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遗传学重叠效应范文1
关键词：油菜；三隐性核全不育系；临保系；优势
中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 1007-7731（2017）05-0066-03
国内报道的油菜细胞核不育类型主要有双基因隐性核不育[1-3]，该不育系应用的一个最大障碍就是制种时要在其开花期拔除50%的可育株，不但影响制种产量和种子纯度，还增加了制种成本。如何解决这一问题已成为多年来油菜育种界研究的热点。
陈凤祥等[7]报道了甘蓝型油菜隐性核不育系9012A的不育性受2对隐性重叠基因和1对隐性上位抑制基因互作控制[5]，并找到了能100%保持其不育性的临时保持系[6]，初步实行“三系”配套，克服了传统“二系法”制种时需拔除50%可育株的难题，为隐性核不育杂种优势利用开辟了一条新途径。陈凤祥等[7]提出的隐性上位互作遗传假说，可以从存在隐性互作的杂交组合后代群体中分离出纯合三隐性完全保持系。这种保持系自交后代不分离，与纯合不育株测交后代植株100%表现不育，但与全不育系回交后代则只出现50%不育株，把这种保持系称作临保系（TAM）。根据遗传分离规律，在存隐性互作的杂交组合F2代中可育株和不育株的分离比例有3∶1，15∶1，13∶3和61∶3等情况，在13∶3和61∶3分离的小区中可育株套袋自交并且分别与不育株一对一测交，可从中找到临时保持系；在3∶1和15∶1分离的小区中进行兄妹交，能找到纯合两型系，从而完成三系配套。
1 材料与方法
1.1 材料 2004年汉中农科所引进三隐性细胞核不育三系杂交种向农03（上海市农科院周熙荣先生惠赠）作为分离对象。
1.2 方法 2005年春季在F1群体中选择200个优良单株套袋自交，收获后进行品质分析。2006年春季在F2代株系中调查育性分离情况，筛选出4个育性分离为13∶3的株系，在这4个株系中选择可育株大量套袋自交，并且与株系中的不育株成对测交。
2 结果与分析
2.1 选育纯合两型系13AB 图1显示：2007年观察了165份可育株自交后代及其成对测交（兄妹交）组合的育性表现，发现2个全不育组合，对应父本自交不分离。据此鉴定并分离出了2个临时保持系，记为TAM-1、TAM-2。在组合分离中同时发现了5个育性分离比例1∶1的株系，对应父本自交育性分离比例3∶1，由于在1∶1系中不能确定其纯合或杂合，因此，继续在1∶1的组合内选不育株与可育株成对兄妹交，相应可育株套袋自交，不育株同时与临时保持系测交；在2个临时保持系中继续套袋自交。2008年春，结合上年兄妹交与测交组合以及相应可育株自交的鉴定结果，筛选出2个兄妹交育性分离1∶1，与临保系测交全不育，可育株自交分离3∶1的组合即纯合两型系，随后继续在组合内兄妹交―自交―兄妹交，严格进行品质改良，稳定纯合两用系的双低品质。至2010年育成稳定纯合两型系13AB。
2.2 临时保持系4081-1的选育 图2显示：与纯合两型系13AB配套的临时保持系4081-1的选育，观察了165份可育株自交后代及其成对测交（兄妹交）组合的育性表现，发现2个全不育组合，对应父本自交不分离。据此鉴定并分离出了2个临时保持系。以纯合两型系中的不育株与配套临时保持系杂交得到全不育系SY13A。之后扩大群体对其品质和农艺性状进行连续4代选择，使双低品质和农艺性状达到稳定一致。
2.3 隐型上位基因互作核不育三系繁殖、制种模式 图3显示：甘蓝型半冬性上位互作细胞核全不育系油菜SY13A的不育性受2对重叠基因和1对上位基因共同抑制。当2对基因为隐性纯合体（m1m1m2m2），另1对互作基因为显性纯合体（RR）和杂合体（Rr）时，植株表现不育（m1m1m2m2RR或m1m1m2m2Rr），其不育纯合体相应的临保系基因型为3对隐性纯合体（m1m1m2m2rr）。利用纯合两型系中的不育株（m1m1m2m2RR）和可育株（M1m1m2m2RR或m1m1M2m2RR）成对兄妹交可产生纯合两型系（M1m1m2m2RR或m1m1M2m2RR）和纯合不育系（m1m1m2m2RR），利用纯合两型系中的不育系（m1m1m2m2RR）和临保系（m1m1m2m2rr）杂交可获得全不育系（m1m1m2m2Rr），全不育系与恢复系（M1M1_ _或M2M2_ _）杂交可获得全可育杂交种，从而将隐型核不育系SY13A的三系杂交种应用于生产。
3 讨论
甘蓝型油菜隐性上位互作核不育系具有恢复源广，配组自由，易于选配强优势组合，易于转育，育性稳定，可避免不育胞质可能存在的负效应和细胞质单一化的潜在危险等优点[8]，更为重要的是解决了隐性核不育两型系制种时拔除不育系中50%可育株的难题，提高了制种产量，降低了制种成本，保证了制种纯度，在杂交油菜育种方面具有显著的优越性。此外，还有学者做了相关研究，如陈大伦等[9]对甘蓝型油菜隐性上位细胞核雄性不育纯合两型系、临保系和全不育系的转育方法进行了介绍.其要点是先转育隐性上位细胞核雄性不育纯合两型系，然后再通过回交转育主要农艺性状与纯合两型系相近或完全一致的相应的全不育临保系；陈芝能等[10]甘蓝型油菜双隐性基因细胞核+广恢型细胞质雄性不育（RRGCMS）三系综合了RM 5637A细胞质雄性不育和双隐性基因细胞核不育的优点；董发明等[11]通过对甘蓝型油菜隐性细胞核雄性不育系9012AB及其临保系T45与来源不同的几个自交系和常规品种杂交和测交后代的遗传分析，提出了隐性细胞核雄性不育系9012AB的新遗传模式；李婧婧等提出[12]9012AB是甘蓝型油菜隐性上位细胞核雄性不育两型系，其育性受2对隐性重叠不育基因（ms3ms3ms4ms4）和1对隐性上位抑制基因（espesp）互作控制。
参考文献
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遗传学重叠效应范文2
>> 基于单片段代换系的水稻抽穗期QTL定位及上位性分析 水稻抽穗期管理注意事项 水稻抽穗期基因qHY—8对植株干物质积累及产量性状的影响 水稻抽穗期QTL鉴定及重叠群作图 水稻抽穗期分子生物学研究进展 水稻抽穗期QTL的聚合及其互作分析 普通小麦抽穗期控制基因TaHd1研究进展与展望 马铃薯连作栽培对土壤微生物多样性的影响 多样性间套种栽培技术 多效唑与氮磷钾肥配合运用减轻小麦抽穗期渍涝研究 环形RNAs形成机制的多样性 团队多样性对员工创新的影响机制研究：一个跨层次研究 城市化影响下植物多样性研究 气候变化对生物多样性的影响 森林对生物多样性的影响及保护 云南旱灾对生物多样性的影响 氮磷污染对生物多样性的影响 植物多样性及其对景观的影响 多样性对企业绩效的影响综述 外来入侵植物对生物多样性的影响 常见问题解答 当前所在位置：l）。基因效应分析采用单因素方差分析，单因素（如Hd1等位基因变异）对总表型变异的贡献率R2=SSintergroup/SSoverall，其中SSintergroup为组间方差，SSoverall为总方差；F1杂种播始期超亲天数占亲本播始期比例MP1=[（F1-P1）/P1]×100%，其中F1为F1杂种播始期，P1为早抽穗亲本的播始期（计算超亲早抽穗时间）或晚抽穗亲本的播始期（计算超亲晚抽穗时间）。
2 结果与分析
2.1 亲本材料及其F1杂种的播始期
表1的结果表明，亲本材料和F1组合的播始期表现广泛变异，亲本材料播始期59～101 d，F1材料播始期60～120 d；通过计算F1杂种与两亲本播始期的相关系数，表明F1播始期与不育系的播始期没有显著的相关性，但是和恢复系播始期呈极显著正相关，相关系数为r=0.77（P
与双亲相比，少数F1杂种播始期表现出超亲现象，6份F1杂种表现出较强的超亲晚抽穗，除杂交组合HD9802S/HR015的超亲晚抽穗天数占迟抽穗亲本播始期比例的8.4%外，其余5份杂交组合为18.8%～20.2%。7份材料表现出超亲早抽穗，超亲早抽穗天数占早抽穗亲本播始期比例的5.6%～13.0%；相同的恢复系与不同的不育系会产生超亲F1，相同的不育系与不同的恢复系也会产生超亲F1，因此F1的生育期超亲表现与双亲的组配有关。
2.2 不同材料抽穗期控制基因的序列比对
选取了16份具有不同抽穗期的水稻材料（表3），对其抽穗期控制基因Hd1、Ehd1、Hd3a、RFT1以及Hd3a启动子序列进行PCR扩增测序分析。除Hd1基因存在4种不同的等位基因外，其余基因均无差异。与日本晴Hd1编码区相比，4个等位基因的编码区分别表现出单核苷酸的替换、片段插入与缺失、无义突变等不同的SNP类型（图2）。利用软件预测分析，这4个等位基因分别编码4种不同的蛋白质（图3）。通过与Takahashi等[2]对水稻Hd1序列及功能分析结果的比对确定本研究中的Hd1-1和Hd1-4为有功能的等位基因，Hd1-2和Hd1-3则因为出现了大片段的缺失，表现为功能缺失型等位基因。通过计算有功能等位基因材料的播始期的平均值和功能缺失型等位基因材料的播始期的平均值可知，前者为86 d， 后者为83 d（表3），并且两者呈显著差异（P
通过分析F1杂种播始期与Hd1等位基因的关系，结果表明有功能Hd1纯合型F1（HD1/HD1）的播始期平均值为89 d，杂合型（HD1/hd1）为94 d，功能缺失型Hd1的纯合型F1（hd1/hd1）的播始期平均值为83 d，并且HD1/HD1和 HD1/hd1基因型与hd1/hd1基因型的播始期均表现出显著差异（P
3 讨论
3.1 Hd1等位基因变异是长江流域杂交籼稻骨干亲本抽穗期变异的遗传基础之一
本研究选取的杂交稻骨干亲本材料中，Ehd1、Hd3a、RFT1的编码区以及Hd3a的启动子序列非常保守，没有表现出差异，Hd1的编码区表现出了4种不同等位基因类型，并且不同类型Hd1等位基因解释了自然日照条件下抽穗期19.75%的表型变异；因此，本研究结果表明Hd1等位基因多态性是我国长江流域杂交籼稻骨干亲本抽穗期变异的遗传基础之一。
3.2 关于F1杂种抽穗期的超亲现象
亲本间感光性和基本营养生长性组合的多样性及强弱的不同使得F1杂种抽穗期呈现多种多样的变化。在杂种优势利用，特别是籼粳亚种间杂种优势的利用中，常遇到超亲晚熟现象，而许多研究表明，F1杂种抽穗期是否严重超亲主要取决于双亲是否带有不同位点的互补的显性感光基因[3-5]，如果带有一对互补基因，那么F1将会表现超亲晚抽穗；徐俊锋[6]的研究结果表明F1超亲晚抽穗主要受两对显性互补感光基因E1（Hd4）和Se-1（Hd1）控制，杂种超亲晚抽穗主要由感光性引起。本研究材料中也出现了抽穗期超亲的杂交组合，其中不育系亲本814A和HD9802S与恢复系亲本HR020和HR935配组的F1超亲晚抽穗天数与晚抽穗亲本播始期的比例为18.8%～20.2%，而且不育系亲本含有有功能的Hd1等位基因，而恢复系亲本含有功能缺失型等位基因，因此存在潜在的互补基因的可能。
