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化学发光法的基本原理范文1
【关键词】 流动注射分析；水质监测；应用
1 流动注射分析法概况
流动注射分析技术（Flow Injection Analysis，FIA）是由丹麦技术大学的RUZICKA和HANSEN于1974年提出的。FIA是在物理不平衡以及化学不平衡条件下，进行动态分析测量的一种微分析技术。该技术的突出特点在于其精度高、分析速度较快、适用范围广、节省试剂和试样、设备比较简单、操作简便、容易实现在线监测。该法是实现溶液的自动化分析的有效手段，很多的科研工作者也在不断地推动FIA法作为标准分析方法。
2 FIA的基本工作原理
FIA是把一定体积的液体试样间歇性地注入到一个密闭的、运动着的、由适当液体（水及反应剂）组成的连续载液之中，利用载流液体井试样推入反应管道中，试样以一定的流速度在反应管道中向前运动，依靠对流作用和扩散作用将试样分散成为具有一定浓度梯度的试样带。在流动过程中，试样带与载流中的某些化学组成发生反应，生成可以被检测的物质，载流液体将这些物质带入到检测器中并进行检测，同时记录仪将连续地记录下检测器的响应，从而进行定量分析。
在使用FIA分析的过程中，所有的试样都要通过分析通道，并按顺序以完全相同的方式进行分析处理，在这个过程中，每一种试样的变化都完全相同。FIA化学反应实际上是试样在试剂中的分散，这个过程是在形成试样带浓度梯度的同时发生的。FIA的采样和进样都是周期性严格重复的。
3 FIA在水质检测中的应用
3.1 FIA分光光度法 最早与FIA法联用的是分光光度法，两者结合形成了FIA分光光度法。该方法有效地提高了分光光度法的检测能力以及分析效率，在气体扩散、溶剂萃取、膜渗析、离子交换以及停流技术等方面都取得了明显效果。该法所使用的仪器设备较为简单，价格低廉，操作简单方便，能够与信号处理系统很好地连接在一起，使用范围较广。赵云利用该法测定了废水中挥发酚，测定结果较精确，且测定较迅速。FIA分光光度法采用N2将药品间隔开，可以有效地防止各段样品之间的混合，从而保证各段试样到达理化平衡的时间均等，降低了样品预处理和分析的难度，较大程度地提高了水质监测准确度和精密度。
3.2 FIA电化学法 电化学分析法是仪器分析法的重要组成部分，主要是以电位、电导、电流以及电量等参数与试样的组成成分及浓度之间的关系作为计量基础进行检测。FIA和电化学法的联合使用大大提高了电化学分析法的检测灵敏度，并实现了水质检测技术的在线监测。FIA电化学法操作简单、选择性及重现性较好，实验仪器比较简单，价格低廉，电极寿命较长，使用范围较广，可用于检测水质中的Pb+及Ca2+等。
3.3 FIA化学发光法 化学发光（CL）法主要通过测量物质在化学反应过程中产生的光强度来对试样进行定量分析，其分析过程不需要任何的光源，灵敏度高，但持续时间较短，随着时间的推移，其发光强度的变化较大。通过与FIA的联合使用，精确度、灵敏度以及线性范围都较常规的化学发光法有了较大的改善，是目前应用较广的痕量分析法。该方法的仪器设备较为简单，操作简便，适用于井水、河水以及自来水中痕量铁的测定。
3.4 FIA原子吸收法 FIA与原子吸收法（AAS）的联合使用可以大大减低试剂的用量，并且在进样前对样品进行预处理，可有效地提高测量方法的灵敏度和选择性，应用较为广泛。FIA-AAS法不仅可以检测多种元素，还实现了对试样的自动化分析及形态分析。图2为利用FIA-AAS测定金属离子的单FIA流路系统示意图。
4 FIA的发展趋势
FIA技术的使用范围较广、灵敏度高、测定快速且结果准确，通过与多种检测方法联合使用可大大提高其灵敏度和准确度。随着FIA与化学计量学以及计算机在线测控技术等的结合，FIA正向着简单化、微型化及智能化的方向发展。未来的FIA将成为常规的分析测试手段，并将广泛运用到实验室以及工业生产中，从而更好地为生产和科研服务。
化学发光法的基本原理范文2
关键词：石化产品 痕量硫化物 测定 分析
石化产品中残留过量的硫，除了对炼油设备、运输设备造成腐蚀外，还会加速油品质变质，且燃烧后造成的二氧化硫会严重污染大气环境。由此可见，强化石化产品中硫含量的控制，对其今后的使用有着极其重要的作用。就此，本文从石油产品中痕量硫化物含量测定原理、石油产品中痕量硫化物含量测定方法及石油产品中痕量硫测定方法的选择等三个方面出发进行分析。
一.石油产品中痕量硫化物含量测定原理
作为石化产品中严格控制的指标之一，硫含量的测定、分析发挥着不可替代的作用。在痕量硫测定中，所测定的对象由原油与成品油、硫回收过程气体及工业炉烟、大气等三个方面组成。
