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反向遗传学研究方法范文1
关键词：牛轮状病毒；反向遗传技术；应用；展望
中图分类号：R392 文献标识码：A 文章编号：1674-0432（2012）-01-0170-1
牛轮状病毒(Bovine rotavirus，BRV)属于呼肠孤病毒科，轮状病毒属，是引起犊牛急性腹泻的主要病毒之一[1]。发生BRV感染之后多容易继发引起细菌性感染，对犊牛的生命安全和生命质量构成很大的威胁，同时也给养牛业带来巨大的经济损失，对我国养牛业的健康持续发展造成严重的影响。近年来，随着科学技术的不断发展和完善，对牛轮状病毒的生物学研究也越来越完善，反向遗传技术的发展更是准确的提供了获得重组毒株制备疫苗的方法，从而为防治牛轮状病毒提供了更有效的措施。本文通过对牛轮状病毒的生物学、流行病学和其分离培养鉴定等内容的研究，分析反向遗传技术在牛轮状病毒中的应用情况，并展望其未来的发展状态，现将分析报告如下。
1 牛轮状病毒的简介
1.1 牛轮状病毒的生物学特性
轮状病毒属于呼肠孤病毒科(Reoviridase)轮状病毒属，是引起人和动物急性胄肠炎的主要病原体之一[2]。其中A组RV感染是世界范围内导致婴幼儿发生严重腹泻的最主要因素，是发展中国家婴幼儿发生致命性腹泻的首要病因[2]。目前，临床中尚没有治疗轮状病毒感染的特效药物，因此，对其疫苗的研究就成了一直备受关注的课题。BRV是引起犊牛严重腹泻的主要因素，且其致死率较高，有报道表明，英国犊牛因牛轮状病毒而引起腹泻的发生率为60-80%[3]，给养牛业造成严重的经济损失。
BRV呈球形，在透射电子显微镜下呈现出车轮样形状，结构稳定，耐热耐酸耐碱，于20℃左右最为活跃，具有较强的季节性。直径为65～75mm，无囊膜，有3层衣壳，具有双层蛋白壳体。牛轮状病毒为二十面体结构，基因组由双链RNA组成，有11个分节段，一个链编码病毒的6个结构蛋白，另一个链编码6个非结构蛋白，决定了病毒的结构和功能[3]，其中至少会有6个蛋白质要与核糖核酸结合。
1.2 牛轮状病毒的流行情况
全球的科研工作者陆续在猴、猪、狗、禽等多种幼龄动物中发现轮状病毒，逐渐认识到轮状病毒是引起幼龄动物病毒性腹泻的主要病原。随着研究的深入，结合电泳图差异，显示可感染牛的是A、B和C群轮状病毒，其中以A群的感染最为严重[3]。牛群中轮状病毒的感染源主要为粪便，在牛感染病毒后1天便可以在其粪便中检测到病毒的存在。感染病毒主要通过接触、呼吸系统、消化系统途径传播，感染的牛群发生持续性腹泻，进而脱水，短时间内继发大肠杆菌和沙门氏杆菌感染，14-21d后引发肺炎，最终死亡。目前，科学研究者多认为接种疫苗是防御此病的最有效方法，另外，也有些报道表示使用适量的抗生素也可以起到一定缓解细菌性腹泻的作用。
1.3 牛轮状病毒的分离培养和鉴定
轮状病毒分离培养比较困难，应用易感细胞和胰蛋白酶处理是细胞培养分离轮状病毒的关键，最初多采用原代细胞，后来易感细胞系恒河猴肾传代细胞MA-104的引进，成功的分离到适应于细胞培养的多种动物轮状病毒细胞株[4]。牛轮状病毒培养时需要加蛋白水解酶如胰蛋白酶或胰凝乳酶，消化后才能适应细胞，且不需血清。通过VP6高价免疫血清或单克隆抗体建立酶联免疫吸附试验、乳胶凝集试验，检测牛粪便以确定有无感染。VP7或VP4的单克隆抗体可以通过血清学检测确定。
2 反向遗传技术
反向遗传学是指直接从生物的遗传物质来对其生命的本质现象进行阐述。在得到生物体的全部基因序列后人工处理，之后再组成有生命活性的个体。这一技术有利于对生物体功能结构的进一步研究，从而研发新疫苗。反向遗传包括RNA干扰技术、基因沉默技术、基因体外转录技术等。通过使用反向遗传技术对轮状病毒中的某些重要的蛋白质功能进行鉴定，可以加深对轮状病毒复制和发病机理的研究，从而获得理想的弱毒株。反向遗传技术推动了研究病毒基因组的人工操作和病毒基因功能的进程，具有准确率高、毒力返毒率低等优点，同时其也存在有一定的局限性。然而，目前对轮状病毒疫苗的研究主要集中在实验室VP4、VP6、VP7三个基因阶段，对于安全可靠的应用在临床中还需要得到更有效的发展。
3 展望
牛轮状病毒是引起犊牛急性腹泻的主要病毒之一，也是引起犊牛急性腹泻的最主要病因，感染后容易继发引起细菌性感染，从而引起犊牛死亡。牛轮状病毒主要是通过消化道、呼吸道和接触的方式进行传播，口服或经肠道后，减毒疫苗可激发肠道黏膜免疫，防止肠道黏膜上皮细胞发生感染，因此研制减毒疫苗对于预防BRV感染有着非常重要的意义。目前，国内尚没有成功研制出BRV口服减毒疫苗，传统的筛选毒株效率低，反向遗传技术于基因组水平改良重组，所以将成为获得弱毒株的有效方法。
