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细胞生物学的研究范文1
【关键词】细胞生物学；教学模式；
【前言】细胞生物学是生命科学中既基础又前沿的一门学科，它是我国基础学科发展规划中的四大基础学科之一[1]。细胞生物学是生命科学各个分支学科在细胞层次上的交汇，它从显微、亚显微和分子水平对细胞的各种生命活动开展研究，进而探讨人体细胞结构、功能、发生、发展、衰老和死亡的生命活动规律及发病机理，是高等医学院校的核心主干课程之一。
进入21世纪以来，细胞生物学的研究发展迅猛，新知识、新方法、新成果层出不穷，传统的以教师为主的课堂教学模式已无法满足新形势下培养高素质人才的要求[2]。如何在有限的课堂教学学时内，切实提高教学质量与效果，让学生在完整系统地掌握细胞生物学基础知识的同时，及时了解细胞生物学的最新研究进展及其在临床医学中的应用，是目前亟待解决的问题。因此，对现有的教学手段和方法进行优化与改革，探索出符合时代要求的新的细胞生物学教学模式势在必行。
1、高等医学院校细胞生物学的教学现况
目前，大多数医学院校的细胞生物学理论教学存在两个主要问题：一是学时少，二是内容繁杂、抽象、枯燥且知识点琐碎。作为医学基础的必修课程，我校的细胞生物学安排在大学一年级的第二学期，理论授课采用大班（130人左右）传统的讲授式教学法（LectureBasedLearning，LBL），即以教师为中心，以系统授课为导向的教学方法，这一方式虽可以系统讲解基础知识，但不利于学生自主学习能力的培养[3-4]。而病例教学法（CaseBasedLearning，CBL）是以典型病例为先导，将临床与相关基础问题相结合，以学生为主体的启发式教学方法[5-6]。这种教学方式虽能克服LBL的不足，提高学生的学习主动性和积极性，但是否适合在超过百人的大班授课过程中实施，仍有待商榷。针对我校现存的细胞生物学的教学现状，我们采用CBL与LBL相结合的教学方法，以期探索出适合我校的切实可行的细胞生物学教学模式。
2、引入临床案例，提高学生的学习兴趣
我校临床医疗专业的细胞生物学理论教学只有28学时，学时相对紧张，因此我们在授课方式上采用灵活多变的教学模式。对于教材中理论性较强，通俗易懂的知识，仍采用传统的LBL方式讲授，而对于一些难点、重点且与临床结合紧密的知识点则采用CBL模式。在CBL教学过程中，案例的选择与问题的设计是关键。教师在备课过程中，搜集与授课章节密切相关的常见病例，查阅文献资料，对病例进行适当的修改和补充，进而编写成教学病例，并设计相关问题。例如在讲授细胞膜物质运输时，引入“家族性高胆固醇血症”，引导学生学习受体介导的胞吞作用；利用“矽肺”病例，讲解溶酶体膜稳定性的重要；通过囊性纤维化（CysticFibrosis，CF）病例分析，引导学生学习蛋白质在内质网腔中正确折叠的重要性。CBL改变了传统的教师讲、学生听的教学模式，学生成为案例分析和课堂讨论环节中的主体。学生通过学习、研究案例来掌握基础理论知识，变抽象为具体，而不再是死记硬背单一的知识点，这充分调动了学生学习的主观能动性，提高了学生的逻辑推理能力，同时也促进了其分析问题、解决问题能力的逐步提升，对学生综合素质的培养及日后从事临床工作颇有益处。
3、多媒体教学和网络学习相结合
医学细胞生物学的某些理论知识相对抽象、晦涩，因此在以LBL为主进行授课时，PPT课件的制作至关重要。我们力求在每一章节的授课过程中将图片、动画与视频相结合，图文并茂，充分调动学生的学习兴趣，从不同的角度吸引学生的注意力。在充分利用多媒体这一教学手段的同时，我们还利用学校覆盖全面的无线网络，将教学过程延展到校园的每一个角落。目前，我校的细胞生物学已成功获批辽宁省精品资源共享课，课程建设已顺利完成。因此，教师可以将教学网站提供给学生，方便学生及时查阅PPT课件、课后自测习题、拓展学习等教学相关资料。同时，我们的SPOC网络教学平台也于2018年3月建设完成并投入使用，该平台的应用进一步夯实了网络教学基础，也在一定程度上解决了课堂教学学时紧张的问题。另外，我们还建立了细胞生物学教研室的教学公众号，定期推送细胞生物学研究的最新进展，课后教师和学生还可以利用微信群和QQ群进行交流与学习的互动。
4、优化理论教学内容，拓展研究型课堂
作为医学基础课程，细胞生物学与生物化学、生理学等其他课程的内容有部分的重叠和交叉，为了避免不必要的重复，保证细胞生物学与其他课程知识的紧密衔接，教研室与相关课程的授课教师进行沟通，删减医学细胞生物学与其他学科的部分重复内容，合理安排教学章节。同时，在教学过程中有选择地补充了与本课程密切相关的科研进展，引导学生利用课外时间查阅相关文献，了解本学科最新的相关研究进展，逐步深化、拓展研究型教学，提高他们自主学习的积极性和主动性。
5、反馈与评价
在2017年、2018年学期末课程结束后，我们连续两年分别在2016级和2017级临床医学专业的260名学生中发放调查问卷，对教学过程和教学效果进行评价。问卷发放260份，收回有效问卷254份，有效回收率为97.7%。通过对问卷进行整理分析，得出以下调查结果：95.8%的学生认为开设细胞生物学课程非常必要或有必要；95.5%的学生认为非常必要或有必要建立网络教学平台；98%的学生认为在教学中介绍临床相关知识非常必要或有必要；97.4%的学生认为非常必要或有必要在教学中介绍相关的研究进展和热点问题；87.7%的学生喜欢并接受CBL与LBL相结合的教学模式，其中有92%的学生认为这种教学模式可以充分激发自己的学习兴趣，但有21.4%的学生认为这种教学模式在对基础知识的系统掌握和理解方面无显着促进作用；87%的学生认为CBL与LBL相结合的教学模式可以明显提高或提高自学能力在调查中，学生还结合自己的体验对细胞生物学的教学提出了一些建议和意见，也在一定程度上反映了我们在教学方面存在的不足和问题。
综合分析调查结果和学生提出的合理化建议、意见，我们将采取下列改进措施：由于授课对象是大一学生，学生相关的专业知识储备不足，因此在选择课堂教学案例时，应尽量选择典型而浅显的病例，并请教临床的医生，进行更为准确的描述，重新撰写案例分析，结合实际教学情况完善教学案例素材；课堂教学及时补充与案例相关的知识点，逐步提升学生自主学习的主动性和积极性；进一步完善网络教学平台建设，并配备专业人员进行平台监管，真正实现师生时时互动，充分发挥网络资源的空间延展性。