在当前石化产品的生产制造中，硫含量作为衡量原油及其产品质量的重要指标之一，是整个石化产品分析内容的重要组成部分。受原油来源及加工方式的影响，其含有的硫可以是元素硫、硫化氢、硫醇类、硫醚类、二硫化物及其同系物等。硫在油品中的存在，一方面会对炼油装置及油品运输设备产生腐蚀，影响油品的安定性，另一方面炼厂及石化装置排放气中的硫化氢、燃气机及锅炉排放的二氧化硫可污染大气，造成中毒事故。但在某些状况下，硫的存在也有着一定优势，如在改善油的性质中，需要加入适量的非活性含硫化合物，这些都对实话产品中硫含量的测定有着严格的要求。
二.石油产品中痕量硫化物含量测定方法
（一）库仑滴定测定法
库仑滴定法也叫库化法，常用语轻质石油产品、原油及渣油中的总硫分析，其测量范围约在百分之几道千万分之几。在其使用中，国内的库伦仪研制及生产已经具备相当高的水平，再加上成本低廉，在很大程度上取代了以往的管式炉法与灯法，成为当前国内石化产品硫含量分析的主要方法。
库仑滴定的基本原理为将油品中的含硫化合物，在高温含氧气流中转变成二氧化硫，并在气流的引导下进入滴定池中，通过滴定池含有K1电解液生成三碘离子与进入滴定池的二氧化硫等当量反应，生成三氧化硫和1-，通过计算产生三碘离子所消耗的电量，便可计算样品中的硫含量。
（二）XRF——X射线荧光法
XRF测定法在使用中，能够对多种油品中的硫、镁等轻元素及铁、钴、镍、铀等重元素进行测定，同时也适用于液体、固体、泥浆及粉末等样品测定。XRF作为一种非接触的无损测量方法，在适用中可以对样品进行直接测量，且测量过后的试样不会发生变化，测量误差比较小。
XRF法在近几年的适用中，凭借其操作简单、成本低廉已成为石化生产中常见的油品元素分析方法。XRF检测原理：用X射线源照射试盘内放好的试样，使用检测元件来感测这些X射线的强度，通过X射线的强度来识别硫元素，信号越强，则硫含量越多，信号越弱，则硫含量越少。
（三）醋酸铅法
醋酸铅硫分析法最初常用于大气H2S含量的检测，约在80年代，测量液态碳氢化合物的在线总硫量系统才得以推出使用。在当前使用的在线总硫量系统中，仍以Houston Atlas 公司生产的VII型总硫分析仪为主，且该分析仪除了具备独特灵活的微处理体统外，在测量过程中不受外界环境的影响。VII型总硫分析仪在对气体硫含量进行测量时，其最小量程为0——1μL/L，其检测原理为：将大量的H2与检测样品混合，在经过一台加氢反应器后，H2与样品会在高温条件下发生还原反应，并生成H2S，接着H2S与醋酸铅接触发生如下反应：
在经过一段时间的反应后，白色的带子上会留下棕黑色的硫化铅，测定人员这时应使用电光二极管及LED光源，通过极其灵敏的光线来测量颜色变化的速率，进而测得H2S的具体含量。但在实际使用中，针对高芳烃含量样品的硫含量测量，测量人员可以使用氧化还原的方法对硫含量进行还原，即通过氧化还原的方式，先将样品中的硫氧化为二氧化硫或三氧化硫，接着将其还原为H2S，最后通过醋酸铅进行含量检测。
（四）其他检测方法
在上述的三种检测方法中，醋酸铅检测方法常用语也太是有产品中硫含量的分析检测，但从其实质来讲，其更适用于检测气体硫含量，且成为检测气体硫含量的标准方法之一；X射线荧光法常用于液态石油产品中硫含量的测定，然而在使用过错中容易受自身低灵敏度的影响，检测结果存在较大误差；火焰光度计与气相色谱技术结合也可以精确地在线测量硫含量，但由于光度计的非当量化响应和对碳氢化合物影响的敏感度，只能做单一含硫化合物组分的分析，难以做总硫分析，因而其应用受到限制。
随着近几年科学技术的迅速发展，我国科研人员研制出了化学发光法总硫检测仪，并将其应用到在线自动检测液态样品中硫化合物的含量检测中。该检测技术在做气相单一硫化物含量分析时就已经证明其精度在很大程度上虞色谱技术不分上下，且该技术经过改造后，在原有的基础上增加了一个整体式加热喷射阀，这样便能将液态样品直接喷入检测器，在实现所有含硫化合物检测的同时，还能直接得出产品中的总含硫量。
三.石油产品中痕量硫测定方法的选择
就石化产品来讲，其种类十分众多，除了包括燃料产品及液化产品外，还包括一些剂产品等化工原料，针对这些不同种类的石油产品，在检测其硫含量时，所用的测定方法也不相同。再加上石油产品中含硫量的不同，又可将石化产品分为高硫石油产品、低硫石油产品及痕量硫石油产品三个种类，再加上不同石油产品含硫量测定方法对硫的检出限有所不同，因而在很大程度上，不同的含硫量石油产品在检测中会出现与之相符的差异性。此外，在痕量硫测定方法的选择上，还应将检测的工作效率及测试成本充分的考虑进去，在保证检测结果准确无误的同时，还能将成本降到最低。
