的颗粒、沉淀物分开鉴别。
3 无菌室方面造成的误差
药品微生物限度检验通常在无菌室进行，一方面，是为了减少不可控因素的影响，提高药品微生物限度检验的准确性。另一方面，无菌室内部的洁净情况，还会直接影响到灭菌消毒的有效性，因此加强无菌室的检查，能够有效的减少药品微生物限度检验中的误差。
3.1 定期检查无菌室的空气质量是否达标
为了保证无菌室的洁净性，通常都采用臭氧消毒器来消毒，虽然臭氧消毒器具有良好的消毒效果，但还是难以保证无菌室的空气状况，因此相关工作人员应该定期检查无菌室的空气情况。[4]
3.2 严格无菌操作
在药品微生物限度检验操作之前，相关研究人员应该使用琼脂培养基放置在工作面的周围，并观察培养基内的情况，如果培养基显示无菌室的空气质量不达标，应该立即停止实验，待无菌室内部的情况满足药品微生物限度检验的要求。
4 结束语
综上所述，要减少药品微生物限度检验中的误差，需要从培养基、设备、无菌室三个方面入手，并采取有效的控制方法，使药品微生物限度检验安全、有序的进行。
参考文献
[1]陈伟盛，关倩明，朱荣峰，等.药品微生物限度检查中微生物污染的鉴定和溯源分析[J].药物分析杂志，2014，01：58-63.
[2]廖晓玲，张贞良，范积平，等.“《医疗机构制剂许可证》验收标准”有关条款难点探讨[J].中国药房，2016，13：964-966.
[3]张新妹，胡昌勤，王淑兰.欧洲药典附录2.6.12非无菌产品的微生物限度检查之一（有活力的需氧菌总数的计数）[J].中国药品标准，20
药品微生物研究范文2
建立生物风险评估体系
王国治介绍说,病原微生物的生物制品生产与质控,其潜在的风险涉及到菌毒种的保藏运输、生产过程、生产设备设施、动物效力评价、废弃物处理以及生产人员的素质等多方面。在2009年新版GMP中尽管增加了质量风险管理与评估的内容,但其主要是针对制品质量风险进行评估,而忽略了生物安全的风险管理;现有的GMP条款对部分内容做了具体的规定,但缺乏系统性,如:在从业人员疫苗接种条款中要求“根据生产制品的生物安全评估结果,应对生产、维修、检验、动物饲养的操作人员、管理人员接种相应的疫苗并定期体检”,但在生物制品GMP附录中并无相应的生物安全评估规定。缺少生物安全风险评估,就无法分析可能存在的风险及风险产生的原因,因此就无法提出风险防范措施来保证安全生产。
王国治建议建立生物风险评估体系,评估内容至少应对病原微生物的生物制品生产与质控的潜在风险所涉及到的菌毒种的保藏运输、生产过程、生产设备设施、动物效力评价、废弃物处理等方面进行风险识别,并分析其产生原因,提出防范措施以及风险再评价。
明确病原微生物分类标准
2009年新版GMP未对病原微生物的分类进行明确规定,在现行GMP实施中,生物制品菌毒种的分类管理依然采用卫生部早期颁发的《中国医学微生物菌种保藏管理方法》,将生物制品、菌苗、疫苗生产用各种减毒、弱毒菌种,分类为低致病性的四类菌毒种,而2010年版《中国药典》参考卫生部的《人间病原微生物名录》的分类标准,重新对生物制品生产用菌(毒)种进行了分类,目前,已将生物制品生产菌株中的结核杆菌、肉毒梭菌、肾综合征出血热病毒、森林脑炎病毒归入第二类,其余灭活疫苗、组分疫苗、类毒素生产用菌(毒)种归为第三类,已经批准的活疫苗与微生态活菌制剂的生产菌株为第四类。王国治认为,这意味着原生产灭活疫苗用的菌毒种的危害级别已经提高,其防护要求也应做相应提高。因而建议进一步对GMP内容进行修订,明确病原微生物分类标准。
建立生物安全管理体系
王国治表示,GMP是药品生产企业对药品质量和生产进行控制和管理的基本要求,目的是确保持续、稳定地生产出适用于预定用途、符合注册批准或规定要求和质量标准的药品,并最大限度地减少药品生产过程中污染、交叉污染以及混淆、差错的风险,但它是以产品质量为中心,对涉及病原微生物生产与质量控制中的生物安全问题未能得以充分体现,其管理体系与文件制定未与国内相关生物安全法规标准相衔接,缺少生物安全的相关规定,如:涉及病原微生物生产企业的生物安全管理体系、针对不同病原微生物生产过程中的个人防护、在操作细则中明确实验操作与使用仪器设备风险步骤与预防措施、意外事故的预案、涉及生物安全的演练、防盗防窃防丢失等生物安保措施、生物安全手册的制定等内容。
“生产企业中涉及病原微生物的从业人员以生产与质量控制的专业人员为主,其对生物安全的知识了解较少,目前的生物安全培训多局限于个人防护,随着国家对生物安全的重视与生物安全研究的不断深入,生物安全管理理念已写入国家新生物安全的标准,并已得到实施。”王国治认为,“若从业人员不在原有普及的基础上进行更新,将无法适应新标准的要求。”