总之，教无定法，因材施教。教学工作就是一个不断优化的过程。在与学生的交流和互动过程中，我们将不断总结反思，探索前行，选择真正适合学生的教学模式，不断完善教学过程，切实提高教学质量，培养学生成为符合时展需要的新型医学人才。
【生物博士论文参考文献】
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细胞生物学的研究范文2
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申明:本网站内容仅用于学术交流，如有侵犯您的权益，请及时告知我们，本站将立即删除有关内容。 摘要：随着我国教育事业的不断发展和新课改的不断推进，对高中生物课堂教学的教学策略也提出了新的要求。依照高中生物新课程理念，对课堂教学过程进行优化、对教学方式进行完善、对教学策略进行研究已成为高中生物教学发展的重中之重，因为只有这样才能不断提高高中生物教学的实效性，提高学生的生物学习水平。本文对高中生物《组成细胞的分子》教学策略进行研究。 关键词：高中生物 《组成细胞的分子》 教学策略
《组成细胞的分子》是人教版高中六册课本中必修第一册《普通高中课程标准实验教科书生物1（必修）分子与细胞》第二章的课程内容，这一章节在高中生物课程的学习中有着及其重要的作用，该章是学习第一册教材其它章节、其它必修模块以及选修模块的知识基础，是培养学生探究、绘图、实验等技能的基础。所以研究如何上好这一章的内容对整个高中生物课程教学都有着极其重要的作用。
一、教学课时安排策略
《组成细胞的分子》这一章的内容主要分为细胞中的元素和化合物、生命活动的主要承担者─蛋白质、遗传信息的携带者─核酸、细胞中的糖类和脂质、细胞中的无机物这五个小节。建议教师每一节课对应一课时来进行讲解，再加上其中两节有实验课，每节实验课一课时，则这章的内容至少要七课时来完成教学计划。为了循序学生由易到难的认知规律，建议把第一节《细胞中的元素和化合物》和最后一节《细胞中的无机物》放在一起学习[1]。这样的课时划分，有利于让学生有针对性的掌握本章每一节的具体内容，并且能够突出本章教材的重点和难点，能够让教师有侧重点地去教学，让学生能够有侧重点的学习和记忆教材内容，从而能够提高生物课堂教学的有效率和学生学习的有效率。
二、联系生活，创设学习情境
在教学过程中，教师要尽可能地创造条件，让学生通过自主的活动，主动去观察、去探究、去学习。生物是一门与实际生活联系紧密的学科，教师可以通过联系生活创设学习情境，让学生在轻松、愉悦的学习氛围中去学习知识、基本技能以及真正领悟科学的思想和精神[2]。《组成细胞的分子》这一章的内容与实际生活联系尤为紧密，教师可以根据生活中的实际例子，来创设问题情境，让学生既能够激发学习兴趣，又能够加强学生对所学知识的理解，还能不断提高学生的实际应用能力。例如教师可以通过“大头婴儿”的示例作为导入来引起学生对《生命活动的主要承担者─蛋白质》这一节课的学习兴趣，然后教师可以让学生举含蛋白质食品的例子等，让学生在接下来的学习中集中注意力。在学习第3节《遗传信息的携带者─核酸》时，教师可以从学生比较感兴趣的DNA技术在案件侦破中的应用作为导入，并让学生自主地围绕DNA讨论几个问题，把学生从思维热身中引入核酸内容的学习中。《细胞中的糖类和脂质》这一节内容更是与学生的生活和身体健康密切相关，教师要善于利用这一特点，结合学生的实际创设情境。一提到吃，学生肯定很感兴趣，教师就可以利用“吃”来引入教学内容，可以通过“运动会时，可以为运动员们准备哪些能够快速补充能量的食物”来让学生认识到糖能为人提供能量，从而过渡到糖类的学习中。通过这样的方式能够紧紧抓住学生的注意力，激发学生的学习兴趣。
三、不断完善教学方式
受传统教育的影响，我国高中教学的教学方式一般都是教师讲、学生听的模式，这样的教学模式严重忽视了学生的主体地位，并且随着新课改的不断推进，传统教学模式的弊端已逐渐显露出来，这就要求教师从传统教学模式的框架下走出来，不断研究并采用国内外有效的教学方式，不断完善生物课堂教学方式。例如小组合作模式，生物教学内容中的实验部分是最适合运用小组合作学习模式的教学内容。例如“观察DNA和RNA在细胞中的分布”的实验，这个实验是本节教学内容的关键，是本章两个重要实验之一。教师可以根据学生的性别、学习能力、实验技能、兴趣爱好等情况遵循“组内异质、组间同质”的原则进行合理分配划分小组，分小组进行实验探究并讨论。这样既能够让学生自己动手实验学习知识，又能够让学生在小组合作中相互学习、相互促进，不断提高生物学习水平。
四、运用多媒体技术
生物教学内容中有很多复杂的生命现象或者生化反应，代谢途径等等，如果教师只是用语言去描述，学生接受起来就有所困难[3]。但是多媒体技术能够把声音、文字、视频等进行有机结合，既形象生动、又直观，让学生能够在视听享受中加深学生对教学内容的理解，让学生能够自主的在头脑中构建相应的理论模型和知识结构，这样学生也容易掌握教学中的难点和重点。例如在学习《生命活动的主要承担者─蛋白质》这一节的内容时，教师可以用多媒体技术展示氨基酸组成蛋白质的结构层次，通过多媒体来展示几种氨基酸的结构，让学生自己推导氨基酸的结构简式，使抽象的内容变得形象生动，既能够让学生印象深刻，又能够构建活泼开放的课堂氛围。
结束语：
随着新课改的不断推进，很多新的教学模式和教学理念正在被广大教师理解并且运用，已经在慢慢影响课堂教学实践，并取得了一定的成果。但是我们也能发现，新理念、新教学模式、新教学策略在课堂教学的落实方面还存在着不足。本文上述提到的《组成细胞的分子》这一章的教学策略并不是唯一的、固定的，这就需要教师在教学过程中不断总结分析并不断完善，在教学实践中不断探索适合自身学科特点的教学策略。
参考文献：
[1]胡冬英.高中生物新教材（人教版）《组成细胞的分子》的教学研究[D].广西师范大学.2012，25（12）：21-22
细胞生物学的研究范文3
[关键词] 核酸适体；纳米材料；CML K562；电化学生物传感器