在对石化产品痕量硫化物进行测定时，需要结合着石油产品的实际状况选择与之相对的检测方式，这就要求测定人员在开展工作时：首先，结合着所选样品的实际状况，准确掌握其基本性质，结合着样品所产生的工艺分析，对硫分的形态及含量范围进行确定；其次结合着石油产品硫含量的测定目的、结果集用途，选择适用范围内更为经济、高效、准确的测试方式。最后，在测量中，应将误差控制在一定范围内，确保测量结果的准确性与高效性。
总 结：
综上所述，石化产品在我国社会发展中有着极其重要的作用，科学、准确的对测定石化产品痕量硫化物的含量，在实现石化产品最大经济效益的同时，还能大大降低其对环境造成的污染程度，符合社会的环保需求。
参考文献：
[1]刘旺娟，赵改萍.轻质石油产品中的微量总硫含量测定方法研究[J].广州化工.2006（04）
[2]赵贵喜，张翠兰，薛慧峰，贠海洲.石油化工产品中痕量硫含量测定方法[J].甘肃科技.2005（12）
[3]杨慧娟，梁景程，张岩，赵萍.有机气体中痕量硫的测定[A].中国化工学会2008年石油化工学术年会暨北京化工研究院建院50周年学术报告会论文集[C].2008
化学发光法的基本原理范文3
【关键词】HIV病毒；分子生物学检测；进展
艾滋病病毒（HIV）主要侵袭人体免疫系统，导致人体免疫缺陷发生多种感染疾病或肿瘤。艾滋病的不可治愈及其快速传播使患者不断增多，2012年全球感染总人数已达3900万人，中国近半艾滋病病毒感染者尚未发现，为了防止艾滋病的大规模流行，艾滋病的检测工作越发重要。目前筛查的免疫学方法，由于灵敏度低，漏检窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸检测为代表的分子生物学技术，灵敏度和特异性均显著提高，明显缩短检出病原体的窗口期，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向，对遏制艾滋病的传播蔓延有重要意义。
1 HIV生物学特性
HIV呈圆形或椭圆形，直径900～140nm，外层为类脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成，基因组除了具有逆转录病毒的基本结构——基因长末端重复序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，还有非常复杂的调控机制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV基因组中存在3个gag-pol- env.Gag基因编码的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上，P17位于白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。核衣壳包被于内部核酸的，由主要的P24和P40及P55组成，其结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。Env编码包膜蛋白即gp120和gp41，起协助HIV进入宿主细胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关[1]。
根据env基因V3段碱基排列的不同，HIV-1分为11个亚型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亚型，HIV-2分为6个亚型[2]，不同国家和地区有相对优势亚型，HIV亚型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研制上有着重要意义。
2 HIV-1的感染机制及感染标志
病毒侵入人体后，通过病毒表面gpl20在化学因子CCR5或CXCR4帮助下与细胞表面受体CD4分子结合，然后在gp41的协助下HIV的膜与CD4+细胞的细胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA进入胞浆。两条RNA+在逆转录酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下复制DNA，此DNA部分存留在胞浆内产生系列变化，然后在细胞膜上装配成新病毒，再感染其它细胞。HIV感染后，首先能够监测到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗体[3]。
3 分子生物学检测技术
随着分子生物学检测技术快速发展，HIV RNA或DNA检测得到应用，核酸检测已是艾滋病实验室诊断的主要发展方向[4]，在HIV感染的监测、诊断、研究、疗效观察及预后判断等方面均发挥着越来越大的作用，主要有定性和定量两类。