参考文献
[1] ,宋玲玲,王洪梅.反向遗传技术在牛轮状病毒研究中的应用[J].安徽农业科学,2011,39(12):7255-7257.
[2] 赵雅静,高雪军,刘晨鸣.轮状病毒LLR疫苗株VP7基因的遗传变异研究[J].中国生物制品学杂志,2008,21(12):1074-1079.
[3] 陈军,杨彪,谢金鑫.牛轮状病毒的流行情况及预防措施[J].养殖技术顾问,2011,2:195.
反向遗传学研究方法范文2
关键词：虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb.et Zucc.）；III型聚酮合酶；查尔酮合酶；RNA干扰；转基因
中图分类号：R282 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）09-2255-05
虎杖（Polygonum cuspidatum Sieb. et Zucc.）为蓼科蓼属多年生草本植物，也是富含芳香族聚酮化合物的药用植物[1]。聚酮化合物是一大类抗菌、抗肿瘤、抗寄生虫并具免疫抑制剂活性的天然产物。聚酮化合物通常在聚酮合酶（Polyketide synthase，PKS）的作用下生成。聚酮合酶可以分为3类：Ⅰ型、Ⅱ型和Ⅲ型PKS[2]，其中III型PKS即查尔酮合酶（Chalcone synthase，CHS）超家族主要分布于植物界。自从1983年第一个植物Ⅲ型聚酮合酶基因家族成员查尔酮合酶基因被克隆以来，植物III型PKS不断被克隆和鉴定，序列分析表明他们之间氨基酸序列相似性在60%以上，编码约400个氨基酸的蛋白质[3]。Ma等[4]从虎杖中克隆得到一个III型PKS基因PcPKS1，该基因含有3个内含子，BLAST分析发现，PcPKS1与其他植物来源的PKS基因具有80%～99%核苷酸序列的相似性[5，6]。体外酶活试验研究表明，PcPKS1是一个具有查尔酮合酶（CHS）和苯亚甲基丙酮合酶（BAS）活性的双功能酶[5]，但PcPKS1在植物体内的生物学功能研究鲜有报道。
RNA干扰（RNA interference，RNAi）是由靶基因同源双链RNA引发，在动植物和真菌中普遍存在序列特异的转录后基因沉默现象。按双链RNA（dsRNA）产生途径将RNAi技术分为多种，其中以具有反向重复序列的hpRNA载体结构在转录过程中形成稳定的dsRNA抑制基因表达的效率较高[7]。RNAi技术已成为功能基因组学研究、动植物性状改良和疾病基因治疗的强有力工具[8，9]。
虎杖富含芳香族聚酮化合物，存在多种Ⅲ型PKS基因来合成这些复杂多样的化合物，深入研究虎杖中聚酮类化合物的生物合成与代谢途径将为人们更合理地利用虎杖的药物资源和基因资源提供参考。本研究从反向遗传学入手，选取位于PcPKS1基因的编码区保守序列（574 bp）和3′端非编码区特异序列（209 bp）为目标序列，以载体pYLRNAi作为骨架载体，分别构建能形成hpRNA结构的RNAi表达载体，为进一步鉴定PcPKS1基因的生物学功能和虎杖功能基因组学研究奠定基础。
1 材料与方法
1.1 材料
1.1.1 材料 野生虎杖植株由广州中医药大学中药资源科学与工程研究中心提供。
1.1.2 菌株和载体 根癌农杆菌LBA4404和潮霉素抗性的双元表达载体pYLRNAi由华南农业大学植物基因组学与生物技术重点实验室提供。
1.1.3 试剂 引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。限制性内切酶、Taq DNA聚合酶、pMD18-T载体购自TaRaKa公司。总RNA提取试剂盒、cDNA第一链合成试剂盒和凝胶回收试剂盒购自Tiangen公司。
1.2 方法
1.2.1 虎杖叶片总RNA的提取及反转录 以野生虎杖叶片为材料，采用Trizol法提取总RNA，用cDNA第一链合成试剂盒将总RNA反转录成cDNA备用，按试剂盒说明书进行操作。
