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不同微生物菌落特征范文1
关键词：食品检验 纸片法 平板计数法 微生物检测
前言：
食品安全问题越来越受到人们的重视，微生物对食品的污染问题也相应地备受关注。在食品生产、加工、储存、运输、销售等各个环节中都有污染微生物的可能。一旦污染，微生物将大量繁殖而引起食品腐败变质，或导致食源性感染和食物中毒，食品的检测与分析工作已经提高到一个极其重要的地位。特别是为了保证食品的标准品质，开展食品科学技术研究，寻找食品污染的根源，人们更需要对食品进行各种有效营养物质和对人体有害、有毒物质的检验和分析。自20世纪70年代起，各种食品检测不断出现，主要包生物化学技术、纸片法等，目前这些技术在食品检测和分析等方面已经得到了较好的应用，特别是纸片法。纸片法以其操作简便、灵敏度高、速度快等优势在食品检测领域得到愈来愈广泛的应用[1，2]。
一、纸片法的原理
纸片法，即以纸片、纸膜、胶片等作为培养基载体，将特定的培养基和显色物质附着在上面，通过微生物在上面的生长、显色来测定微生物的方法[3]。快速测试片法有以滤纸为载体的测试片，这种测试片是一种水合物干膜，由上下两层薄膜组成，上层是聚丙烯薄膜，下层是上印有网格的聚乙烯薄膜，通过一种冷水可溶性的凝胶剂附着在培养基上。培养基上有微生物生长所需的营养物质、特异性显色物质和抗生素。
纸片扩散法是将含有定量抗菌药物的滤纸片贴在已接种了测试菌的琼脂表面上，纸片中的药物在琼脂中扩散，随着扩散距离的增加抗菌药物的浓度呈对数减少，从而在纸片的周围形成一种浓度梯度。在药物扩散的同时，纸片周围抑菌浓度范围内的测试菌不能生长，而抑菌浓度范围外的菌株则继续生长，从而在纸片的周围形成透明的抑菌圈。不同抗菌药物抑菌圈的直径因受药物在琼脂中的扩散速率的影响而可能不同，抑菌圈的大小可反映测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药对测试菌的最低抑菌浓度（MIC）呈负相关，即抑菌圈越大，MIC越小。
二、纸片法的优、缺点及改进
本文介绍的是北京陆桥公司研制的Easy TestTM纸片（简称ET），E T微生物测试纸片是一种将脱水培养基附着于无纺布棉垫上的即用型检测产品，利用了特异性酶与特异性显色底物反应的原理，使目标菌与非目标菌呈现可明显区别的不同特异性颜色，ET测试纸片的培养载体采用了无纺布和水溶性营养底物的设计，具有良好的吸水性，可快速吸收测试液，使微生物自动均匀分布于无纺布上，为测试液和营养底物创造了一个固定的混合区域。这种纸片法排除了滤纸测试片不易计数、营养物质分布不均、显色指示剂单一和保水性差的缺点，待测样品不需灭菌、本身带有培养基，样品可直接加入。其特点可归纳为：可应用于现行GB/T 4789-2008和SN标准中；使用方便，即用型产品，省去配制步骤，减少工作量；大量缩短检测时间，提高检测效率；降低对操作人员的技术要求；准确：灵敏度高、特异性强；可用于食品微生物检测和环境卫生检测，可分别检测菌落总数、大肠菌群计数、霉菌和酵母计数、金黄色葡萄球菌计数。如用大肠菌群快检纸片检测餐具的表面，操作简便、快速、省料，特异性和敏感性与发酵法符合率高，使用时应正确掌握操作技术和判断标准，从而达到理想的检测效果[4]。
从实用性来说，ET纸片省却了大量的玻璃器皿的麻烦，操作简便，携带方便，污染小；可在野外迅速检测所采集样本，避免常规方法因运输时间长而造成的菌落环境变化，更能反映采集样本真实菌落情况；培养后所长的为有色菌落，便于计数。
纸片法也有其弊端，测试片较小，菌量数较大时计数困难；只研制出了少数几种类型的测试片，只能局限于几个指标的检测上。
目前，对纸片法分改进主要是扩大被检测目标菌种种类；研制具有检测较大菌量的纸片，并且提高检测准确性。神保胜彦[5]（1991）对纸片法作了进一步研究和改进，改进后的纸片法不仅能够确定抗生素的种类，而且提高了检出率和准确性，氯霉素最低检出量0.01mg/kg，土霉素0.05mg/kg，链霉素1mg/kg，红霉素0.05mg/kg，青霉素0.0025mg/kg。
三、纸片法在食品微生物检验中的应用[6]
1.菌落总数测试片，揭起覆盖的胶片，将1ml样品悬液滴于纸片中央后盖回，用压板轻轻压下，将样品均匀地覆盖于培养基上。静置约1min使培养基中的凝胶固化。测试片水平放于37℃恒温箱内培养。细菌总数测试片培养48±3h后计数红色菌落数作为细菌总数，亦可用作乳酸菌测定。
2.霉菌、酵母菌测试片，该测试片含霉菌酵母生长的营养物质、菌落生长的指示剂，并添加抗生素以抑制细菌生长。接种后，21℃～25℃培养3～5 d，计数。酵母菌菌落特征：小型菌落，边缘清晰，颜色均一，灰白色至蓝绿色，菌落隆起。霉菌菌落特征：大型菌落，边缘模糊，中间颜色深暗，颜色不均一，菌落扁平。
3.大肠菌群、大肠杆菌检测纸片，该测试片含有改良的VRB（Violet Red Bile）培养基及葡萄糖苷酸酶指示剂。绝大多数大肠杆菌能产生β-葡萄糖苷酸酶，与培养基中的指示剂反应，产生蓝色沉淀环绕在大肠杆菌菌落周围，表面覆盖的胶膜，可留住发酵乳糖产生的气体，形成蓝色和深蓝色的菌落并有气泡相连。大肠菌群菌落在测试片上产酸，pH指示剂使培养基变为暗红色，在红色菌落周围有气泡者为大肠菌群。所以，一次测试即可测出大肠杆菌和大肠菌群数：带气泡的蓝色和红色菌落为大肠菌群，带气泡的蓝色菌落为大肠杆菌。
4.金黄色葡萄球菌测试片，该测试片含有改良的Baird Parker培养基，对于金黄色葡萄球菌的生长有很强的选择性，并能将其鉴定出来，与3个Baird Parker平板加一个血浆凝固酶试管的方法等效。其可形成暗紫色菌落，如果在测试片上有其它可疑菌落出现，可以使用金黄色葡萄球菌确认反应片。其含有显色剂及脱氧核糖核酸，由于金黄色葡萄球菌产生的脱氧核糖核酸酶，具有耐高温特性，高温处理后仍能将DNA降解而与反应片上的显色剂反应形成粉红色环。
5.沙门氏菌测试片，将选择性培养基中加入沙门氏菌特有辛酯酶的显色指示剂，并将其加载在纸片上，通过培养，如果样品中含有沙门氏菌，即可在纸片上呈紫红色的菌落。
四、分别用纸片法和平板计数法检验食品中的大肠菌群
1.检验之前的准备，检验之前的准备是保证检验高质量的前提，应做好以下几点：
1.1为了保证微生物检验的高质量，要求检验人员的要有专业知识和熟练的技术，而且还必须具备对工作的高度责任感和实事求是的科学工作作风。确保实验室人员得到及时培训及不断更新知识，学习和掌握新理论、新技术和新方法。
1.2 环境，实验室应具有进行微生物检验适宜充分的设施条件，包括检测设施（专用于微生物检测和相关活动）及辅助设施（大门、走廊、管理区、样品区、清洁间）特殊的设备要在特殊的环境下放置和操作。所用无菌实验室应符合GB19489[7]的规定。