3.2 定性检测
3.2.1 原位杂交（insite hydzmion）
应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸，起初标记探针是放射性标记，后来逐渐发展为酶标记或化学发光标记等等。原位杂交的阳性率比聚合酶链反应（PCR）略低，随着核酸扩增技术的出现并广泛使用，基因探针技术也就逐渐失去应用意义。
3.2.2 聚合酶链反应技术（PCR）
PCR是一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。患者感染HIV 1～14d后血浆中能检测出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗体检测不确定等情况的辅助诊断或用于血液筛查，尤其在HIV阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV的诊断中有着非常重要的意义，前病毒DNA PCR检测法对出生48h内的婴儿检测敏感性为38%，出生14d的婴儿检测敏感性达93%[5]。
3.2.3 逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）
RT-PCR技术通过对RNA逆转录酶的应用实现，即将病毒RNA逆转录DNA，接着进行PCR，指数扩增DN段，将放大产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。RT-PCR技术可在2h内扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，准确定量的RT-PCR方法已被许多商业实验室证实，目前多种改良的快速RT-PCR检测方法应用于HIV的快速临床诊断[6，7]。
PCR灵敏度高、特异性强、操作简便，但易污染出现假阳性结果；此外，HIV基因的多样性，尚无一套引物能够覆盖所有的HIV序列，限制了检测敏感性，因此，阳性结果还须核酸序列测定加以确认。HIV核酸定性检测阳性结果可作为HIV 抗体窗口期的早期诊断的辅助指标，但不能单独用于HIV感染的确诊，成为限制PCR对于HIV感染诊断的临床应用。
3.3 定量检测
HIV核酸定量检测即病毒载量测定，感染HIV后病情发展速度直接与血浆中病毒载量呈正比。在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸，使窗口期缩短6～11.5d，且慢性潜伏期也能检出，便于早期辅助诊断；HIV病毒载量常用于用于评估疾病病程、监测抗病毒治疗成效、选择抗病毒治疗方案；还可用于鉴定出生后18个月内的婴儿血液中的HIV-IgG抗体是否来自于母体，婴儿是否感染HIV（母婴诊断）。当前，常用的定量检测方法有较高的敏感性、特异性和可重复性。
3.3.1 分支DNA信号扩大系统（bDNA）
bDNA是指人工合成带有侧链的DN段标记被激发的标记物，利用发光强度与样品中HIV RNA含量成比例，可通过发光强度来定量检测血浆中HIV-1型RNA的一种方法。bDNA作为一种定量核酸检测方法具有对检测靶序列变异的更强识别能力，目前发展到灵敏度更好的、具有靶序列放大系统的第三代bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针，不仅可用于检测HIV感染，可以方便地检测HIV的部分变异株，且可用于疗效观察，文献报道其为一种高灵敏度及特异性的方法[8，9]。与PCR相比bDNA不存在扩增物的交叉污染，但灵敏度不如PCR，提高bDNA的灵敏度仍是难点[10]。
3.3.2 核酸序列依赖的扩增系统（NASBA）
NASBA是以RT-PCR为基础，由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆转录酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。NASBA无需热循环装置，只在一个温度下进行（42℃），即可扩增大量拷贝的RN段。对不同条件的实验室可以一次扩增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血浆样品，适合冻存血浆的回顾性分析。其高效扩增的特性，能与多孔板酶介导的显像技术及实时荧光检测结合。因扩增产物的不稳定性特征，对传染病病原的定性、定量检测，减少了分子诊断实验室扩增产物的交叉污染。但操作较繁琐，不便于大批量处理，且扩增时退火温度较低，容易引起污染，当前，NASBA已应用于HIV-1的分子诊断[10]。