1.2.2 干扰片段的选择 根据PcPKS1基因的保守区和特异区序列分别设计2个干扰片段（图1），用于后续2个RNAi载体的构建。将NCBI中PcPKS1基因（登录号：EF090266）的序列进行Blast比对，查找PcPKS1基因的保守区域，选择编码区605～1179 间长574 bp的序列作为第一个干扰片段，简写为CDS。在3′端非编码区选取长209 bp的特异序列作为第二个干扰片段，简写为UTR。
1.2.3 引物设计 以表达载体pYLRNAi为基础载体（图2），该载体携带强组成型35S启动子和GUS基因内含子（250 bp），具有2个多克隆位点MCS1和MCS2，可用于干扰片段的正反向插入。在正向片段引物两端分别加上BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切位点，反向片段引物两端分别加上Mlu Ⅰ和Pst Ⅰ酶切位点。共设计4对引物，引物序列如表1所示。针对PcPKS1基因编码区，设计引物CDS-1和CDS-2扩增正向干扰片段CDSf，设计引物CDS-3和CDS-4扩增反向干扰片段CDSr。针对PcPKS1基因3′端非编码区，设计引物UTR-1和UTR-2扩增正向干扰片段UTRf，设计引物UTR-3和UTR-4扩增反向干扰片段UTRr。
1.2.4 干扰片段的克隆与测序 采用25 μL反应体系，PCR扩增条件：94 ℃预变性4 min；94 ℃变性30 s，56 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，循环35次；72 ℃延伸5 min。将正向、反向片段的PCR产物纯化后分别连接pMD18-T载体，将PCR验证正确的阳性重组子进行酶切验证并测序。分别将测序正确的重组子命名为pMD18-CDSf、 pMD18-CDSr、 pMD18-UTRf、pMD18-UTRr。
1.2.5 RNAi载体pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR的构建
1）RNAi载体pYLRNAi-CDS的构建。利用BamHⅠ和Hind Ⅲ分别对测序正确的重组克隆质粒pMD18-CDSf和pYLRNAi进行双酶切，用回收的片段作正向连接，16 ℃连接过夜，转化大肠杆菌DH5α感受态细胞，选取长出的单菌落进行PCR检测。检测出的阳性克隆摇菌提取质粒，将提取出的质粒和测序正确的pMD18-CDSr进行MluⅠ和Pst Ⅰ双酶切，用回收的片段进行反向连接，获得RNAi载体pYLRNAi-CDS（图3A），将其转化大肠杆菌。将已转化大肠杆菌的载体pYLRNAi-CDS进行菌落PCR扩增鉴定和酶切鉴定。
2）RNAi载体pYLRNAi-UTR的构建。方法同上，最终获得RNAi载体pYLRNAi-UTR（图3B）。用CaCl2冻融法将RNA干扰载体pYLRNAi-CDS和 pYLRNAi-UTR分别导入农杆菌EHA105中，用于后期植物转化。
2 结果与分析
2.1 CDS序列的正向片段和反向片段的克隆
以cDNA为模板，用引物CDS-1和CDS-2对正向片段CDSf进行PCR扩增，用CDS-3和CDS-4对反向片段CDSr进行PCR扩增，扩增产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增条带与预期574 bp的片段大小一致，初步表明已获得了CDS序列的正向片段和反向片段（图4）。正向片段CDSf和反向片段CDSr回收纯化后分别连接到pMD18-T载体，对得到的重组质粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr进行双酶切鉴定（图5），均能酶切得到大小约574 bp的片段。测序结果表明，获得的CDS序列的正向片段和反向片段是正确的。
2.2 RNAi载体pYLRNAi-CDS的酶切鉴定
分别用BamH Ⅰ+Hind Ⅲ和MluⅠ+Pst Ⅰ将正向片段和反向片段从重组质粒pMD18-CDSf和pMD18-CDSr上切下来，先后插入到pYLRNAi载体的内含子两侧，得到RNAi载体pYLRNAi-CDS。首先对重组质粒pYLRNAi-CDS 进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌液提取质粒DNA。将阳性重组质粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小574 bp的正义片段；用MluⅠ和Pst Ⅰ酶切则切出大小574 bp的反义片段（图6A）。将重组质粒pYLRNAi-CDS用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小约1.4 kb的片段，符合内含子（250 bp）加上正义片段和反义片段长度（图6B）。以上结果表明，RNAi载体pYLRNAi-CDS构建成功。