药品微生物研究范文3
［关键词］生物测定；药理；药品
药品是特殊商品，药品质量直接关系到用药者的安全和疗效。药品检测方法和检测水平随着制药工业的发展不断改进提高。由于现代科学技术的发展，相邻学科之间的相互渗透，分析化学的发展经历了三次巨大的变革，使分析化学发展成为以仪器分析为主的现代分析化学。面对生命科学中复杂的分离分析任务，发展了色谱分析方法。结构分析、价态分析、晶体分析等方面的研究又促进了光谱分析的发展。以计算机应用为主要标志的信息时代的来临，仪器分析迅速发展，为药物检测提供各种非常灵敏、准确而快速的分析方法［1］。生物测定受到了极大的挑战，其发展前景令我们从事药品生物测定工作者所关注。
1药品生物的特点与业务范围
1.1药品生物测定的定义与特点药品生物测定（简称生测）是利用药品（或药品中的有害杂质）对生物（或离体器官及组织）所引起的反应来测定药品的含量或安全性的一种方法。
生测法的优点是测定的结果与医疗要求基本一致，能直接反映药品的效果或毒副作用，这是其他物理学方法或化学方法所不能达到的。因此，目前各国药典仍大都采用这一方法。
生测法的缺点是检验周期长，微生物有生长繁殖过程，动物有生理代谢过程，观察分析时间一般在2~7天，有些试验会更长。影响因素多，有生物差异性，也有系统操作误差和环境条件等造成的影响。用品用具、动物质量、仪器设备都会对结果产生影响［2］。所以，以生测主检的品种在中国药典中逐版减少。
1.2药品生物测定的业务范围中国药典是法定的药品标准，它将药品质量控制项目归为四类：性状、鉴别、检查和含量。生测的业务主要涉及到中西药品的检查类和含量类。
其中作为药品安全性检查项目最多，包括：无菌、热原、细菌内毒素、异常毒性、安全试验、急性全身毒性、过敏物质、刺激性、溶血、降压物质、微生物限度等。含量（或效价）测定包括：抗生素微生物检定法，胰岛素、硫酸鱼精蛋白、缩宫素、卵泡刺激素、黄体生成素、升压素等生物检定法。
2药品生物测定的现状
由于现代化检测仪器的广泛应用，药品生物测定的品种和范围，方法和要求，也发生了很大变化。
2.1品种和范围的变化抗生素的含量测定，最初大部分抗生素用微生物法测定含量。随着制药工业发展，提纯方法不断改进，有效组分更加明确，许多品种检测方法不断改为仪器测定和化学测定。例如：2000年版中国药典收载约219个抗生素品种，其中有15个原料药及其制剂从1995年版的化学法和微生物法改为高效液相色谱法（简称HPLC），使该法达到97种，微生物法仅有24个，其中9个品种是新增加的。有人预计本世纪初，HPLC法会发展成为中国药典使用频率最高的一种仪器分析法［3］。规定取消抗生素过期检验，抗生素微生物效价测定的业务工作量更是明显减少。
药品注射剂的热源检查。1942年美国首先将家兔法收入药典，相继世界各国药典均规定用该法。中国药典从1953年开始收载。自1973年以来，鲎试剂被证明是一种检测细菌内毒素（热原）存在的灵敏试剂。用鲎试剂要比家兔试验迅速、经济，所需样品量少，操作过程工作量小，每天可进行许多样品检测。1980年美国药典20版首载“细菌内毒素检查法”，1985年USP21版收载5种注射用水及40种放射性药品。1991年11月执行的USP22版第五增补版公布了185种药品删除家兔法，用细菌内毒素检查法代替。1995年USP23版注射剂的热源项几乎都被细菌内毒素检查法代替［4］。
我国从20世纪70年代开始研究制备鲎试剂，1988年卫生部颁布细菌内毒素检查法，1993年中国药典第二增补本收载该法，但未涉及任何品种，1995年中国药典二部正式收载，并规定了注射用水、氯化钠注射液和二十多种放射性药品并删除热源检查，以内毒素代替。2000年版中国药典进一步扩大到68种。预计2005年版中国药典还要继续增加品种，热源项都将被内毒素代替。动物试验改为生化试验。
2.2实验动物生测离不开实验动物，在实验中，为了减少生物差异，提高动物反应敏感性，以最少的动物达到最满意的结果。国家非常重视实验动物，1988年国务院颁布了《实验动物管理条件》，对实验动物的饲管、管理、使用等做出了明确规定，实行达标认证制度，严格管理。按微生物控制程度把实验动物分为四级：普通动物、清洁动物、无特殊病原体动物和无菌动物［5］。一般动物实验必须达到清洁动物标准，种系清楚，不杂乱，无规定指出的疾病。动物级别越高，饲养管理条件越严，设施投资越大。实验动物是实验研究的活试剂，既要有纯度，也要有数量，背景明确，来源清楚，符合要求才能使用。（随着药品纯度的提高，凡是有准确的化学和物理方法或细胞学方法能取代动物实验，进行药品和生物制品质量检测，应尽量采用，以减少动物的使用。）
