免疫组织化学技术范例6篇

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免疫组织化学技术范文1

关键词：免疫组织化学检测；病理诊断；临床价值

乳腺疾病属女性常见疾病，其中危害较大的是乳腺癌[1]。乳腺癌的治疗方式主要以手术治疗为主，其手术治疗的预后好坏主要取决于患者肿瘤的大小、组织学的分级以及是否出现淋巴结转移三项指标。在进行个体化治疗方案的过程中正确的识别病变组织分子的情况是十分重要的一个环节。除此之外，乳腺癌是一种恶性肿瘤，大部分乳腺癌在常规的切片中就可以诊断出来，但是，其中有一小部分肿瘤无法用常规检查方法检测出来，因此，这一部分乳腺癌患者可以使用免疫组化进行诊断。

1 资料与方法

1.1一般资料 选择我院2013年1月～2015年12月收治的60例乳腺病患者作为研究对象。纳入标准：①两组患者均以疼痛、溢液、乳腺肿块为主要临床症状；②检查后均行病理检查确诊；③知情同意。按照随机双盲法将其分为观察组（n=30）与对照组（n=30）。其中观察组年龄25～45岁，平均（31.28±3.55）岁。对照组年龄21～53岁，平均（35.23±3.43）岁。两组患者一般资料差异无统计学意义，P>0.05，具有可比性。

1.2方法 观察组进行免疫组织化学检测，对照组进行常规检查，最后以术中病理检查结果为金标准，比较免疫组织化学检测与常规检查在乳腺病理诊断中的诊断效果。免疫组织化学检测的操作方法如下：对所采集的标本用10%的福尔马林进行固定，包埋使用常规石蜡[2-3]。采用免疫组化S-P法，S-P即用型试剂盒及即用型抗P63、SMA单克隆抗体均购自福州迈新生物技术公司[4]。切片厚4Lm，常规脱蜡、水化后，P63进行高温高压抗原修复，其它步骤按说明书进行。PBS代替一抗是本次检测的阴性对照，已知乳腺腺病作为阳性对照。

1.3观察指标 P63定位于细胞核，SMA定位于细胞质[5]。当细胞核或是细胞质呈现为棕黄色我们可以判定为阳性细胞。

1.4统计学处理 应用SPSS19.0统计学系统，计量数据以（x±s）表示，组间比较应用t检验，计数资料应用χ2检验，P

2 结果

2.1检测结果对比 免疫组织化学检测的30例标本中有阳性标本有23例，阴性标本有7例，阳性率为76.67%，阴性率为23.33%；常规检查结果显示，30例标本中阳性标本为12例，阴性标本有18例，阳性率为40.00%，阴性率为60.00%。两种方法阳性率差异具有统计学意义（P

2.2乳腺腺病与浸润性癌 正常的乳腺上皮一共有三层：分别为腺型上皮、基底层肌上皮以及管腔基底层型上皮。在阳性病例中我们发现乳腺癌可累及乳腺的终末导管小叶，同时也会造成细胞结构以及形态的改变，通过免疫组化的检查方法可以鉴定被检组织有肌上皮、基底膜，P63呈不均匀的间断性表达。这一结果就可以判断出病理组织表达高分子角蛋白CK5/6[5]。

2.3原位癌与增生性疾病 这里所指的原位癌与增生性疾病主要是指导管/小叶部位。通过免疫组化我们可以证实原位癌与增生性疾病在表型方面所呈现出的特点各有不同，主要区别在于角蛋白不同，因此，这两种疾病可以表现出不同的生理活性。根据最新资料显示，在一般的增生性疾病中34βE12主要为阳性表达，而在原位癌中这种34βE12主要为阴性表达。

3 讨论

乳腺癌是女性中最常见的恶性肿瘤之一，乳腺癌主要是以细胞粘附性为主要发病机理，可以分为小叶性乳腺癌与导管乳腺癌。根据最新资料显示，目前我们对小叶性乳腺癌与导管乳腺癌进行区别的主要标志物是β-catenin、34βE12和E-cadherin[6]。

E-cadherin主要分布在细胞表面，其主要载体是细胞表面的跨膜蛋白，这种标志物在导管原位癌的表达中呈阳性，而在小叶性乳腺癌中呈阴性，是进行两种疾病区别的最有价值的标志物。这种标志物主要表达腺型上皮、基底层肌上皮以及管腔基底层型上皮上，对于不同的患者，其表达形式也有所不同。

在乳腺疾病发展过程中，还有其他的重要的生物学标志物，其中较为重要的就是内质网（ER）与孕激素受体（PR）。在临床治疗过程中，ER与PR的表达情况可以显示出乳腺癌内分泌治疗的情况。在进行相关治疗尤其是内分泌治疗之前，我们必须对患者的ER与PR进行检查，若检测结果均为阳性，那么治疗有效率将会达到60%以上；若这两种标记物为一个阴性一个阳性，那么治疗有效率将在20%左右；若两种标记物均为阴性，患者的治疗有效率仅为5%。

在本次研究结果显示免疫组织化学检测的30例标本中有阳性标本有23例，阴性标本有7例，阳性率为76.67%，阴性率为23.33%；常规检查结果显示，30例标本中阳性标本为12例，阴性标本有18例，阳性率为40.00%，阴性率为60.00%。两种方法阳性率差异具有统计学意义（P

综上所述，与传统检查方法相比，免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中阳性率较高，免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中的应用具有较高价值，可以作为乳腺病的诊断检查。

参考文献：

[1]汪勤，唐曼，刘婷E.免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中的作用[J].安徽医药，2014，1（5）：957-960.

[2]李廷超.免疫组织化学检测在乳腺病理诊断中的作用[J].吉林医学，2014，12（32）：42.

[3]余敏，王泽华，龚军丽，等.用于人乳腺癌病理检测的抗人ARD1单克隆抗体的制备[J].生物工程学报，2011，3（1）：57-62.

[4]龚继芳，袁艳华，宋国红，等.乳腺癌干细胞比例增高与临床治疗相关的探索性研究[J].北京大学学报（医学版），2013，7（5）：465-470.