Chang等[7]对感光品种的感光性（PSP）和基本营养生长性（BVP）同时进行研究，认为PSP受单一显性基因或2个显性基因（Se）控制，BVP则受2个或2个以上基因（Ef）控制，这些基因具有累加效应，短的BVP相对于长的BVP为显性，因此不同Ef基因在F1材料中的互补可能会导致营养生长期比双亲的缩短，从而导致提前抽穗[8]，因此还需要进一步的试验去验证本研究中的超亲早抽穗是否也是由Ef基因导致的。
参考文献：
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遗传学重叠效应范文3
关键词：RQ-PCR；荧光探针；分子生物；荧光共振能量转移
中图分类号：O657 文献标识码：A 文章编号：1009-2374（2013）13-0044-02
1 RQ-PCR技术概述
RQ-PCR是FPET（荧光共振能量转移）技术在PCR定量上的应用。其指在PCR反应体系中加入荧光基团，在指数扩增期间通过连续监测荧光信号出现的先后顺序及强弱变化实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析的方法。RQ-PCR同步进行定量和扩增，这样就克服了传统PCR的平台效应，减少了终点检测带来交叉污染的机会，也克服了终点法定量的不准确性。另外，RQ-PCR无需再处理，节约了时间和精力，更避免了放射性同位素可能给实验人员造成的伤害。目前，RQ-PCR在分子生物学研究中应用越来越多。
1.1 荧光共振能量转移
当一个荧光基团的荧光光谱与另一个荧光基团的激发光谱重叠，并且两个基团距离足够近时，供体荧光基团的激发能诱发受体基团发出荧光，同时供体荧光基团自身的荧光强度衰减，即能量从短波长的荧光基团传递到长波长的荧光基团，相当于短波长荧光基团释放的荧光被屏蔽，这个过程称为FRET。
1.2 参照物
参照物有外参照和内参照两种。外参照不与目的基因在同一反应体系中扩增。以已知浓度的目的基因为模板按一定比例稀释，制备标准曲线。而未知标本则根据该标准曲线得出相对的拷贝数和Ct值。其优点是可以和目的基因保持较高的同源性，保证了二者的扩增效率近似。缺点是不能克服也无法检测可能出现在样本反应体系中的影响因素。内参照是在各标本中加入已知浓度的内参照基因，与样本一起抽提、扩增。内参照基因的DN段与目的基因相似。为保证目的基因只能与内参照探针结合，运用定点突变的方法改变与探针结合的中间部位的序列。内参照系统的结果重复性更好，可以避免不同抽提效率导致的样本间差异。
1.3 RQ-PCR几个重要参数
（1）荧光域值3～15个循环的荧光信号的标准偏差的10倍设置为荧光域值的缺省，荧光本底信号为PCR反应的前15个循环的荧光信号；（2）Ct值中C代表Cycle，t代表threshold，Ct值的含义是：每个反应管内的荧光信号到达设定阈值时所经历的循环数；（3）Ct值与起始模板的关系研究表明，每个模板的Ct值与该模板起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，利用已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，当获得未知样品的Ct值，即可从标准曲线上计算出该样品的起始拷贝数。
2 RQ-PCR技术的关键
RQ-PCR技术在常规PCR基础上添加了荧光染料或探针。特异的将双链DNA掺入荧光染料中，保证其信号与PCR产物完全同步递增。在探针的3’端和5’端分别标记淬灭基团（Q）和报告基团（R），进行能量的传递。R基团所发出的荧光可被Q基团吸收或抑制；抑制作用随着两者距离变远而消失，R基团增强后的荧光信号可以被荧光监测系统接收到。当荧光信号增强到某一阈值时，Ct值被记录下来。这样，通过未知样品的Ct值和标准曲线就可以将该样品的起始拷贝数确定。因此，在RQ-PCR中，荧光染料或探针就成为了技术关键。目前已经开发出的荧光染料和探针按照能量转移和基团标记的方式，大体可以分为水解类探针和杂交类探针两类。
2.1 Taq Man探针法
在该探针的3’末端和5’末端分别标记Q基团和R基团，使其与两引物所包含的一段序列内DNA模板完全互补。当探针完整时，利用Taq酶5’3’外切酶的活性，Q基团吸收R基团的荧光，荧光信号也就不能被检测到；相反如果正确的底物被扩增出来后，即有特异的PCR发生时，探针就会在复性阶段与其杂交，当聚合酶延伸到探针时，它就会将与模板杂交上的探针切碎，使得R基团和Q基团分开，解除淬灭作用，从而释放出荧光信号，可通过检测系统观察到信号的变化。每扩增一条DNA链，就会有一个游离的荧光分子形成，实现了荧光信号累积与PCR产物形成完全同步，进而计算出Rn值、Rn值、Ct值和阈值。通过计算就可以获得起初模板量。常用的荧光基团是VIC、TET、FAM、HEX。
2.2 非特异性双链DNA嵌入染料
SYBR Green 1是一种与双链DNA结合的染料。当它游离在溶液中时，不发出荧光；但当其掺入DNA双链后，会发出强烈荧光。该染料最大的优点是可以作用于任何模板的任何引物。但由于其对DNA模板没有选择性，可能会造成定量不准确。若想解决这个问题，可以使用比较由于融解曲线法，还可以通过反应条件的优化及严格设计高特异性引物，降低引物二聚体形成的可能性。
2.3 分子信标
分子信标由Tyagi和Krammertm建立，适用于鉴定点突变。该探针是单链DNA所形成的呈发卡结构的茎环双标记寡核苷酸，环部部分碱基同靶DNA序列互补，长度为15～35个核苷酸；茎部有互补配对的碱基组成，同靶DNA无序列同源性，约5～7个核苷酸长。在探针的5’端标记R基团，3’端标记Q基团。当分子信标游离时，由于R、Q两个基团紧密相邻，荧光被淬灭。而在PCR变性后的复性阶段，分子信标与溶液中的特异模板杂交，靶DNA序列与分子信标环部的核苷酸序列互补结合，使发卡结构破坏，释放出荧光信号，淬灭作用被解除。由于荧光强度会随着分子信标量的增加而增加，从而达到定量检测的目的。在PCR的延伸阶段，分子信标与模板解离，再次形成发卡结构，荧光消失。每次扩增后产物的积累量可以通过当时的荧光强度的增加来反映。该方法的优点是探针可循环利用，缺点是标记相对复杂。同时，茎部结构的高热力学温度会影响探针和靶序列的杂交。
2.4 杂交探针
双杂交探针也是以FRET为原理进行的。该方法使用四个寡聚核苷酸分子、两个引物和两个探针。发光探针的5’端标记一个R基团，淬灭探针的3’端标记Q基团，杂交时R基团紧密相邻Q基团，以首尾相接的方式退火靶扩增子，当循环仪的光源激发3’端的Q基团后，产生从供体到毗邻探针R基团的FRET使荧光淬灭。起始模板的量越高，荧光淬灭的程度越低，以此可以进行PCR的定量分析。该方法的优点是淬灭效率高，缺点是扩增效率不稳定，合成成本相对较高。
3 RQ-PCR技术的应用
3.1 基因工程研究领域
RQ-PCR技术的出现加强了对基因的量和质变化的研究。它目前已经在遗传分析中广泛应用以检测基因突变及基因组的不稳定性。
（1）基因表达研究由于探针杂交的效率和其后的切除与杂交有关，可以将由不同荧光报告基团标记的探针与野生型和突变基因杂交，2005年刘敬忠等使用RQ-PCR技术对β地中海贫血纯、杂合子作出诊断。目前对遗传性物质改变引起的疾病还无法根治，而应用RQ-PCR技术可以通过产前监测和产前基因诊断来减少病婴出生。
（2）转基因研究Tesson等确定了分析转基因鼠接合性的RQ-PCR技术使用条件，利用合适的循环域值及发光探针，扩增一个转移后的基因和一个对照基因。通过RQ-PCR检测，同型结合的和异质接合的动物后其子代中转基因的传递情况与孟德尔遗传规律相符。这项技术可以广泛地应用于基因剂量功效实验和转基因动物的繁育中。
（3）单核苷酸多态性与突变的分析RQ-PCR可以用来检测基因突变和基因组的不稳定性。一条横跨突变位点的探针和一条锚定探针是检测基因突变的基础。两条探针用两种不同的发光基团标记。如果靶序列中无突变，探针杂交便完全配对；如果靶序列和探针不完全配对，会降低杂交体的稳定性和熔解温度。这样便可对突变和多态性进行分析。
3.2 医学研究领域
（1）病原体检测2000年苏学飞等利用该技术对淋球菌、沙眼衣原体、解脲支原体、人类瘤病毒、单纯疱疹病毒五个项目进行了定量测定。2004年针对SARS流行性病的检测和诊断使得RQ-PCR技术得以应用和发展。近年来，TaKaRa公司推出的试剂盒可以一步完成对H5N1、H7N9等禽流感病毒的检测。
（2）肿瘤诊断基因发生了变异是肿瘤产生的根本，RQ-PCR方法可以将这些异常变化都检测出来。许多癌基因的突变和表达增加，在肿瘤早期就出现。除了能够有效地检测基因突变，RQ-PCR还能够准确地检测到癌变基因的表达量。随着与肿瘤相关的新基因被不断地发现，会使RQ-PCR技术在肿瘤的研究中发挥越来越大的作用。
（3）抗药性考核日本Funato等使用RQ-PCR技术对临床样品中如MRP、MDR21等与抗药性相关的基因表达进行了检测。结果表明，RQ-PCR技术可以可靠地定量检测抗药基因的表达，运用该技术可以对化疗可能引起的反应进行预测。
4 结语
现在，RQ-PCR技术不仅快速、灵敏、准确，而且己经发展为一项高度自动化的核酸定量技术，大大降低了假阳性率，提高了工作效率，且不必使用对人体有害的染色剂。因此该技术被广泛地应用在基因表达研究、基因单核苷酸多态性和遗传性疾病诊断、病原微生物诊断等诸多科研领域。但与传统的PCR技术相比，RQ-PCR也存在不足之处：（1）RQ-PCR在复合式检测方面的应用能力会因检测光源和荧光素种类的局限所限制；（2）由于检测环境相对封闭，减少了扩增后电泳的检测步骤，也就无法对扩增产物的大小进行监测；（3）RQ-PCR实验的高成本也限制了其广泛的应用。
参考文献
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遗传学重叠效应范文4
关键词分子标记;概念;基本原理;特点
中图分类号Q78文献标识码A文章编号 1007-5739(2009)11-0264-07
随着人们对生命认识的不断加深以及遗传学的不断深入发展,越来越多的遗传标记被发现,遗传标记的种类和数量越来越多。主要分为4种类型,即形态标记、细胞学标记、生化标记和DNA分子标记。显然,前3种标记都是以基因表达的结果(表现型)为基础,是对基因的间接反映;而DNA分子标记则是DNA水平遗传变异的直接反映。与表型标记相比,DNA分子标记具有能对各发育时期的个体、各个组织、器官甚至细胞作检测,既不受环境的影响,也不受基因表达与否的限制,数量丰富,遗传稳定,对生物体的影响表现“中性”以及操作简便等特点。分子标记的所有这些特性,奠定了它具有广泛应用性的基础[1-2]。
1分子标记的来源及定义
1.1分子标记的来源