2.3药品生物测定在方法上的改进与变化为了缩短操作时间，减少实验误差，近年来生测方面也研制并投入使用了部分仪器设备，如：抗生素抑菌圈测定仪、微机热原测温仪、集菌仪、细菌数测定仪等，减轻了工作强度，提高了工作效率，检测结果更加准确可靠。
3药品生物测定的发展趋势
生测作为经典方法沿用至今，表明它有其他方法不能替代的特点，在药品检验中发挥了重要作用。不少老产品改为其他方法控制质量，也会不断有新产品离不开生测法，我们应当充分发挥它的优点，尽量克服它的不足，开拓新的业务范围。
3.1微生物限度检查工作量大为了控制药品染菌限度，1975年美国药典19版首载微生物限度检查，1980年英国药典收载，我国在1990年由卫生部颁布了药品卫生标准及检验方法，1995年版中国药典正式收载［6］。2000年版中国药典按剂型规定了微生物限度标准，执行范围除注射剂和中药饮片外几乎包括中西药的所有制剂和原料。该项检查成为药典品种适用最多的检查
项目，占当前地市级药品检验所生测室业务工作量的80%以上。在这项检查中，有大量的业务技术需要我们进一步研究，改进试验条件，使数据准确，探讨快速检测的新方法。药包材的检查，国家药监局已经试行标准，业务范围将更加扩大，这是我们进一步做好工作，努力探讨研究的新领域。
3.2药品生物测定在中药开发中的作用我国是中药王国，2000年版中国药典一部共收载920种，其中中成药398种。有含量测定的157种，仅占总数的17%，中药成分多，杂质和干扰物质很多。复方制剂，尤其大复方制剂专属性的检出处方中所含药材很困难，有大量的研究工作需要做。中成药中的杂质如重金属、残留农药等达到一定水平会产生毒副作用，影响药物安全性［7］。要让中药制剂打进国际市场，我们在检查类的控制项目和含量类的方法探讨方面有大量工作要做，生物测定可以在毒理、药理方面进行研究、探讨，逐步完善质量控制标准，提高制剂质量发挥更大的作用。
3.3新药研制开发与安全性评价新药研制开发是多学科合作的系统工程。在获得一个具有生物活性的化合物后，研究开发组织者要在生物医学领域进行药物评价研究，首先必须组织药理学、毒理学、病理学、兽医学、遗传学、生物化学、药代动力学方面的专家进行合作研究，按药物非临床研究管理规范GLP进行管理。组织药理、毒理（包括一般毒理和特殊毒理）、病理、药代动力学和毒代动力学、药物分析、临床化学、实验动物、生物统计、质量保证等部门有关人员进行讨论，分阶段
做出评价［8］。生测在这方面可以参加开发研究或进行技术指导。
药物动力学研究，通常需要从动物体液或组织器官匀浆中分离、鉴定和检测代谢后的原粉及其他代谢产物。但是，将服药动物按指定时间间隔处死，测定随时间变化的血药浓度，不仅动物用量大，而且常因动物个体差异无法得到可靠结果，也无法在同一动物重复实验确证。处死动物的代谢产物也只能反映被处死时的结果，无法了解药物代谢的全过程。有学者报道，采用微透析取样技术，可在活的动物不同部位重复取样，用微柱液相色谱［9］或毛细管电泳［10］进行分析，测定药物的吸收、分布、代谢和排泄情况［11］。
自动进取样装置和计算机工作站应用于药理实验的探讨，使药品生物测定趋向微量、灵敏、专属、简便、快速和自动化的方向发展。
综上所述，药品生物测定是药物分析的重要组成部分，是不可缺的检测专业，现代仪器的大量使用，不仅不会影响其发展，而是如虎添翼，让药品生物测定展示出新的前景。
［参考文献］
1倪坤义，田颂九，丁丽霞.21世纪药物分析学的发展趋势.中国药学杂志，2000，35（12）：798.
2张治锬.抗生素药品检验.北京：人民卫生出版社，1991，12-20.
3田颂九，丁丽霞，田洁.国内外药典中质量标准的发展趋势简述.中国药学杂志，1999，34（11）：781.
4吴伟洪.鲎与鲎试验法论文汇编（三）.厦门鲎试剂厂，1996，18.
5施新猷.医学实验动物学.西安：陕西科学技术出版社，1989，32.
6马绪荣，苏德模.药品微生物学检验手册.北京：科学出版社，2000，59.
7李真，龚培力，曾繁典.药物杂质及其对安全性的影响.中国临床药学杂志，2001，17（6）：452.
8刘昌孝.美国新药研究开展与药物安全性评价研究概况.中国药学杂志，1999，34（11）：785.
9ChenAQ,LunteCE.Microdialysissamplingcoupledon-linetofastmicroboreliquidchromatography.JChromatogr,1995,691（1-2）:29.