[中图分类号] R557 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）08（b）-0014-03
Study of electrochemical biosensor for diagnosis chronic myeloid leukemia
LIU Wenwei ZHANG Xueyan XI Jing HAN Yuewu
Research Institute of Biochemistry, School of Basic Medical Science, Lanzhou University, Gansu Province, Lanzhou 730000, China
[Abstract] Objective To creat a method of detection for chronic myelocytic leukemia. Methods A method of detection had been built, based on an experiment in lab, during which, 5 highly-combined aptamers of CML K562 cells had been selected. Five aptamers were marked with two kinds of nanoparticles separately. The ten marked aptamers were divided into 20 pairs by every two combination. In every pair, the aptamers, one as the capture molecules, the other the determination molecules, were combined with CML K562 cells. Then the Au atoms were transformed into the state of Au-ion by REDOX reactions and electric current was sensed by electrochemical detection. Results The best pair of aptamers was selected to detecte CML K562, the fitted curve equation to test cells number and DPV of current value was obtained. Conclusion Get a electrochemical biosensor which can be used to diagnose CML K562 cells, with a detection limit up to 50 cells.
[Key words] Aptamers; Nanoparticles; CML K562; Electrochemical biosensor
目前以适体作为识别元件的生物传感器有光学适体生物传感器、电化学生物传感器、压电石英晶体生物传感器[1-4]。SELEX技术自问世已有20多年的发展历程，光学适体生物传感器和压电石英晶体生物传感器已相继有商品，但适体电化学传感器的研究还处于起步阶段，其中早期诊断慢性粒细胞白血病（CML）的电化学生物传感器也是一个空缺。笔者采用两种纳米材料分别标记5个适体，两两组合，一个作为捕获分子，一个作为测定分子与CML K562结合后，经氧化还原反应将测定分子上的金属转化成离子状态，利用电化学工作站检测电流[5-10]，筛选出最佳组合，结合适体与CML K562的结合率，可以判断结合的CML K562的数量，得到一种操作简单、灵敏度高、快速的早期诊断慢性粒细胞白血病的方法。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
CHI1210A电化学分析仪（CHI公司，美国）、原子吸收分光光度计、德国耶拿原子吸收光谱仪，型号ZEEnit700。
质粒抽提、PCR等试剂盒、100 bp DNA marker、胎牛血清（上海生工生物技术有限公司）生物素-链霉亲合素磁珠及磁力架、8种引物（上海生工生物技术有限公司）分别为P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7、P8：带羧基磁性纳米颗粒（平均粒径为30 nm）（巴溪仪器有限公司）；四氯金酸溶液（HAuCl4，上海中秦化学试剂有限公司）等。
1.2 方法
1.2.1 用氨基标记核酸适体S1、S2、S3、S4、S5
细胞生物学的研究范文4
【关键词】 肝素； 脱细胞血管； 小口径血管； 内膜增生； 多普勒超声
冠状动脉旁路术后，约30%~50%静脉桥在5~10年后出现通畅率下降[1]。有研究显示，这与血流流速和切变力等血流动力学变化有关[2-3]。本实验通过对异种脱细胞血管移植物在不同血液流速中移植后管腔内经与血流动力学的研究，探讨肝素包被对异种脱细胞血管移植物移植术后的影响。
1 材料与方法
1.1 材料
1.2 方法
1.2.1 移植物血管的处理 采用经本研究室研究证实的脱细胞方法对收集的犬颈动脉进行脱细胞处理[4]。脱细胞后对部分犬颈动脉进一步采用Conklin等[5]报道的方法行肝素包被处理。
1.2.2 分组 新西兰大白兔18只（由上海交通大学医学院动物试验中心提供）随机分为两组：A组（未肝素包被）（n=9）移植未经肝素包被处理的脱细胞血管，B组（肝素包被）（n=9）移植经肝素包被处理的脱细胞血管。
1.2.4 超声观察 术后分别于1周，3周和12周，用HP Sonos 4500型超声成像系统（探头频率10 MHz）检测移植血管通畅情况，观察血管移植物的彩色血流状况并测量血管内径；计算血流动力学参数，包括血流峰值速度（PSV）、阻力指数（RI）、搏动指数（PI）等。
1.3 统计学处理 采用SPSS 10.0统计分析软件，均数间经方差齐性检验后，计量资料以（x±s）表示，以单因素方差分析统计结果，P