1.3 操作，操作人员必须严格按照GB/T
4789[8]食品微生物检验标准中的操作规程进行检验，做好灭菌处理，为防止二次污染采取必要措施，原始记录要真实准确，不得随意填写。按照GB/T 4789标准规定的方法进行数据处理及结果判定。
以严谨科学态度，做好上述几个环节准备工作，就能使我们微生物检验数据的准确性得以保证，为食品卫生和安全提供可靠技术保障。
2.材料与试剂
2.1 材料：培养箱、移液器、水浴锅等。
2.2 试剂与培养基：北京陆桥大肠菌群ET测试纸片，培养基。
2.3 茵株：大肠杆菌标准菌株一株，金黄色葡萄球菌标准菌株一株，实验室分离保存菌株两株（沙门氏菌和酵母菌）。
2.4 样品：瓶装啤酒、冰点、休闲小食品、糕点、速冻食品、水产品、乳制品、熟肉制品等为本实验室日常抽检样品和委托检验样品，生肉类、熟制品、凉拌菜共十二类产品，每类10份样品，共120份样品。
3.比较与实验方法
3.1 方法比较：根据实际试验操作情况，将GB方法（平板计数法）[9]同ET测试纸片法进行对比，主要列举和分析计数原理、操作步骤、培养时间等。
3.2 检测结果比较实验
3.2.1 菌株加标实验：将大肠杆菌、沙门氏菌和酵母菌分别和干扰菌金黄色葡萄球菌一起加入各类食品样品中，每类加入3份，共36份样品。每份样品目标污染值约为1*10CFU/ML，每份样品均采用GB平板计数法VRBA法和北京陆桥大肠菌群测试纸片ET法同时检验。
3.2.2 普通样品检测：将120份样品按照GB4789.3—2010处理，用平板计数法VRBA法和ET测试纸片法同时检验。
3.2.3 结果分析：将加标实验的36个结果和普通样品检测中的阳性结果取对数，进行配对t检验，计算P值，研究两种方法间是否存在显著性差异[10]。
4.结果与分析
4.1 方法比较，针对GB4789. 3—平板计数VRBA法与ET测试法的比较见表1。
4.2 菌株加标实验结果：加标的36个样品结果见表2。
4.3 普通样品检测结果：十二类120个样品中，共检出59对阳性结果，具体结果见表3。
4.4 通过配对t检验计算可知P值为0.16 > 0.05，可见两种方法检测结果无差异。
4.5纸片法与平板计数法相比较，具有快速、简便、易于操作等特点[11]，平板计数法需要72h出结果，而纸片法只需24h就能报告检测结果，检测速度得到了很大的提高，更能满足现代食品进出口业务快进快出的要求，而且纸片法操作简便，省去了培养基配制、杀菌消毒、器皿洗涤等繁琐的劳作，有效提高了实验室的工作效率，但是测试片价格较贵，可先在专业食品检测实验室和经济效益较好的食品生产企业推广使用。
五、结论
尽管食品微生物的检测方法有很多种，但纸片法在食品检测的实际应用中表现出操作简便、灵敏度高、速度快等特点，已在食品领域的微生物检测中得到广泛应用。随着纸片法食品微生物检测技术的不但发展，相信纸片法会在食品微生物检测、监控等方面发挥愈来愈大的作用。
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不同微生物菌落特征范文2
从医学微生物学的角度出发，口腔医学专业所接触的微生物有其自身鲜明的特点：口腔微生物数量庞大、种类丰富，且厌氧菌占较大比例。这就决定了使用普通的细菌培养方法是无法客观反应口腔内微生物构成的。于是针对口腔专业的特殊需要，并兼顾教学的趣味性，调动学生主动探索的兴趣，我们对口腔专业添设了题为“发现你所不知道的自己”的全新实验课教学单元，该部分共计4次实验课，包括8个实验学时。
第一次实验课的主要内容是口腔微生物的构成、口腔厌氧菌及厌氧培养法。在本次实验课上，教师先启发学生分析口腔的特殊环境，安排学生以小组为单位思考、讨论口腔微生物的构成，最后由教师进行归纳性总结，并系统讲解口腔菌群的组成。然后，向学生介绍口腔厌氧菌及其存在部位，并简要介绍常见的厌氧培养法，包括高层琼脂柱法、厌氧培养皿法、亨盖特滚管技术、厌氧罐技术等。要求学生思考、讨论各种方法的异同点和各自的优缺点，重点掌握厌氧罐技术，我们将在后续的实验学时中采用此法进行口腔厌氧菌的培养。
第二次实验课的主要内容是介绍常见的口腔真菌及其相关口腔疾病、真菌的培养与常用培养基，并进行口腔微生物样本的采集与接种。在本次实验课上，主要讲解真菌适宜的生长环境与条件以及真菌培养中最常使用的沙保氏培养基的配制，并教学生进行口腔微生物样本的采集与接种。具体操作包括：
①需氧培养：用无菌棉签采集龈上牙菌斑或牙垢接种于固体血琼脂平板培养基，37℃倒置于培养箱孵育；
②厌氧培养：用无菌棉签采集龈下牙菌斑或牙垢接种于加有还原剂的固体平板，置于厌氧罐中，抽真空并密封，放入37℃培养箱中孵7天；
③真菌的选择培养：用无菌棉签采集后牙邻间隙牙菌斑，接种于新鲜配置的沙保氏培养基，28℃培养箱中培养7天；
④牙菌斑的刚果红负性染色法直接观察菌群构成：刚果红负染后让学生在油镜下观察并报告球菌、直杆菌、梭菌、丝状菌、弯曲菌和螺旋体六大类微生物的百分比。
第三次实验课的主要内容是培养菌落观察及鉴定。具体操作包括：
①观察厌氧和需氧培养基上菌落的形态，大小，颜色等特征，分别选取数个单菌落进行革兰染色，观察不同菌落的革兰染色性。
②观察沙保培养基中的菌落生长情况，挑取数个不同的单菌落分别接种于科马嘉显色培养基，28℃孵育7天。
第四次实验课的主要内容是观察科马嘉医学显色培养结果，根据菌株在培养基上的不同色彩对其进行大致的分类鉴别。
同组同学共享实验数据，根据四次实验的结果并结合本组同学自身口腔健康情况讨论口腔微生物的构成与常见的口腔健康或疾病之间的关系，撰写实验报告。
2实验课教学改革成果
通过8个学时的主题实验课学习和操作，同学们生动详细的了解了自己的口腔菌群构成，鲜活的观察到了自己原来所不知道的自身口腔微生态。全课程不仅充满趣味，更贴近口腔医学工作的实际。教学全程气氛轻松愉快，学生学习态度积极，思维敏锐活跃，课堂上体现了很高的主动性、创造力和团队协作精神。课程结束后，我们分别对参加普通微生物学实验课学习和参加针对口腔专业微生物学实验课学习的不同批次的医学专业学生进行了问卷调查，发现与参加传统课程的同学相比，参加改革后口腔专业微生物学实验课的同学对课程教学的满意程度提高了25％，对医学微生物学以及相关专业课的学习兴趣提升了30％。当然，学生的期末考试成绩的优秀率、通过率以及考试平均分也均有大幅度提高。
3讨论
不同微生物菌落特征范文3
关键词：喀什地区；水体；生态分布；丰度
中图分类号 X52 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2016）24-0029-04
A Preliminary Study on Microbial Ecological Distribution of the Main Rivers in Kashgar
Liu Zhenming et al.