“标记”一词,根据汉语大词典的解释,是“便于识别的标识或者记号”。随着人们对生命本质认识的一步步加深,在人们研究DNA序列时发现了大量的非编码序列,甚至占到了全序列的90%以上。这些非编码序列具有特殊的一级结构,如串联重复、回文结构、Alu序列(反向重复序列)、CpG岛等,并且全基因组分布[3]。随着人类基因组计划的人类基因组框架草图的完成和一个个模式生物的全基因组测序,一个个新的DNA特异序列被发现并且在染色体上定位,整个基因组内的标记密度越来越高,并且大量的特异序列与不同的基因片段有着不同程度的连锁,所有这些标记构成了人类研究探索各种生物基因组DNA的地图与路标。
1.2分子标记的定义
广义的分子标记指可遗传并可检测的DNA序列或者蛋白质。蛋白质标记包括种子贮藏蛋白和同工酶(不同基因位点编码的酶的不同分子形式)及等位酶(同一基因位点上不同的等位基因编码的酶的不同形式)。狭义的分子标记仅仅指DNA标记,一般所称的分子标记即被界定在此范围之内[4]。这是因为在应用上DNA标记比蛋白质标记广泛的多。蛋白质的结构比DNA的结构复杂的多。构成蛋白质的氨基酸有几十种,而构成DNA的碱基只有4种,通过指数级的排列方式仅是其一级结构的可能性就有数量级上的差异,且不计蛋白质更加复杂的二级、三级、四级结构及其结构域。并且到目前为止,蛋白质的复制与合成远不及DNA复制技术成熟,可控性也不高。因此,蛋白质标记应用远不如DNA标记方便和广泛。但从更严格的意义上讲,蛋白质标记是研究生命现象更为精确的标记,因为其更稳定、多态性更高,每种蛋白质都是唯一的(序列唯一、构象唯一)。
1.3理想的分子标记
理想的分子标记必须达到以下要求:①具有高多态性;②共显性遗传,即利用分子标记可鉴别二倍体中杂合和纯合基因型;③能明确辨别等位基因;④遍布整个基因组;⑤除特殊位点的标记外,要求分子标记均匀分布于整个基因组;⑥选择中性(即无基因多效性);⑦检测手段简单、快速(如实验程序易自动化);⑧开发成本和使用成本尽量低廉;⑨在实验室内和实验空间重复性好(便于数据交换)[5]。
特别需要提出的是,所有的分子标记都必须满足和某个基因或者已知标记紧密连锁(连锁程度越高越好)甚至共分离。
但是,目前发现的任何一种分子标记均无法同时满足以上所有要求。使用者可以根据自己的实验目的和要求具体选用某种标记技术。
2目前常用分子标记的基本原理
2.1限制性片断长度多态性(RFLP)
限制性片断长度多态性(Restriction Fragment Length Pol-ymorphism)是指用限制性内切酶处理不同生物个体的DNA所产生的分子片断大小的差异。此技术基于生物个体的基因组的变异,是研究不同基因组间的差异的技术,由Grod-zicker于1974年首先提出。其基本原理是:物种经过长期的进化,各个种属甚至品种之间的同源DNA序列上的限制性内切酶识别位点不同,或者由于突变、重组等原因引起限制性内切酶位点上的核苷酸的变化。若引起DNA分子某一特定内切酶识别位点序列内发生变化,这样该位点就不能被切开,使得DN段比亲本长;若突变后形成新的酶切位点,则酶切后的片断变短。这样,通过电泳可以将大小不同的片断区分开来。对于分子量较小的质粒DNA就可直接观察到DNA长度的差异,但对于核DNA而言,DN断呈连续分布,无法辨别差异,需通过Southern杂交转移至支持膜上,用单拷贝或低拷贝的DNA克隆作为探针与膜上的酶切片断杂交,通过放射自显影或非同位素显色技术,发生变异的材料显示的带就可能与亲本的带处于不同位置。检测出与此标记DNA相关的片段构建出多态性图谱,即为RFLP[5,6]。这种特定的限制性片断与DNA探针的组合,便可以作为遗传标记。由于RFLP起源于DNA的变异,不受显隐性关系、环境条件和发育阶段的影响,具有遗传的专一性和稳定性的特点,在数量上不受限制,可随机选取足够数量能代表整个基因组的RFLP标记,而且每个标记变异大,检测方便。用于检测RFLP的克隆探针可随机选取,可以是使核糖体DNA、叶绿体DNA,也可以是总DNA。这样就可以获得能够反映遗传差异的大量多态性,为进行资源分析、品种鉴定、物种进化、基因定位、亲缘关系和遗传距离的分析,遗传图谱的构建提供了有力的工具。并且RFLP是共显性标记,能够区别出杂合体与纯合体[7]。虽然RFLP具有结果稳定可靠,重复性好,特别适合建立连锁图等优点,但也具有检验步骤多、周期长、成本高等缺点。并且RFLP对DNA多态性检出的灵敏性不高,RFLP连锁图谱上还有很大的空间区(gap),甚至在使用同位素时可能对人有一定的伤害等等,这些都是需要进一步完善的地方。
2.2随机扩增多态性DNA(RAPD)
随机扩增多态性DNA(Random Amplified Polymorphi-sms DNA)是美国杜邦公司的Williams和加利福尼亚生物研究所的Welsh等领导的2个小组于20世纪90年代同时开发出来的一种新的DNA指纹技术。此技术是应用一系列随机引物扩增并寻找多态性DN段的遗传标记技术。这一技术建立于PCR反应基础之上,以随机的短脱氧核苷酸(通常为10个碱基)作为PCR引物,对基因组DNA进行扩增而产生多态的DNA图谱。扩增产生的片段可通过琼脂糖电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳分开,经溴化乙锭染色或银染色得到多态性的DNA图谱后进行多态性观察。在基因组上,每个引物可以连续直接扩增特定的DN段,对一个特定的基因型来讲,这些扩增的片段或片段的类型是唯一的。它的应用是基于这样的一个理论:对于同一模板DNA,用同一引物扩增既可能得到相同的带谱(模板基因组间可能具有同源性),也可能得到不同的带谱。仅在某一特定模板中出现的条带即可作为该模板的分子标记[8,9]。事实上,不同基因组DNA总是有一定差异的,所以用RAPD即可进行分子标记研究。理论上讲,在一定的扩增条件下,扩增的条带数取决于基因组的复杂性。对特定的引物,复杂性越高的基因组所产生的扩增条带数也越多。
RAPD所用的一系列引物的DNA序列虽然各不相同,但对于某一特定引物来说,它同基因组DNA序列有特定的互补区域。这些特定区域在基因组的分布如果符合PCR扩增的反应条件的话,即引物在模板上的2条链如果有互补位置并且与引物的3′端在200bp以内,就可以扩增出这一片段。如果基因组在这些区域内发生插入、缺失或者替换即可导致这些特定的结合位置分布发生变化而使PCR产物发生增加、缺失或者分子量发生改变,通过对PCR产物的检测,即可找出基因组DNA在这些区域内的多态性[10]。由于RAPD分析时所用的引物数量极大,并且引物序列随机,虽然对某一引物而言检测的区域有限,但是利用一系列引物可以检测的区域几乎可以覆盖整个基因组。与RFLP是从一系列酶切片段中寻找多态性片段不同,RAPD是利用PCR随机合成多态性DN段,检测被扩增区域内的遗传特征变化。其具体优点体现在:①极大的丰富性,能反映整个基因组的变化;②强大的可探测性,无需合成特定的引物;③高效性与灵敏性。短期内可以得到大量的扩增片段,只要是遗传特异性的发生变化,即使亲缘关系很近的个体也可以识别出[11]。
RAPD最大的特点是引物的碱基序列是随机的,所用引物通常多达几百种,并且1套引物可以用作多个物种或者群体,所以RAPD技术在用于遗传多样性和品种鉴定的研究中具有极大的优越性。因此,用来鉴定品种纯度是很有用的。据报道[9],从玉米、大豆、小麦及红三叶草干种子中提取DNA并成功地利用RAPD技术扩增DN段;中国科学院遗传所陈洪等利用OPP-18引物成功地鉴定了杂交水稻汕优63杂种纯度,鉴定结果与田间小区种植鉴定完全一致。RAPD技术反应灵敏、多态性强,操作简便,速度快,费用低,既有大量的随机引物可供筛选之用,又不受种属的限制,被广泛用于多种作物的种子鉴定[9,11,12]。
由于是随机引物对整个基因组进行多态性检测,在技术上简单易行不需要克隆制备、同位素标记、Southern印记等预备性工作,所需DNA样品量少,安全性好,价格便宜,是继RFLP之后应用最广的分子标记。由于引物没有特异性,1套引物可用于不同生物基因组的的分析,分析速度快,短期内可得到大量的遗传标记,并克服了同工酶位点少和RFLP操作技术复杂的弊端,已经广泛应用于遗传作图、基因定位和克隆、物种进化及鉴定特殊染色体区段的鉴别和分离以及动植物育种等方面,特别是在寻找与目的基因连锁的分子标记方面,近年来报道了大量的与各种目的基因连锁的RAPD标记。水稻的Xa-21 基因和西红柿的pto基因的成功分离就是首先找到了与目的基因紧密连锁的RAPD标记,然后通过定位克隆的方法克隆了目的基因[13]。
与PCR相比,RAPD具有以下特点:①RAPD使用的是随机引物,不需要预先了解目的基因和相应的序列;②操作简便,实验周期短,能在较短的时间筛选大量样品;③引物具有普遍适应性,适用于自动化操作分析。
与RFLP相比,RAPD具有以下特点:①RAPD分析只需要少量模板,1次扩增仅需20~100ng,这对于DNA量很少的材料进行基因组分析有利。比如对花粉粒、原生质体、种子等的DNA分析是切实可行的。②RAPD标记具有更大的随机性,亦有利于图谱的构建。对于DNA含量大的和多倍体物种,RFLP探针会与多倍体的多个片段杂交,所得到的混合指纹会对其他等位基因的阐明带来困难。而且由于DNA量较大,进行单拷贝的Southern杂交不很实际,至少需要很长的曝光时间,并且已知的探针数量有限。RAPD大大增加了可构建遗传图谱物种的数量。③无需借助于有伤害性的同位素,耗费的人力物力少。④灵敏度高。引物中的个别碱基的变化会引起扩增条带和强度的剧烈变化,这是RFLP所无法比拟的。短期内可以得到大量的扩增片段,只要是遗传特异性发生变化,即使亲缘关系很近的个体也可以识别出。⑤RAPD标记可以覆盖整个基因组,包括编码和非编码区,可以反映整个基因组的变化。但是,由于引物的竞争性等,基因组的RAPD位点有时不能全部检出,造成假象上的差异,这在种属亲缘关系的研究上尤其明显。⑥RAPD产物有大于50%的条带扩增于单拷贝区,经过克隆和序列分析后,可作为RFLP和原位杂交的探针,在基因定位、克隆及辅助选择育种中可以广泛应用。
随着RAPD日益广泛的使用,其不足之处也逐渐显现,比如标记的显隐性位点性,致使其不能在后代中区分杂合体和纯合体;稳定性差,由于是单链引物随机的结合,在众多的反向重复序列上,每次的实验结果可能不一致。解决办法是对单链引物进行筛选,优化PCR条件;高度的变异性,即使在亲缘关系很近的物种间,结果也可能差异极大;Tm值低的随机引物易受外界环境影响,如Mg2+浓度等[8,9,14]。
由于RAPD技术是由多种成分参加的生化反应,反应中各种成分均为微量,尽管其反应灵敏度高,但是影响因素较多,故而RAPD受环境影响很大,稳定性差,重复性也不好,因此对实验的设备、条件及其操作的一致性很严格,这又大大限制了它的使用。为了得到较稳定的结果,各种反应参数必须事先优化选择,操作中每一步都必须小心谨慎,以防止出现差错。
2.3特征序列扩增区域(Sequence-characterized amplified regions,SCAR)