免疫组织化学技术范文2

【关键词】多形性腺瘤 腺样囊性癌 GFAP CD57 诊断

中图分类号：R739.63文献标识码：A文章编号：1005-0515（2010）12-043-02

唾液腺是多种良性或恶性肿瘤性疾病及非肿瘤性疾病的源头。多形性腺瘤PA是目前最常见的唾液腺肿瘤，约占所有唾液腺肿瘤的75%。而腺样囊性癌ACC是在除腮腺外其它唾液腺最常见的原发性恶性肿瘤。尽管对于ACC和多形性腺瘤的细胞学特征已经有了很确切的描述，但是还是很容易把ACC与一些良性肿瘤混淆，尤其是多形性腺瘤[1]。因为有些良性多形性腺瘤的基底膜的局部区域和透明球区域可以以腺样囊性模式生长，这种情况下很难区分多形性腺瘤和ACC[2]。而又因为治疗方法上的差异，使得多形性腺瘤和ACC的鉴别诊断看起来具有相当大的意义。因此要得到一个能够确切把多形性腺瘤 与ACC区别开的标记物将会是解决这些诊断难题的关键。

一些外科病理文献揭示了在多形性腺瘤中GFAP和CD57的阳性表达[3]。尽管在吸涂片中GFAP的免疫定位使其成为辅助PA诊断的常规的细胞学标准，并且其在鉴别其它唾液腺肿瘤中的潜在作用也是有记载的[4]，但是就目前所知没有任何的文献研究来具体评价通过已获得的组织标本，经免疫组织化学染色来评估GFAP和CD57在鉴别诊断PA 和ACC中的作用。本研究采用了免疫组织化学方法检测了26例唾液腺肿瘤石蜡标本中GFAP 及CD57 的表达情况， 并由此来评估GFAP和CD57在鉴别诊断PA 和ACC中的作用。

1材料与方法

1.1病例及标本选择从2006年~2009年间，山西医科大学第一医院口腔颌面外科行手术切除的涎腺肿瘤存档石蜡标本中，我们选择26例经细胞学诊断为以下的（1）PA(10例)（2）非典型性细胞学改变，不能排除ACC（8例）（3）ACC（8例）。所有病例均为首发病例，术前均未行任何抗肿瘤治疗。

1.2主要试剂及方法所用试剂

标本中选取肿瘤边缘部位蜡块，以2μm 厚度连续切片，使用S-P法分别做GFAP、CD57免疫组织化学染色。GFAP免疫组化表达产物分布于胞浆内，CD57免疫组化表达产物分布与胞膜。所用试剂兔抗人胶质纤维酸性蛋白（GFAP）多克隆抗体、鼠抗人自然杀伤细胞（CD57）单克隆抗体、PV-6000通用二步免疫组化试剂盒、枸橼酸修复液、浓缩型DAB 试剂盒，均购自于北京中杉金桥生物技术有限公司。

1.3结果判定：1）GFAP结果判定将胞浆中出现棕黄色颗粒的细胞视为阳性细胞，- 为细胞染色数= 0 ; + 为0 < 细胞染色数< 33 %; ++为33% < 细胞染色数< 66 % ; +++为细胞染色数> 66 %. 2）CD57 定位于淋巴细胞中的自然杀伤细胞膜呈棕黄色颗粒.阳性结果判定采用4 级、半定量法. 阴性( - ) :无阳性细胞; 弱阳性( + ) : 少于10 %的胞膜见棕黄色颗粒; 中阳性( + + ) :10 %～50 %的胞膜见棕黄色颗粒;强阳性( + + + ) : 多于50 %的及胞膜见棕黄色颗粒。

1.4结果及分析

细胞学特征

被诊断为PA的10例标本中显示为单个或松散片状的上皮细胞，这些上皮细胞为小的卵圆形核，核染色质淡染，并且细胞质界限明显，还可见由梭形间质细胞构成的丰富的的软骨基质。镜下观察为由大量的软骨样基质与有相似细胞学表现的上皮细胞掺杂在一起的多形性结构。

被诊断为ACC的8例标本显示占绝对优势的不同大小的透明球区域被有粘合性的具基底细胞样外观的肿瘤细胞所包围。这些肿瘤细胞为圆或卵圆形，深色的呈角形的细胞核，有极少的细胞质，核浆比例高。在其中的5例中表现为异型核，3例中出现了核的有丝分裂相。镜下观察组织块表现为明显的透明球结构被有相似形态结构的肿瘤细胞包绕而成的筛状结构。

其余8例有非典型细胞学改变的标本中显示，只有极少的区域显示透明球区域被有少量细胞质和淡染的细胞核特征的肿瘤细胞包绕。在其余大多数区域可看到染色的间质与小而淡染的相似细胞掺杂在一起。镜下观察组织块没有明显的由透明球和肿瘤细胞围成的筛状结构。肿瘤细胞有与分泌物涂片检查描述的相似的细胞学特征。

通过免疫组织化学方法对唾液腺疾病的细胞学诊断和组织诊断的总结如下：被诊断为多形性腺瘤的所有10例标本的GFAP染色均表现为染色深而弥散。其中的8例还表现为CD57染色强阳性。所有的上皮细胞和间质成分均为阳性染色；被诊断为腺样囊性癌的全部8例标本的GFAP和CD57的免疫组织化学染色均呈现阴性；有非典型性细胞学改变的8例标本中，有4例表现为GFAP阳性和CD57阳性，4例表现为GFAP和CD57阴性。其中有前述表现的4例在组织切除后被确诊为多形性腺瘤，而有后者表现的4例在组织切除后被确诊为腺样囊性癌。

2讨论

多形性腺瘤是最常见的唾液腺肿瘤，由上皮，间充质及软骨样基质组成。虽然由细针穿刺细胞学诊断涎腺肿瘤的敏感性可达94％[5]，但是细胞间质量很少的PA 与分化良好的ACC之间的差异很难区别。多形性腺瘤是与ACC的鉴别诊断中最常见的涎腺肿瘤，多形性腺瘤和ACC都可以形成筛孔状或圆柱状，并且形成透明球状。在最近的研究中，美国的Yang 和 Waisman总结了可以使用超快的巴氏染色法和油浸镜头，通过观察细胞核的特征和细胞质量的差异把ACC和圆柱形的多形性腺瘤区分开来[6]。尽管Yang 和 Waisman1996年就开始在它们的工作室中运用这项技术，但是细胞病理学家们在日常临床实践中并不常使用。而又因为治疗方法上的差异，使得PA和ACC的鉴别诊断看起来具有相当大的意义。对一个良性肿瘤来说，例如PA ,选择的外科方法是保留面神经的腮腺浅叶切除术。而对于ACC而言，它是一个恶性唾液腺肿瘤，具有迟发型转移和较差的长期生存，常选择全部腺体切除或根治术常，而且一般也不保留面神经[7]。

通过唾液腺细针活检得到一个能够确切把PA 与ACC区别开的标记物将会是解决这些诊断难题的关键，免疫组织化学染色常常规避开这些外科病理学的问题[8]。Nakazato等人首次演示了在PA的肿瘤细胞中进行GFAP免疫组织化学染色和正常涎腺组织中的阴性表达，他们还确定了这些肿瘤中的GFAP相关抗原，他们推测这些抗原是由肿瘤细胞中的机上皮细胞系所产生的[3]。Domagala 等人在分泌物涂片中运用免疫荧光技术证明了12例PAS病例中有11例出现了GFAP的正染色，而在所有的2例ACC病例中均无染色[9]。Ostrzega等人也已经证明了在分泌物图片中，所有的PA病例均出现GFAP的表达，而在2例ACC病例中则出现免疫组化染色阴性[4]。Hayash等人对他的手术标本中CD57的免疫组织化学染色也显示了在所有PA病例中的54%会出现阳性反应，而所有ACC病例则缺乏对CD57的表达[10]。