2.3 UTR序列的正向片段和反向片段的克隆
以cDNA为模板，用引物UTR-1和UTR-2对正向片段UTRf进行PCR扩增，用UTR-3和UTR-4对反向片段UTRr进行PCR扩增，扩增产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳检测，结果表明扩增条带与预期209 bp的片段大小一致，初步表明已获得UTR序列的正向片段和反向片段（图7）。正向片段UTRf和反向片段UTRr回收纯化后分别连接到pMD18-T载体上，对得到的重组质粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr进行双酶切鉴定（图8），均能酶切得到大小约209 bp的片段。测序结果表明，获得的UTR序列的正向片段和反向片段是正确的。
2.4 RNAi载体pYLRNAi-UTR的酶切鉴定
分别用BamHⅠ+Hind Ⅲ和Mlu Ⅰ+Pst Ⅰ将正向片段和反向片段从重组质粒pMD18-UTRf和pMD18-UTRr上切下来，先后插入到pYLRNAi载体的内含子两侧，得到RNAi载体pYLRNAi-UTR。首先对重组质粒pYLRNAi-UTR进行菌落PCR鉴定，将鉴定正确的菌液提取质粒DNA。将阳性重组质粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和Hind Ⅲ酶切，切出大小209 bp的正义片段；用MluⅠ和PstⅠ酶切则切出大小209 bp的反义片段（图9A）。将重组质粒pYLRNAi-UTR用BamHⅠ和MluⅠ酶切，切出大小约660 bp的片段（图9B），符合内含子（250 bp）加上正义片段和反义片段长度。以上结果表明，RNAi载体pYLRNAi-UTR构建成功。
3 讨论
RNAi载体构建过程中，正、反向重复序列间加一段间隔序列（如内含子），在转录后能形成更加稳定的hpRNA结构，显著提高RNA沉默的效率和强度[10]。在本研究中，选择了pYLRNAi载体中的GUS基因内含子序列作为间隔序列，以利于转录后的反向重复序列形成hpRNA。干扰片段的长度影响RNAi的效率，在哺乳动物中，表达的hpRNA双链长度在21～25 nt时，既能引发干扰效应，又不会导致细胞死亡[10]。Wesley等[11]研究发现，植物双链hpRNA长度为98～853 bp的靶基因反向重复片段均能高效地导致基因沉默。
靶基因的位置也影响RNAi构建的效果[12]。一方面，若将靶基因保守区域包含在干扰片段内，就有可能同时沉默一簇基因，这种同时沉默多基因家族的特点，使RNAi在植物功能基因组学研究成为可能[13]；另一方面，选择非保守区域作为干扰片段，则会提高沉默单个基因的效率和特异性[10]。Fukusaki等[14]以矮牵牛查尔酮合酶ThCHS1为靶基因，分别选择610 bp的编码区保守序列和132 bp的3′端非编码区为干扰片段，构建了2个RNA干扰载体CDSi和UTRi，遗传转化结果显示，CDSi转化株系的紫色花色几乎完全消失，花瓣呈纯白色，而UTRi株系的紫色花色只是部分消退，花瓣呈淡紫色，其原因可能是花色由多个查尔酮合酶基因共同调控的，3′端非编码区与同家族基因的同源性较低，针对3′端非编码区设计的RNAi载体UTRi，往往不会干扰其他基因而是特定干扰ThCHS1基因表达，因而导致花色只是部分改变。
在本研究中，经过序列比对分析，选取PcPKS1 基因3′端的非编码区长为209 bp的特异序列作为干扰区段，构建了载体pYLRNAi-UTR，这样保证提高了沉默PcPKS1基因的效率和特异性，为研究PcPKS1基因的功能奠定基础。同时，选取PcPKS1基因编码区长为574 bp的保守序列作为干扰区段，构建了载体pYLRNAi-CDS，期望沉默虎杖Ⅲ型聚酮合酶基因家族或查尔酮合酶基因家族，为虎杖功能基因组学研究奠定基础。
查尔酮合酶是Ⅲ型聚酮合酶家族的重要成员。查尔酮合酶基因是个多功效基因，可以用于花色修饰[15]和种皮色泽调节[16]，甚至影响植株的育性[17]或激素运输[18]。虽然体外试验表明虎杖PcPKS1具有查尔酮合酶活性[5]，但目前对虎杖中查尔酮合酶基因CHS的功能以及该基因在生物合成途径中的作用了解较少。