RAPD标记一般表现显性遗传,但若某RAPD片段不是重复序列,也可将其转化为RFLP标记。另外,为了提高某一理想RAPD标记的稳定性,可首先将其克隆并对其末端测序,之后,在原来RAPD所用的10bp引物上增加合成上述末端序列的14bp的核苷酸,以此为引物对基因组DNA再行扩增分析,此即SCARs(Sequenced Characterized Amplified Regions)标记[15]。
SCAR首先由Parar和Michlmore(1993)提出并应用。SCAR标记是在RAPD技术的基础上发展起来的。其基本步骤是:先作RAPD分析,然后把目标RAPD片段(如与某目的基因连锁的RAPD片段)进行克隆和测序,根据原RAPD片段两末端的序列设计特定引物(一般比RAPD引物长,通常24个碱基,是在原RAPD引物的3′与5′端延长14个碱基),利用两端各24个碱基的引物再进行PCR特异扩增,这样就可把与原RAPD片段相对应的单一位点鉴定出来。这样的位点就称为SCAR。总的来说,SCAR比RAPD和其他利用随机引物的方法在基因定位和作图中的应用更好,因为它有更高的可重复性(原因是使用的引物长),标记是共显性遗传的[16]。
该方法与RAPD相比,具体有如下优点:①由于有较长的引物,退火温度较高,因此具有更高的检测稳定性;②有将显性RAPD标记转化为共显性的SCAR标记的可能性;③如果是显性标记,则在检测中可以直接染色而不需电泳检测。另外,用RAPD找到扩增片段后不再设计引物,而是直接测序后通过电脑软件分析(如用ClustalX软件进行对位,MEGA软件计算DNA序列间的差异百分率和转换/颠换数,UPGMA软件建亲缘关系树状图等),找出特异性的碱基作为鉴定的特异性标记[17]。
2.4与RAPD技术相近的分子标记种类
下面提到的所有技术都是利用1个或2个短的富含GC碱基的随机引物。
(1)DNA扩增指纹图谱(DNA amplification fingerprint-ing,DAF)[18]。与RAPD技术不同的是,在DAF分析中,引物浓度更高,引物长度更短(一般5~8个碱基),只有2个温度循环(在RAPD中是3个温度循环),并且往往用聚丙烯酰胺凝胶电泳,DAF通常会产生非常复杂的带型。
(2)任意引物PCR(arbitrarily primed polymerase chain reaction, AP-PCR)。AP-PCR使用的引物较长(10~50个碱基),但PCR反应前2个循环的严谨条件较低,最终的反应结果与RAPD类似[19]。在AP-PCR分析中,扩增分为3个部分,每个部分要求的条件和组分的浓度存在差异;在第1个PCR循环中,引物浓度较高;引物长度不定,并且常常来自为其他目的而设计的引物(如M13通用测序引物)。
2.5扩增片段长度多态性(AFLP)
扩增片段长度多态性(Amplified Fragment Length Poly-morphism),亦称选择性限制片段扩增(SRFA, Selective Res-triction Fragment Amplification),是荷兰Keygene公司的Za-beau Marc和Vos Pieter于1993年创建的一种新型的分子标记,并于当年获得了欧洲专利局专利[20]。
它是RFLP和PCR相结合的分子标记技术,既有RFLP的可靠性,又有PCR(如RAPD)的灵敏性,多态性高。其基本原理是利用PCR技术选择性扩增基因组DNA双酶切后产生的限制性片断。基因组经2种限制性内切酶消化以后将一双链DNA人工接头(artificial adapter)连接于限制性片断两端。然后根据接头序列和限制性位点附近的区域的碱基序列,设计一系列3′端含数个随机变化的选择性碱基的PCR引物进行特异性条件扩增,只有那些限制性位点的侧翼序列与引物3′端选择碱基相匹配的限制性片段才能得以扩增。这些选择性碱基数目的多少主要是由待测样品的基因组大小决定,选择性碱基数目多,选择性就强,扩增产物就少;反之,其数目就少,选择性弱,扩增产物就多。扩增产物经变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离显示其多态性。当不同基因组DNA中因为突变引起限制性位点的数量发生改变或2个限制性位点之间的区域内发生碱基插入、片段消失或顺序重排时,电泳谱带显示多态性,多态性以扩增片段的长短不同和数量多寡显示出来[21]。
AFLP的技术特点包括以下几个方面:①使用2种内切酶消化模板DNA。一些酶的切割位点较多,如MseI、TaqI、XbaI等,另一些酶切位点较少,如PstI等等。采用双酶切割的原因是:多切点酶产生小片段,便于凝胶分析切点数少的酶减少扩增片段,由于AFLP反应中扩增片段是2个酶共同酶切的片段,这样减少了选择扩增时所需的选择碱基数。双酶可以进行单链标记,从而防止电泳中因为双链泳动不均而产生的双带假象。并且可使少量引物产生许多不同的引物组合,从而产生大量的不同的AFLP指纹图谱[22]。另外,不同物种基因组的AFLP过程中使用的限制性内切酶也不尽相同。EcoRI可靠廉价,是6碱基内切酶的首选。分析真核生物基因组时大多使用MseI(4碱基),因为MseI的识别序列是TTAA,而真核生物基因组富含AT序列,与TaqI相比(其识别序列为TCGA),可以获得更多的便于PCR扩增和电泳分离的小片段DNA[23]。②AFLP的接头为双链寡核苷酸。人工合成时接头未进行磷酸化处理,所以只有1条单链连接于酶切片段的末端。③与常规的PCR相比,AFLP的引物有其独特性。其引物有3部分构成:与接头互补的核心序列、内切酶识别序列以及3′末端的选择性碱基。该类引物的一个重要特征是通常以鸟苷酸G开头,这样可以有效的形成双链,不过当dNTP浓度过低时容易形成双链结构。此外,选择性碱基的数目影响着AFLP反应的特异性。研究表明,引物带有1~3个选择性碱基时扩增的选择性较好。当选择性碱基超过4个时,扩增的错配程度超过了允许程度,故而AFLP的选择性碱基数目一般不超过3个,具体数目取决于基因组的大小。研究表明,分析500Mbp以下的植物基因组时用EcoRI+2(2个选择性碱基)/MseI+3引物组,500~6 000 Mbp的基因组应采取EcoRI+3/MseI+3较为严谨的引物组。微生物通常采用1个选择性碱基的引物组[24]。④AFLP的PCR扩增分两步进行。首先预扩增,其扩增产物经过一定比例稀释后,以此为模板再进行选择性扩增。两步扩增可以减少扩增产物中的非特异性带,降低了不清晰电泳造成的指纹图谱的背景,提高了指纹图谱的清晰度,还可以增加扩增片段数,为AFLP分析提供充足的模板。
AFLP技术不仅具有其他分子标记的优点,即位点数量无限,呈典型的孟德尔遗传,无表型、复等位效应,不受环境影响等,还具有一些独特的优越性,如标记异常丰富,典型的AFLP反应中,1次电泳可得到100~150个扩增产物,其他标记技术难以达到。稳定性、重复性好,应用非常广泛,可用于任何生物基因组的遗传分析。与PCR技术结合,可在短时间内得到大量多态性标记。同时对模板浓度不敏感,模板需求量也小。Vos Pieter在对番茄基因组AFLP分析时,证实了模板浓度在相差1 000倍以内(0.000 5~25ng)获得的指纹图谱基本一致。另外,在AFLP中标记的引物会全部耗尽,引物耗尽后,扩增的带型不受循环数的影响。这样模板浓度即使不一致也可以通过增减循环次数的方法获得强度一致的带型。目前,AFLP是构建基因组特定区段高密度连锁图谱的最有效的方法。此外,AFLP全基因组分布非常适合构建遗传连锁图谱。AFLP也可以用于检测DNA库(DNA pool)克隆的DNA大片段的多态性,而且其多态性的标记大多对应于基因组的某一位置,这样就可以和STS一样,成为遗传图谱(genetic map)和物理图谱(physical map)之间的桥梁[25,26]。
实际操作中,影响AFLP指纹图谱结果的因素很多。因此,应采取质量高、纯度好、分子量大的的基因组DNA作为模板。如果模板中含有其他杂质或者DNA降解很严重,导致酶切不完全,许多未经酶切的模板片段经电泳后产生表现为高分子量的条带(假带),导致不能真实地反映被测物种的多态性。为了避免电泳的条带过多或者过少,应对PCR反应体系进行优化,筛选出最佳的引物组合。PCR扩增时,应在模板变性之前加入Tag酶和dNTP,否则会导致扩增失败。反应体系中的dNTP浓度不能过低,否则扩增产物容易形成双链结构[21,27]。
2.6序列标签位点(STS)
序列标签位点(Sequence -Tagged Site,STS)指的是一段序列已知并且能够在基因组中作为“路标”使用的DNA序列,是对由特定引物序列所界定的一类DNA标记的统称。其最大特点就是利用特异PCR,因此结果非常可靠。显然,成为STS必须满足2个条件:①序列已知;②位置确定并唯一。从理论上讲,任何一段DNA都可以成为STS。但是,由于需要的是与某一个目标性状基因或已知的标记紧密连锁的DN段,因此能够利用的STS数量则非常有限。根据单拷贝的DN段两端的序列设计1对特异引物扩增基因组DNA,产生的一段长度为几百bp的特异序列在基因组中往往只出现1次,从而能够界定基因组的特异位点。在人类基因组作图中已用其作为将遗传图谱与物理图谱整合的共同位标,这在基因组作图上具有非常重要的作用。随着大量的模式生物的全基因组测序,会有越来越多的可利用的STS被发现。
2.6.1表达序列标签标记(Expressed Sequence Tags,EST)。EST是指一小段(通常长度300~500bp)单次重复的mRNA序列或cDNA序列。它们在特定的组织或者特定的时期内特异的表达,可以看作是特定的cDNA文库中的标记。EST计划由美国科学家Venter于1989年提出,并首先应用于人类基因组研究,之后被广泛用于植物基因组研究,它是通过大规模的cDNA随机测序,从而获得对基因组认识的一种研究策略。目前,许多国家和组织正在开展某些作物基因组EST计划的研究,如成立于1998年的国际小麦族EST协作网(International Triteace EST corperation,ITEC),就是致力于麦类EST研究和开发的[28]。近几年来,国际公共数据库中的EST序列呈指数增长,截止到2006年8月,美国生物信息中心(NCBI)数据库Genbank已公布涉及205 000种生物的61 132 599条EST序列,总长度共65 369 091 950bp。
快速增长的ESTs数据为SSR标记的开发提供了一个巨大的有价值的来源。首先,避免了传统SSR标记开发需要构建基因组DNA文库等烦琐步骤,而且从ESTs中发掘出的SSR只是ESTs测序计划的副产品,从而节省了大量人力物力[29];其次,其本身是功能基因的一部分序列,所以它将为功能基因提供“绝对”的标记[30]。同时,由于不同物种间基因共线性和保守性,从一种作物中开发的EST-SSR可同时用于其他作物研究,从而能够为比较基因组学和同源基因克隆提供新的途径[31]。现在EST-SSR已被用于构建遗传图谱、分离与鉴定新基因、基因表达差异研究、比较基因组研究和制备DNA芯片等方面。