（College of Life and Geographic Sciences，Kashgar University Key Laboratory of Ecology and Biological Resources in Yarkand Oasis of Education of Xinjiang Uygur Autonomous Region，Kashgar 844006，China）
Abstract：The water microorganisms of Kizil River，Tuman River，East Lake，South Lake in Kashgar city were isolated by the serial dilution plate count technique，and the ecological distributions of different microbial physiological groups were studied. The results indicated that the microorganisms of the waters in Kashgar region display extreme abundance in biodiversity，the number and the diversity of bacteria was significantly higher than that of fungi or actinomycetes，the number of microorganisms in Tuman River was larger than others. Microbial abundance fluctuated seasonally，the quantity of microorganism in summer were much larger than that of in winter，and the abundance in upstream was also larger than that of in downstream.
Key words：Kashgar；Water；Ecological distributions；Abundance
喀什市位于新疆维吾尔自治区西南缘（E73°20′～79°57′，N35°20′～40°18′），是南疆的政治、经济、文化中心，古丝绸之路上的重要商埠，亦是新疆维吾尔自治区唯一的历史文化名城。喀什市水资源较为丰富，来源较广，流经市内的主要河流有3条：克孜勒河、盖孜河和吐曼河，孕育着喀什47万人民。2010年5月中央新疆工作座谈会决定大力建设新疆，设立喀什经济特区，近几年来喀什地区经济文化建设取得了迅猛发展，城镇化水平进一步提升。但在大开发、大建设过程中，也不可避免地带来了一定的水环境问题，如水体污染严重、富营养化加剧、矿化度升高等，严重制约了喀什地区经济社会的可持续发展。当前克孜勒河、吐曼河等已遭受严重污染，并将严重威胁地到喀什市的地下水供水安全[1]。因此，近年来对其水质监测与评价成为生态环境保护工作者关注的热点。
水资源质量的评价指标涉及多项生物学参数和非生物学参数，其中微生物最具有指示意义[2]。水域生态系统中的浮游微生物不仅与区域环境密切相关，还在物质与能量储存中发挥积极作用，其类群分布与数量变化受到水文状况、营养盐含量及人类活动的影响[3-5]。探讨水体微生物生态分布可为深入研究水域生态系统的功能结构及生物生产力提供一定的参考素材，为水环境质量评价及综合治理提供科学依据。近年来对喀什水质的研究多集中于污染原因和治理对策研究[6，7]，而微生物学指标调查及分析鲜见报道。为此，本研究对喀什城市河流中微生物群落构成、数量及时空分布等进行了初步检测分析，旨在为喀什城市河流污染现状及防治对策提供生物学依据。
1 材料与方法
1.1 样品采集 选择流经喀什市的5个主要河流和湖泊：克孜勒河、盖孜河、吐曼河、东湖、南湖，分别于2015年2月、8月同一位点、同一时段取样，分析水体中微生物群落的时空分布，同时现场检测采样点水温、浊度、pH等项目。5个水体中3条河流属流动水体，按照一定比例将各河段分为上、中、下游，依据流速、流域面积及河水深度不同分别在河两岸布设采样点6个，无菌操作法取样，每一采样点取3瓶水。东湖、南湖为静止水体，根据水域面积采样：将2个湖面划分成5个断面，同样无菌操作法取样，每一断面取3瓶水，尽快带回实验室检测分析。
1.2 水体微生物分析
1.2.1 菌株分离培养及计数 采用常规稀释平板法，将样品在无菌工作台下适度稀释（10-1、10-2、10-3、10-4），每一稀释度设3个平行，用移液枪移取100μL稀释液涂布到3种不同培养基平板上。细菌分离培养用细菌通用培养基LB，真菌分离用马丁氏培养基，放线菌培养用YPD培养基。接种后各平板置于37℃培养箱恒温倒置培养，其中细菌培养1～2d，真菌培养4～5d，放线菌培养6～7d。待菌落长至合适大小，挑取单克隆用平板划线法纯化2～3次，即得到不同类型微生物纯培养物。微生物计数均采用平皿倾注法检测菌落总数，并进行统计分析证明。平板适宜计数标准为细菌和放线菌为每皿50～200个菌落，真菌每皿20～80个菌落，取3个平行样品的均值作为终值。
1.2.2 表型特征 参照《常用细菌鉴定手册》[8]观察分离到的微生物表型特征（包括形态、大小、颜色、透明度等），记录并分析可培养微生物多样性。
1.3 统计分析 采用DPS（Data Processing System）7.05对微生物数量进行方差分析，最小显著差异法（least significant difference，LSD）进行多重比较，分析不同水体中微生物时空分布规律。
2 结果与分析
2.1 微生物种群、数量的季节分布 微生物的生命活动对外界因子较敏感，其数量易受环境条件影响，始终处于不断发展变化中，不同季节、不同水域环境中微生物数量及种类各异。由表1可知，调查期间喀什5个水体中细菌数量波动范围为4.1×104～7.7×105，真菌波动范围2.1×102～7.4×103，放线菌为1.0×102～6.0×102，各区系最高峰均出现在2015年8月。5个水体中3类微生物数量和类型季节变化趋势一致，8月份的细菌、真菌、放线菌数量均高于2月份，微生物类型也较丰富。尤其吐曼河中游细菌数量由8.5×104增加到1.2×105，数值差别达到1个数量级（P
微生物季节变动与各类群微生物自身生长特性、环境因子及水体各项理化性质密切相关[9]，尤其温度对微生物生命活动影响强烈，推测喀什5个水体中微物季节差异主要受温度影响。微生物生长繁殖在一定范围内与温度呈正相关，而喀什夏季光照十分充足、水温升高，微生物生产力显著提高，数量自然增加；冬季光照减弱、水温相对降低，抑制微生物新陈代谢，导致微生物种类贫乏，数量稀少。此外，可能还受到溶解氧、透明度、营养盐水平以及部分离子浓度影响。
2.2 微生物种群、数量的空间分布 喀什不同河流中微生物丰度及分布情况（年均值）如表2所示。由表2可知，5个不同水体中细菌、真菌、放线菌数量差异显著（P盖孜河>南湖>东湖>克孜勒河，真菌数量分布为吐曼河>东湖>南湖>克孜勒河>盖孜河，放线菌数量分布为东湖>南湖>吐曼河>盖孜河>克孜勒河。根据污水生物系统法评价标准，细菌总数>106/mL为多污带，105～106/mL为α-中污带，
从河段看，3条河流微生物丰度从上游至下游逐步升高，推测上游水体中有机物含量较少，污染较轻，水体自净能力使微生物含量较低。河水流动过程中受人们大量生活污水、工业有机废水及农作物施肥等影响，越往下游营养物质越丰富，氮、磷营养物质富集超标越严重，污染越加剧，致使下游河段微生物种类、丰度最多，尤以吐曼河最显著。从多样性看，细菌类群也较真菌、放线菌丰富，如吐曼河下游细菌种类多达14种，而霉菌、放线菌种类有7种。
3 讨论