药品微生物研究范文4
关键词：微生物学;教学改革;制药工程专业
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2016）42-0128-02
一、目前存在的问题
我校制药工程专业将专业定位成工程类，开设了较多工程类的课程，对微生物学这门课程不够重视;该课程设置为专业选修课、考查课;缺少实践环节;缺少专业特色。使学生走进“制药工程只需要面对制药的仪器设备，知道制药的工艺就可以了，微生物学对我们专业没用”的误区。导致学生学习微生物学的动力和兴趣都不高。因此，有必要对制药工程专业微生物学的教学内容、教学方法等方面进行改革和思考，帮助学生走出误区。
目前关于制药工程专业的微生物学教学的探讨相对较少，仅从教材和实验教学有少量探讨。因此结合铜仁学院制药工程专业教学课时较少，缺少实践部分教学安排，考核方式为考查等课程设置中出现的问题，课题组从教学内容、教学方式、教学手段、考核方式等方面对该专业微生物学课程教学进行了有益的探索，为促进制药工程专业微生物学教学的完善，为培养应用型人才奠定坚实的基础。
二、选择教材和教学内容
1.教材选定。教材选择方面充分考虑铜仁学院制药工程人才培养方案的设置，突破原有的一门课程一本教材的固有观念。选择满足既要基础知识又要专业应用相关知识的专业需求的教材。但目前尚无专门针对制药工程专业的微生物教材。因此，初步确定教材选用黄秀梨主编的《微生物学》与沈关心主编的《微生物学与免疫学》。
2.教学内容选定。（1）理论教学内容。教学内容选择主要从帮助学生建立系统的微生物学概念，以及联系药物的生产实际，理解微生物与药物及药物生产的关系两个方面着手考虑。黄秀梨主编的《微生物学》的内容作为微生物学基础知识部分，帮助学生建立有菌、无菌、什么菌的概念和意识;掌握微生物生长和繁殖、代谢，微生物控制、菌种保藏等制药工程专业密切相关的微生物基本知识。沈关心主编的《微生物学与免疫学》的内容作为微生物在制药专业中应用的知识，帮助学生了解药物生产过程中微生物的影响和处理方式、微生物药物的重要地位、研究步骤、生产过程;了解常见的病原微生物等。结合专业特点深入介绍微生物在制药中的应用对制药过程的影响;有害微生物的控制;抗生素的制备及应用;微生物其他产物在制药中的应用;药品的微生物学质量控制;药品的微生物学质量控制等微生物在制药应用的相关知识。（2）实践教学内容。铜仁学院制药工程专业也同其他大多数高校的制药工程专业一样忽略了微生物学在制药工程中的重要性，课程中未设置实验课程。为帮助学生掌握微生物学的基本实验机能，增加了实验课，主要包括培养基制备、接种、培养，自然界纯种微生物分离，细菌检查及其生理生化反应，菌种保藏等以微生物控制为基础的实验课程。使学生掌握微生物研究与应用的基本技术，培养学生发现问题、独立思考与创新思维能力，增加学生就业面。
三、合理的教学方法
在教学过程中，同时针对不同的内容，采取不同的教学方法。总体思路为基于学生已有的知识，以微生物在制药工程中应用的实例为主线引导学生主动学习书本知识。让学生感受到微生物在自己专业中是如何应用，引起学生对微生物学的兴趣，再讲解基本原理等重点和难点。
1.探讨式。借鉴慕课的教学方式，学习之前先提出问题或案例，要求学生课前进行学习，课堂上分组就问题或案例用微生物学知识进行讨论讨论。例如抗生素头孢的生产，在课前首先提出分组查阅头孢的生产过程、生产菌株，产生的机理，生产过程中微生物需要如何控制，如何确定药品的质量等内容，再回到课堂就自己查阅到的知识与同学交流、探讨。以此活跃课堂气氛、引起学生浓厚的兴趣。对于学生不懂的知识，充分利用学生已有的知识逐步引导学生理解，取得了很好的教学效果。
2.研究式。教学过程中注意将最新的研究引入到教学中，丰富和更新教学内容，提高教学效果。通过建立以科研辅助教学，以教学促进科研的互补的模式。引导学生培养科研思维、学习科学研究方法。鼓励有兴趣的学生参加教师的科研项目，参与锻炼动手操作，发现问题、解决问题的能力，提高学生的科研素质。
3.自学式。对于内容相对简单，学生容易理解，并且有较多获得渠道的部分章节选择由学生自学，利用少量的课堂时间，让学生上讲台讲解自己学习的知识。既可以促进学生自主学习的兴趣，同时还能锻炼学生表达能力、语言组织能力，帮助学生克服怯场或胆小的问题，提高学生的自信。
四、多样化教学手段
根据微生物学的特点，在教学过程中借用现代化手段，帮助学生理解。将文字、图片、动画、视频、声音等手段将内容简洁、直观地展现在学生面前。节约时间的同时进一步提高学生学习兴趣。
五、考核
通过教学内容的选择，教学方法的搭配虽然能在一定程度上提高学生学习兴趣，促进学生自主学习;但尚不足帮助学生合理分配学习压力。需要通过合理设置考核方式、考核内容，将学习压力分散到学期的各个时段。考核分为平时考核与期末考核两部分，比例为平时考核50%;期末考核50%。平时考核中包括4次课堂考核占50%，平时作业，课堂讨论，课堂讲解，考勤、平时回答问题分别占10%;期末考核包括期末笔试和实验考核分别占70%和30%。实验考核通过期末操作考核体现。可提高学生对实验的重视。
药品微生物研究范文5
【关键词】 苯甲醇辅料； 微生物限度； 薄膜过滤法； 方法学验证
【Abstract】 Objective：To establish a method of microbial limit test for pharmaceutical excipient benzyl alcohol and make a applicability test for this method.Method：The test method was carried out according to the raw material and pharmaceutical excipient’s requirements in volume Ⅳ of Chinese Pharmacopoeia 2015.The membrane filtration method was applied to the tests for total viable aerobic count，total combined yeasts and molds count detection and specified bacteria.The bacteria，fungi or yeasts count method for microbial limit test was validated as described above for each of the microorganism tested.And the method for specified bacteria test was also validated.Result：The results showed that the recovery ratios of all the tested strains were in accordance with the acceptance criteria of the pharmacopoeia and the method for specified bacteria test was reliable.Conclusion：The method is suitable for the microbial limit test of pharmaceutical excipient benzyl alcohol.