另外,还有一种被称为GSS序列的标记。GSS序列本质上和EST序列是一样的,不同之处是它的序列直接来源于基因组而不是mRNA或cDNA。它通常有以下几种来源:①全基因组检测得到的特异/单次重复序列;②来自质粒/BAC/YAC克隆所得到的单次重复序列;③基因组外显子捕获;④通过Alu―PCR得到的序列。
2.6.2微卫星(SSR)。微卫星(microsatellite)又叫做简单重复序列(Simple Sequence Repeat)或者短串联重复序列(Short trandem repeat,STR)、简单序列长度多态性(Simple Seque-nce Length Polymorphism,SSLP)。简单序列重复多态性(Si-mple Sequence Repeat Polymorphisms,SSRP)微卫星指的是真核生物普遍存在的遍布整个基因组的排列为2~5个核苷酸的短串联重复序列,如(CA)n、(GT)n、(CAG)n等,尤以(CA)n重复序列最为常见,其长度由重复单位的拷贝数决定。在真核生物基因组中微卫星很丰富,通常长度能够达到150bp,是一类呈高度多态的遗传标记,不仅可用于基因组遗传连锁图的构建以及基因的定位与克隆,而且可用于遗传性疾病的连锁分析和基因诊断。其重复单位数目的改变可以引起相当高的多态性,但突变率仅为0.5×10-4~5.0×10-4,在家系中可以稳定地遗传,是一种很好的遗传标志[32]。
微卫星约占真核基因组的5%,其基本构成单位一般为1~8bp,多位于编码区附近,也可位于内含子、启动子及Alu序列(反向重复序列)中。人类基因组约有5~10万个(CA)n重复序列。通常认为重复序列的产生是由于在遗传物质复制过程中DNA滑动或在有丝分裂、减数分裂期染色体不对等交换所致,因此该重复序列多存在于不经严格选择的基因组区域。目前普遍认为微卫星充当基因重组的热点是基因重排和变异的来源[33]。微卫星不稳定性(microsatellite instabi-lity,MSI)是指由于复制错误(replication error,RER)引起的简单重复序列的增加或丢失,也称RER阳性或RER表型。MSI首先在结直肠癌中观察到。微卫星通过改变DNA结构或通过与特异性蛋白质结合而发挥其基因调控作用。
由于微卫星的寡核苷酸在同一物种的不同基因型之间差异很大,可以利用特异引物进行PCR扩增。引物根据与微卫星重复序列两翼的特定保守序列设计,用来扩增重复序列本身。由于重复的长度变化极大,所以这是检测多态性的1种有效方法[34]。其特点包括:一般检测到的是1个单一的多等位基因位点;共显性遗传,故可鉴别杂合子和纯合子;得到的结果复性很高。为了提高分辨力,通常使用聚丙烯酰胺凝胶电泳,它可检测出单拷贝差异。也可以在同1个反应试管中把PCR反应与不同的SSR引物结合起来(称为multiplexing),这可节省时间,但是,这只能在不同引物的产物在大小上下不重叠的情况下才能使用[35,36]。很显然,使用SSR技术的前提是需要知道重复序列两翼的DNA序列的信息,这一方面可以在其他种的DNA数据库中查询,否则就必须先建立含有微卫星的基因组文库,再从中筛选可用的克隆,进行测序,然后设计合适的引物。同时,这种由保守序定的微卫星序列也具有染色点的特异性,因此1981年Miesfeld等首次发现微卫星后,很快成为1种常用高效的分子标记。统计分析表明,不同的物种其微卫星的突变频率也是稳定的。SSR的PCR引物也是对某一高变重复位点高度专一的。用特定引物扩增出相应的微卫星片段后,再通过电泳分离,差异可经过EB或者银染后观察。一般种群可显示出超过10种类型的等位基因。微卫星不仅重复单位变异数大,而且其重复区域总长度又在PCR易于扩增的区域,快速简便,所需的DNA用量小。与等位酶相似,微卫星是具有独立的共显性基因。由于微卫星的遗传中性并且比等位酶法有更多的可供检测的等位基因,这样就可以提供更加精细的基因变化的范围,因此在种群研究上有着更大的应用[3,34,37-39]。
简而言之,微卫星的最大优点在于通过简单的PCR扩增即可直接检测到已知的特定的染色点,不仅具有一般PCR操作简单、快速、成本低的特点,还具有RFLP的稳定可靠、特异性、共显性等特点,不足之处是其引物开发难度较大,技术复杂,周期长,成本也高。不过随着众多模式生物的全基因组测序的飞速进展,对全基因组了解的日益全面,各个大型数据库的逐步完善,并且借助越来越发达的计算机计算和预测技术,使得开发成本有所降低。
2.6.3其他具有特定引物的分子标记种类。
(1)加锚微卫星寡核苷酸(Anchored microsatellite oli-gonucleotides)。Zietki-ewicz et al(1994)对SSR技术进行了发展[40],他们用加锚微卫星寡核苷酸作引物,对基因组节段而不是重复序列本身进行扩增。在SSR的5′端或3′端加上2~4个随机选择的核苷酸,这可引起特定位点退火。这样就能导致位于反向排列的间隔不太大的重复序列间的基因组节段进行PCR扩增。这类标记又被称为ISSR(inter-simple sequence repeat)、ASSR(anchored simple sequence repeats)或AMP-PCR。这类标记往往是显性遗传的。在所用的两翼引物中,可以1个是ASSR引物,另1个是随机引物。如果1个是5′端加锚的ASSR引物,另1个是随机引物,则被称为RAMP技术。
(2)CAPS(Clea-ved amplified polymorphic sequence)。CAPS技术又可称为PCR-RFLP。所用的PCR引物是针对特定的位点而设计的。其基本步骤是:先进行PCR扩增,然后将PCR扩增产物用限制性内切酶酶切,再用琼脂糖凝胶电泳将DN段分开,用EB染色,观察。与RFLP技术一样,CAPS技术检测的多态性其实是酶切片段大小的差异。在酶切前进行RCR产物检测,其多态性称为ALP。Neff et al.(1998)在此基础上又发展出dCAPS技术(derived CAPS),这是检测单核苷酸多态性的一种良好方法。
(3)单引物扩增反应(single primer amplification reaction,SPAR)。SPAR技术与RAPD技术相似的是也只用1个引物,但SPAR分析中所用的引物不是随机的,而是在SSR的基础上设计的,例如可能的序列是(TA)10或(CGA)6。扩增的是SSR之间的DNA序列。又称为MP-PCR(microsate-llite-primed PCR)。
(4)小卫星区域DNA直接扩增(directed amplification of minisatellite region DNA,DAMD)。直接用小卫星的核心序列作引物进行扩增。
(5)Inter-Alu PCR like genomic profiling。与SPAR技术相近,也只用1个引物,但所用的引物是在Alu序列(反向重复序列)的基础上设计的,扩增的是copia(另一种反向重复序列)序列之间的DNA序列。
(6)ISTR(inverse sequence-tagged repeat)。这种技术与SPAR技术也相近,所用的引物是在copia序列的基础上设计的,扩增的是copia序列之间的DNA序列。
(7)IFLP(intron fragment length polymorphism)。检测的对象是内含子的长度差异。根据内含子两端的特征序列设计引物,扩增出长度不同的内含子片段。
(8)RAMPO(random amplified microsatellite polymorph-ism)。RAMPO的英文全名与RAMP的英文全名相近,但实验方法却不同。RAMPO的基本步骤是:先用1个单一的随机引物(即RAPD引物)对基因组DNA扩增,用电泳将扩增片段分开,然后,把凝胶转移到尼龙膜上,使之与一个带有放射性标记(或其他标记)的与SSR互补的寡核苷酸探针如(CA)8和(GA)8杂交,放射自显影后可得到新的多态性类型。
先找到RFLP标记后,对RFLP探针进行测序,再合成适当的PCR引物,这样可发现新的STS标记。这也可称为RFLP-PCR。
3抗性基因同源序列(RGA)
近年来,在各种农作物抗性育种的进程和模式生物的抗性研究中,在水稻、玉米、番茄、马铃薯、烟草、拟南芥等植物中克隆了若干抗性基因,包括植物对病毒、细菌、线虫的抗性基因。例如烟草抗花叶病毒基因、水稻抗白叶枯病基因Xa-21、拟南芥抗丁香假单胞杆菌基因RPS2、亚麻抗锈病基因L6以及甘蔗抗胞囊线虫基因HS1等。
Leister等通过分析研究已克隆的植物抗病基因的结构特征,发现很大一部分的抗病基因都含有NBS保守序列。同年,《美国科学院院刊》在同一期发表了2篇应用同源序列从大豆中克隆R基因同源序列的报道,从而引发了同源序列法在植物抗病基因研究中的应用。随后的大量研究表明,植物抗病基因中存在多种类型的保守结构域。Hammond Kosack和Parker通过分析已克隆的植物抗病基因结构,将植物抗病基因分为8 类,其中,含有NBS-LRR(富亮氨酸重复子Leucine-rich Repeats,LRR)结构域的抗病基因是最主要的类型。
这些结构可能是参与蛋白质之间的相互作用或者细胞信号的传导以及识别。根据抗性基因的这一共性,以其保守结构的序列为基础设计引物,在任何作物中,用PCR技术扩增和分离具有相似序列的DN段,即抗性基因同源序列。
RGA提供了一种快速鉴定候选抗性基因的便捷途径。目前已经利用此技术在小麦、大豆、马铃薯中鉴定了候选抗性基因,它们在基因组的位置基本上就在已知的抗病基因区域。已知基因包括抗病毒、细菌、真菌和线虫的基因。而且部分与抗性基因紧密连锁的标记本身就是抗性基因或者抗性基因的一部分。因此,应用RGA进行基因定位可以较快地检测到与抗性基因紧密连锁的分子标记。可以预见,RGA将成为抗性基因定位的重要手段,并且在分子作图的领域将发挥更加巨大的作用[41,42]。
4单核苷酸多态性(Single nucleotide polymorphisms,SNPs)
单核苷酸多态性是指2套基因组的DNA序列两两进行位置比对时, 单个核苷酸的的不同而显示出的差异(多态性)。因此,SNP反映了过去多数突变事件的特点,2个个体在同一位点携带的不同等位基因被认为是进化的遗传标志。显而易见,SNP是目前已知的多态性最高的分子标记。据Genbank估计,如果比较2套人类基因组的DNA序列,出现SNP的频率可达1/2 000~1/1 000,看起来这个频率并不高,但是考虑到人类基因组共有3.2×109bp时,即可能出现3.2×1012个SNP位点时,这个数量已经相当可观了。并且这只是2套基因组之间的比较,所有的SNP位点肯定比这个数字大得多。水稻中SNP分布频率也很高,平均1 000bp就有1个SNP,这些标记随着水稻基因组的实施而被发现和利用。由于SNP具有同一个位点多态性低而全基因组多态性又极其丰富的特点,并且分析时只需要进行阴/阳性分析而不需进行片段的长度分析,特别适合用DNA芯片技术进行大规模的扫描分析,是继微卫星后最为高效的标记。不过其昂贵的成本(开发和使用的成本都很高)使其应用受到一定的限制。建立可供利用的SNP标记需经过以下几步:①全基因组测序;②根据测序结果确定特定的序列标记位点;③对STS进行扫描,寻找SNP位点;④确定SNP;⑤将SNP定位到染色体上。