不像先前的研究，我们运用组织块材料来评估将GFAP作为诊断PA的一个辅助工具所起的作用。另外，我们也分析了PA组织块材料中CD57的免疫反应性。据目前所知，对于PA和ACC的组织块材料中GFAP和CD57的免疫组织化学分析以前还没有报道。依我们的经验，这个可以作为首选方法，因为组织切片供应充足，其管理也可控制。除此之外，在一些病例中，我们观察到当在实验室运用脱色涂片时会出现假阴性或假阳性免疫染色或背景染色。

此研究证明GFAP和CD57免疫染色在PA的诊断中可作为一个有用的辅助标记物。据我们观察，GFAP免疫染色可出现在被细胞学诊断为PA的所有病例中，以及一些有模棱两可细胞学表现但最终被组织学诊断为PA的所有病例中。相反，所有GFAP阴性和CD57阴性则出现在被细胞学诊断为ACC的所有病例中以及一些有模棱两可细胞学表现但最终被组织学诊断为ACC的所有病例中。其中两例PA病例显示结果为CD57假阴性的原因还未明了，但是我们的结果可以反映抽样限制，因为我们所染色的组织块只是肿瘤组织的一部分。

在临床实践中，要把多形性腺瘤，基底细胞腺癌与腺样囊性癌区别开来是很困难的，尤其当透明球不存在的吸涂片。核异形，粗质和突出的核仁可能是诊断ACC有用的细胞学特征[11]。据我们有限的经验，有两例基底细胞腺瘤的病例和两例基底细胞腺癌的病例，他们并没有表达GFAP和CD57。因此，在一些模棱两可的病例中当使用GFAP和CD57免疫染色阴性作为诊断ACC的唯一诊断标准时一定要慎重，因为它可能排除其它良性或恶性肿瘤的可能性。然而，在一些模棱两可的病例中使用CD57和GFAP染色阳性在辅助诊断多形性腺瘤时很有效，可以减少鉴别诊断和降低不确定诊断病例的数量。

总之，对于模棱两可的唾液腺病变，尤其当遇到ACC和PA的鉴别诊断时，石蜡包埋切片后进行CD57和GFAP的免疫组织化学染色可以作为诊断多形性腺瘤的一种有用的辅助工具。当临床评价血涂片时观察到非典型性表现，而又能取得足够的组织块材料时，它可以作为一种必要的辅助方法。我们的研究结果证明，细胞块筹备后GFAP和CD57免疫组织化学染色均阳性可以作为PA诊断的强有力的支持，而CD57负染法并不能排除PA 的诊断。

参考文献

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[3]Nakazato, Y. , Y. Ishida , K. Takahashi , and K. Suzuki . Immunohistochemical distribution of S-100 protein and glial fibrillary acidic protein in normal and neoplastic salivary glands. Virchows Arch A Pathol Anat Histopathol 1985. 405:299-310.

[4]Ostrzega, N. , L. Cheng , and L. Layfield . Glial fibrillary acid protein immunoreactivity in fine-needle aspiration of salivary gland lesions: a useful adjunct for the differential diagnosis of salivary gland neoplasms. Diagn Cytopathol 1989. 5:145-149.

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[8] Chandan, V. S. , D. Wilbur , W. C. Faquin , and K. K. Khurana . Is c-kit (CD117) immunolocalization in cell block preparations useful in the differentiation of adenoid cystic carcinoma from pleomorphic adenoma? Cancer 2004. 102:207-209.

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免疫组织化学技术范文3

【关键词】乙酰肝素酶-2；非小细胞肺癌；肿瘤标志物；免疫组织化学肺癌一直都是全球范围内高死亡率的恶性肿瘤, 并且死者中80%为非小细胞肺癌(non-small-cell lung cancer, NSCLC)患者, 由于肿瘤发生、发展过程中大量具有调控作用的细胞因子活性发生变化, 寻找上述活性分子。乙酰肝素酶-2(heparanase-2, HPSE2)属于乙酰肝素酶家族 ［1］, 现已发现HPSE2在头颈部肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、直肠癌、胃癌组织中高表达并与肿瘤进展存在关联［2-6］, 但HPSE2在NSCLC组织中的表达情况目前尚无报道, 本实验将探讨HPSE2在NSCLC组织中的表达水平及其与肺癌临床病理因素之间的关系。

1材料与方法

1. 1材料选取2002年1月~2006年12月辽宁省肿瘤医院手术切除并经病理确诊的NSCLC标本82例, 其中49例具有完整随访资料。10例对照标本取自同期距离癌灶边缘5 cm以上并经HE染色证实的正常肺组织。所有患者术前均未接受放化疗。

1. 2方法

1. 2. 1免疫组织化学所有标本均用10%中尔马林固定, 石蜡包埋, 制成4 μm切片, 采用S-P法检测HPSE2蛋白表达情况。HPSE2单克隆抗体购自美国Santa cruz公司, S-P法试剂盒及DAB显色试剂盒购自福州迈新生物技术公司。切片滴加HPSE2一抗(1:100)4℃湿盒内孵育过夜, 次日按照SP试剂盒说明书进行染色, DAB显色, 苏木素复染。以PBS代替一抗作为空白对照。细胞染色强度以胞浆着色阴性、淡黄色、黄棕色、深棕褐色分别记0、1、2、3分；染色范围以着色细胞量占肿瘤细胞75%分别记0、1、2、3分, 两项计分相乘为最终得分(0~9分), 得分≤4分为低表达, >4分为高表达。

1. 3统计学方法采用SPSS13.0统计软件进行数据分析处理, 免疫组织化学染色结果各组间的比较采用χ2检验及 Fisher 确切概率法, 生存数据分析采用 Kaplan-Maier 法, 采用 log-rank 法判断差异性, P

2结果

2. 1免疫组化结果免疫组织化学染色显示, HPSE2主要定位于细胞浆, 82例NSCLC组织中, 30例(37%)为高表达, 在非癌性肺组织中弱表达或无明显表达。HPSE2高表达同局部淋巴结转移减少(P=0.012)相关, 与患者年龄(P=0.658)、性别(P=0.96)、肿瘤组织类型(P=0.654)、pTNM分期(P=0.266)、肿瘤体积(P=0.105)、肿瘤分化水平(P=0.174)等均无相关性。.