4 小结
本研究基于反向调控策略，分别以PcPKS1基因的编码区保守序列和3′端非编码区特异序列为目标序列，成功构建了以组成型CaMV35S为启动子，以潮霉素抗性为筛选标记的RNA干扰表达载体pYLRNAi-CDS和pYLRNAi-UTR。
参考文献：
[1] 张文根，杨赛刚，李 波，等.中国蓼科植物化学成分研究进展[J].现代生物医学进展，2008（8）：393-396.
[2] SHEN B.Polyketide biosynthesis beyond the type II，II and III polyketide synthase paradigms[J]. Current Opinion in Chemical Biology，2003，7（2）：285-295.
[3] ABE I， MORITA H.Structure and function of the chalcone synthase superfamily of plant type III polyketide synthases[J]. Natural Product Reports，2010，27（6）：809-838.
[4] MA L Q，GUO Y W，GAO D Y，et al.Identification of a Polygonum cuspidatum three-intron gene encoding a type III polyketide synthase producing both naringenin and p-hydroxybenzalacetone[J]. Planta， 2009， 229（5）： 1077-1086.
[5] MA L， PANG X， SHEN H， et al. A novel type III polyketide synthase encoded by a three-intron gene from Polygonum cuspidatum[J].Planta，2009，229（3）：457-469.
[6] 李 星，王 红.虎杖查尔酮合酶PcCHS1基因的克隆与功能分析[J].中国科学院研究生院学报， 2013，30（2）：206-212.
[7] SIOMI H，SIOMI M C.On the road to reading the RNA-interference code[J]. Nature，2009，457（22）：396-404.
[8] WANG M B，ABBOTT D C，WATERHOUSE P M.A single copy of a virus-derived transgene encoding hairpin RNA gives immunity to barley yellow dwarf virus[J]. Mol Plant Pathol，2000，1（6）：347-356.
[9] REGINA A， BIRD A，TOPPING D，et al.High-amylose wheat generated by RNA interference improves indices oflarge-bowel health in rats[J].PNAS，2006，103：3546-3551.
[10] WIANNY F，ZERNICKA-GOETZ M.Specific interference with gene function by double-stranded RNA in early mouse development[J].Nat Cell Biol，2000，2：70-75.
[11] WESLEY S V，HELLIWELL C，SMITH N A，et al.Constructs for efficient，effective and high throughput gene silencing in plants[J].Plant J， 2001， 27： 581-590.
[12] 曾晓珊，戴良英，刘雄伦，等.dsRNA介导植物基因沉默及其应用[J].生命科学，2007，19（2）：132-138.
[13] 柳 觐，相微微，张怀刚.RNA干扰技术在小麦中的应用研究进展[J].麦类作物学报，2009，29（4）：725-729.