2 结果
2.1 术后18只兔子存活16只，A、B两组各死亡1只，均发生在术后第1天，死亡原因为手术技术原因所致双侧移植物血管闭塞。动物死亡后随机补充，补足至18只进入结果分析。
3 讨论
冠状动脉旁路移植术后，静脉桥再狭窄率较高，是影响手术疗效的重要原因，其主要病理变化就是吻合口的内膜增生。研究发现，血流流速和切变力等血流动力学变化是造成内膜增生的关键原因之一，高、低切变力均可促进内膜增生形成[6-8]。当静脉移植物由低压、低流速的静脉系统移植到高压、高流速的动脉系统时，由于动脉系统的高压、高流速会对静脉移植物的内皮细胞造成损伤，从而引起内膜增生的发生；而低流速产生的低剪切力使得血小板与内皮下胶原接触时间增加也是造成内膜增生的主要原因。本实验将脱细胞异种血管移植物模拟冠状动脉旁路移植的方法植入兔子的颈内动脉，然后通过结扎与不结扎颈内动脉，从而使得不同流速的血液流经移植物血管，对其产生不同的剪切力，有效消除了由于内皮细胞损伤所造成的影响，同时为肝素包被对内膜增生影响的研究，提供了一个良好的动物模型。
肝素具有抗凝作用，正常的内皮细胞可以通过合成肝素来抑制平滑肌细胞增殖、减少其迁移，从而达到防止内膜增生的效果。脱细胞异种血管移植物由于丧失了内皮细胞的这种作用，移植后极易发生狭窄，研究证实，血管移植1周后，平滑肌细胞开始由中膜向内膜转移，可持续3周左右。笔者采用肝素包被的方法有效预防了这种情况的发生。发现均较未包被肝素组的脱细胞异种血管移植物的改变要轻，尤其是在移植后第3周时，两组间阻力指数出现了明显的差异（P
PSV反映的是血流的速度，所受的影响因素较多，如血管顺应性、吻合口的大小、血栓形成等，单纯依照PSV尚不足以判定血管的狭窄程度，而PI值是反映桥血管通畅率的一个较好指标，通畅的桥PI值应较小，而较高的PI值则提示存在吻合口狭窄的可能，两者结合可以较好地反映血管的狭窄程度。实验中，未结扎侧的PSV均明显偏低于结扎侧的PSV，而未结扎侧的PI仍偏高于结扎侧的PI，这说明随着时间的延长，这种由于偏低的血流速度，而使得脱细胞血管移植物在移植后更易发生内膜增生，从而造成管腔狭窄，而肝素包被的脱细胞异种血管在应对不同血流冲击时的表现，亦明显优于未包被肝素组。
目前，在血管狭窄性疾病诊断方面，虽然数字减影血管造影仍是目前公认的金标准，但其明显的缺点也早已成为共识，除其侵袭性外，数字减影血管造影通常低估管腔狭窄程度，尤其是小动物模型进行数字减影血管造影检查，技术上比较困难，容易直接或间接导致动物死亡而影响实验。而随着高分辨率超声的出现，使人们不仅可以直接显示血管病变解剖结构上的改变，同时能提供血流动力学信息，能够确定周围动脉狭窄的程度和范围。
参考文献
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细胞生物学的研究范文5
【摘要】
目的 体外分离培养、鉴定兔骨髓基质干细胞(BMSCs)并探讨其分化潜能。方法 应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养兔骨髓来源的骨髓基质干细胞，培养过程中倒置显微镜下观察其生物学特性，HE染色和CD34、CD44免疫组织化学染色行细胞学鉴定；应用体外成骨与成脂诱导分化检测其生物学活性。结果 体外实验成功分离培养兔BMSCs，HE染色显示细胞均一性好；CD44强阳性表达，CD34阴性表达。诱导成骨结果显示BMSCs具有较强的成骨活性，ALP染色阳性；成脂诱导结果显示BMSCs具有较强的成脂活性，油红“O”脂肪染色阳性。结论 BMSCs体外具有潜在的多向分化能力。
【关键词】 骨髓基质干细胞；细胞培养；多向分化
ABSTRACT: Objective To observe the effect of the in vitro isolation， culture and identification of rabbit bone marrowderived mesenchymal stem cells (BMSCs) and explore the differentiation potentials of BMSCs. Methods BMSCs were isolated and purified by density gradient centrifugation combined with attachment culture method. The biological characteristics of BMSCs were observed under an inverted microscope. The BMSCs were identified with HE staining and CD34/CD44 immunohistochemical staining. The biological activity of BMSCs was detected by osteogenic induction and steatogenic induction. Results BMSCs were isolated successfully in vitro and had good homogenicity. Immunohistochemical staining of CD34/CD44 showed strong positive expression of CD44 and negative expression of CD34. Fortis osteogenic ability and positive staining of ALP could be detected by osteogenic induction， and fortis steatogenic ability and positive staining of axungia could be detected by steatogenic induction. Conclusion BMSCs have the capability of multidirectional differentiation in vitro.