2. 2HPSE2表达水平与NSCLC患者预后生存率之间的关系对49例有完整的术后随访记录的患者进行Kaplan-Meier生存时间分析显示: NSCLC组织中HPSE2高表达组患者生存时间高于低表达组生存时间［(61±4.31) VS (50±8.92)］；Log-Rank, P=0.027)。

3讨论

乙酰肝素酶家族包括两个成员：乙酰肝素酶-1 (hepara-nase-1, HPSE1), 乙酰肝素酶-2(heparanase-2, HPSE2)；HPSE1是一种β-D-内切葡糖醛酸酶, 在人肿瘤组织中常高表达并同肿瘤进展密切相关, HPSE1可通过水解细胞外基质、释放活性细胞因子及激活信号通路等方式调控肿瘤进展。HPSE2蛋白结构同HPSE1有大约59%的同源性, 在脑、乳腺等组织中常有较高表达［1］, 在头颈部肿瘤、卵巢肿瘤、宫颈肿瘤、直肠癌、胃癌组织中高表达［2］, 但其所发挥的具体生物学作用及机制尚不十分明确。

HPSE2在NSCLC组织中表达情况及临床病理意义目前尚无报道, 通过免疫组织化学染色发现HPSE2在NSCLC组织的表达强度高于癌旁组织及正常肺组织, 这与其他肿瘤的研究结果相一致。经进一步统计分析发现, HPSE2高表达与NSCLC局部淋巴结转移减少及患者预后生存时间延长相关, HPSE2在头颈部肿瘤高表达同局部淋巴结转移负减少及预后生存时间延长相关［2］, 胃癌组织中HPSE2高表达同患者生存时间延长相关, 这些结果提示HPSE2对肿瘤的发展可以发挥抑制作用, 可能的机制有：①HPSE2可以与HPSE1竞争底物进而抑制其活性抑制肿瘤进展［2］；②.多蜂房蛋白EZH2可以抑制靶基因转录, EZH2在多种恶性肿瘤中高表达并被视为肿瘤进展的标志物, 因此被EZH2抑制的基因可能发挥抑癌的作用, 而HPSE2正是EZH2抑制的靶基因, 这提示HPSE2抑制肿瘤进展的作用可能与EZH2有关, 而在NSCLC组织中HPSE2同HPSE1及EZH2的相互作用机制尚需进一步研究。现有研究均发现HPSE2在肿瘤组织中表达强度高于癌旁及正常组织, 同时, 在宫颈病变组织中HPSE2表达强度随恶变程度增加逐级增高, 在胃癌组织中HPSE2高表达与肿瘤体积增加相关。

综上所述, HPSE2在肿瘤发展过程中所起的作用较为复杂, 尚需进一步研究, 在NSCLC组织中, HPSE2表达与肿瘤局部淋巴结转移减少及患者预后生存时间延长相关, HPSE2有可能成为NSCLC筛查、诊断及预后结果判定的新靶点。

参考文献

［1］ McKenzie E, Tyson K, Stamps A, et al. Cloning and expression profiling of Hpa2, a novel mammalian heparanase family member. Biochem Biophys Res Commun, 2000, 276(3):1170-1177.

免疫组织化学技术范文4

［关键词］ 鼻咽组织;免疫组织化学;标准化;质量控制

Quality Control of Immunohistochemical Stainig in Slice of Nasopharynx Tissues

Abstract： Objective To establish a standard empirical process of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues catering to the requirement for pathological diagnosis and research in the future.Methods Introducing the methods of immunohistochemical staining and slice making of nasopharynx tissues as well as the link of quality control in detail. Results The results shown that method has three features: stable and reliable， strong specificity， and high sensitivity. Conclusion This method can improve the quality ofimmunohistochemical staining of nasopharynx tissue.

Key words:Nasopharynxtissue;Immunohistochemistry;Qualitycontrol

鼻咽癌是我国华南地区常见的恶性肿瘤之一，其发生的病因、发病机制以及发生发展也是我们广东医学院病理学教研室一直关注和研究的课题。由于鼻咽组织活检时不易大量取材，且组织中淋巴细胞较多，组织质地较脆，石蜡切片常出现组织碎裂、染色发白、模糊不清、细胞固缩等现象，另外淋巴细胞、网状细胞表面上的Fc受体及一些反应性淋巴细胞干扰免疫组化的结果，导致制作满意的鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色较为困难，继而影响病理诊断及后续的科研工作。为此，我们摸索自己实验室的工作条件及各种抗体最佳的实验条件来制定标准化实验流程，稳定鼻咽组织石蜡切片及其免疫组化染色的质量，现报道如下。

1 材料与方法

1．1 材料 来自广东医学院附属医院临床送检的鼻咽标本。

1．2 主要仪器 轮转切片机(德国，Leica)、家用高压锅(广州)。

1．3 主要试剂 p53、PCNA、Ecadherin等鼠抗人单克隆抗体、多克隆抗体及免疫组化染色SP试剂盒、浓缩型DAB试剂盒、抗体稀释液均购自北京中杉金桥生物技术有限公司。

1．4 组织切片的制备 鼻咽组织离体时立即用生理盐水轻轻洗去组织上的血液及黏液，随后即用4%中性缓冲甲醛液固定，并及时送病理科作进一步处理。4%中性缓冲甲醛液固定不宜超过18 h。脱水从低浓度乙醇到高浓度乙醇梯度脱水，级差以10%为宜，一般从60%乙醇开始30 min，70%乙醇30 min，80%乙醇25 min，95%乙醇25 min，无水乙醇Ⅰ20 min，无水乙醇Ⅱ20 min;二甲苯Ⅰ10 min，二甲苯Ⅱ10 min;58 ℃石蜡浸蜡，期间最好更换1次，浸蜡3 h后60 ℃石蜡包埋制成蜡块。一次性刀片进行切片，切片厚度为2 μm～3 μm，40 ℃以下水温展片，65 ℃温箱烤片1 h～4 h。

1．5 免疫组化染色方法 切片烤片后脱蜡至水，然后蒸馏水洗两次，高压锅内放约5 cm深的自来水，大火加热至沸腾，再将柠檬酸盐缓冲液(200 ml～400 ml pH 6.0)倒入搪瓷杯中，把切片置于耐高温塑料切片架上放入盛有缓冲液的搪瓷杯中，盖上锅盖，扣上压力阀，继续中火加热至喷气，从喷气开始记时1 min后，压力锅离开火源，冷却至室温(稍冷后，可在自来水龙头下流水加速冷却)，取出切片，先用蒸馏水冲洗两次之后用PBS(pH 7.2～7.4)冲洗，余下按免疫组化步骤选择不同的抗体进行染色。

2 结果

鼻咽切片组织无收缩、开裂，组织结构、细胞形态清晰，鼻咽癌癌细胞及各种炎症细胞能清晰辨认，HE染色鲜艳，细胞核呈鲜明的蓝色，细胞质被伊红染成深浅不同的粉红色、桃红色，核仁呈红色，对比度良好(见图1)。免疫组化染色结果为病变组织结构完整、无脱片现象，阳性与阴性对比明显，阳性物质定位准确；背景干净、清晰，无非特异性着色(图2)，组织结构与细胞轮廓完整、清晰，染色结果稳定可靠、敏感性高、特异性强、细胞核呈蓝色、适合显微照相等。