微生物对环境污染或变化较为敏感，其作为水质评价的一项重要指标，能及时反映整个水生环境的变化，从生物学角度为水环境质量监测评价与处理提供依据。研究发现喀什5个水体中微生物数量差异显著，但均以细菌绝对优势菌，真菌和放线菌相对较少，这与其他水体中微生物生态分布相符。吴根福[10]对杭州西湖水域菌群分布调查发现，水体微生物数量以细菌最高，放线菌数量较少；王风芹[11]等报道贾鲁河水体微生物数量细菌数量显著高于真菌和放线菌，但上下游水体中微生物区系数量没有呈现规律性变化。
喀什5个水体中细菌丰度均超过104cfu/mL，为β-中污型水体，尤其吐曼河细菌数量年均达到2.6×105，表明吐曼河水质一年四季均处于严重污染状态，为重污染带。这与吐曼河承担着喀什工农业活动和生活用水的主体责任，排污口较多，大量工业废水废物及生活污水直接排入关系巨大。东湖和南湖属于湖泊，水动力交换差，水体滞库时间长，也为水体富营养化创造客观条件，导致微生物污染。
喀什水体中各微生物类群分布受季节影响显著，夏季丰度、类群均高于冬季，与张红光有关青藏高原青海湖和纳木错湖水微生物[12]的报道相符。而朱亮[13]对宿迁市大运河沉积微生物时空分布研究显示，冬季微生物数量反而高于夏季，与Comte[14]、Findlay[15]等报道相符；北京温榆河流域微生物数量受季节影响并不显著[16]。说明微生物的季节变动是一个复杂的综合问题，水体中的微生物并不是独立存在的。推测不同季节下微生物数量多寡可能与地域环境因子有关，受微生物所能利用的底物含量制约，而喀什冬夏季温差较大，直接影响微生物新陈代谢，也会对水体生态系统初级生产力、溶解氧等产生一定影响，最终导致微生物群落结构改变。
从河段看，吐曼河、克孜勒河、盖孜河3条河流中下游河段污染均较上游轻，推测原因主要与人类活动影响有关。河流水体本身具有过滤自净能力，河体中的泥沙也可以吸附一定有机污染物质，所以上游污染较轻。但水体流动过程中承接人类大量的工农业废水、废物，造成氮、磷、钾等元素不断积蓄，为各类微生物生长繁殖提供充足的营养源，造成中下游水体富营养化，环境污染加剧，破坏了河段间生态平衡。感观上比较，下游水体颜色也明显变暗、混浊，同上游形成强烈反差。综上，喀什主要河流水质已呈现不同程度的富营养化，日益恶化的水环境问题应当引起政府和科研部门的高度关注。
研究结果提示当前喀什主要水体中微生物丰度较高，类群较丰富，受工农业生产和居民生活影响较多的中下游水系中微生物尤其多，夏季数量高于冬季。喀什水体中微生物时空分布格局，体现了其作为一个敏感指标对自然及人类活动双重影响下河流湖泊生态环境变化的响应。进一步探讨喀什河流中不同微生物生理类群与水体中氮、磷、钾营养盐、溶解氧（DO）、化学耗氧量（COD）等的相关性，或可为喀什河流污水生物治理及水体生态修复提供更全面的理论和参考资料。
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不同微生物菌落特征范文4
关键词： 草原围封年限；土壤微生物；土壤酶
中图分类号： S 812.2文献标识码： A文章编号： 10095500(2012)01000106
典型草原不仅是中国北方重要的生态屏障和牧民赖以生存的基本生产资料，也在维持生态平衡、调节气候、涵养水源、保持水土、防风固沙等方面占据主要地位，对维护生态安全，促进牧区经济发展有着十分重要的意义。然而，由于人口与家畜数量的剧增，目前典型草原面临着生物多样性减少，生产能力下降，草原大面积退化等严重问题。随着国家对生态恢复与草原保护的关注，相关部门开展了大量生态建设工作，其中对退化草地实行围封禁牧是区域生态重建的一项重要举措。作为退化草地恢复治理的手段之一，围封禁牧通过控制家畜的采食及践踏，从而使退化草地植物群落结构改善，物种多样性增加，草地生产能力提高\[1-4\]，土壤结构改善，养分含量增加\[1,5-8\]，土壤微生物数量增加，酶活性增强\[9,10\]，草地恢复演替。
近年来，国内外学者针对草地围封恢复演替过程中植被及土壤理化性状的变化做了大量研究\[1-8\]，但在围封后土壤生物学性状的变化及其与植被、土壤养分的相关性方面所做的研究不多，居于此，以内蒙古锡林郭勒盟南部太仆寺旗典型草原为研究区域，在该区域选取不同围封年限的生长季围封恢复草地为研究对象，开展围封年限对典型草原土壤微生物及酶活性影响的研究，探讨典型草原恢复演替过程中土壤生物学性状的变化规律，揭示土壤生物学性状与草地植被及土壤养分的相关关系，以期深入认识草地的围封恢复演替机制，指导半干旱典型草原区退化草地的恢复与草地资源的科学管理。
1材料和方法
1.1研究区域概况
研究区域位于内蒙古锡林郭勒盟南部太仆寺旗境内，地处N 41°35′~42°10′，E 114°51′~115°49′。研究区域土壤类型主要为栗钙土。气候类型属中温带半干旱大陆性气候，冬季寒冷干燥，夏季温暖湿润。年均温1.6 ℃，年均降水量407 mm，年均蒸发量为1 900.6 mm。太阳辐射强，总辐射量134～138 kcal/cm2。
研究区域植被类型以半干旱典型草原为主，以羊草（Leymus chinensis）和克氏针茅（Stipa krylovii）为建群种，位于草群上层，糙隐子草（Cleistogenes quarrosa）、冷蒿（Artemisia frigida）和星毛委陵菜（Potentilla acaulis）形成低矮的下层，伴生成分有草（Koeleria cristata）、根茎冰草（Agropyron michnoi）、寸草苔（Carex duriuscula）、麻花头（Serratula centauroides）、猪毛菜（Salsola collina）等。有毒有害杂草包括瓣蕊唐松草（Thalictrum petaloideum）、狼毒（Stellera chamaejasme）、披针叶黄华（Thermopsis lanceolata）等。
1.2研究方法
1.2.1样地选择与设置在研究区域采用空间系列代替时间系列的取样方式（即利用空间上处于不同演替阶段的样地来推断草地演替的趋势与速率），根据实地调查、资料记载与调查访问，选取植被组成一致、土壤类型相同，但围封年限不同的生长季围封草地为研究对象，选取未围封的自由放牧草地为对照。研究样地在2009年8月的植被、土壤状况及管理方式见旬，在每一样地内采用蛇形取样法选取30个点，用土钻按0～10、10～20、20～30 cm分层取样，剔除根系、石块等杂物，按层混合后将样品分成两份，一份风干，用于土壤酶活性的测定，另一份保鲜带回实验室，4 ℃保存于冰箱，用于土壤微生物数量及微生物生物量的测定。
1.2.3土样分析方法土壤微生物数量采用稀释平板计数法测定。其中真菌采用马丁-孟加拉红培养基，以平板表面涂抹法计数。即称取土壤鲜样10 g，在无菌条件下用无菌水配成不同浓度梯度悬浮液，取稀释度为10-1，10-2，10-3的土壤悬浮液各50 μL，接种于盛有灭菌的马丁-孟加拉红培养基的培养皿中，用无菌刮刀涂抹均匀。每个浓度3次重复，恒温（25 ℃）培养5～7 d，选取每皿菌落数为15～150的1个稀释度统计菌落数，按公式：菌数（cfu/g）=菌落平均数×稀释倍数/干土%计算真菌数量。放线菌采用改良高氏一号培养基，以平板表面涂抹法计数，除取稀释度为 10-3，10-4，10-5的土壤悬浮液各50 μL接种于盛有灭菌的改良高氏一号培养基外，其余与真菌数量测定方法相同。恒温（28 ℃）培养7～10 d，按上述方法和公式统计菌落数并计算放线菌数量。细菌采用牛肉膏蛋白胨琼脂培养基，以平板表面涂抹法计数。除恒温（28 ℃）培养3 d统计菌落数外，其余与放线菌数量测定方法相同\[11\]。
土壤微生物量碳、氮采用氯仿熏蒸法测定\[12\]，用 Multi N/C 3000可溶性碳氮测定仪（德国耶纳分析仪器公司）测定。
土壤脲酶活性采用苯酚钠比色法测定，以1 g土壤中NH3N的毫克数表示，活性单位为NH3N mg/g土；土壤转化酶活性采用硫代硫酸钠滴定法测定，活性单位为Na2S2O4 mL/g土\[13\]。