KEY WORDS: bone marrowderived mesenchymal stem cell; cell culture; multidirectional differentiation
基因治疗过程中目的基因感染的靶向性成为基因工程研究的关键环节，选取何种目的细胞、组织作为基因感染的效应器是众多研究的核心。骨髓间充质干细胞(bone marrowderived mesenchymal stem cells， BMSCs)是一种具有自我更新能力和多向分化能力的干细胞，在特定条件下可以向成骨细胞、成软骨细胞、肌腱、脂肪细胞等分化。将编码与骨组织再生有关的生长因子的基因片段转移到BMSCs中，既能够诱导其向成骨细胞转化，使之发挥种子细胞的作用，又能在体内骨组织再生过程中持续高效地分泌生长因子，有利于骨组织的再生修复和新骨形成。因此，将其作为基因治疗宿主细胞以及组织工程种子细胞已成为当前研究的热点。
本实验应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养兔骨髓来源的BMSCs，培养过程中应用相差显微镜及HE染色观察细胞的贴壁、扩增、形态、生长速度及群体生长方式等特征，利用细胞表面抗原免疫组化染色鉴定及诱导成骨、成脂鉴定等方法鉴定培养的BMSCs的特征及纯度，为后续实验提供充足的靶细胞支持。
1 材料与方法
1.1 实验材料
2月龄纯种新西兰大耳白兔，雄性，体重1.5～2.5kg，由西安交通大学医学院实验动物中心提供。胎牛血清、低糖DMEM培养基(LGDMEM)、胰蛋白酶、Percoll分离液(1.073g/mL)购自美国Gibco公司；CD34、CD44羊抗兔单克隆抗体、鼠抗羊IgGFITC二抗购自美国Santa Cruz公司；β甘油磷酸钠、抗坏血酸、地塞米松购自美国Sigma公司；其余试剂均为国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 兔BMSCs的分离与培养
采用全骨髓密度梯度离心法合并贴壁培养法培养BMSCs[3]。取兔的胫骨和股骨，磷酸盐缓冲液洗去附着的血迹，将其两端干骺端切除，显露骨髓腔。用含有100u/L肝素的生理盐水反复冲洗骨髓腔，将含有骨髓的冲洗液用DMEM培养基稀释后，以等体积比缓慢注入装有已滤菌的Percoll(1.073g/mL)分离液的10mL离心管中，室温下2000r/min离心30min。小心吸取单个核细胞层加入DMEM低糖培养液中，1200r/min离心10min，反复两次，洗净细胞悬液中的Percoll分离液。用含100mL/L FBS的DMEM低糖培养液5mL重悬细胞，按1×106个细胞/cm2接种于25cm2培养瓶中，置于37℃、50mL/L CO2饱和湿度孵育箱中行原代培养。48h换液，弃去未贴壁细胞，此后每3d换液1次。原代培养细胞12d后细胞达80%融合，用2，5g/L胰酶消化后以1∶3的比例传代培养。取第3代细胞行下游相关实验。
1.2.2 兔BMSCs的形态学观察
细胞培养过程中，应用相差显微镜逐日观察体外培养的BMSCs的生长状态及形态学变化，记录细胞贴壁、扩增、细胞形态、生长速度、群体生长方式等特征。将第3代细胞常规制备细胞爬片，950mL/L乙醇固定行HE染色，光学显微镜下观察BMSCs的形态、结构并照相记录。
1.2.3 兔BMSCs的细胞免疫化学鉴定
以1×105细胞密度常规制备细胞爬片，至细胞长满玻片的80%左右，吸出6孔板中的培养液，PBS冲洗两遍，每孔加入新配制40g/L多聚甲醛溶液固定30min。PBS洗涤后30mL/L H2O2室温10min以灭活内源性酶，正常山羊血清封闭液室温孵育30min后分别滴加羊抗兔CD34、CD44一抗，对照组以PBS代替一抗。4℃孵育过夜。次日37℃复温1h，采用SP法检测CD34、CD44的表达。
1.2.4 兔BMSCs诱导成骨分化的生物学活性
常规制备细胞爬片。待细胞生长融合至40%，加入成骨诱导培养液(LGDMEM中含有100mL/L FBS、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL、β甘油磷酸钠10mmol/L、抗坏血酸50mg/L、地塞米松10nmol/L)进行诱导培养，诱导培养期间应用相差显微镜观察细胞的生长状态及特征。诱导培养3周后行碱性磷酸酶染色及矿化结节染色鉴定细胞成骨活性变化。
1.2.5 兔BMSCs诱导成脂分化的生物学活性
常规制备细胞爬片。待细胞生长融合至40%，加入成脂诱导培养液(LGDMEM中含有100mL/L FBS、青霉素100u/mL、链霉素100u/mL、0.5mmol/L异丁基甲基黄嘌呤、200μmol/L吲哚美辛、10umol/L地塞米松、10mg/mL胰岛素)进行诱导培养，诱导培养期间应用相差显微镜观察细胞的生长状态及特征，诱导培养3周后行油红“O”染色鉴定细胞成脂活性的变化。
2 结 果
2.1 原代培养的BMSCs的观察