图1 鼻咽癌组织(HE 400)（略）

图2 Ecadherin在鼻咽慢性炎上皮的强阳性表达(SP 400)（略）

3 讨论

免疫组织化学由于其具有的复杂性，在技术应用过程中存在不少问题，直接或间接地影响了最终的病理诊断，应予以重视以下几方面，才能从总体上保证鼻咽组织免疫组化染色的质量。

3.1 制作优质石蜡切片是做好鼻咽组织免疫组化染色的基础 取材时鼻咽组织上的血液及黏液将影响固定液的渗透和干扰免疫组化染色的结果，而且鼻咽组织由于组织中淋巴细胞比较丰富和致密，间质成分较少是难以制作优质石蜡切片的主要原因，所以组织固定的好坏是影响免疫组化结果的关键因素。因此有条件时，鼻咽组织离体时立即用生理盐水洗去组织上的血液和黏液，并用4%中性缓冲甲醛液固定；或者用4%中性缓冲甲醛液固定后及时送病理科做进一步处理：即轻轻晃动瓶内固定液，利用原有固定液洗去鼻咽组织上的血液及黏液，再换一次4%中性缓冲甲醛液固定。乙醇脱水尽可能从较低浓度起始，以免组织过度收缩。常温下二甲苯透明时间≤30 min，不然组织变脆。制片严格按操作程序进行，否则是免疫组化产生假阳性、假阴性或脱片的主要原因。

3.2 鼻咽组织蜡块的管理 因为要考虑患者的经济负担，经病理确诊后的病例做免疫组化染色不普遍，鼻咽组织做免疫组化染色绝大部分是教师或研究生的研究课题需要。为了档案资料的齐全和避免医疗纠纷，＜2 mm组织的蜡块一般不允许再切片。教师或研究生选择做免疫组化的鼻咽组织蜡块要通过观察HE染色切片的组织形态的基础上来决定，根据诊断来选择，不要选择组织坏死和出血多的蜡块，所有需要做免疫组化的鼻咽组织切片均由有经验的专业技术员切片，以防组织蜡块切削过多。切片完毕后组织蜡块要及时封蜡归档，力求科研工作有延续性和档案资料的完整性。

3.3 免疫组化切片的质量控制要求 免疫组化染色使用的玻片必须用饱和的重铬酸钾浓硫酸液浸泡3 d以上，捞出后用自来水彻底清洗干净，再经95%乙醇过一遍，晾干后涂防脱片剂烘干备用。裱片时切片片膜不能留有气泡，烤片时温度过低、时间过短，则易脱片，温度过高、时间过长则对抗原有破坏，烤片后用专用二甲苯、乙醇脱蜡至水洗，脱蜡要彻底。我们曾采用微波加热等方法进行抗原修复，但效果不如高温高压抗原修复法理想。另外高温高压加热时间的长短很重要，从组织切片放入缓冲液到高压锅离开火源的总时间控制在3 min内，时间过长，可能会使染色背景加深。柠檬酸缓冲液不能重复使用，且容量必须保证所有切片都能浸泡到，整个染色过程不要让切片干涸。显色在镜下控制，时间约3 min～7 min，在阳性明确的部位着淡黄色即终止显色，此时显色程度较佳，能有效地避免背景着色。苏木素复染后要充分返蓝，否则背景呈紫红色(见图3)。

图3 苏木素复染未充分返蓝、背景呈紫红色（略）

3.4 增强特异性着色、降低非特异性染色是免疫组化的质量保证 抗体是免疫组织化学最核心的试剂，其质量直接影响免疫组织化学的结果判断继而影响诊断，由于鼻咽组织中的淋巴细胞、网状细胞会产生非特异性染色。因此要选择特异性强、效价高的一抗，新购进的抗体储存在4 ℃冰箱并进行预实验，摸索出最佳实验条件。抗体的稀释包括特异性一抗、中间联结抗体及标记抗体，其稀释度与抗体的浓度、质量及有效期、孵育时间和采用的方法等。防止失效的抗体进入实验室，此外要选择病变典型的做免疫组化染色对照，一定要每一批免疫组化均设有已知阳性对照和用PBS代替一抗的空白对照。

3.5 免疫组织化学结果的判读 结果的判断免疫组化切片应是阳性标记强而非特异性染色淡或无，两者形成鲜明的对比，阳性表达必须在细胞或组织特定的部位，细胞边界清楚;每批染色都要有阳性对照、阴性对照和自身对照才能对染色结果作出正确判断。判断标准常根据阳性细胞的百分比或阳性细胞的染色深度来判断，其颜色深浅反映抗原量的多少。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。阳性反应分布总是有规律、局限、定位准确和一定形态特征的，如细胞膜着色呈圆形;典型的细胞核着色为均质状，核仁和染色质呈颗粒状着色。

3.6 免疫组织化学阳性库的建立 为了保证阳性对照的可靠性，在日常工作中要收集各种抗原的阳性组织和阳性切片，逐步建立阳性对照切片库及相应的电子档案库。如预期结果为阴性或病理形态诊断与免疫组化结果相反时，必须要有阳性对照才能作出正确的病理诊断，阳性对照能说明染色技术和阴性结果的可靠性，不是由于标本处理不当导致的抗原丧失、方法错误、技术不熟练等造成的假阴性。鼻咽组织免疫组化染色步骤多、过程长、影响因素也多，因此只有在各个细节都认真对待，然后以常规的形式相对固定下来，才能确保其免疫组织化学结果的可靠性。

参考文献：

［1］ 陈杰，郑杰，霍临明.重视免疫组织化学的质量控制和标准化［J］.中华病理学杂志，2005，(2)：6566.

免疫组织化学技术范文5

【摘要】 套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是一类较少见的非霍奇金淋巴瘤（nonHodgkin's lymphoma， NHL），形态学方法常难以将其与其他类型小细胞淋巴瘤相鉴别。为了提高对MCL的认识，报道1例误诊为滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma， FL）的MCL，总结该病例临床资料及实验室检查特点。结果显示：流式细胞术（flow cytometry，FCM）及免疫组织化学染色检查符合MCL的特征，细胞遗传学检查发现了包括t(11;14)在内的多种染色体异常。结论： MCL为难以确诊的疾病，间期荧光原位杂交、多重荧光原位杂交、FCM以及免疫组织化学染色等检查有助于MCL的诊断。

【关键词】 套细胞淋巴瘤

A Case Report of Misdiagnosed Mantle Cell Lymphoma

Abstract

Mantle cell lymphoma (MCL) is a rare group of nonHodgkin's lymphoma (NHL)， which is difficult to discriminate from other subtype of small lymphocytic lymphoma in morphologic appearance. In order to enhance the understanding of MCL， a case of MCL first diagnosed as follicular lymphoma (FL) was reported. The clinical and laboratory characteristics of MCL were analyzed and summarized. The results showed that the findings of flow cytometry (FCM) and immunohistochemical staining technique were compatible with the diagnosis of MCL. Cytogenetic analysis can detect multiple types of chromosomal abnormalities， including t(11;14). In conclusion， MCL is a disease which diagnosis is difficultly confirmed. Interphase fluorescence in situ hybridization， multiplex fluorescence in situ hybridization， FCM and immunohistochemical staining technique play important roles in the diagnosis of MCL.