5单链构象多态性(Single Strand Conformational Poly-morphism,SSCP)
SSCP是指DNA单链构象的多态性,是基于PCR扩增而新发展起来的一项检测DNA多态性的分析技术。在进行SSCP分析时,利用PCR特异的扩增出基因组目的DN段,然后将这些扩增出来的DN段进行变性处理,使双链DNA分开成单链,再用非变性凝胶电泳分离。由于在自然状态下,单链DNA会折叠卷曲,形成一定点空间构象,这种空间构象是由DNA链的碱基序列决定。如果扩增的目的DN段序列的碱基发生了变异,就可能造成其单链的空间构象发生改变,从而影响其单链电泳时的迁移速率,导致其在电泳图谱上的带纹位置不同,显示出不同生物个体DNA的特异性。
6新型分子标记的开发及其应用前景
自从20世纪70年代第1代分子(RFLP)标记出现以来,分子标记家族迅速发展繁荣起来,并且准确性和灵敏性也一步步提高。目前的SNP技术已经可以在单个核苷酸的水平上找出不同样本之间的差异,即使它们之间的亲缘关系非常接近。
纵观分子标记的发展,是伴随着人们对生命本质的认识一步步加深,认识范围从宏观表型一步步逼近微观世界的进程同步发展的。任何一个特殊生命现象的发现,都可能导致革命性的理论或技术的产生,DNA双螺旋理论的提出导致了DNA的自我复制理论,又进而导致了PCR技术以至于后来的全自动PCR仪的问世(当然也少不了其间Taq聚合酶的发现)。比如各种类型的外切酶和内切酶的发现导致了RFLP技术的产生。
重大的技术突破来源于理论的突破性进展,重大理论的提出来源于无数细微现象的总结。回顾20世纪生命科学的重大突破:1900年孟德尔的遗传理论被重新认识;1920年,摩尔根的基因理论和连锁遗传的提出;1953年,DNA双螺旋结构理论的提出;直到90年代,自动PCR仪的出现。从此,人们又进入了一个众多实验现象的重复和积累的阶段。已经有很多不能解释甚至是矛盾的试验现象在陆续出现。可以预言,下一次的理论突破将导致更加革命性的发现,也必将使得分子标记技术能够从更加深的层面上解释生命现象本身,人们对分子标记的认识和利用也更加深刻和简便。并且随着计算机技术的迅速发展,使得人们不仅能从浩如烟海的数据和现象中发现总结规律,还能够根据现有的现象和规律来预测可能的现象乃至规律。根据目前的发展来看,分子标记的用途不会再局限在传统的生物、医学、农业等领域,还会扩大到诸如数据加密传输、计算技术等领域。
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遗传学重叠效应范文5
关键词：抑郁症；神经成像；转化研究；临床
分类号：B845
1.前言
抑郁症（Maior Depressive Disorder）是最常见的精神障碍之一，其在临床上最为显著的表现为情绪低落、精力减退、活动降低、缺乏以及相关的躯体症状（如体重增加或减轻、睡眠障碍和疲劳等），重度抑郁甚至导致心理迟滞与思维困难（Seminowiez et al.，2004）。世界卫生组织的统计结果表明，抑郁症目前已经成为全球第四大疾患，并且预计到2020年可能成为仅次于心脏病的人类第二大疾患（WHO，2008）。相关数据表明，高达20%的人群在其人生历程中至少经历过一次抑郁，而且其复发率超过80%（Gotlib&Hamilton，2008）。抑郁症不但增加了病人及其家属的经济负担，损害了病人的生理、认知和社会功能，还导致了更高的死亡风险（Bortolotti，Menchetti，Bellini，Montaguti，&Berardi，2008）。由于它的高发生率和破坏性后果，抑郁症已经成为一种重要的公共健康问题。
虽然许多元分析的结果表明，心理治疗（如认知行为疗法、心理动力学疗法与人际关系疗法等）和药物治疗能够减轻抑郁症状，有一定治疗效果（cuijpers，van Straten，Andersson，&Varl Oppen，2008；Cuijpers，Van Straten，van Oppen，&Andersson，2008；Pinquart，Duberstein，&Lyness，2008）。但在临床隋境中，还存在以下问题：（1）抑郁症的病因和发病机制不甚清楚。（2）现有的诊断采用疾病分类学的方法，过于简单和主观，容易导致较低的抑郁症识别率。（3）抑郁症具有很大的异质性，不同阶段和不同的人表现出来的症状类型和严重程度存在很大差异，容易导致较高的误诊率。（4）抑郁症治愈率低且药物治疗存在一定副作用，尤其是针对难治型抑郁症（treatment-resistant refractory maior depression），大约20%的人治疗不起作用（Fava，2003；Keller et al.，1992）。（5）抑郁症治疗的长期效果差，复发率高。基于以上因素，探讨新的途径，用于提高抑郁症的预防、诊断和治疗效果具有重要的现实价值。而神经成像技术的转化研究为这一目标的实现提供了巨大的可能性。
2.转化研究的发展概况、定义及其主要步骤
转化研究（translational research）是指系统性地尝试整合基础研究者和临床研究者的两个不同的研究视角（Rosenthal，Gratz，Kosson，Cheavens，Lejuez，&Lynch，2008）。其中基础研究经常采用控制精良的实验室方法来阐述潜在的过程，在该过程中不需要思考实际应用目标，其产出是一般知识以及对自然法则和规律的理解（Rubio et al.，2010）；而临床研究者聚焦于将研究结果更加直接地运用到真实世界中，包括患者导向研究（Patient-oriented research）、流行病学和行为研究以及成果研究和健康服务研究（NIH，2001）。转化研究这一术语最早出现在1993年Medline搜索中，但是上世纪90年代的医学文献中只有很少的文章与该术语相关联，而且相关的文章也大都是关于癌症研究的。那时，关于癌症的文献倾向使用“转化研究”来指代包含不同类型研究的工作（例如，覆盖基础和临床研究两方面的免疫学研究）或者在某一特殊研究类型中包含不同学科的工作（例如，涉及分子遗传学和免疫学两种学科的基础研究）（Rubio et al.，2010）。时至今日，不同领域的研究者在此定义上进行了大量尝试和工作。大体上说，目前转化研究主要有两种路径：一种是将基础研究的发现转化到临床运用（from bench to bedside）；另一种是将临床问题转化为基础研究（fTom bedside to bench）（Rubio et al.，2010）。
Wang，Heinssen，Oliveri，Wagner和Goodman（2009）提出转化研究包含两个步骤：第一步是将实验室和前临床研究阶段所得的研究结果应用于人类的临床试验或研究；第二步着眼于将临床试验或研究的结果迁移到日常生活中去，以提高人类健康水平。在此过程中预防和治疗策略的成本效益在转化科学中也是非常重要的部分。不过上述只是一个单向的转化研究路径。Rubio等（2010）以提高公共健康为长期目标，将基础研究、患者导向研究和以人群为基础的研究fPopulafion-based research）相整合，提出了更加详细和更为成熟的转化研究多向模式。该模式分为3个步骤：第一步探索基础研究和患者导向研究之间的作用，以促进对疾病科学性的新理解或改善护理标准；第二步加强患者导向研究和以人群为基础的研究两者之间的作用，以改善患者的治疗效果，实施更好方法促进人群的健康状况；第三步提高基于实验室的基础研究和以人群为基础的研究之间的作用，促进对人类健康和疾病更加深入的科学性理解。在基础研究、患者导向研究和以人群为基础的研究中，两两之间是双向的关系并且三者之间彼此动态地交互作用。广义上说，患者导向研究和以人群为基础的研究实际上落入到更广泛的临床研究范围内。患者导向研究包括患者和健康个体的研究，用于理解疾病和健康的机制，决定治疗效果或者提供患者护理轨迹的决策分析；而以人群为基础的研究则涉及流行病学、社会和行为科学、公共卫生、质量评估以及成本效益等方面。
总之，转化研究作为一种新的视角，为实验室的基础研究成果转化到临床运用提供了一个有前景的框架。本文就以抑郁症为例，沿着从基础研究到其预防、临床诊断和治疗的这一转化研究路径，详细探讨抑郁症神经成像转化研究的进展。
3.抑郁症的神经成像基础研究
神经成像作为认知神经科学研究最为主要的技术手段之一，使人类有史以来第一次能直接观察到大脑的心理过程和认知活动，成为近年来国际上该领域研究的趋势。同样，这一技术在抑郁症领域的研究中也发挥着越来越重要的作用。借助神经成像技术，研究者能够探讨到抑郁症患者的异常脑区，这些脑区可能在结构或功能上异于正常人。如抑郁症患者的颞叶（temporal lobes）、海马、杏仁核、额叶（fontal lobes）、扣带前回（anterior cingulate cortex）、基底神经节（basal ganglia）和丘脑结构异于正常人。具体表现为，抑郁症患者具有更小的左侧颞叶容量和海马容量；与慢性抑郁症病人和正常人相比，首发抑郁症患者的杏仁核灰质容量减少；在严重的抑郁症患者中，整个的前额叶容量和/或眶额叶皮层（orbitofrontal codex，OFC）容量减少；抑郁症患者的吻侧扣带皮层（rostral cingulate codex）的灰质容量减少，并且这和疾病时程有显著正相关；虽然基底神经节的结构和抑郁症的关系还不确定，但是在难治型抑郁症患者中，尾状核（the caudate nuclea）的灰质容量减少，这异于康复的抑郁症患者和正常人；抑郁症患者的丘脑灰质容量也减少（Bora，Fomito，Pantelis，&Yucel，2012；Hastings，Parsey，Oquendo，Arango，&Mann，2004；Neumeister et al.，2005；Vasic，Waiter，HOse，&Wole 2008；vythilingam et al.，2004）。虽然病人的人口学特征、所采用的成像技术、分析方法和临床因素等可能导致结果存在变异，但是在抑郁症患者中存在显著的杏仁核、基底神经节、海马、眶额皮层、膝下扣带皮层（subgenual cingulated cortex，sgACC）和丘脑容量改变。