兔骨髓组织经Percoll分离液梯度离心后可形成明显的分层结构。吸取单核细胞层细胞洗涤后接种，2～4h后细胞开始贴壁，24h后细胞逐渐由圆形变为短梭形、纺锤形、多角形；但仍可见少量造血系细胞悬浮于培养液中或沉积于培养瓶底壁，呈圆形散在分布(图1A)，经首次换液后再次观察大部分非贴壁细胞已经去除。接种4d后可见较明显的细胞集落形成(图1B)，14d左右，贴壁细胞生长至瓶壁的80%左右，将细胞传代，传代细胞形态逐渐呈均一的纺锤形和长梭形，核质比大，细胞分布均匀不再呈集落生长，细胞密度增大后多沿胞体长轴呈有序同向分布，旋涡状。传代细胞增殖速度更快，一般4～5d可长满培养瓶底部，传代1次(图1C)。
2.2 原代培养的兔BMSCs的鉴定
光学显微镜下HE染色可见：细胞形态规则，大部分呈长梭形，胞质丰富为淡红色，细胞核多为卵圆形核浆，分界清晰，位于胞体膨大部的中央，呈蓝色，其中可见处于分裂期的核仁。细胞形态与BMSCs形态一致(图2A)。以已知CD34、CD44阳性片为阳性对照组，以PBS代替一抗作为阴性对照组，观察到CD44表达于细胞的细胞质中，呈现棕黄色，CD34及阴性对照组无表达。CD44阳性细胞百分数为91.78%(图2B、2C)。
2.3 诱导成骨分化的相差显微镜观察鉴定
用成骨细胞条件培养液诱导培养原代细胞，培养20d后进行ALP染色(Gomori钙钴法)鉴定，可见诱导培养组细胞胞质内出现阳性反应，呈现灰黑色颗粒；常规培养组细胞胞质内少见灰黑色颗粒(图3)。茜素红染色鉴定可见诱导培养组细胞形成粗大的钙化结节，常规培养组没有钙化结节的形成或仅有散在的钙盐颗粒形成(图4)。
2.4 诱导成脂分化的相差显微镜观察鉴定
在成脂肪诱导后，细胞原来的多角形突触逐渐回缩，但仍呈多角形，7～9h时出现明显脂滴，脂滴多位于细胞边缘(图5A)。诱导14h后，脂肪细胞增加，细胞内脂滴密布，多数细胞形态变圆，多散在分布。油红“O”染色为阳性(图5B)。
3 讨论
BMSCs是一种具有多向分化潜能的干细胞，在不同理化环境和细胞因子诱导下，可向成骨、成软骨、脂肪和纤维细胞系等多方向分化分离、扩增，并易于被外源基因感染且稳定表达，是基因治疗以及组织工程理想的靶细胞[12]。体外如何获取、纯化BMSC并使其高效快速增殖，是利用其治疗疾病的前提。细胞的粘附特性仍是分离和纯化BMSCs的最基本原则，物理性富集后塑料器皿内的贴壁培养以其经济实用、操作简便的特点仍是分离 BMSCs的最基本方法。
目前用于分离BMSC的方法主要有3种：①贴壁筛选法：根据BMSC具有在塑料组织培养瓶中快速贴壁生长的特性对其进行筛选；②密度梯度离心法：根据BMSC与其他细胞密度不同而采用Percoll分离液进行密度梯度离心将其分离出来；③磁珠分选法：利用免疫磁珠分离技术，基于抗体对细胞表面抗原的特异识别，将偶联在抗体上的磁珠标记在细胞上，在磁场作用下达到分离细胞的目的。单纯应用某一种方法均具有一定得局限性。贴壁筛选法尽管实验方法简单，但是获得的细胞纯度低，不能满足组织工程的要求。研究发现，密度梯度离心法所获得的细胞生长优于全骨髓贴壁筛选法[3]。但是我们通过实验发现，单纯应用密度梯度离心法获得的细胞数目较少，原代培养时间延长。磁珠分选法尽管分离纯度高，但因其需要较高的实验条件及其成本较高等限制了该方法的普遍应用。
本实验采用密度梯度离心和贴壁筛选相结合的方法，取得了理想的分离效果。由于原代取材抽取的骨髓血包含大量血系细胞和少量基质细胞，通过梯度离心的方法先对骨髓进行分离，可以将绝大部分红细胞、脂肪细胞和血小板去除，获得纯度较高的单个核细胞。提取单个核细胞层细胞培养24h待大量细胞贴壁后，再提前进行换液结合使用贴壁筛选，经过多次换液后即能去除培养瓶内悬浮未贴壁的造血细胞，从而获得均一性较好的BMSCs。随着换液与传代，BMSCs逐渐得到进一步纯化。目前较常用的分离液有Percoll液、淋巴细胞分离液等。PITTENGER等[4]利用流式细胞仪检测密度梯度培养的第1代和第2代的BMSCs的均质性可达95%和98%。随着细胞传代数目的增多，非贴壁细胞逐步去除，基质干细胞的纯度也逐步升高，一般认为该方法分离培养的BMSCs纯度大于70%[5]。
到目前为止，还没有高度特异性的BMSCs细胞表面标记物被发现，故无法直接对其鉴定。对BMSCs的鉴定主要是采用流式细胞仪对其表面抗原进行检测，再通过其能向其他细胞分化而反证。PITTENGER[4]认为称某种或某一群细胞为BMSCs时，它必须具有以下特性：①骨髓来源；②体外培养贴附于培养皿上形态呈成纤维样集落形成单位(CFUF)；③能够自主增殖，至少可以分化为3种以上间质细胞系。BMSCs的细胞表面标记是其与其他细胞区分的特异性标志。通过众多研究结果的筛选[510]，发现骨髓来源的CD44表面标记的阳性表达与造血系来源的CD34表面标记的隐形表达是较为肯定的结论。因此，本实验应用免疫组化方法对二者进行了染色鉴定，结果证实了CD44分子的强阳性表达和CD34分子的阴性表达。该结果说明本实验获得的目的细胞纯度较高，能满足下游实验的要求。