1.2.4数据分析采用SPSS 11.5进行单因素方差分析（Oneway ANOVA）、多重比较（Duncan法）和相关分析（Pearson法）；采用Excel 2003作图。
2结果与分析
2.1围封年限对典型草原土壤微生物数量的影响
土壤3大类微生物具有强大的酶系统，能引起土壤中植物残体和有机化合物的分解，在土壤有机物和无机物转化过程中起着巨大作用，与土壤肥力有密切的关系\[11\]。重度退化自由放牧草地采用生长季围封恢复措施后，土壤0～30 cm土层细菌、放线菌、真菌数量显著增加(表2)。不同围封年限细菌数量的高低顺序为：20年＞7年＞13年＞10年＞0年，放线菌和真菌数量的高低顺序为：13年＞20年＞10年＞7年＞0年。具体表现为：1）与自由放牧草地相比，围封7、10、13年，土壤0～10 cm土层细菌数量无显著性增加，10～20、20～30 cm土层细菌数量呈无规律性变化；围封20年土壤0～10、10～20、20～30 cm土层细菌数量均显著增加（P＜0.05）。2）围封7、10年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土层放线菌数量无显著性增加；围封13年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土层放线菌数量显著增加（P＜0.05）；围封20年，土壤0～10 cm土层放线菌数量显著增加（P＜0.05），10～20、20～30 cm土层放线菌数量无显著性增加。3）围封7、10年，土壤0～10 cm土层真菌数量显著增加（P＜0.05），10～20、20～30 cm土层真菌数量无显著变化；围封13、20年，土壤各层真菌数量均显著增加（P＜0.05）。
2.2围封年限对典型草原土壤微生物生物量的影响
土壤微生物生物量是土壤有机质中最活跃和最易变化的部分\[14\]，对植物养分具有贮存和调节作用，其大小和活性直接影响养分的矿化和固定\[15\]，亦影响土壤酶活性。重度退化自由放牧草地采用生长季围封恢复措施后，土壤微生物量碳、氮含量显著增加(图1，2)。具体表现为：围封7年，土壤0～10 cm土层微生物量碳、氮含量显著增加，与自由放牧草地差异显著（P＜0.05），10～20、20～30 cm土层无显著变化；围封10、13、20年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土层微生物量碳、氮含量均显著增加，与自由放牧草地差异显著（P＜0.05）。
图1不同围封年限典型草原土壤微生物生物量碳
Fig.1Soil microbial biomass C of typical steppein different
exdosure period
图2不同围封年限典型草原土壤微生物生物量氮
Fig.2Soil microbial biomass N of typical steppein different
exdosure period
2.3围封年限对典型草原土壤酶活性的影响
土壤转化酶又名蔗糖酶，是广泛存在于土壤中的一个重要的酶，它对增加土壤中易溶性营养物质起着重要作用\[16\]。土壤脲酶与土壤中含氮物质的转化有关，其活性可以表征土壤中的氮素状况，反映土壤有机态氮向有效态氮的转化能力和土壤无机氮的供应能力\[17\]。自由放牧草地采用生长季围封恢复措施后，土壤转化酶、脲酶活性均显著增强，不同围封年限土壤0～30 cm土层转化酶、脲酶活性的高低顺序为：13年＞20年＞10年＞7年＞0年(图3，4)。就不同围封年限土壤转化酶、脲酶活性空间层次的比较结果来看，围封7年，土壤0～10 cm土层转化酶活性显著增强（P＜0.05），10～20、20～30 cm土层转化酶活性无显著变化；围封10、13、20年，土壤0～10、10～20、20～30 cm土层转化酶活性均显著增强（P＜0.05）。
2.4土壤生物学性状与草地植被、土壤养分间的相关关系
研究指出，草地生态系统土壤微生物活动能力的强弱受土壤状况、牧草生长、利用方式和强度等的影响，且对土壤环境的变化较为敏感\[18\]。研究采用Pearson相关分析，对不同围封年限典型草原土壤微生物及酶活性与草地植被及土壤养分（表1）进行相关分析，结果表明：土壤微生物及酶活性与草地植被及土壤有机质、全氮含量间呈正相关关系，以土壤真菌数量、微生物量碳、微生物量氮含量与草地植被及土壤养分含量间的相关性最为显著，相关系数均达显著水平（P＜0.05）（表3）。说明放牧草地采用生长季围封措施后，由于控制了家畜对草地的采食与践踏，草地植被发育良性化，较多的根量和凋落物的输入与分解改善了土壤环境，促进了土壤有机质的形成和积累，土壤环境良性发展，微生物数量增加，活动能力增强。
(1)关于围封年限对土壤微生物及酶活性的影响，前人研究指出，退化草地随着恢复年限的延长，土壤细菌、放线菌、真菌数量随之增加，土壤酶活性增强\[19\]，土壤微生物量碳、氮含量与植被恢复年限关系密切，表现为随着植被恢复年限的延长土壤微生物量碳、氮含量显著增加\[20\]。研究结果表明，重度退化自由放牧草地采用生长季围封恢复措施后，土壤微生物数量、微生物量碳、氮含量显著增加，酶活性增强，且随围封年限的延长呈增加的变化趋势。说明围封禁牧有利于土壤微生物数量的增加及活动能力的增强，与前人研究结论一致\[9,10,19,20\]。
(2)前人研究指出，土壤微生物数量及活动能力受土壤营养状况、土壤质地、植被组成和覆盖度等的综合影响\[21\]。草地土壤微生物数量与植被盖度、有机C含量、全N含量、土壤微生物量氮含量均呈正相关关系\[22\]。相关分析结果表明，典型草原恢复演替过程中土壤微生物数量、微生物量碳、氮及土壤酶活性与草地植被盖度、地上现存量、0～30 cm土层根系生物量、凋落物现存量、有机质含量、全N含量均呈正相关关系。与前人研究结论一致\[22\]。表明退化草地在恢复演替过程中植被与土壤之间形成一个相互作用，相互影响的统一系统\[1,23\]。退化草地围封后植被恢复演替，较多的根量和凋落物的输入与分解改善了土壤环境，促进了土壤有机质的形成和积累，给土壤微生物提供了充足的食物来源和良好的生长环境，从而促进土壤微生物数量的增加及活动能力增强。
(3)草地生态系统中土壤微生物数量的多少及活动能力的强弱对土壤环境的变化较为敏感，可用来反映土壤的肥力状况\[18\]。然而，对于土壤微生物数量、生物量及酶活性能否作为土壤肥力和土壤健康评价的指标，不同学者观点不一。有学者认为，土壤微生物数量及酶活性与土壤有机质、全氮等养分含量间具有显著的相关性，可以用来指示土地的健康状况\[22,25\]。土壤微生物数量和生物活性的高低具有时效性，可以反映土壤养分转化的强弱，是土壤肥力和土壤健康的重要指标\[26,27\]。也有学者认为，土壤微生物数量和生物活性与土壤的营养水平间并不存在显著相关关系\[28\]。研究结果表明，放牧草地围封后引起的植被恢复和土壤养分含量的增加，促使土壤微生物数量及生物活性显著增强，并且土壤微生物数量、生物量及酶活性的变化与土壤有机质、全N的变化规律相同，两者关系密切。因此认为土壤微生物数量、生物量及酶活性可以用来作为土壤肥力和土壤健康的评价指标。
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Influence of exclosure period on soil microorganism
and its enzyme activity in typical steppe
SHAN Guilian1,CHU Xiaohui1,LUO Fucheng1,MA Yubao2,
LI Linghang2,CHEN Gong1