【Key words】 Pharmaceutical excipient benzyl alcohol； Microbial limit test； Membrane filtration method； Method validation
First-author’s address：Jiangxi Institute for Drug Control，Nanchang 330029，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2017.04.013
微生物z查作为药品安全的重要指标，其标准制定也随着药品产业的发展及对药品质量高要求的需求而不断提高。2015年版《中国药典》对微生物限度检查法做了较大的修订，新版药典将2010年版药典附录中的Ⅺ J微生物限度检查法拆分为三个部分，分别为微生物计数法、控制菌检查法和微生物限度标准[1]。其中检验所用实验菌液、检验方法、培养基、培养温度等都做了不同程度的更改。新版药典更加关注生产过程中的微生物控制，在药品生产、储藏和流通各个环节中，药品生产企业均应严格遵循GMP的指导原则。制剂、原料及辅料、中药提取物及中药饮片的微生物限度与2010年版《中国药典》比较给出了具体的限度标准。本文按照2015年版《中国药典》的操作要求及指导原则，对苯甲醇药用辅料微生物限度检查法进行研究及适用性实验，以确定出适宜、有效的检查方法[2]。苯甲醇也称苄醇，英文名Benzyl alcohol，是最简单的含有苯基的脂肪醇，苯甲醇为无颜色透明液体，有微弱的芳香气味，稍溶于水，易溶于乙醇、乙醚、氯仿等有机溶剂[3-4]。苯甲醇用途广泛，主要应用于环氧树脂及涂料领域，也广泛应用于日化、食品、医药等领域。近年来随着相关行业的发展，国内外对苯甲醇的需求量不断增加，2011年医药领域苯甲醇的消费量约为1200 t。由于其具有麻醉、镇痛的功效，苯甲醇在制剂中用作防腐剂和局部止痛剂，但因不良反应较大，婴儿使用时有过致死案例，目前主要用作防腐剂。
1 仪器与材料
1.1 仪器 BKQP-50L型高压蒸汽灭菌器（济南博鑫生物技术有限公司）；M1-211A微波炉（美的集团有限公司）；XP-S电子天平（梅特勒-托利多仪器上海有限公司）；SW-CJ-2D净化工作台（苏州净化有限公司）；Heal Force-900C 生物安全柜（上海力申科学仪器有限公司）；HWS-250恒温恒湿实验箱（天津市莱玻特瑞仪器设备有限公司）；3758CN低温培养箱（赛默飞世尔科技中国有限公司）；HH.S21-6电热恒温水浴锅（上海博讯实业有限公司）；ZW-2008智能集菌仪（温州维科生物实验设备有限公司）；薄膜过滤器（浙江泰林生物技术股份有限公司）。
1.2 主要试剂 苯甲醇，批号：20151201、20151202、20151203三个批次，由江西阿尔法高科药业有限公司提供；培养基有：胰酪大豆胨液体培养基，批号160119；胰酪大豆胨琼脂培养基，批号160128；沙氏葡萄糖琼脂培养基，批号160119；沙氏葡萄糖液体培养基，批号151222；肠道菌增菌液体培养基，批号：160203；紫红胆盐葡萄糖琼脂培养基，批号160614；麦康凯液体培养基，批号160511；麦康凯琼脂培养基，批号160511；甘露醇氯化钠琼脂培养基，批号151124；溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基，批号151102，以上培养基均来源于北京陆桥技术有限责任公司。实验菌种有：枯草芽孢杆菌[CMCC（B） 63501]、金黄色葡萄球菌[CMCC（B） 26003]、铜绿假单胞菌[CMCC（B） 10104]、大肠埃希菌[CMCC（B） 44102]、白色念珠菌[CMCC（F） 98001]、黑曲霉[CMCC（F） 98003]，以上菌种均购自中国药品生物制品检定所。
1.3 验证方法
1.3.1 实验菌株菌液制备 将金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、大肠埃希菌的胰酪大豆胨液体培养基置35 ℃培养24 h，分别取以上新鲜培养物各1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-3～10-7，做活菌计数备用。将白色念珠菌的沙氏葡萄糖液体培养基置25 ℃培养2 d，取新鲜培养物1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。将黑曲霉的沙氏葡萄糖琼脂培养基置25 ℃培养7 d，加5 mL 0.9%无菌氯化钠溶液将黑曲霉孢子洗脱，吸取出孢子悬液1 mL，用0.9%无菌氯化钠溶液适量稀释，用标准比浊管比浊，其浊度与标准比浊管相比后，取1 mL稀释后的孢子悬液，用0.9%无菌氯化钠溶液10倍稀释至10-2～10-4，做活菌计数备用。
1.3.2 供试液制备 取供试品10 mL，置无菌锥形瓶中，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液稀释至100 mL，混匀，作为1∶10供试液，备用。
1.3.3 细菌、霉菌及酵母菌数计数适用性实验
1.3.3.1 实验组 （1）需氧菌计数：取上述1∶10供试液1 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的实验菌（金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌、白色念珠菌、黑曲霉），滤干，转移滤膜菌面朝上贴于胰酪大豆胨琼脂平板上，实验平板置35 ℃培养箱培养。金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、铜绿假单胞菌培养3 d，白色念珠菌、黑曲霉分别培养5 d，逐日观察平板生长情况。（2）霉菌和酵母菌计数：取上述供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，在最后一次冲洗液中加入不大于100 cfu的实验菌（白色念珠菌、黑曲霉），滤干，转移滤膜菌面朝上贴于沙氏葡萄糖琼脂平板上，实验平板置25 ℃培养箱培养5 d，逐日观察平板生长情况。
1.3.3.2 供试品对照组 取上述1：10供试液，以稀释液代替菌液，同实验组操作，测定供试品本底菌落数。
1.3.3.3 菌液对照组 取相应稀释液替代供试液，同实验组操作加入实验菌液并进行微生物回收实验。
1.3.3.4 判断标准 计数方法适用性实验中，实验组菌落数减去供试品对照组菌落数的值与菌液对照组菌落数的比值应在0.5～2范围内。
1.3.4 控制菌检查方法的适用性实验