BMSCs具有多向分化潜能，在体外培养时，为了使BMSCs向成骨细胞定向分化，常通过理化或生物因子等手段促进BMSCs的增殖与分化，其中以生物因素最重要和最常用。地塞米松(Dex)虽抑制BMSCs增殖，但可显著增加BMSCs的碱性磷酸酶(ALP)的活性，从而促进成骨细胞的分化成熟、诱导成骨。β甘油磷酸钠可为骨细胞分化和增殖提供磷离子作为碱性磷酸酶作用的底物，诱导和激活碱性磷酸酶，促进有机磷向无机磷转化，能增加ALP在成骨细胞中的表达，从而促进生理性钙盐的沉积、促进钙化；维生素C可提高ALP的活性、促进矿化及胶原mRNA的表达[11]。因此，本实验采用含100mL/L FBS、100nmol/L地塞米松、10mmol/Lβ磷酸甘油酸、50mg/L维生素C的成骨诱导培养液，诱导细胞向成骨方向转化。本实验所培养的BMSCs经诱导成骨后，在相差显微镜下观察，呈梭形或多角形，具有多个突起，采用Gomori钙钴法ALP染色鉴定显示，ALP分泌旺盛，成骨性能增强，3周后形成钙结节样结构，表现出典型的成骨细胞特性。向生长状态良好的第3代BMSCs中添加了脂肪细胞诱导剂(胰岛素、地塞米松以及异丁基甲基黄嘌呤)，发现作用1周后成纤维细胞样细胞的突触逐渐回缩，细胞形态逐渐由梭形向椭圆形、多角形转变，胞质内出现了数量不等的脂肪滴，聚集在细胞核周围，两周后油红“O”染色呈阳性反应。证实了BMSCs在脂肪细胞诱导剂作用下实现了向脂肪细胞的定向分化。
本实验应用密度梯度离心联合贴壁筛选的方法，体外分离培养扩增兔骨髓来源的BMSCs，培养过程中相差显微镜及HE染色观察到细胞生长状态良好，细胞表面抗原免疫组化染色鉴定显示获得的目的细胞纯度较高，诱导成骨成脂鉴定显示获得的BMSCs具有典型的干细胞细胞特性。制备具有强增殖能力的BMSCs无疑为组织工程提供了良好的靶细胞支持，提高了组织工程修复组织缺损的能力，为骨坏死及骨缺损等疾病的组织工程治疗奠定了坚实的实验基础。
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细胞生物学的研究范文6
关键词：医学细胞生物学;教学;实践
中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2014）42-0100-03
医学细胞生物学是从细胞整体、显微、亚显微和分子水平等多个层次，来研究细胞结构及功能的学科[1]，其理论及技术已经渗透到基础和临床医学的各个方面，是当前医学生物研究最活跃的前沿地带。作为高等医学院校重要的必修课，它起到承上启下的作用。
如何通过教学内容和组织形式的优化整合，来提高教学质量，让学生在掌握基础理论的情况下，形成系统的全局观，提高知识迁移能力和实践综合能力，培养良好的科学素养，成为高校医学细胞生物学教改的重要内容之一。为此本文结合实践教学过程，谈谈在教学中的一些心得体会。
一、精选教学内容
精选教学内容包括教学中教材的选择组合、教学内容的优化和更新[2]。
细胞生物学是生命科学的基础学科，内容涉及许多相关领域，如生物化学、遗传学、分子生物学、组织胚胎学、生理学、病理学等[2]。因此现行医学细胞生物学教材普遍篇幅较大、知识覆盖面很广，以人民卫生出版社陈誉华主编的《医学细胞生物学》为例，分为细胞生物学概论、细胞结构和功能、细胞的社会学、细胞基本生命活动、细胞工程五个部分，共17个章节。而目前临床专业的细胞生物学的理论学时安排为40学时，如果授课时每章面面俱到，不但与后继学科内容重复，而且学生势必觉得内容繁杂，重点不突出。因此在有限的学时内，如何对教学内容进行合理取舍，如何将条理清晰、重难点分明、容量较大的知识点系统地传递给学生，是应该首先进行思考的。
在教学实践中，首先在教材选用上，进行主教材和辅助教材的结合使用。主教材采用科学出版社杨抚华主编的《医学细胞生物学》。其最大特点在于线条清晰、内容浓缩、重点突出、框架分明。对于刚从中学进入大学的学生来说，这种风格让其容易很快掌握所学知识点的整体框架和相互关系，不会陷入过多繁冗的细节之中而迷惑。辅助教材采用人民卫生出版社陈誉华主编的《医学细胞生物学》。其优点在于各个知识点讲解得透彻详实，知识面辐射广，案例较多。在授课上，以主教材拉章节线条和框架，在对重要知识点扩展时，让学生参阅辅助教材的相关内容，进行知识拓展和迁移。让其在学习中慢慢地参悟自我学习的思维方式，学会如何有效学习。
其次，优化和更新教学内容。备课时，查阅下游课程，如生物化学、分子生物学、组织胚胎学、生理学、病理生理学，了解细胞生物学与它们的衔接、渗透、重复部分，做好对后继课程的铺垫作用。对重复的内容要淡化或舍去，对延伸的内容要讲透。比如细胞膜与物质转运这部分，离子泵内容涉及到生理、病理、药理的一些知识点，因此这一部分必须讲透讲深，结合案例进行分析。比如核糖体章节中的蛋白质合成过程的内容，在生物化学课程中，会深入学习，因此在这里只需要简单地介绍核糖体的结构和功能，其余设为学生自学内容[1]。再如信号转导部分，这部分新名词较多，转导路线繁杂，内容有一定难度。虽然在生物化学中将详细学习，但由于该内容会影响学生对后继课程如生理学、药理学等知识点的理解，因此在细胞生物学教学中，应该抓主线轻细节，让学生建立一个受体、配体、信使、细胞信号转导特点和路线的宏观整体印象即可。此外，对于教材内容要及时更新，将各个章节的一些最新动态、前沿专题引入。
二、优化教学方法和形式
（一）重视案例引入，增强学生学习兴趣，加强基础学科的学习[1]
由于授课的学生将来都要进入临床，他们关注的重点常为所学的知识是否有利于未来的临床工作。因此，经常会有初学者问我，学习细胞膜、细胞器这些内容，到底和今后的临床或者科研工作有多大关系？