Key words

mantle cell lymphoma; IFISH; MFISH; FCM

套细胞淋巴瘤（mantle cell lymphoma， MCL）是1994年于欧美淋巴瘤修订分类（revised European American lymphoma， REAL）中提出的一个独特的病理类型［1］，为较少见的一类非霍奇金淋巴瘤（nonHodgkin's lymphoma， NHL），占NHL的2％-10％。在Kiel分类中归为生发中心细胞淋巴瘤，在工作分类中归为小细胞与大细胞混合性淋巴瘤或弥漫型小裂细胞淋巴瘤，但不明确的滤泡部分常被误诊为滤泡性淋巴瘤（follicular lymphoma， FL）或反应性淋巴滤泡增生。细胞遗传学特点是t(11;14)(q13;q32)，由11号染色体的Bcl1基因（11q13）易位到14号染色体免疫球蛋白重链（immunoglobulin heavy chain， IgH）基因启动子的下游，从而导致Bcl1基因表达的上调。Bcl1基因的易位导致细胞周期蛋白D1（cyclin D1，CCND1）mRNA过度表达，最终导致细胞增殖的调控紊乱。临床过程呈进展型，侵袭性强，预后较差，中位生存期为3-5年［2］。近来我科收治1例患者，外院误诊为FL，在我院经过荧光原位杂交（fluorescence in situ hybridization， FISH）以及流式细胞术（flow cytometry， FCM）检测确诊为MCL，现报告如下。

材料和方法

病例资料

患者，男，58岁，2005年1月体检B超发现后腹膜淋巴结肿大。增强CT、MRI显示：两下肺结节影，纵隔淋巴结肿大；腹腔及后腹膜淋巴结肿大，胰腺周围及腹主动脉旁、肝门处见多个大小不等的低回声，周围清晰，最大直径5.9 cm × 5.3 cm，部分内部回声不均，脾脏肿大，膀胱直肠间类圆形软组织影。外院行腹腔淋巴结切除活检术，术后病理检查显示： FL（I级）；免疫组织化学检查显示： CD79α+、CD20+、CD43+，CD3-、Bcl2+、Bcl6-、CD10-、CCND1+、CD5-。2005年2月以MACOP（米托蒽醌、阿糖胞苷、环磷酰胺、长春新碱和泼尼松）方案化疗，2005年3月复查，CT显示两下肺结节絮状影有所进展，纵隔淋巴结仍肿大，转至其他医院病理切片会诊显示： FL（I级），免疫组织化学检查显示：CD79α+、CD20+、CD43+、Bcl2+、Bcl6-、CD10-、CCND1+，背景细胞CD3+、CD5+。2005年3月-2006年1月采用FND（福达华、米托蒽醌和地塞米松）方案化疗，共计8疗程，期间多次复查CT显示部分病灶有所吸收，部分增大，并出现左颈根部、左腋下淋巴结肿大。2005年8月中国实验血液学杂志 J Exp Hematol 2007; 15(5)套细胞淋巴瘤一例误诊分析常规骨髓检查未见异常。2006年3月患者出现四肢游走性疼痛，4月复查CT显示：左中下颈、左侧锁骨上及左侧腋窝淋巴结较前增大、增多，两肺浸润灶较前有所缩小，脾肿大。骨ECT显示：两肱骨中段、两股骨中段、左侧坐骨肿瘤骨转移。患者疾病进展，于2006年4月26日转至我院。我院病理报告显示： FL（I-Ⅱ级），入院体检为：轻度贫血貌，皮肤黏膜无瘀点瘀斑，浅表淋巴结未扪及，胸骨无压痛，心肺无异常，腹平软，肝未及，脾肋下2 cm。骨髓细胞形态学：有核细胞增生明显活跃，原始淋巴细胞22.8%，幼稚淋巴细胞10.0%，成熟淋巴细胞4.0%；原幼细胞过氧化物酶（POX）和糖原染色（PAS）染色阴性。外周血白细胞16×109/L，原始淋巴细胞11%，幼稚淋巴细胞11%，成熟淋巴细胞38%，血红蛋白 85 g/L，血小板 160×109/L。

常规细胞遗传学（conventional cytogenetics， CC）分析

取骨髓5 ml肝素抗凝，有核细胞计数后按(1-2)×106/ml进行直接法和（或）短期培养法制备染色体并采用R显带技术进行核型分析。染色体核型按照《人类细胞遗传学国际命名体制（ISCN 2005）》描述。

间期FISH检测t(11;14)

探针来源 间期FISH探针购自美国Vysis公司。该探针是分别用荧光素SpectrumGreenTM标记的IgH和用SpectrumOrangeTM标记的CCND1探针的混合物。

方法 参照文献步骤［2］。

结果分析 应用Leica DMRA2型荧光显微镜在DAPI/FITC/TexasRed三色滤光镜激发下观察间期细胞荧光杂交信号：无t(11;14)(q13;q32)异常的间期细胞核内出现两个红色信号和两个绿色信号（2R2G）。有t(11;14)(q13;q32)异常的间期细胞核内出现绿色和红色相互靠近或叠加产生的黄色融合信号（F）。每个病例计数200个间期细胞。

MFISH分析

探针来源 MFISH探针购自美国Vysis公司。此探针是经流式细胞仪分选、显微切割后经DOPPCR扩增的全染色体涂抹探针，应用5种荧光素的不同组合经缺口平移法标记，5种荧光素包括SpectrumGoldTM、SpectrumFRedTM、SpectrumAquaTM、SpectrumRedTM和SpectrumGreenTM。

步骤 标本处理、图像采集及分析方法参照文献步骤［3］。

FCM免疫表型分析

取肝素抗凝的新鲜（6小时内）抽取的骨髓，调整细胞数至（0.5-1.0）×106/ml，取100 μl经直接免疫荧光标记法标记，避光15分钟后上溶血剂溶解红细胞。流式细胞仪（BeckmanCoulter公司产品，Epics XL型，USA，488nm激发波长，采用Expo32 ADC分析软件）检测至少10 000个细胞，FS/SS双参数设门，分析淋巴细胞群不同抗原的表达情况，膜单克隆抗体包括有CD5、CD19、CD20、CD23（购自法国Immunotech公司）。结果判断以抗原表达≥20％为阳性。

结

果

FCM检测结果

原幼淋巴细胞占39.9%，其表达为CD19+ 90%，二次设门（CD19+细胞表达）CD5+ 89.5%，CD20+ 100%，CD23-。

CC检查结果

92，XXYY，7q+×2，9q+×2，t(11;14)×2，13q+×2，15q+×2［2］/46，XY［8］。

间期FISH检查结果

t(11;14)阳性细胞占24%，其中3R3G3F 16%，4R3G2F 4%，2R2G3F 4%（图1）。

Figure 1. t (11; 14) positive cells shown by FISH.