1.3.4.1 金黄色葡萄球菌检查 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，加入不大于100 cfu金黄色葡萄球菌实验菌（将实验菌加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，取上述培养物划线接种于甘露醇氯化钠琼脂培养基平板上，35 ℃培养72 h，观察平板生长情况。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照金黄色葡萄球菌检查法操作。
1.3.4.2 铜绿假单胞菌检查法 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤，用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，加入不大于100 cfu铜绿假单胞菌实验菌（将实验菌加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，35 ℃培养24 h，取上述培养物划线接种于溴化十六烷基三甲铵琼脂培养基平板上，35 ℃培养72 h，观察平板生长情况。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照铜绿假单胞菌检查法操作。
1.3.4.3 大肠埃希菌检查法 实验组：取上述1∶10供试液10 mL，置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，滤干，取膜置于100 mL胰酪大豆胨液体培养基中，同时加入不大于100 cfu的大肠埃希菌液，35 ℃培养24 h，取上述培养物1 mL接种至100 mL麦康凯液体培养基中，42 ℃培养24 h。取麦康凯液体培养物划线接种于麦康凯琼脂平板上，35 ℃培养48 h。取麦康凯琼脂平板上菌落划线接种于营养琼脂平板进行分离纯化，经纯化后的培养物，接种至含5 mL MUG培养基的试管内，培养，于5、24 h在366 nm紫外线下观察，同时用未接种的MUG培B基作本底对照。观察后，沿管壁加入数滴靛基质试液，观察MUG培养基颜色变化。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照大肠埃希菌检查法操作。
1.3.4.4 耐胆盐革兰阴性菌检查法 实验组：将上述1：10供试液置于25 ℃预培养2 h。取上述预培养供试液10 mL（2份），置薄膜过滤器中，采用薄膜过滤法，每筒用pH 7.0无菌氯化钠-蛋白胨缓冲液300 mL分3次冲洗，分别加入不大于100 cfu的大肠埃希菌液和不大于100 cfu的铜绿假单胞菌液（将实验菌液加入最后一次冲洗液中），取膜置于100 mL肠道菌增菌液体培养基中，35 ℃培养箱中培养48 h后，上述培养物划线接种于紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上，置35 ℃培养24 h，观察平板生长情况。若紫红胆盐葡萄糖琼脂平板上有菌落生长，代表检出耐胆盐革兰阴性菌。阴性对照组：取稀释液10 mL替代1∶10供试液，照耐胆盐革兰阴性菌检查法操作。
2 结果
2.1 需氧菌、霉菌及酵母菌计数方法适用性实验结论 在三次独立的需氧菌计数方法适用性实验中，5种菌株的回收比值均在0.5～2.0范围内，符合药典规定。因此可照此方法测定苯甲醇的需氧菌总数。在三次独立的霉菌和酵母菌计数方法适用性实验中，白色念珠菌和黑曲霉的回收比值均在0.5～2.0范围内，符合药典规定。因此可照此方法测定苯甲醇的霉菌和酵母菌总数。见表1。
2.2 控制菌检查方法学适用性实验结论 在进行金黄色葡萄球菌检查、铜绿假单胞菌检查、大肠埃希菌检查和耐胆盐革兰阴性菌检查四种控制菌的适用性实验中，实验组均检出阳性实验菌，阴性对照组无菌生长。因此，可照此方法进行苯甲醇的控制菌检查。见表2～5。
3 讨论
与2010年版药典相比，2015年版药典在微生物控制方面做了很大幅度的改变。新版药典将“方法验证”改为了“方法适用性”，适用性是把实验条件、供试品等因素作为一个整体来评价，更为完整科学。新版药典中的培养体系也有变化，首先是培养基的改变，需氧菌计数所使用的培养基为胰酪大豆胨琼脂培养基[5-9]，霉菌和酵母菌计数使用沙氏葡萄糖琼脂培养基。培养温度也做出了适当的调整，需氧菌计数培养温度由35～37 ℃调整为30～35 ℃，霉菌和酵母计数培养温度由25～28 ℃变为20～25 ℃。测试菌株也发生了改变，采用金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌和铜绿假单胞菌三株菌进行方法适用性实验，其中铜绿假单胞菌替换了2010版药典中的大肠埃希菌。而且需氧菌计数的适用性实验中，需要使用5种菌株，相较于2010版药典的3菌株增加了白色念珠菌和黑曲霉[10-11]。此外，计数回收方法中增加了新的检测方法-MPN法，可作为平板计数法和薄膜过滤法不适用时的补充。
控制菌检查方面，新版药典控制菌检查法除梭菌和白色念珠菌外，其余检查指标在预培养和增菌培养这一步骤中都统一使用了胰酪大豆胨液体培养基，大大方便了实验操作。新版药典新增了耐胆盐革兰阴性菌的检查，替代了《中国药典》2010年版的大肠菌群的检查。在各控制菌项下，生化实验和“应进行分离、纯化及适宜的鉴定实验”改为“采用其他适宜方法进一步鉴定”，检测方法更加灵活多变，实验室可以根据自身情况灵活选择适宜的方法，调高检验效率和结果可靠性[12-14]。
药用辅料是药品重要的组成部分，它们的质量关系到所有药品的安全性[15-16]。与原版药典相比，2015年版药典对原料及辅料的微生物限度控制更加严格规范[17-18]。《中国药典》2010年版附录ⅪJ微生物限度检查法中对“原料及辅料”的微生物限度的描述为“参照相应制剂的微生物限度标准执行”[19]。而《中国药典》2015年版四部1107非无菌药品微生物限度标准中，第5点明确规定了“非无菌药用原料及辅料的微生物限度标准”[20]。其中，需氧菌总数限度为103 cfu/g或cfu/mL，霉菌和酵母菌总数限度为102 cfu/g或cfu/mL。控制菌未做统一规定，需要根据原辅料及其制剂的特性和用途、制剂的生产工艺等因素检查具有潜在危害的微生物[17-18]。由于苯甲醇为药用辅料，考虑在医药领域中苯甲醇主要作为防腐剂、局部止痛及药物溶剂作用，实验设计控制菌检查大肠埃希菌、铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌和耐胆盐革兰阴性菌检查。
苯甲醇作为防腐剂广泛应用于药品制剂中，为更好的控制本产品的质量，本研究建立了其微生物检查方法，并对方法适用性进行了研究。由于苯甲醇作为防腐剂具有一定的抗菌作用，采用平皿法进行需氧菌总数计数适用性实验时，发现本品对实验菌株具有较强的抑制能力，回收率比值达不到要求。为消除苯甲醇的抑菌干扰，本文采用薄膜过滤法进行菌落计数检查和控制菌检查，保证实验结果的准确性和科学性，从而保证临床用药安全有效。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（四部）[S].中国医药科技出版社，2015：140-153.