3.3.3 转录介导的扩增系统（TMA）
TMA技术原理与NASBA大致相同，差别是TMA利用MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性，反应温度为41.5℃，1h内RNA模板扩增约109倍。相比p24抗原检测，TMA技术可缩短窗口期6 d，比HIV抗体检测缩短14 d [11]。
3.3.4 连接酶酶促链式反应 （LCR）
LCR法是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，原理是由两段数l0个核苷酸组成的单链DNA探针与目标序列杂交，将被检测物中的特异性片段进行扩增，检测扩增产物。LCR既可扩增，又可检测DNA突变，对已知突变类型的基因诊断是一个切实有效可行的方法，是随PCR后一种较有发展前景的体外扩增新技术。
3.3.5 实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术的应用使HIV核酸检测技术又进入到一个新境界。原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。一般使用TaqMan探针或Sybr Green荧光染料。但Sybr Green染料不能区别目的产物和非目的产物，使结果有偏差，目前广泛使用的是TaqMan探针技术。荧光实时PCR则可以进行实时检测，改变了传统的电泳终点检测，得到相应的S型扩增曲线，其不但可以进行定性检测，更重要的是可以进行定量检测。与常规相比，具有特异性强、自动化程度高、有效解决污染问题等特点，能够检测血浆中的病毒载量及血液中单个核细胞的前病毒载量。美国PE公司1996年发明TaqMan技术[12]，已广泛应用于基因检测， 国内2002年4月深圳匹基公司获批准第一个生产HIV荧光PCR检测试剂盒，并应用于临床诊断，国产实时荧光RT-PCR试剂检测HIV-1血浆病毒载量与进口试剂相比具有较好的相关性[13]，并具有价格低廉的优势，已在临床逐步推广应用。
3.3.6 PCR-ELISA
PCR-ELISA技术是PCR扩增以后，在微孔板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。该技术是一种具有很高灵敏度和特异性的方法[14]，但ELISA是一个开放性的反应，扩增后进行ELISA反应，容易产生污染引起假阳性，同时操作过程较繁琐，临床上难以广泛应用。
3.3.7 基因芯片技术
是PCR技术与核酸分子杂交相结合，通过对HIV基因组分析，将该病毒的高度保守序列作为鉴定指标，可直接对病毒病原体进行检测，显著提高了诊断的准确性。1996年，Kozal等[15]研制出一种DNA芯片，对HIV-1逆转录酶及蛋白酶的基因突变进行筛选，并跟踪监测HIV拮抗药物的产生和突变、疾病相关基因型以及患者在治疗中的反应。1998年，Hauser等[16]应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测HIV，对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生产的新一代诊断试剂盒，利用RMS实验室的PCR扩增技术和DNA芯片技术结合检测艾滋病患者的HIV耐药反应。HIV PRT440也已广泛用于HIV-l病毒的测序、分型及多态性分析[17] 。基因表达谱研究可以高通量在检测基因表达信息[18]。国内也有文献报道采用基因芯片检测HIV[19，20] 。由此可见，基因芯片在鉴定HIV感染中具有其他方法无可比拟的优越性。
尽管基因芯片技术需要进一步的不断完善，但完全可以预计在不久的将来其应用前景会锦上添花。不单限于HIV的耐药性检测和基因诊断，可以让许多感染性疾病病原体的基因集中在一张芯片上，同时对其进行感染诊断。
总之，分子生物学检测技术有助于HIV感染者的早发现、早诊断、早治疗，也有助于对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程，减少艾滋病对个人、家庭及社会的危害。随着HIV分子生物学技术在高特异性、高敏感性、快速、自动化等方面的不断进步，HIV分子诊断可望成为艾滋病诊断标准之一，并通过对HIV突变及个体遗传差异的检测指导抗病毒治疗，为人类遏止艾滋病的流行发挥重要的作用。
参考文献：
[1] 杨绍基，任红.传染病学[M].第7版.北京：人民卫生出版社，2008：113.