MFISH检查结果

综合上述FCM、CC、IFISH和MFISH结果，结合外院淋巴结免疫组织化学CCND1+、CD43+、CD10-，诊断此患者为MCL（IV期A组）。于2006年5月初开始HyperCVAD A方案（环磷酰胺、长春新碱、阿霉素、地塞米松）及B方案（阿糖胞苷和甲氨蝶呤）交替化疗，每周期2次腰穿鞘注甲氨蝶呤、阿糖胞苷和地塞米松治疗，共计进行4疗程化疗。5月26日复查骨髓：原幼淋占0.8%。FCM未见微小病灶残留（minimal residual disease， MRD）。FISH 结果：t(11;14)阳性细胞：0/200。2006年8月复查CT显示：左腋窝淋巴结、纵隔淋巴结、腹膜后淋巴结均明显缩小，脾脏亦有所缩小，但仍超过正常大小，肺部病灶明显吸收。

讨

论

MCL因其独特的细胞来源、病理形态、免疫表型和分子生物学特征而成为WHO NHL分类中独立的一种类型。MCL起源于滤泡套内层中未受抗原刺激的CD5+CD23-周围性B细胞，拥有B细胞的免疫标记： CD19+、CD20+、CD22+、CD43+、CD79α+、sIgM+，并过度表达CD5+、FMC7+、Bcl2+，但CD3-、CD10-、CD23-、Bcl6-，CD5+有助于MCL与FL区别。CCND1+几乎存在于每例MCL中，而在慢性淋巴细胞白血病/小淋巴细胞淋巴瘤（chronic lymphocytic leukemia/small lymphocytic lymphoma，CLL/SLL）及其它NHL很少见［5］。通过遗传学和免疫学方法检测t(11;14)(q13;q32)和CCND1表达可作为区别MCL和其他小B细胞性淋巴瘤的重要手段［6］。

在MCL、FL、CLL/SLL和边缘区B细胞淋巴瘤等小B细胞淋巴瘤中，组织病理学形态有时有重叠，而套细胞淋巴瘤对治疗反应性差，5年生存率仅为11%［7］，因此必须与其他小B细胞淋巴瘤作鉴别。有时MCL的结节性病灶极类似于FL的肿瘤性滤泡，单从形态上很难鉴别，因此鉴别两者需把组织学、免疫组织化学和分子遗传学综合考虑。由于免疫组织化学检测易受到多种技术性与人为因素以及抗体特异性与敏感性不足的影响，因此其结果始终是HE组织学改变的辅助与补充，不能脱离组织学改变去评价免疫组织化学检测结果，我们认为免疫组织化学结果与组织学特点相一致才可以肯定。尤其是淋巴瘤的诊断，最基本的是确切、充分的组织学依据，免疫组织化学检测只能作为分型与鉴别诊断的辅助手段。此病例虽然免疫组织化学检测结果CCN1+，但先后两次CD5结果不一致，而淋巴结病理形态与FL高度符合，鉴于上述原因，三家医院病理科诊断为FL。先后以MACOP方案1次及FND方案8次化疗，均无明显疗效，病情进展，转至我院后FCM显示CD5+、CD19+、CD20+、CD23-、CC、间期FISH和MFISH检测均有t(11;14)异常，尽管病理学诊断为FL，但结合病史特点以及免疫表型特征和分遗传学结果确诊为MCL。

t(11;14)易位导致了CCND1的表达异常。Monteil等［8］在1996年首次采用间期FISH检测MCL中t(11;14)(q13;q32)。现FISH已经作为国外日常病理辅助诊断MCL的首选方法［9］。PCR只能检测出11q13上主要易位簇（major translocation cluster， MTC）内有限区域上（大约几百个bp）的断裂点，落在距离主要易位簇以外大约100 kb的次要易位簇（minor translocation cluster， mTC）内的断裂点，由于PCR技术上的局限性而不能完整的扩增出如此长的片段。FISH敏感性高的原因是其所用的CCND1探针杂交的目的片段包括了11q13上MTC、CCND1等大约350 kb大小的区域，明显提高了易位检出率［10］。本研究中，骨髓细胞采用FISH检测到t(11;14)(q13;q32)。

间期FISH只能用特异性的探针检测已知的染色体异常，且通常一次杂交只能检测一种至数种染色体异常。MFISH不仅可以确定CC发现的核型异常，包括染色体易位、大片段缺失、不明来源的额外物质的增加、衍生染色体和标记染色体，而且还可以发现CC分析未发现的异常，纠正CC分析中的错误，对检测未知核型异常很有帮助。本例患者CC与MFISH检查示近四倍体，染色体条数稍有差别可能和不同的分裂像有关，CC仅见t(11;14)伴7q+，9q+，13q+，15q+，而MFISH发现了6、7、9、13、14、22号衍生染色体，t(7;9)，t(9;15)，t(3;13)，t(11;14)，t(4;22)易位及11号染色体片段缺失等多种染色体异常，11号染色体片段缺失可能与易位的14号片段丢失或其片段很小有关。

近来人们利用比较基因组杂交（comparative genomic hybridization，CGH）技术显示MCL的基因突变。deLeenw等［11］用基因芯片技术分析8例MCL细胞系（G519、HBL2、NCEB1、Rec1、SP49、UPN1、Z138C和JVM2），结果发现平均每个细胞有35种基因改变，其中14种为基因缺失、21种为基因扩增，18q21/Bcl2和13q31/GPC5异常扩增和9p21缺失多见，重要的是发现了位于2p11和22q11上的免疫球蛋白轻链基因等新的位点的缺失，这些新位点的变化对研究MCL很有意义。Jarosova等［12］利用CGH分析30例确诊的MCL，80%的患者有不稳定的异常染色体变化。常见的缺失有1p、8p、9q、11q、13q和17p，约1/4的病例3号染色体有附加异常。

Ott等［13］用FISH及CC方法研究发现，大约30％的MCL可检测到染色体四倍体克隆，且在母细胞样型MCL出现率明显增高（80％）。由于四倍体染色体异常在其它B细胞NHL现象少见，可作为MCL遗传学特征之一。本研究结果提示，对少见复杂表现的小细胞淋巴瘤可以先借助组织学和免疫组织化学染色来诊断大部分的病例。不能鉴别时，采用FCM检测、间期FISH、MFISH等方法尤为重要。