[2]孙占松.国内苯甲醇生产及应用分析[J].精细与专用化学品，2012，20（12）：12-14.
[3]吕秋军，曹萍.药用辅料的不良反应及其安全性管理[J].药物不良反应杂志，2010，12（6）：410-414.
[4]廖彬，刘雁鸣，龙海燕，等.气相色谱法测定药用辅料苯甲醇的有关物质[J].中国药师，2015，18（8）：1315-1319.
[5]杨晓莉，李辉，马英英，等.《中国药典》2015年版非无菌产品微生物限度检查：控制菌检查法解读与对策[J].中国药师，2016，19（4）：748-752.
[6]杨晓莉，李辉，马英英，等.中国药典2015年版非无菌产品微生物限度检查：微生物计数法解读[J].药物分析杂志，2016，36（6）：1101-1107.
[7]冯震，范一灵，杨美成.《中华人民共和国药典（2015年版）》（四部）中微生物检验相关通则的增、修订情况介绍[J].上海医药，2016，37（7）：11-15.
[8]唐菱，侯晓军，周剑，等.硫酸新霉素凝胶微生物限度检查方法的适用性试验[J].中国抗生素杂志，2016，41（9）：680-683.
[9]吴朝阳.浅谈注射剂中抑菌剂引起的不良反应[J].中国医学工程，2012，20（3）：180.
[10]姚静.药用辅料应用指南[S].中国医药科技出版社，2011：157-159.
[11]国家药典委员会.中华人民共和国药典（二部）[S].中国医药科技出版社，2010：附录107-116.
[12] The United States Pharmacopoeial Convention.United States Pharmacopoeia35th Edition （USP35） and National Formulary30th Edition（NF30）[S].The United States by United Book Press，Inc，Baltimore，MD，2012：1713-1715.
[13] The Council of Europe and Council DE L’ Euerope.European Pharmacopoeia7th Edition（EP7.0）[S].Acid-free paper by Druckerei C.H.Beck，Nordlingen，2011：1469-1470.
[14] Japanese Pharmacopoeial committee.Japanese Pharmacopoeia16th Edition（JP16）[S].The Minister of Health，Labor and Welfare，2011：432-433.
[15]_明生，高天蕙.药剂辅料大全（第二版）[M].成都：四川科学技术出版社，2006：1088-1089.
[16]周国斌.中国药品检验标准（操作规程）[S].中国医药科技出版社，2010：附录310-325.
[17]宋永熙，赵炜镭.注射用添加剂引起药物不良反应事件原因与对策[J].药事管理，2010，45（5）：396-398.
[18]李雪.药品在微生物限度检验中的误差影响因素[J].药物研究，2016，11（3）：12-14.
[19]张海燕，邬伟魁，宋民宪，等.《中国药典》2010年版药用辅料标准探讨[J].中国实验方剂学杂志，2011，17（11）：289-291.