[2] 倪语星，尚红.临床微生物学检验[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2012：112-116.
[3] Constantine NT，Zink H.HIV testing technologies after two decades of evolution[J].Indian J Med Res，2005，121（4）：519-538.
[4] 陈勤.HIV-1感染机体的分子生物学基础[J].现代医学，2004，4：7-9.
[5] 沈霞.艾滋病的实验室诊断[J].中华检验医学杂志，2003，26：327-328.
[6] 普冬，赵勤，汪亚玲，等. 巢式PCR方法检测艾滋病毒载量结果评估[J].实用临床医学，2008，9（12）：25-26.
[7] Stevens W，Horsfield P，Scott LE.Evaluation of the performance of the automated NucliSENS easyMAG and Easy Q systems versus the Roche.Am PliPrep-AMPLICOR combination forhigh-throughput monitoring of human immunodeficiency virus load[J].J Clin Microbiol，2007，45：1244-1249.
[8] 张淑琼，吕 浩，穆剑强，等.bDNA与RT-PCR方法检测艾滋病患者病
艾滋病病毒（HIV）主要侵袭人体免疫系统，导致人体免疫缺陷发生多种感染疾病或肿瘤。艾滋病的不可治愈及其快速传播使患者不断增多，2012年全球感染总人数已达3900万人，中国近半艾滋病病毒感染者尚未发现，为了防止艾滋病的大规模流行，艾滋病的检测工作越发重要。目前筛查的免疫学方法，由于灵敏度低，漏检窗口期和新近感染病毒的感染者，而以核酸检测为代表的分子生物学技术，灵敏度和特异性均显著提高，明显缩短检出病原体的窗口期，是HIV诊断方法和诊断试剂持续发展的主要方向，对遏制艾滋病的传播蔓延有重要意义。
1 HIV生物学特性
HIV呈圆形或椭圆形，直径900～140nm，外层为类脂包膜，成分是外膜糖蛋白（gp120）和跨膜糖蛋白（gp41），核心由RNA逆转录酶、DNA多聚酶和结构蛋白等组成，基因组除了具有逆转录病毒的基本结构——基因长末端重复序列（LTR）、核心蛋白（gag）、聚合蛋白（po1）、包膜蛋白（env）gF，还有非常复杂的调控机制，包括tat、rev、nef、vif、vpr、vpu等调节基因，其作用是在转录、翻译、装配等各个环节对病毒的生长和繁殖起调节作用。HIV基因组中存在3个gag-pol- env.Gag基因编码的核心蛋白均位于病毒的核酸蛋白体上，P17位于白与壳层之间的基质上，包被于包膜蛋白的内部。核衣壳包被于内部核酸的，由主要的P24和P40及P55组成，其结构比较稳定，是HIV-1型的特异性蛋白。Env编码包膜蛋白即gp120和gp41，起协助HIV进入宿主细胞的作用。聚合酶蛋白包括P66、P51和P31，它位于病毒的核区内，并与病毒核酸紧密相关[1]。
根据env基因V3段碱基排列的不同，HIV-1分为11个亚型即A、B、C、D、E、F、G、H、I、J、M和0亚型，HIV-2分为6个亚型[2]，不同国家和地区有相对优势亚型，HIV亚型在流行病学、诊断、临床、试剂选择、药物筛选和疫苗研制上有着重要意义。
2 HIV-1的感染机制及感染标志