Khouri等［14］报道45例MCL患者予HyperCVAD方案化疗4周期化疗后总体有效率93.5％，其中完全缓解(CR) 38％，部分缓解(PR)55.5％。所有随后进行移植的患者均达CR。25例初治的患者3年总体生存率(OS)和无事件生存率(EFS)分别为92％和72％，而曾经接受过治疗的患者其OS和EFS则分别为25％和17％。与经典的CHOP类似方案相比， HyperCVAD方案的3年EFS及OS亦显著增高。认为HyperCVAD方案后进行干细胞移植是治疗初诊MCL患者的有效方案。而Hagemeister［15］认为在年龄小于65岁的患者中，美罗华联合HyperCVAD方案与HyperCVAD后进行干细胞移植在治疗有效率、疾病无复发以及总体生存率方面类似。本例患者初诊时误诊为FL，外院采用MACOP及FND方案化疗，疗效不佳，且病情进展，侵犯骨髓，我们应用HyperCVAD方案取得了较好的近期疗效，目前患者仍在随访中。

参考文献

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3李建勇，潘金兰，薛永权等. 间期荧光原位杂交检测骨髓增生异常综合征8 号染色体三体. 中华血液学杂志，2000;21:179-181

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5Decaudin D. Mantle cell lymphoma: a biological and therapeutic paradigm. Leuk Lymphoma， 2002;43:773-781

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10Aguilera NS， Bijwaard KE， Duncan B， et al. Differential expression of cyclin D1 in mantle cell lymphoma and other nonHodgkin's lymphomas. Am J Pathol， 1998;153:1969-1976

11deLeeuw RJ， Davies JJ， Rosenwald A， et al. Comprehensive whole genome array CGH profiling of mantle cell lymphoma model genomes. Hum Mol Genet， 2004;13:1827-1837

12Jarosova M， Papajik T， Holzerova M， et al. High incidence of unbalanced chromosomal changes in mantle cell lymphoma detected by comparative genomic hybridization. Leuk Lymphoma， 2004;45:1835-1846

13Ott G， Kalla J， Ott MM， et al. Blastoid variants of mantle cell lymphoma: frequent bcl1 rearrangements at the major translocation cluster region and tetraploid chromosome clones. Blood， 1997;89:1421-1429

14Khouri IF， Romaguera J， Kantarjian H， et al. HyperCVAD and highdose methotrexate/cytarabine followed by stemcell transplantation: an active regimen for aggressive mantlecell lymphoma. J Clin Oncol， 1998;16:3803-3809

免疫组织化学技术范文6

[关键词]整合素α2；细胞凋亡；集合管；肾发育；小鼠

[中图分类号]R692

[文献标志码]A

[文章编号]2095-0616（2016）23-38-03

整合素（integrin）是细胞粘附分子的一种，在肾脏有20余种整合素的表达。整合素α2是一种表达在肾小管和集合管上皮细胞中的整合素，对肾小管上皮细胞的分化及细胞与细胞外基质的粘附起一定的作用。细胞凋亡也称作程序性细胞死亡，是特殊的细胞死亡过程，由基因调控，发生机制十分复杂。发育生物学相关研究证实肾脏等机体器官的发生发育过程中包含着细胞凋亡，且有着较为严格的时空顺序。研究发现整合素α2能够促使肿瘤细胞表达凋亡相关蛋白，整合素相关的钙离子的内流，磷酸化的发生等与细胞凋亡的激发有密切的关系。目前，关于肾发育过程中细胞凋亡与整合素时空性表达的关系尚未见报道。本研究通过免疫组织化学、细胞灰度值测量、TUNEL染色和细胞凋亡指数测定观察分析整合素α2在小鼠肾脏集合管发育过程中的表达变化和细胞凋亡情况，探讨在肾集合管发育过程中整合素α2和细胞凋亡的作用及相互关系。

1.资料和方法

1.1一般资料

2015年6月～2016年6月期间由锦州医科大学生命科学研究院动物部提供健康的昆明小鼠，2月龄，雌雄各半，体重25～30g。小鼠雌雄1：1同窝饲养，以观察阴道栓脱落的方式确定雌鼠受孕时间，将阴道栓脱落的最早时间记为胚龄（embryonicdays，E）0d。以观察到仔鼠出生的最早时间记为生后（postnatal days，P）0d。选取胚龄17、18d的胎鼠和生后1、3、7、14、21、40d的仔鼠，每组5只。兔抗小鼠整合素α2抗体购自Abcam公司，sP免疫组化试剂盒购自福建迈新公司，TUNEL试剂盒购自Sigma公司。

1.2方法

1.2.1标本制备10%水合氯醛（100g/L）麻醉孕鼠，剖腹取胎鼠，胚龄17、18d的胎鼠后壁剖开取全肾，生后1、3、7、14、21、40d的仔鼠取出肾脏后切成小块固定。肾脏标本放入4%多聚甲醛中固定，梯度酒精脱水，二甲苯透明，石蜡定向包埋，切5um厚度的切片，用于免疫组织化学染色和TUNEL染色。

1.2.2免疫组织化学染色及灰度值测量石蜡切片常规免疫组织化学染色检测整合素α2在不同发育阶段小鼠肾组织集合管中的表达变化，阳性反应产物呈棕黄色。用细胞图像分析系统对阳性反应切片进行图像分析，以灰度值来表示整合素α2蛋白的表达量，灰度值越大表示整合素α2的含量越少，染色越浅。以切片背景色为参照，对集合管进行分析。每个日龄动物选取5个组织块，每个组织块选取5张切片，每张切片系统随机取5个阳性视野，在400倍光镜下分析。

1.2.3TUNEL染色及细胞凋亡指数检测石蜡切片脱蜡至水，滴加蛋白酶K室温孵育15min，滴加TUNEL混合溶液37℃孵育1h，冲洗，滴加转化剂-POD 37°C孵育30min，冲洗，DAB显色，镜下观察，随时终止。苏木精染色细胞核5min，脱水透明，树胶封片。TUNEL阳性染色定位于细胞核内，呈不同程度棕黄色。每一日龄小鼠肾脏标本取5张切片，每张切片随机选取5个集合管，在细胞图像分析仪上记数TUNEL阳性细胞数量和集合管总细胞数，计算凋亡指数AIfApoptosis Index，AI=TUNEL阳性细胞数/细胞总数。

1.3统计学处理

统计分析用SPSSl9.0软件完成，计量资料以（x±s）表示，采用t检验，计数资料以百分比表示，采用X2检验，P

2.结果

2.1免疫组化染色灰度值测量结果

对整合素α2免疫组织化学染色阳性切片进行灰度值测量，经过统计分析得到结果如下：胚龄17d，小鼠肾脏中出现集合管，此时可见整合素α2微弱表达，灰度值较强，随后，在胚龄18d以及生后1、3、7d的集合管中，整合素α2的表达强度逐渐增强，灰度值逐渐减小。生后7d，整合素α2的表达达到顶峰后，表达量趋于稳定。见表1。

2.2TUNEL染色及细胞凋亡指数检测结果

TUNEL染色阳性的细胞为凋亡细胞，计数小鼠肾集合管中凋亡细胞和总细胞数，统计凋亡指数。生后1d，集合管细胞开始出现凋亡现象，细胞凋亡指数为（33.46±3.59）%，生后7d凋亡达到高峰，凋

3.讨论