药品微生物研究范文6
论文摘要：随着科技发展和人们生活水平的提高，食品安全和卫生已经成为人们关注的焦点。近年来国际卫生组织非常关注食品微生物污染问题，食品微生物检验成为了食品质量安全控制方面的重要技术之一，对控制微生物引起的食源性疾病具有重要作用。本文从分析食品微生物检验应注意的问题入手，来探讨食品微生物检验的内容和技术，为食品微生物检验技术的发展做出贡献。
一、食品微生物检验应注意的问题
1、操作人员的选用和操作要求
实验室应当聘请具有一定微生物学资质的人来操作，并且要经过考核合格后方能上岗。要求其具有较熟练的操作技能，强烈的质量意识，并且严格遵守无菌操作规程，减少人为因素带来的困扰。
操作要求：(1)操作人员牢记无菌观念，整个过程要求无菌操作，严格按照 GB／T4789食品微生物检验标准进行操作。(2)用无菌工具无菌操作取样。(3)按照 GB／T4789标准方法进行数据处理，得出实验结果。
2、设施设备的放置环境
实验室应当具有适宜微生物检验进行的设施设备条件，包括检测设施及辅助设施，并且要特别注意特殊的设备要在特殊的环境下放置和操作。
3、各种设备及药品的正确配置
(1)培养箱、水浴锅 、于热灭菌箱和高压灭菌锅的安装要求：①在首次安装时要校对温度的稳定性和一致性。②记录以上设施其温度稳定性达到平衡时所需要的时间。③要求定期对以上设备进行清洁和消毒。④最好是使用感应器来对运转循环情况进行控制和监控。
(2)药品配置：①培养基采用高压湿热灭菌法，121℃灭菌15分钟。②部分培养基如胆硫乳培养基则需采用煮沸灭菌法。③对于热敏感的培养基采用膜过滤法。
4、样品的采集、运输和保存
采集具有代表性的样品，并且样品采集必须在无菌操作下进行，以防止样品受到外源性污染和细菌的生长。采样用具及包装物必须是灭菌的。在样品的运输和保存过程中应避免日光照射，防止外来物的污染。采样后，应将样品在接近原有贮存温度条件下尽快送往实验室检验。运输时应保持样品完整。一般不应超过3小时。如不能及时运送，应在接近原有贮存温度条件下贮存。
二、食品微生物检验内容和技术
食品微生物检验的内容有以下几类 ：
1、对食品污染程度指示菌的检验。(1)细菌总数又被称为菌落总数，指食品及生活饮用水检样经过处理，在一定条件下经过培养后，所得 1g或1mc检样中所含细菌菌落个数，是判断食品及生活饮用水被污染程度的重要指标。(2)大肠菌群系指一群在37℃培养24h后能发酵乳糖、产配、产气、需氧或兼性厌氧的革兰氏染色阴性无芽孢杆菌。其主要来源于人和牲畜的粪便，所以研究中经常采用粪便污染指标菌来评价生活饮用水及食品的卫生质量。
2、对食品中致病菌的检测。在GB4789食品微生物学检验标准中，已明确规定某些微生物的数量，所以我们除要检测食品污染程度指示菌，如菌落总数、大肠菌群(MPN)的测定外，还有致病菌如金黄色葡萄球菌、沙门氏菌和志贺氏菌等。
食品微生物检验的技术
多年以来，对食品微生物的检测，通常采用琼脂平板培养法，共需2—3d才能完成。近几年各国的许多机构和学者都致力于快速检测技术和方法的研究，已改进和开发了一些快速的检测技术和方法，提高了食品微生物检验的高效性、准确性和可靠性，其中新方法有以下几种。
1、采用电阻抗法。其原理是细菌在培养基内生长繁殖的过程中，将会使培养基中的火分电惰性物质如碳水化合物、蛋白质和脂类等，代谢为具有电活性的小分子物质，其能增加培养基的导电性，从而使阻抗发生变化，所以我们可以通过检测培养基的电阻抗变化情况来判定细菌在培养基中的生长繁殖特性，即可检测出相应的细菌。该法已用于霉菌、大肠杆菌等细菌的检测。
2、采用快速酶触反应及代谢产物的检测。细菌在生长繁殖过程中可合成和释放某些特异性的酶，所以根据其特性来选用相对应的底物和指示剂，并记录反应的结果。如美国3MPetiffilmTM微生物测试片可分别快速测定细菌总数、金黄色葡萄球菌等。
3、采用分子生物学技术。其又包括两种技术：(1)核酸探针技术。根据碱基互补的原则，用特定的方法测定标记物。(2)聚合酶链式反应 (PCR)技术。其原理为通过加热使双链 DNA经裂解成两条单链，成为引物和 DNA聚合酶的模板；然后降低温度，使寡聚核苷酸引物与 DNA分子上的互补序列退火。一般情况下退火温度越高，扩增特异性越好。
4、采用免疫学方法检测细菌抗原和抗体的技术。其有三种技术：(1)荧光抗体检测技术 (IFA)，包括直接法和间接法。直接荧光抗体检测法是在检样上直接滴加已知特异性荧光标记的抗血清，经洗涤后在荧光显微镜下观察结果。间接法是在检样上滴加已知细菌特异性抗血清，待作用后经洗涤，再加入荧光标记的抗体后在荧光显微镜下观察结果。(2)免疫酶技术 (EIA)，其是将抗原、抗体特异性反应和酶的高效催化作用原理结合，是一种新颖且实用的免疫学分析技术。通过共价结合将酶与抗原或抗体结合，形成酶标抗原或抗体，或通过免疫方法使酶与抗酶抗体结合，形成酶抗体复合物。(3)免疫磁珠分离法 (IMS)，即应用抗体包被的免疫磁珠，用一个磁场装置收集铁珠。
5、采用仪器法。(1)微型全自动荧光酶标分析仪(Mini—VIDAS)，其主要采用具有优异的敏感性和特异性的酶联荧光技术(ELFA)，所测的荧光与抗体中抗原的含量成正比。(2)全自动微生物分析系统 (Vietk—AMS)。其可以同时对60-~480个样品进行分析，并且鉴定时间只需 2～3h，这是效率非常高的一个检验系统，并且也是今后食品微生物检验技术发展的一个方向。
三、总结
总而言之，我们在对食品微生物检验时要遵守职业道德，严谨科学态度，注意各个环节来确保微生物检验数据的准确性，为食品卫生和安全提供可靠的依据。并且随着现代技术的发展，今后食品微生物检验技术的发展方向会是：(1)采用快速和大批量的检验方法，来提高检验效率；(2)形成标准化的实验条件；(3)提高和保证检验的精度和灵敏度。
参考文献：
[1] 张洁梅.食品微生物检验技术的研究进展[J].现代食品科技，2005，21，(2):221-222.