(1. Grassland Science Department,Yunnan Agricultural University,Kunming 650201,China;
2. Grassland Research Institute of Chinese Academy of Agricultural Science,Hohhot 010010,China)
不同微生物菌落特征范文5
关键词：基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术 马尔尼菲篮状菌 鉴定
Study on the optimized pretreatment conditions for identification of Talaromyces marneffei by MALDI-TOF MS
LIU Yugu HE Ying FU Junfang LONG Jun XIONG Jun JIANG Lingxiao WANG Yanfang
Microbiome Medicine Center,Department of Laboratory Medicine,Zhujiang Hospital, Southern Medical University;
Abstract：Objective To construct the database of Talaromyces marneffei for Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry(MALDI-TOF MS) identification, and to explore the best culture conditions and pretreatment method for MALDI-TOF MS identification of Talaromyces marneffei.Methods A self-built mass spectrometry database was constructed by using 8 strains of Talaromyces marneffei.The effects of different culture media [Sabouraud Dextrose Agar(SDA),Sabouraud Dextrose Broth(SDB)],culture temperature(28,35 ℃),culture day and pretreatment methods(formic acid acetonitrile method and direct coating method) on the quality of spectrum and the accuracy of identification were compared.Results In VITEK MS research use only mode(RUO mode),the self-built mass spectrometry database of Talaromyces marneffei was successfully constructed.SDA was more suitable for MALDI-TOF MS identification of Talaromyces marneffei than SDB,and the latter had more interference peaks in the acquisition spectrum.The characteristic peaks of the spectra collected at the two temperatures were similar, but the identification accuracy of colonies at 35 ℃ was slightly higher.The accuracy rate of colony identification was higher than 71.4% when cultured for 3-5 days, and the highest rate could reach 100.0% when cultured for 5 days.The extraction effect of formic acid acetonitrile method was better than that of direct coating method.Conclusion The best identification accuracy could be obtained by culturing Talaromyces marneffei on SDA at 35 ℃ for 3-5 days and pretreated with formic acid acetonitrile method.This is also applicable to the Talaromyces marneffei with atypical morphology.
Keyword：Matrix Assisted Laser Desorption/Ionization Time of Flight Mass Spectrometry; Talaromyces marneffei; identification;
马尔尼菲篮状菌(TM)是一种双相真菌，流行于东南亚地区及我国南方地区，可致播散性感染，多发于免疫缺陷患者，其病情凶险、预后差，因此早期准确鉴定尤为重要[1-3]。目前，TM的鉴定以其典型菌落特征(温度双相性和红色素)为主，但对于形态不典型菌株，单一温度培养时检验人员易出现判断错误的情况，从而延误患者的诊治。分子生物学方法虽是“金标准”,但目前尚不适用于临床检验科的常规鉴定。近年来，基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱技术(MALDI-TOF MS)在微生物鉴定领域发展迅速，因其具有快速准确的优点被称为最有前景的鉴定方法[4-5]。目前MALDI-TOF MS应用较广泛的有Bruker Biotyper及VITEK MS系统，但其对于双相真菌的应用研究较为滞后[6]。本研究拟在VITEK MS科研模式(RUO模式)中构建TM的参考数据库，并通过比较不同培养条件及样品前处理方法，探索用于TM质谱鉴定的最佳培养条件和前处理方法。现报道如下。
1 材料与方法
1.1 材料来源
南方医科大学珠江医院检验科分离的TM 8株，菌株编号分别为ZJ01、ZJ02、ZJ2360、ZJ399、ZJ18919110、ZJ110307、ZD180201、ZJLin, 以上菌株均经形态学及ITS测序鉴定。以大肠埃希菌ATCC8739作为校准和内质控菌株。
1.2 仪器与试剂
MALDI-TOF MS仪(法国生物梅里埃股份有限公司，数据库版本V3.0,RUO模式);隔水式电热恒温箱(28、35 ℃),高速冰冻离心机，大型落地摇床(美国Themo Fisher科技有限公司);电子天平；沙保弱葡萄糖琼脂培养基(SDA,广州市迪景微生物科技公司);VITEK MS-CHCA基质液(主要成分为α-氰基-4羟基肉桂酸)、VITEK MS-FA(主要成分为甲酸，酵母菌前处理液)、VITEK MS-DS靶板(法国生物梅里埃股份有限公司);葡萄糖，蛋白胨[生工生物工程(上海)股份有限公司];70%乙醇，甲酸，乙腈(天津市化学试剂供销公司),蒸馏水等。
1.3 方法
1.3.1 分生孢子悬液制备
于SDA平板接种上述8株TM,28 ℃培养5 d, 用含0.05%吐温20的磷酸盐缓冲液收集菌液，并经12层无菌纱布过滤得到孢子悬液，计数并调节孢子浓度为2×107个/毫升。
1.3.2 菌株培养