[14] FUKUSAKI E，KAWASAKI K， KAJIYAMA S，et al.Flower color modulations of Torenia hybrida by downregulation of chalcone synthase genes with RNA interference[J]. J Biotechnology， 2004，111：229-240.
[15] NAKATSUKA T，PITAKSUTHEEPONG C，YAMAMURA S， et al.Induction of differential flower pigmentation patterns by RNAi using promoters with distinct tissue-specific activity[J].Plant Biotechnol Rep，2007，1：251-257.
[16] 狄曙玲，刘列钊，柴友荣，等.类黄酮物质及查尔酮合酶在油菜性状改良中的作用[J].安徽农学通报，2007，13（18）：21-24.
反向遗传学研究方法范文3
关键词：RNA干扰；脑胶质瘤细胞U251；X连锁凋亡抑制蛋白
中图分类号：R739.4 R255.2 文献标识码：A 文章编号：1672-1349（2011）06-0720-03脑胶质瘤是神经系统最常见的恶性疾病，起源于神经上皮的原发肿瘤，约占颅内肿瘤的35%～60%，具有血供丰富，浸润性生长等恶性肿瘤的生物学特点。外科手术要完全切除脑胶质瘤很难，化学治疗、放疗的治疗效果不容乐观，且易发生一些毒副反应，肿瘤复发率高，预后差，病死率高。近几年来，在临床上对脑胶质瘤的综合治疗措施不断的改进和提高，但其死亡率仍未下降，其中位生存期仅13个月。脑胶质瘤的恶性进展及其复发是一个涉及多基因、多阶段、多步骤的复杂过程，现阶段脑胶质瘤基因治疗表现出了它的优越性，X连锁凋亡抑制蛋白（X-linked inhibitor of apoptosis protein，XIAP） 是凋亡抑制蛋白家族（inhibitor apoptosis proteins，IAPs）中的成分之一，且是IAPs中抗凋亡作用最强的，研究显示XIAP在多种正常细胞中呈现低表达状态，但在恶性肿瘤中表达则呈高表达状态【sup】［1］【/sup】 。IAPs编码一组结构相关的蛋白质，它的主要功能是抑制细胞凋亡，在凋亡调控中发挥着关键作用，从现在的研究发现IAPs有八个主要成员，研究比较多的是其中的XIAP和survivin。目前，国内外尚未见以XIAP为靶点治疗脑胶质瘤的类似报道。本实验选择RNA干扰技术，设计特异性针对XIAP的siRNA，将siRNA转染人脑胶质瘤细胞U251细胞，检测XIAP的表达及其细胞周期和凋亡率的改变。为临床诊断和治疗脑胶质瘤奠定理论基础。
1 材料与方法
1.1 材料 脑胶质瘤细胞（山西医科大学）， RNA提取试剂盒（北京飞捷生物公司），lipofectamin 2000（Invitrogen 公司），RT-PCR一步法试剂盒（Promega公司），DNAmark（Takara公司），Protein Markers（Hong KongTech.Co.Ltd），β-actin小鼠单抗（晶美生物公司），辣根过氧化酶标记山羊IgG（H+L）（中杉金桥公司），XIAP（3F3）小鼠单抗（sc58470）（Santa Cruz Biotechnology.Inc），SiRNA1-3（北京三博远志生物技术有限责任公司）。
1.2 方法
1.2.1 脑胶质瘤细U2451细胞siRNA转染效率检测 在37 ℃，5% CO【sub】2【/sub】温箱以10%的RPM1640培养液培养人脑胶质瘤U251细胞，胰酶消化传代。当细胞达到对数期以 2×10【sup】5【/sup】的密度接种6孔板，24 h后用带荧光的siRNA转染细胞，在转染前1 h用无血清无抗生素的空白1640换液2次，细胞呈饥饿状态。按照锐博公司siRNA转染说明将配好的siRNA和脂质体2000在室温下混合20 min，逐滴加入6孔板，在37 ℃，5% CO【sub】2【/sub】温箱孵育24 h后观察其转染效率。转染效率（发出绿色荧光的细胞数/总细胞数）×100%。
1.2.2 实验分组 根据实验需要分为5组：筛选有效siRNA后，将有效siRNA按浓度分为20 nmol/L组、30 nmol/L组、50 nmol/L组，并且有阴性对照组和阳性对照组。