病毒侵入人体后，通过病毒表面gpl20在化学因子CCR5或CXCR4帮助下与细胞表面受体CD4分子结合，然后在gp41的协助下HIV的膜与CD4+细胞的细胞膜相融合，病毒核心蛋白及RNA进入胞浆。两条RNA+在逆转录酶作用下成DNA-，在DNA多聚酶的作用下复制DNA，此DNA部分存留在胞浆内产生系列变化，然后在细胞膜上装配成新病毒，再感染其它细胞。HIV感染后，首先能够监测到病毒RNA，其次是p24抗原，最后是抗体[3]。
3 分子生物学检测技术
随着分子生物学检测技术快速发展，HIV RNA或DNA检测得到应用，核酸检测已是艾滋病实验室诊断的主要发展方向[4]，在HIV感染的监测、诊断、研究、疗效观察及预后判断等方面均发挥着越来越大的作用，主要有定性和定量两类。
3.2 定性检测
3.2.1 原位杂交（insite hydzmion）
应用特定的标记探针以分子杂交法直接检测标本中的HIV病毒靶核酸，起初标记探针是放射性标记，后来逐渐发展为酶标记或化学发光标记等等。原位杂交的阳性率比聚合酶链反应（PCR）略低，随着核酸扩增技术的出现并广泛使用，基因探针技术也就逐渐失去应用意义。
3.2.2 聚合酶链反应技术（PCR）
PCR是一种以核酸生物学为基础的分子生物学诊断技术。基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。PCR由变性—退火—延伸三个基本反应步骤构成。患者感染HIV 1～14d后血浆中能检测出HIV RNA，可用于急性感染期患者、抗体检测不确定等情况的辅助诊断或用于血液筛查，尤其在HIV阳性母亲产下的婴儿是否感染HIV的诊断中有着非常重要的意义，前病毒DNA PCR检测法对出生48h内的婴儿检测敏感性为38%，出生14d的婴儿检测敏感性达93%[5]。
3.2.3 逆转录多聚酶链反应技术（RT-PCR）
RT-PCR技术通过对RNA逆转录酶的应用实现，即将病毒RNA逆转录DNA，接着进行PCR，指数扩增DN段，将放大产物变性并与多孔板结合，利用酶联系统进行检测。RT-PCR技术可在2h内扩增产物达到凝胶电泳或实时荧光法可检测的水平，准确定量的RT-PCR方法已被许多商业实验室证实，目前多种改良的快速RT-PCR检测方法应用于HIV的快速临床诊断[6，7]。
PCR灵敏度高、特异性强、操作简便，但易污染出现假阳性结果；此外，HIV基因的多样性，尚无一套引物能够覆盖所有的HIV序列，限制了检测敏感性，因此，阳性结果还须核酸序列测定加以确认。HIV核酸定性检测阳性结果可作为HIV 抗体窗口期的早期诊断的辅助指标，但不能单独用于HIV感染的确诊，成为限制PCR对于HIV感染诊断的临床应用。
3.3 定量检测
HIV核酸定量检测即病毒载量测定，感染HIV后病情发展速度直接与血浆中病毒载量呈正比。在其他血清学和病毒学标志出现前检出病毒核酸，使窗口期缩短6～11.5d，且慢性潜伏期也能检出，便于早期辅助诊断；HIV病毒载量常用于用于评估疾病病程、监测抗病毒治疗成效、选择抗病毒治疗方案；还可用于鉴定出生后18个月内的婴儿血液中的HIV-IgG抗体是否来自于母体，婴儿是否感染HIV（母婴诊断）。当前，常用的定量检测方法有较高的敏感性、特异性和可重复性。
3.3.1 分支DNA信号扩大系统（bDNA）
bDNA是指人工合成带有侧链的DN段标记被激发的标记物，利用发光强度与样品中HIV RNA含量成比例，可通过发光强度来定量检测血浆中HIV-1型RNA的一种方法。bDNA作为一种定量核酸检测方法具有对检测靶序列变异的更强识别能力，目前发展到灵敏度更好的、具有靶序列放大系统的第三代bDNA有数十个覆盖整个基因组的探针，不仅可用于检测HIV感染，可以方便地检测HIV的部分变异株，且可用于疗效观察，文献报道其为一种高灵敏度及特异性的方法[8，9]。与PCR相比bDNA不存在扩增物的交叉污染，但灵敏度不如PCR，提高bDNA的灵敏度仍是难点[10]。