抑郁症是一种认知和情绪障碍，大量的行为和认知任务表明，抑郁症和负性认知偏差、学习和记忆能力受损、对奖赏的钝化反应、对惩罚的高度敏感以及受损的社会认知密切相关（Mathews&MacLeod，2005；Whitmer，Frank，&Gotlib，2012）。与此相对应，抑郁症患者在加工这些认知或社会性任务时，其大脑的激活模式也往往异于正常人。如Davidson，Pizzagalli，Nitschke和Putnam（2002）认为抑郁症是一种情绪表征和调节障碍，与这些功能异常相关的脑区包括额叶皮层（prefrontal Cortex）、扣带前回、海马和杏仁核。Gotlib和Hamilton（2008）认为抑郁症患者的情绪体验、表达和调节异常与杏仁核、膝下扣带前回的过度激活以及背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex，DLPFC）激活不足密切相关。Clark，Chamberlain和Sahakian（2009）列举了抑郁症患者常见的四种认知异常：执行控制、记忆、情感加工和反馈敏感性。这些功能改变所涉及的神经回路包括额叶多个区域、皮层下区域（纹状体、丘脑）和颞叶结构（杏仁核、海马）的交互作用。
总之，抑郁症的神经成像基础研究表明，抑郁症患者的一些特定脑区的结构和功能都不同于正常人，这尤其表现在杏仁核、丘脑、海马和额叶皮层等部位。这为理解抑郁症的病因及其发病机制提供了新的证据。基于这些研究成果，可以为抑郁症的预防、诊断和治疗的转化研究提供新的视角。
4.神经成像研究与抑郁症预防
鉴于抑郁症治疗的复杂性，为了减少抑郁症的巨大疾病负担，越来越多的研究者认为抑郁症的早期识别和预防能起到更好的效果（Hetrick et al.，2008）。首先因为即使在理想的条件下，现有的药物和心理治疗所减少抑郁症的疾病负担不超过35%（Andrews&Wilkinson，2002；Andrews，Issakidis，Sanderson，Corry，&Lapsley，2004）。其次因为抑郁症首发阶段的早期有效干预能够减少其复发的可能性，后者随着病程的进展，将变得更为频繁。Harrington和Clarke（1998）研究表明，假如抑郁症患者能够早在13岁时被成功治愈，那么其在16岁时患复发抑郁症的风险将减少大约10%。
流行病学的调查研究发现，青少年早期是抑郁症的高发期，且女性得抑郁症的概率要显著高于男性，如美国青少年中15%-20%患有重度抑郁（Lewinsohn&Essau，2002）；而在我国约有42.3%的中学生存在轻度抑郁（冯正直，张大均，2005）。此外，抑郁症父母的子代在青少年期患抑郁症的风险是健康父母的子代的3-5倍（Hammen，2009）。尤其是母亲抑郁与其女性子代的早发和更严重的抑郁相关（Lieb，Isensee，Hoefler，Pfister，&Wittchen，2002）。因此，抑郁症父母的子代，尤其是抑郁症母亲的女性子代，是抑郁症的高发群体，对其大脑结构和功能的神经成像研究可以探究抑郁症的风险因素。如Chen，Hamilton和Gotlib（2010）的研究表明抑郁症患者的女儿比正常人的女儿有更少的双侧海马灰质密度，并且前者的左侧海马容量减低。Joormann。Cooney，Henry和Gotlib（2012）通过负性情绪诱发和自动情绪调节任务，比较了抑郁症母亲的女儿和正常母亲的女儿，发现前者出现更多的杏仁核和腹外侧前额叶皮层（ventrolateral prefrontal codex）激活；而在自动情绪调节过程中，后者出现更大的背外侧前额叶皮层（dorsolateral prefrontal cortex）和背侧前扣带回皮层（dorsal anterior eingulated codex）激活。Mannie，Harmer，Cowen和Norbury（2010）采用不同认知负荷的口头工作记忆任务（1-2-3-back vso-back），对父母患有抑郁症但其本人没有抑郁症病史的年轻人和父母及其本人都没有抑郁症的年轻人的比较发现，虽然两组的总体认知能力是相似的（操作准确性和反应潜伏期没有显著差异），但是前者比后者在外侧枕叶皮层（lateral occipital cortex）、颞上皮层（superior temporal cortex）和顶上皮层（superior parietal codex）有更大的激活水平。
抑郁的认知理论认为负性的认知偏差（如注意偏差、记忆偏差和解释偏差等）是抑郁症的认知易感性因素（Mathews&MacLeod，2005）。在压力情境下，认知易感性高的个体更容易产生抑郁症。因此，高认知易感性也是抑郁症的风险因素，对其相关脑机制的探讨可以为抑郁症的早期预防提供新的参考。如Zhong等（2011）采用情绪匹配任务，使用fMRI检验未服药的抑郁症患者、具有认知易感性的非抑郁症被试和没有抑郁症的正常被试，发现与正常被试相比，抑郁症患者有更强的左侧杏仁核激活和更弱的左侧背外侧前额叶皮层激活水平。相似地，与正常被试相比，高认知易感性被试有更高的双侧杏仁核激活和更低的双侧背外侧前额叶皮层激活水平。高认知易感性被试在脑机制上可能表现为对情绪刺激的前额叶的减弱反应和杏仁核的增强反应。
总之，最近对抑郁症高风险人群的神经成像研究表明，与健康对照组相比，该群体特定脑区的结构和功能都存在异常。这些异常出现在抑郁症发作之前，可能影响抑郁症的发展进程。因此，借助这些脑成像的证据，有助于超越以往的问卷调查和行为学指标，更加敏感地甄别抑郁症的高风险人群，从而对其进行早期有效预防和干预，有助于减少其抑郁症发作风险，将损失降低到最低程度。
5.神经成像研究与抑郁症诊断
当前抑郁症的临床评估主要采用疾病分类学的方法，根据临床访谈诊断体系（如精神障碍诊断原则和统计手册第四版DSM-IV、国际疾病分类第十版ICD-10和中国精神障碍分类与诊断标准第3版CCMD-3），通过病人或其家属的口头报告和临床医生的直接观察来判断病人是否具有症状以及具有何种症状，最终做出是否有抑郁症的诊断结果。如根据DSM-IV，抑郁症的诊断标准是在连续两周的时间里，病人表现出九个症状（抑郁心境、兴趣或缺乏、体重减轻、失眠、精神运动兴奋或迟缓、疲劳无精力、无价值或负罪感、无法思维或集中注意力、反复出现死或自杀念头、自杀的企图或计划）中的五个以上。这些症状必须是病人以前没有的或者极轻的。并且抑郁症的诊断至少包括抑郁心境、兴趣或缺乏这两个症状中的一个。根据这些规范化的评估体系，可以改善我们对患者的认识，对抑郁症做出相对比较准确的判断。但是，由于抑郁症的症状诊断采用全或否的方式、自我报告和临床观察的方法具有较强的主观性，尤其是抑郁症作为一种复杂的精神障碍，在不同人中甚至在同一个人不同时期中都会表现出许多异质性的情绪、认知和运动症状，这些因素可能使抑郁症的诊断出现误差，需要进一步完善。
神经成像技术的发展，尤其是抑郁症神经成像的基础研究，为抑郁症的诊断和鉴别提供了一条非常有价值的发展路径。其中，抑郁症的生物标记研究是近年来精神障碍领域的一个研究热点。当前抑郁症的诊断主要依靠于可操作化的诊断系统，但是抑郁症具有不同的生理机制，不同生理因素导致的抑郁症在临床症状上的表现可能是重叠的，生物标记就能很好地应对这一难题。因此，借助基础研究所发现的抑郁症的生物标记，可能是改善抑郁症患者准确识别和识别速度的非常重要的一环。
5.1抑郁症诊断的生物标记
生物标记（biomarker）是一种可以客观测量和评估的特征，可作为正常生理过程、病理过程或者治疗干预的药物反映的指标（Masdeu，2011）。NIH生物标记和替代终点（surrogate endpoint）的工作组认为存在3种水平的生物标记：0型生物标记用于追踪疾病的自然进程；1型生物标记用于检验干预的效果，连同试验化合物所熟知的作用机理，但和临床结果没有精确的关系；替代终点2型生物标记用于预测临床结果（Wong，TauscheL&Grtmder，2009）。生物标记在疾病诊断上产生价值，需要具备以下几个条件：第一，在甄别和区分不同的障碍方面有非常高的敏感性和特异性（>80%）（Ritsner&Gottesman，2009）；第二，为了确保它们可用于日常临床实践，生物标记是可再生的、可信的、便宜的、非入侵的和容易获得的（Ritsner&Gottesman，2009）。由于识别生物标记并调查它们之间的相互作用有助于揭示疾病的病理生理原因，长久来看有助于发展基于生理而不是行为症状导向的疾病分类体系，这可能有助于改善抑郁症的诊断。
Marquand，Mourao-Miranda，Brammer，Cleare和Fu（2008）对完成口头工作记忆任务的被试进行fMRI扫描，来探究抑郁症诊断的生物标记。他们发现，2-back任务具有最高的准确率，为68%。由于抑郁症患者在表情加工上存在问题，Fu等（2008）采用对悲伤表情和中性表情的神经反应来鉴别抑郁症，其中中等强度悲伤表情的准确率为74%，高强度悲伤表情的准确率为76%，中性表情的准确率为87%。鉴于抑郁症和早期不良依恋之间的关系，Zhang，Yaseen，Galynker，Hirsch和winston（2011）采用fMRI，比较抑郁症患者和正常被试在观看母亲照片、朋友照片和陌生人照片时的脑激活模式，采用主成分回归方法（a principal component regression method，PCR），发现BA-32的活动模式能够识别抑郁症患者。该方法与BDI-II和临床精神病访谈的诊断一致性为89%，敏感性为85.7%，特异性为92.8%。一些研究者（Hahn et al.，2011）认为由于抑郁症具有多个症状，不同症状可能涉及到多种神经过程，从而单个生物标记（如与单个病理异常过程或症状相关的神经反应）在预测复杂症状模式的疾病上是有难度的。因此，他们主张采用合成的生物标记来诊断抑郁症。Hahn等（2011）基于3个任务（对中性表情、大奖赏和安全线索的反应）的全脑神经反应模式，采用模式再认算法（pattern-recognition algorithms），发现综合多个生物标记的决策树算法（decision tree algorithm）对抑郁症的诊断正确率为83%（敏感性为80%，特异性为87%），比仅用单个生物标记的准确率提高了11%。
5.2难治型抑郁症与非难治型抑郁症的区别
尽管抑郁症治疗方法在不断更新，但是大概15%-30%的抑郁症病人对治疗方法存在排斥，导致巨大的个人、社会和经济负担（Bedim&Turecki，2007）。其中，当至少2种来自不同药理类别的规范化抗抑郁药物对抑郁症症状不能产生显著的改善时，这种抑郁症就可以称为难治型抑郁症（Berlim&Turecki，2007；Stimpson，Agrawal，&Lewis，2002）。因此，发展针对这一群体的更有效治疗方法需要对其神经生物基础有更深刻的认识。