因此在绪论部分，重点介绍了细胞生物学的发展沿革，特别是近年来的前沿领域和重大发现，同时特别介绍了在医学领域的应用实例。如2001年以来的生理或医学诺贝尔奖、化学奖的获奖内容，包括2001年生理或医学奖“发现细胞周期调控的分子机制”、2002年生理或医学奖“器官发育的遗传基础和细胞的程序性死亡”、2003年化学奖“细胞膜水通道、离子通道结构”、2007年生理或医学奖“胚胎干细胞、基因敲除技术”等，通过这些对生物医学发展具有深远意义奖项的介绍，让学生切实地感受到细胞生物学一直活跃在科学研究与应用的前沿，并非只是过时、毫无价值的基础理论，从而增强学生的好奇心和学习兴趣。
其次，在理论教学中，设立细胞生物学的研究技术和方法这一章节，而此部分是很多院校细胞教学中的删除内容。在教学实践中发现，学生对教材中各种细胞与亚细胞结构图的来源，以及细胞组分的分离与培养过程，好奇而充满兴趣。生物学本来就是一个实践性学科，任何数据的产生，都以实验为基础，因此在有限的课时内，以案例引入的方式简要介绍常规研究技术和方法。其重点集中在以显微镜介绍为主的细胞形态研究技术、细胞的分离与培养、细胞组分和亚组分的分离、测定技术。让学生对细胞的研究过程有一个系统、整体的了解，有利于对后续理论教学和实验操作步骤的理解。
再次，在教学中加强病案的分析。医学细胞生物学与临床密切相关。在教学中，分章节讲述后进行相关的病案分析，将增强学生的兴趣，加大与所学专业的联系。比如在细胞膜与物质的跨膜运输中，引入家族性高胆固醇血症的介绍，让学生对膜受体的作用有深刻的认识。在讲授内膜系统中的溶酶体时，以“矽肺”和“痛风”为例进行讲解。引发学生探究发病机制，加深对溶酶体的认识和理解。在细胞周期的讲解中，将与细胞周期有关的肿瘤治疗策略贯穿其中，举例讲述肿瘤细胞的化疗药物作用机制和使用原则，加深学生对细胞周期运行机制的理解。
（二）加强多媒体辅助教学
细胞生物学的研究对象（如细胞及细胞器结构，各种生理过程）多集中于细胞的微观水平，学生理解起来较为抽象和枯燥。因此在医学细胞生物学的教学中应强调图形、动画、文字的三结合。如膜转运蛋白介导的跨膜运输中，学生很容易混淆离子通道和离子泵这两种运输的原理。在讲解中应对比图形并引入动画，将两者差异变得直观可辨，一目了然。在细胞连接中，涌现出许多关于连接的新名词，如紧密连接、锚定连接、通讯连接、桥粒、半桥粒等等，光从语句上辨析，容易混淆。通过细胞连接总图的展现，各个连接类型的区别及其功能便清楚可辨，让学生在脑海中建立一个立体完整的细胞连接通讯网络。又如细胞微丝和微管的装配，很多学生无法通过文字在脑海中呈现出“踏车行为”这种动态的组装过程，一个几秒的动画，能让学生获取直观的印象。细胞信号转导的动画演示，能强化转导线路中的每个传输节点，能形象展示信号传递中蛋白修饰或结构的改变，以及之后信号级联放大的生物事件，让学生从冗长枯燥的文字表述中脱离出来，得到一个完整的印象。因此，在一些不易区分、不易理解的微观水平的分子事件的教学上，加大图形和动画的使用频率，通过动画图形之间的对比，区分相似事件，建立动态的概念，形成相互联系的全局观，促进学生进一步理解生命活动的本质规律[3，4]。
（三） 适当应用PBL教学方法
以问题为中心，培养学生分析解决问题的能力，养成终生自我学习的能力，是PBL教学法的特点[6]。在医学细胞学教学中，适当穿插PBL教学法。如细胞骨架中的阿尔茨海默病的病因、诊断、治疗的讨论。在内膜系统教学中，在讲述内质网和高尔基复合体的功能及相互动态关系时，以“胰岛素如何合成、分泌”为中心问题，引导学生提出“胰岛素如何翻译合成”、“如何加工修饰”、“如何分泌出细胞”这三个问题，从而具体到“这个过程和哪些细胞器有关”、“每个细胞器扮演的什么角色”这些细节问题。通过讨论这些细节问题，最终完成对中心问题的学习[7]。
三、加强实验教学中学生的科学素质的培养
在实验教学中应根据不同时期学生的特点，循序渐进地展开教学。对于刚进大学的学生来说，医学细胞生物学实验是第一门与动物相关的实验课程，学生对仪器、动物充满好奇感，容易忽略对知识点的关注和理解。在初期实验教学上，应加强学生对实验的基本认识和基本操作能力的培养。将预实验所拍摄的照片及录像穿插在课件中，在操作关键点上进行讲解，将学生的兴奋点引入到所学的知识中。在中期实验教学上，应着重培养学生主动学习的能力，强调实验的逻辑性和严密性。以提问的方式，让学生通过预习了解使用药品和操作步骤的目的性，得出实验的流程图。在实验过程中，提倡能够丢开书本，按流程图，有逻辑地进行独立操作，使学生了解细胞生物学拥有一个系列性、完整性较强的实验体系，并非依葫芦画瓢的简单模仿就能做好实验。此外，还应加强实验课堂最后10分钟的实验小结，让学生分组讲述实验的心得体会，并由老师进行点评，增强学生的学习积极性和协助精神，培养学生的知识迁移能力和创新能力[2，8]。
教学中还应有意识地培养学生的实验习惯和心态，对于部分有专业兴趣倾向和喜爱科研的学生，可开放实验室，让其根据相关的课题进行实践，过程中采用方式多种多样，包括查文献、写综述、写实验方案、实验小结、注意事项，培养学生的科学思维，提高其实验综合能力。
综上所述，通过细胞生物学的教学内容及形式方法的初步探索，在一定程度上能加强学生对理论知识的理解，提高知识迁移能力和实践综合能力，培养一定的科学素养。
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