取上述TM菌株约2×106个孢子接种于SDA、沙氏葡萄糖肉汤培养基(SDB)中，于28、35 ℃进行培养，分别在第3、5、7、9天取菌落前处理进行质谱鉴定。以编号ZD180201菌株的质谱数据建立TM质谱参考库。其余7株TM用于验证参考库及构建TM超级谱图库。
1.3.3 菌落前处理方法
酵母相菌落(35 ℃)分别采用甲酸乙腈法或者直涂法处理，菌丝相菌落(28 ℃)生长过程的孢子与菌丝不够丰富，且部分生长呈现“咬琼脂”现象，难取样，因此未采用直涂法，按照VITEK MS推荐的丝状真菌前处理方法即甲酸乙腈法处理，具体步骤如下。甲酸乙腈法：按照VITEK MS丝状真菌前处理方法进行处理，即生物安全柜内挑SDA或SDB中菌落分别于900 μL 70%乙醇静置10 min, 14 000 r/min离心2 min, 弃上清液；沉淀中加入70%甲酸和乙腈各40 μL振荡混匀，14 000 r/min离心2 min。取1 μL上清液及质控菌株加于靶板点位上，干燥后覆盖1 μL CHCA基质液，室温下干燥上机，自动采集质谱谱图。直涂法：生物安全柜内直接取酵母相菌落适量涂靶板，待干后加入0.5 μL VITEK MS-FA,干燥后覆盖1 μL CHCA基质液，同上采集质谱谱图。
1.3.4 构建参考库
以其中1株(编号ZD180201)在不同培养基(SDA、SDB),培养温度(28、35 ℃),培养天数(3、5、7、9 d),前处理方法(甲酸乙腈法、直涂法)的高质量谱图，即背景噪音低、基峰分辨率高、主次峰分布错落有致、一致性好、主峰信号强度强、基线稳定及出峰数为80～250个的谱图，构建TM参考库，加入VITEK SARAMI数据库中。
1.3.5 结果判读
专用分析软件对鉴定结果进行判读，版本为V3.0。靶板点位通过点位颜色变化来提示结果的可信度，通常有绿、黄、红3种颜色。绿色提示只有一个鉴定结果，概率为60.0%～99.9%,结果可信度水平高。黄色提示仪器对标本分辨率较低，需要进一步采用试验进行区别。红色提示与数据库中任何质谱不匹配。
1.3.6 验证并创建超级谱图库
利用其余7株TM验证TM参考库，并汇总高质量质谱谱图，创建超级谱图库，保留39～41个特征性峰，特征性峰权重之和≤1 400。
1.4 统计学处理
计数资料以频数或百分率表示，比较不同培养天数、培养温度、前处理方法时的TM质谱鉴定正确率。正确率=正确鉴定菌株数/总数×100%。因样本量小，未进行统计分析。
2 结 果
2.1 不同培养天数、培养温度及前处理条件对TM质谱谱图的影响
TM质谱谱图的离子峰以位于质荷比m/z 7 848.00、6 113.00、6 668.00、3 335.00附近的特征峰为主，见图1。不同培养温度时，特征峰信号基本相似但略有不同，28 ℃培养特征峰主要以m/z 6 113.00附近为主峰，见图1A、B,而35 ℃培养以m/z 7 848.00附近为主峰，见图1C、D。
相比于SDB,SDA培养的TM更易采集到较多的特征离子峰信号且强度明显的高质量质谱谱图，见图1A、B。TM在SDB 35 ℃培养的菌落采集的高质量谱图数量较少，谱图主要表现为干扰峰多，特征峰信号强度不明显，未纳入参考库。且未使用SDB继续对其他7株临床分离菌株进行培养。
不同培养时长对特征峰的数量与强度影响较为明显，培养3～5 d时采集的质谱谱图质量更佳，可获得较多数量且信号强度明显的特征峰，信噪比较高，见图1A、B、C、D,而培养第9天时特征峰的数量明显减少且信号强度减弱，甚至消失，见图1E、F。
甲酸乙腈法与直涂法前处理方法进行比较后发现，在特征峰最佳的第3天培养时，甲酸乙腈法较直涂法可获得更多数量、信号强度更明显的特征峰，且信噪比更高，质谱谱图与参考库中的特征性质谱谱图匹配效果更好，提示蛋白提取效果更佳，见图1C、D。
2.2 MALDI-TOF MS对不同培养温度、培养天数的TM的鉴定正确率比较
不同培养温度下的TM鉴定结果显示，在相同培养天数时，35 ℃培养菌落鉴定正确率均高于28 ℃培养菌落，其中35 ℃培养3～7 d内鉴定正确率均超过70.0%,培养5 d时鉴定正确率可达100.0%。而28 ℃培养菌落则需要在培养3～5 d内行MALDI-TOF MS鉴定，正确率可超过70.0%,见表1。
不同培养天数下的TM鉴定结果显示，培养第5天鉴定正确率最高(28 ℃培养时鉴定正确率为85.7%,35 ℃培养时鉴定正确率为100.0%),而培养第9天时鉴定正确率最低，均不足50.0%,见表1。
2.3 MALDI-TOF MS对不同前处理方法培养的TM的鉴定正确率比较
利用甲酸乙腈法、直涂法对35 ℃,SDA培养的TM进行前处理，结果显示，经甲酸乙腈法提取蛋白进行鉴定的正确率略高于直涂法，见表2。另外，甲酸乙腈法及直涂法对TM的鉴定效果均表现为培养第3～5天鉴定正确率最高，随着培养时间延长，鉴定正确率降低，见表2。
2.4 MALDI-TOF MS在不典型TM鉴定中的价值
2.4.1 不典型TM的形态学特征
本研究中的不典型TM菌株分离自南方医科大学珠江医院患者肺泡灌洗液和痰液，形态学表现为温度双相型，但是红色素产生极缓慢，28 ℃培养7～9 d局部开始分泌红色素，经ITS测序证实为TM(100%),见图2。
2.4.2 TM自建数据库在不典型菌株鉴定中的应用
对于28 ℃培养7 d未分泌红色素的不典型TM菌株(编号ZJLin),生长速度较典型TM慢，但培养3～5 d时可被TM自建数据库正确鉴定，而培养第7～9天均无法经TM自建数据库正确鉴定。不同温度和前处理方法对鉴定结果均无差异。见表3。
3 讨 论
近年来，随着免疫抑制人群数量的增加，TM感染发病率也随之上升。目前临床微生物实验室对TM的鉴定，主要依赖其温度双相的菌落特征(35 ℃培养为酵母样，28 ℃培养为霉菌样)及典型红色素来判断，但形态学鉴定主要依赖于检验人员的经验。分子生物学鉴定则需要获取足够数量的菌体。对于生长缓慢的菌落，其鉴定耗时长。这限制了TM感染的早期诊断和及时治疗。同时，形态不典型菌株的出现，向微生物实验室对TM的快速准确鉴定提出挑战。
MALDI-TOF MS是微生物鉴定领域的一项极具前景的新技术，有成本低、耗时短、准确、高效等优点，可实现菌株的快速鉴定，目前在国内检验科被广泛推广。但国内外常用的Bruke Biotyper及VITEK MS系统均无TM鉴定参考库，且适合用于TM质谱鉴定的菌落培养条件及前处理方案鲜有报道。
质谱鉴定的准确性受许多因素影响，如培养基种类、培养条件、培养时间、蛋白提取方法等[7]。本研究比较了两种温度(28、35 ℃)、两种培养基(SDA、SDB)培养3～9 d的质谱鉴定正确率。其中从SDB 35 ℃培养菌落采集的质谱谱图数量少，干扰峰较多且特征峰信号强度不明显，考虑为液体培养基摇菌时菌量不足及洗涤不充分所致。因此，操作时应尽可能将菌落沉淀洗涤干净。另外，从28 ℃ SDA及SDB中培养菌落采集到的质谱谱图无明显差异。液体培养基培养操作较复杂，培养液等营养成分会干扰质谱分析，且菌落培养耗时更长，因此固体培养基更适合临床微生物室的快速鉴定。LAU等[8]发现，补充构建数据库后，MALDI-TOF MS能准确鉴定TM,其菌丝相和酵母相质谱谱图类似。本研究发现TM菌丝相及酵母相的特征峰相似，且与文献报道的主峰一致，但在35 ℃培养时鉴定正确率略高。
不同真菌培养时间下质谱谱图的特征峰数量和强度存在明显差异[9-11]。本研究发现，TM培养3～5 d时进行质谱鉴定的正确率高，且第5天最佳，可达100.0%。这主要与此时质谱谱图质量佳、信噪比高及鉴定结果稳定有关。随着培养时间的延长，特征峰信号强度减弱，甚至消失，从而出现错误鉴定或无鉴定结果，这可能与真菌细胞壁较厚且坚韧难破壁、色素产生干扰等有关。