Wu等（2011）采用静息态功能成像，根据区域同步分析（Regional homogeneity analysis），发现与正常人和非难治型抑郁症患者相比，难治型抑郁症患者有更多脑区改变的区域同步。Guo等（2012）也采用了静息态功能成像，基于一致性的ReHo（Cohe-ReHo）方法，对比了难治型抑郁症患者和治疗敏感（treatment-sensitive）的抑郁症患者的大脑结构，发现小脑部位的更低的ReHo值可以作为区分前者与后者的标记，它具有83%的敏感性和86%的特异性。
5.3双相障碍与单相抑郁症的区别
由于在双相障碍（Bipolar disorder）中，抑郁症状比躁狂症状更为普遍，且在双相障碍和单相抑郁症中都存在较高的亚临床躁狂症状，从而导致在临床领域中将60%的双相障碍诊断为抑郁症或复发性单相障碍，从而耽误合适的治疗，导致许多双相障碍患者的病情恶化（de Almeida&Phillips，2013）。因此，区分双相障碍和单相抑郁症是一个重要的临床挑战。识别双相障碍的生物标记可能有助于区分双相障碍和单相抑郁症，并最终优化所有抑郁症患者的临床和功能结果。
Konarski等（2008）综合比较了单相抑郁症和双相障碍的神经结构成像，发现皮层下结构，尤其是纹状体、杏仁核和海马可以用来区分单相抑郁症和双相障碍。神经成像的研究发现双相障碍比单相抑郁症有更大范围的白质连接异常和白质高度浓缩（hyperintensities），缰核容量（habenula volume）减少以及在情绪调节和注意控制神经环路上有不同的功能异常模式。从不同的病理生理过程，尤其是情绪调节、奖赏和注意的神经环路可以区分双相障碍和单相抑郁症（de Almeida&Phillips，2013）。
Lawrence等（2004）对比了双相障碍和单相抑郁症对轻度到重度恐惧、快乐和悲伤表情的功能性成像的神经反应，发现与单相抑郁症患者相比，双相障碍患者对快乐和悲伤表情有更强的皮层下和腹侧前额叶皮层（ventral prefrontal cortical）激活。De Almeida等（2009）采用两个事件相关的范式——分别评定快乐和悲伤表情的情绪强度，通过动态因果模型检验双相障碍和单相抑郁症在支持情绪调节左右脑区中的杏仁核与眶内侧前额叶皮层（orbitomedial prefrontal cortex，OMPFC）的有效连接，发现在快乐评定任务中异常的、左侧自上而下眶内侧前额叶皮层，杏仁核以及右侧的、自下而上的杏仁核-眶内侧前额叶皮层有效连接能够区分单相抑郁症和双相障碍。
Bertocci等（2012）采用面部表情的n-back任务，通过高记忆负荷（2-backl和低记忆负荷（O-back）条件，检验她们对情绪性分心物的情绪调节的执行控制的脑机制，发现单相抑郁症女性组比双相障碍女性组和正常女性组在高记忆负荷条件下，中性表情分心物诱发了更大的双侧和左侧背侧前中扣带皮层（dorsal anterior midcingulate cortex，dAMCC）激活水平，且两个抑郁症组的双侧壳核（bilateral putamen）激活水平大于正常组。在快乐表情分心物的高记忆条件下，单相抑郁症的女性比正常女性诱发了更大的左侧壳核激活水平。因此，在情绪调节的注意控制的神经环路上功能异常，尤其是背侧前中扣带皮层上的差异，是区分单相抑郁症和双相障碍女性的一个潜在神经成像测量指标。
6.神经成像研究与抑郁症治疗
目前抑郁症治疗主要采用心理和药物两方面的治疗。在心理治疗方面，临床上更多地使用认知行为疗法和人际关系疗法。这两种疗法共有3个目标：（1）旨在改善抑郁症患者处理压力事件的方式和有问题的人际关系，以此来提高他们问题解决的能力；（2）修正患者关于他们自己和关系的角度；（3）尝试帮助个体调节压力情绪状态（Frewen，Dozois，&Lanius，2008）。特别是在心理干预和神经成像技术相结合来短期治疗重度抑郁症上已取得令人欣喜的结果，有研究者利用PET、SPECT技术发现进行人际关系疗法且从未参与过药物治疗的抑郁症个体，与治疗前相比，其大脑的右侧前额叶、左侧前扣带回皮层、左侧脑岛和左侧颞叶皮层的葡萄糖代谢率降低（Brody et al.，2001），整个治疗过程右侧后扣带回的脑血流量明显增加（Martin，Martin，Rai，Richardson，&Royall，2001）。同样，利用认知行为疗法也发现治疗后抑郁个体大脑代谢活动的变化并且得到明显改善（Goldapple et al.，2004；Siegle，Carter，&Thase，2006）。此外，最近的一项研究还表明心理动力学疗法对抑郁症患者进行长期干预取得一定的进展，他们发现患者的前额叶一边缘系统功能（包括左前海马、杏仁核、膝下扣带回和内侧前额叶皮层）在治疗前有较高程度的激活，而在历时15个月的治疗后激活程度明显降低，这意味着抑郁症状的减轻（Buchheim et al.，2012）。
当前的药物治疗主要针对一元胺系统，但是将近1/3的病人在第一次开药后复发，抗抑郁症药物见效慢，药物治疗需要至少4到6周时间来甄别药物治疗有效者和无效者。Lisiecka等（2011）基于fMRI技术并采用两种常见的抗抑郁症药物，即文法拉辛或米尔塔扎平fvenlafaxine或者mirtazapine），对抑郁症患者进行四周的随机临床治疗，采用表情匹配任务，考察在治疗前和治疗后的眶额叶皮层功能连接，发现在治疗前左侧运动区和眶额叶皮层区更高的功能连接是治疗有效者的特征。而治疗无效者的特征是更高的眶额叶皮层和小脑的连接。反应的强度与左侧眶额叶皮层、尾状核、丘脑的功能连接正相关。文法拉辛和米尔塔扎平治疗纵向改变的差异体现在运动区、小脑、扣带回（cingulate gyms）和角回（angular gyrus）。此外，药物治疗对许多病人会产生很多的副作用并且在长期可能复发。因此，对于新的抗抑郁药物的评估和开发也是非常重要的。例如，选择性5-羟色胺再摄取抑制剂（SSRI）治疗方法的有效性已遭到质疑，McCabe，Mishor，Cowen和Harmer（2010）利用西酞普兰（citalopram）对患者进行短期治疗时发现这种抗抑郁药能同时降低奖赏或厌恶刺激的神经加工，造成抑郁所呈现的动机降低和缺乏状态，也可用来解释SSRI治疗期间患者所表现出的情感迟钝体验。相反地，去甲肾上腺素再摄取抑制剂瑞波西汀（Reboxetine）的使用能促进对奖赏刺激在内侧眶额叶皮层（medial orbitofrontal cortex）的激活反应。近期的一项研究使用抗抑郁药依他普伦（Escitalopram）对重抑郁患者进行治疗，同时利用fMRI考察患者在负性情绪图片呈现和预期过程中的神经激活，发现在治疗前当患者对负性图片有所预期时，杏仁核有更大的激活，即使没有预期线索，当患者看到负性图片时，前额叶也有明显的激活；而在治疗之后杏仁核和前额叶的激活程度都明显降低（Rosenblau et al.，2012），说明该药物能够改变抑郁症患者异常的情绪加工的神经机制并使其趋于正常化。当然，在迫切需要开发治疗抑郁症的新药物的同时也面临着问题，新的开发方法的出现很大程度上受前临床方法的不良预测效度的影响。缺乏前临床和临床方法之间的共同靶点（endpoints）也是开发新药物的一个不足。
除此之外，伴随着神经成像技术的发展，抑郁症在神经生物标记上的发现有助于深入了解其病因、机制及制定更合理的治疗方法。经过抗抑郁治疗后，严重的抑郁症患者在观看悲伤的情绪图片时，与治疗之前相比，个体表现出在大脑的右侧膝下扣带回和视觉皮层的反应的效应值下降，这说明对负性面孔的反应与临床治疗的改善有关，特别表现在膝下扣带回这一生物标记上（Keedwell et al.，2009）。Pizzagalli（2011）通过元分析发现吻侧前扣带皮层（rostral anterior cingulate codex，rACC）在静息状态下活动的增强是非常具有前景的，有助于抑郁症取得更好疗效的预测指标。
7.研究展望
虽然抑郁症的神经成像转化研究有助于早期识别抑郁症的高危人群（如抑郁父母的青少年子代尤其是抑郁母亲的女性子代和高认知易感性的群体），提供抑郁症诊断的有效生物标记，进一步区分难治型抑郁症和非难治型抑郁症、双相障碍和单相抑郁症；并有助于进一步评估心理治疗和药物治疗的干预效果和开发新药物。但是，还有以下问题有待进一步的解决。
第一，转化研究是个双向自由流通过程，一方面是从基础到临床，将基础研究的成果快速转化到临床应用领域，为疾病的预防、诊断和治疗提供更先进的理念、手段、工具和方法；另一方面从临床到基础，将临床问题进一步转入相应的基础领域进行深入研究。但是在现实情境中，基础研究和临床研究（或科学与实践）之间一直存在很大的鸿沟。一方面，国家投入大量的科研经费从事基础研究，并产生众多的科研成果，但是这些成果却鲜为临床工作者所知和应用；另一方面，临床工作者对治疗为什么会起作用以及用于解释病人改变的具体何种因果机制还知之甚少。如Johnson（2004）将心理治疗人员的现状概括为“当治疗者想明确地叙述问题、描绘治疗目标或者关注治疗阶段中的历时变化过程时，往往没有一致的、综合的和研究所支撑的图景。”因此，为了进一步促进转化研究的成果，基础研究者和临床运用者的有效沟通非常重要。这方面可以借鉴精神分裂症领域的成功经验。为了更好地运用认知神经科学的转化研究，开发针对精神分裂症认知损伤的新干预方法，这一领域的研究者组织了3次国际性会议，召集了这一领域众多知名学者，分阶段讨论了用于精神分裂症治疗方法开发的认知机制、用于认知神经科学临床转化研究的认知范式（涉及工作记忆、执行控制、注意、长时记忆、知觉和社会认知）选择和相应的神经成像生物标记（Barch et al.，2009；Carter et al.，2008，2011）。同样，抑郁症是种认知和情绪障碍，相关的基础研究积累了大量的抑郁症的认知机制、实验范式和神经成像生物标记的研究成果，有待这一领域的学者针对抑郁症临床运用问题，进行更有效的整理、归纳并提出主要的解决方法。
第二，从基础研究到临床运用是个多阶段过程。第一阶段是利用神经成像基础研究的成果并将它们转化为更有效的预防、诊断和治疗干预手段。第二阶段是将新的方法转化到日常的临床实践和健康决策上去（Wang，Heinssen，Oliveri，Wagner，&Goodman，2009）。虽然当前抑郁症的神经成像转化研究在第一阶段取得了较大的成绩，但是第二阶段的进展还非常缓慢。这主要有以下几个原因：首先，相关研究的数量、变异的结果和较少独立的效度验证试验表明这方面的研究还处在婴儿期（Schleim&Roiser，2009）。现有研究所采用的被试数量较少，这导致了实验的外部效度较低，已有的研究结果是否能够推广运用到临床情境中更多的病人身上还需要更加深入的研究。而且，研究结果的稳定性和高效性有待进一步验证，因为抑郁症病人组与正常组所得到的差异显著性结果并不一定适用于某个特定的抑郁症患者。此外，临床情境中的干预方法运用强调其成本收益，神经成像转化研究的运用缺乏这方面证据的支撑。其次，由于设备昂贵的费用，对于大多数的临床心理学家和门诊部来说，神经成像不容易获得。