1.2.3 RT-PCR检测特异性的siRNA 登陆NCBI网站，从GeneBank上查询XIAP的mRNA序列，根据XIAP的mRNA序列，用Primer5软件设计RT-PCR引物，并用BLAST比对，内参为GAPDH，参照GeneBank资料设计。取对数生长期细胞，用20 nmol/L、30 nmol/L、50 nmol/L浓度siRNA转染后培养24 h为实验组，正常培养未加干预细胞为对照组，提取RNA步骤按照RNAfast200-总RNA极速抽提试剂盒进行。建立50 μL的反应体系，将无核酸酶水，AMV/Tfi 5×反应缓冲液，dNTP混合物，特异上下游引物及25 mmol/L MgSO【sub】4【/sub】加入倒置于冰上的0.5 mL薄壁反应管中，配制成反应混合物。然后向反应体系中加入AMV反转录酶和Tfi DNA聚合酶。将反应管轻柔振荡10 s以使该混合物混匀。反应条件如下48 ℃ 45 min， 94 ℃ 2 min，94 ℃ 30 s，58 ℃ 1 min， 68 ℃ 2 min，68 ℃ 7 min，4 ℃∞。共44个循环，扩增产物于1%的凝胶电泳检测。XIAP引物序列、扩增片段大小详见表1。表1 XIAP引物序列、扩增片段大小
1.2.4 Western-blot检测XIAP的蛋白表达 用终浓度为1 mmol/L蛋白裂解液RIPA裂解细胞，在4 ℃ 12 000 r/min离心10 min，取上清。紫外分光光度仪测定蛋白浓度，－70 ℃储存，将定量后的蛋白质100 ℃加热5 min后上样电泳，将转好的硝酸纤维素膜用封闭液室温振荡封闭2 h，用1 mL 1∶400的一抗封闭4 ℃过夜，弃一抗后加入1 mL 1∶400的辣根过氧化酶标记的二抗，室温下孵育2 h，弃去二抗后TBST洗膜5次，每次8 min，化学发光试剂显影5 min照相。
1.2.5 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率的变化 选取对数生长期密度在1×10【sup】6【/sup】，1 500 r/min离心10 min，去上清，PBS洗涤。一半加1 mL PBS吹打成悬浮细胞，流式细胞仪检测凋亡。另一半悬于250 μL PBS中，缓慢加入－20 ℃预冷的95%乙醇，终浓度为70%，冰浴30 min，加0.2 mL RNaseA，37 ℃水浴30 min，加入染色液PI0.3 mL，暗室下染色20 min。流式细胞仪检测周期。
1.3 统计学处理 采用SPSS 13.0进行分析，采用LSD-t检验，组间比较采用SNK-t检验，P
2 结 果
2.1 siRNA转染脑胶质瘤U251细胞的转染效率 计算出转染效率在80%以上。
2.2 siRNA抑制 XIAP后mRNA的表达（见图1） 共3个靶位的siRNA， siRNA2特异性抑制 XIAP的表达，而其他两个靶位siRNA没有明显的抑制效果。
注：M为脂质体2000 DNA mark1～3 为siRNA1-34为阳性对照。
图1 RT-PCR检测3个靶位siRNA的特异性
2.3 siRNA抑制 XIAP前后的蛋白表达（见图2） 内参显示为均一的条带，实验组XIAP组蛋白灰度比值有较大的差异，以30 nmol/L最为显著，蛋白表达量较多，而转染前XIAP的蛋白表达几乎很少，与内参对照比较各组的灰度值比值为12%、86%、71%、5.5%、73%、68%，各组XIAP蛋白的表达量由0.088±0.005上升到0.705±0.040（P
注：1为阳性对照组；2为阴性对照组；3为20 nmol/L组，4 为30 nmol/L组；5为50 nmol/L组；6为转染前。
图2 转染前后脑胶质瘤U251细胞XIAP的表达
2.4 siRNA抑制DNMT1前后细胞周期和凋亡的比较（见表1） 人脑胶质瘤细胞U251经siRNA干扰后停滞在G1期的细胞增多，与转染前及阴性对照组比较有统计学意义（P
3 讨 论
RNA干扰是指21-23nt的siRNA介导识别并靶向切割同源性靶mRNA分子，导致mRNA降解，只有在特异性双链核糖核酸（dsRNA）存在的条件下mRNA才被降解，从而实现特定基因的表达沉默；RNA干扰技术能同时封闭多个基因或基因家族；RNAi技术使基因表达暂时降低，基因组的信息仍是完整的，优越于基因敲降技术（可能破坏基因的完整性）；同时RNAi技术因其操作简单、特异性高、能迅速而方便地使某个基因失去功能；鉴于以上优点RANi技术首先被应用于功能基因组和反向遗传学的研究，其次用于研究mRNA差别剪接形成的异构体【sup】［2-4］【/sup】。