TM于28 ℃时呈菌丝相，35 ℃呈酵母相生长。法国梅里埃公司推荐对丝状真菌采取甲酸乙腈法，对酵母菌采用直涂法进行前处理。直涂法用于酵母菌鉴定效果好，且适用于多种商业化MALDI-TOF MS系统[12-15]。而甲酸乙腈法是利用甲酸及乙腈对菌体进行蛋白提取来获得高质量质谱谱图，不仅适用于酵母菌鉴定[16],也适用于曲霉、皮肤癣菌等丝状真菌鉴定[17-20]。本研究比较两种前处理方法对TM酵母相菌落的鉴定发现，对培养3～5 d的菌落，甲酸乙腈法的鉴定正确率略优于直涂法(100.0%、100.0% vs.71.4%、85.7%)。这与甲酸乙腈法蛋白提取更充分有关。
综上所述，本研究发现经SDA培养3～5 d的酵母相(35 ℃)菌落，经甲酸乙腈法处理后，可获得良好的质谱谱图，鉴定正确率高。此条件也同样适用于形态不典型的TM,为TM的快速、准确鉴定提供了辅助手段。但本研究仅纳入8株TM的质谱谱图，还需要更多菌株进一步完善数据库并验证。MALDI-TOF MS提高了真菌鉴定的准确性，但在鉴定中仍需努力解决如生物安全问题、少见菌株数据库问题及样本处理标准化等问题。
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不同微生物菌落特征范文6
关键词：亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌；羽绒羽毛；微生物
引言
我国的羽绒羽毛资源十分丰富，并且是世界上最大的羽绒及其制品的生产国、出口国和消费国，产量占世界总产量的70%以上。羽绒是一种动物源性产品，卫生安全问题尤为重要，而亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌广泛存在于羽绒羽毛原料中，生产过程中灭菌处理不严格就会有残留。
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌是梭状芽孢杆菌属的一群细菌，能形成芽孢，并还原亚硫酸盐产生硫化物，厌氧生长，具有动力，且革兰氏阳性[1]。该菌在自然界中分布广泛，通常存在于人和动物粪便排泄物、废水和土壤中。该菌具有一定的致病性，可引起创伤感染、食物中毒和坏死性肠炎。
我国羽绒羽毛中亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检验依照国家标准GB/T 10288―2003《羽绒羽毛检验方法》和行业标准FZ/T 80001―2002《水洗羽毛羽绒试验方法》。但是这两个标准中某些技术参数不很完善，对检验过程的某些问题指导性不强。本文参照上述两个标准并结合实际亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验工作，研究了培养时间、培养温度、亚硫酸盐添加量和多粘菌素B添加量对检出菌落数的影响关系，以期掌握亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验的关键点，提高检验水平。
1试验部分
1.1试剂与材料
羽绒羽毛：取自某品牌送检原料亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验呈阳性样品；
0.1%灭菌的蛋白胨生理盐水：蛋白胨1g，氯化钠8.5g，蒸馏水1000mL；
亚硫酸铁多粘菌素B培养基：胰蛋白胨15g，酵母浸膏10g，柠檬酸铁胺0.5g，亚硫酸钠1g，琼脂16g，10mL多粘菌素B，1000mL蒸馏水；
革兰氏染色液试剂盒（北京陆桥技术有限责任公司）；脱脂棉纱布（河南焦作联盟卫生材料有限责任公司）。
1.2试验仪器
显微镜（XS-212，江南仪器厂）；调速多用振荡器（HY-2，江南仪器厂）；厌氧培养箱（1029，美国热电公司）。
1.3试验方法[2-3]
1.3.1试样前处理
用灭菌一次性手套取出12g（精确到0.1g）试样，放入经过灭菌处理的三角烧瓶中，加入1200mL 0.1%无菌蛋白胨生理盐水，无菌室中室温振荡3h。通过消毒纱布过滤溶液，取该溶液5mL于经过灭菌处理的三角烧瓶中待用。
1.3.2亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的测定
将5mL样品滤液置于75℃水浴中处理10min。取处理后的原始滤液1mL做10倍递增稀释，同时即以吸取该稀释度的1mL稀释液于灭菌平皿内。及时将晾至（46±1）℃的亚硫酸盐多粘菌素B培养基注入平皿约15mL，小心转动使试样与培养基充分混匀。待凝固后，再用5mL相同培养基覆盖表层。再次凝固后置于厌氧培养箱中37℃厌氧培养48h。
1.3.3菌落计数和确证试验
厌氧培养48h后，计数黑色和暗棕色菌落。取特征菌落进行确证试验，镜检为革兰氏阳性梭状芽孢杆菌，过氧化氢酶试验阴性。
2结果与讨论
2.1亚硫酸盐的影响
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌以还原亚硫酸盐成硫化氢为主要特征。因此，对该菌进行检验的选择性培养基中一定含有亚硫酸盐。试验中对培养基中亚硫酸盐的添加量进行了优化，结果表明，每100mL培养基中添加10%亚硫酸钠溶液为1mL时，最利于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长繁殖（见图1）。
图1不同Na2SO3添加量的检出菌落图
2.2多粘菌素B添加量的影响
多粘菌素B是由多粘芽孢杆菌产生的一组多肽类抗生素，对大肠杆菌、绿脓杆菌等革兰氏阴性杆菌有抑制或杀菌作用。亚硫酸铁多粘菌素B培养基中添加多粘菌素B能有效地抑制革兰氏阴性杆菌的生长，提高对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验的选择性。试验发现，多粘菌素B的添加量对亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的检出菌落数有一定影响。添加量在每100mL培养基中1mL～2mL时最有利于亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长（见图2）。
2.3培养温度的影响
温度是影响机体生长与存活的最重要因素之一。在一定范围内，机体的代谢活动与生长繁殖随着温度的上升而增加，温度上升到一定程度，开始对机体产生不利影响，如果温度继续提高，细胞功能急剧下降以至死亡[4]。试验发现，亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的培养温度在36℃～40℃时最利于其生长（见图3）。
图2不同多粘菌素B添加量的检出菌落图
图3培养温度对检出菌落的影响（a, 阳性样品; b, 空白）
2.4培养时间的影响
当少量微生物接种到一个恒定容积的培养基中，在适宜条件下培养。开始有一短暂时间，细胞数并不增加，以后增加很快，然后又趋于稳定，最后逐渐下降[5]。在亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的培养过程中，培养时间过短，可见菌落过少；时间过长，则易造成菌落相连或染菌。因此，在48h内应间隔一段时间计数一次，如发现菌落相连，则以上一次计数为准。 试验选取亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌检验阳性羽绒样品，取三份样品进行平行试验，并记录不同培养时间的检出菌落数（见表1）。
表1培养时间的影响
3结论
亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌是羽绒羽毛制品微生物检验的重要指标。依照GB/T 10288―2003和FZ/T 80001―2002进行检验时，培养温度、培养时间等因素都会影响亚硫酸盐还原梭状芽孢杆菌的生长，因此要严格控制各项环境条件和培养基配方，提高检验的准确性，确保检验质量。
参考文献:
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