XIAP家族成员的表达增高是引起肿瘤细胞逃逸各种凋亡途径（内源性的线粒体途径和外源性的死亡受体途径）的诱导因素的主要原因【sup】［5］【/sup】，XIAP是抑制蛋白家族中抗凋亡作用最强的一个成分，在细胞畸变、肿瘤形成时表达明显增加【sup】［6］【/sup】，同时有研究证明XIAP的高表达与放疗、化疗的抵抗性呈正相关【sup】［7］【/sup】，XIAP蛋白水平的变化能够明显改善细胞的凋亡反应。
本实验采用RNA干扰技术，通过脂质体2000成功地将siRNA转入人脑胶质瘤U251细胞，在荧光显微镜下观察转染后带荧光的细胞，转染效率在80%以上，肯定了后继实验的可靠性；采用PCR检测siRNA干扰后XIAP的mRNA表达，结果显示siRNA2效果显著，使XIAP低表达，甚至不表达；采用Western-blot检测不同浓度siRNA干扰后XIAP蛋白的表达显示：30 nmol/L siRNA抑制效率较强；采用流式细胞仪检测发现经RNA干扰后停滞在G0/G1期的细胞增多，在S期的细胞减少，并且细胞的凋亡率增加；同时，本研究还发现高浓度的siRNA并不能带来更高的抑制效应，甚至有抑制效应下降的现象，主要的原因可能与RNAi发生时引起的一些非特异性反应及剂量效应的缺失有关，并且一些学者发现当siRNA浓度增高时有基因表达上调的现象【sup】［8］【/sup】。结合本实验结果认为，RNAi技术可抑制脑胶质瘤细胞U251上XIAP基因的表达，人工合成siRNA可通过抑制脑胶质瘤细胞的增殖和促进凋亡而发挥抗肿瘤作用。因此特异性siRNA干扰XIAP基因可能为人脑胶质瘤治疗提供广阔的应用前景。
参考文献：
［1］ Tfelt-Hansen J,Kanuparthi D,Chattopadhyay N.The emerging role of pituitary tumor transforming gene in tumor genesis［J］.Clinic Med Press,2006,4（2）:130-137.
［2］ Chow LS,LoK W,Kwong J,et al.RASSFIA is a target tumor suppressor from 3p21.3 in nasopharyngeal carcinoma［J］.Cancer,2004,109（6）:839-847.
［3］ Dreijerink K,Braga E,Kuzmin I,et al.The candidate tumor suppressor geneRASS1A from human chromosome 3p21.3 are involved in kidney tumor genesis［J］.Proc Antacids Sci USA,2001,98（13）:7504-7509.
［4］ Murray PG,Qiu GH,Fu L,et al.Frequent epigenetic inactivation of the RASSF1A tumor suppressor gene in Hodgkin lymphoma［J］.Oncogene,2004,23（6）:1326-1331.
［5］ LaCasse EC,Holcik M,Korneluk RG,et al.Apoptosis in health,disease,and therapy:Overview and methodology in apoptosis in health and disease［J］.Clinical and therapeutic aspects Cambridge:Cambridge University Press,2005,6:1-48.
［6］ Takeuchi H,Kim J,Fujimoto A,et al.X-linked inhibitor of apoptosis protein expression level in colorectal cancer is regulated by hepatocyte growth factor met pathway via at signaling［J］.Clinic Cancer Press,2005,11:7621-7628.
［7］ Schimmer AD，Dalili S，Batey RA，et al.Targeting XIAP for the treatment of m alignancy［J］.Cell Death Differ,2006,13:179-188.
［8］ 陆嵘，房静远.表观遗传修饰与肿瘤［J］.生命科学,2006,18（1）:10-14.