3.3.2 核酸序列依赖的扩增系统（NASBA）
NASBA是以RT-PCR为基础，由一对引物介导的、连续均一的、体外特异性核苷酸序列等温扩增RNA的新技术，原理是提取病毒RNA，加入AMV逆转录酶、核酸酶H（Rnase H）、T7RNA聚合酶和引物进行扩增。NASBA无需热循环装置，只在一个温度下进行（42℃），即可扩增大量拷贝的RN段。对不同条件的实验室可以一次扩增足量的RNA用于多次研究和直接使用肝素抗凝的血浆样品，适合冻存血浆的回顾性分析。其高效扩增的特性，能与多孔板酶介导的显像技术及实时荧光检测结合。因扩增产物的不稳定性特征，对传染病病原的定性、定量检测，减少了分子诊断实验室扩增产物的交叉污染。但操作较繁琐，不便于大批量处理，且扩增时退火温度较低，容易引起污染，当前，NASBA已应用于HIV-1的分子诊断[10]。
3.3.3 转录介导的扩增系统（TMA）
TMA技术原理与NASBA大致相同，差别是TMA利用MMLV逆转录酶及T7 RNA聚合酶两种酶，MMLV逆转录酶既有逆转录酶的活性又具有RNA酶H活性，反应温度为41.5℃，1h内RNA模板扩增约109倍。相比p24抗原检测，TMA技术可缩短窗口期6 d，比HIV抗体检测缩短14 d [11]。
3.3.4 连接酶酶促链式反应 （LCR）
LCR法是基于靶分子依赖的寡核苷酸探针相互连接的一种探针扩增技术，原理是由两段数l0个核苷酸组成的单链DNA探针与目标序列杂交，将被检测物中的特异性片段进行扩增，检测扩增产物。LCR既可扩增，又可检测DNA突变，对已知突变类型的基因诊断是一个切实有效可行的方法，是随PCR后一种较有发展前景的体外扩增新技术。
3.3.5 实时荧光定量PCR技术
实时荧光定量PCR技术的应用使HIV核酸检测技术又进入到一个新境界。原理是在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。一般使用TaqMan探针或Sybr Green荧光染料。但Sybr Green染料不能区别目的产物和非目的产物，使结果有偏差，目前广泛使用的是TaqMan探针技术。荧光实时PCR则可以进行实时检测，改变了传统的电泳终点检测，得到相应的S型扩增曲线，其不但可以进行定性检测，更重要的是可以进行定量检测。与常规相比，具有特异性强、自动化程度高、有效解决污染问题等特点，能够检测血浆中的病毒载量及血液中单个核细胞的前病毒载量。美国PE公司1996年发明TaqMan技术[12]，已广泛应用于基因检测， 国内2002年4月深圳匹基公司获批准第一个生产HIV荧光PCR检测试剂盒，并应用于临床诊断，国产实时荧光RT-PCR试剂检测HIV-1血浆病毒载量与进口试剂相比具有较好的相关性[13]，并具有价格低廉的优势，已在临床逐步推广应用。
3.3.6 PCR-ELISA
PCR-ELISA技术是PCR扩增以后，在微孔板上借用酶联免疫吸附试验（ELISA）的原理，使用酶标抗体，进行固相杂交来实现定量。该技术是一种具有很高灵敏度和特异性的方法[14]，但ELISA是一个开放性的反应，扩增后进行ELISA反应，容易产生污染引起假阳性，同时操作过程较繁琐，临床上难以广泛应用。
3.3.7 基因芯片技术
是PCR技术与核酸分子杂交相结合，通过对HIV基因组分析，将该病毒的高度保守序列作为鉴定指标，可直接对病毒病原体进行检测，显著提高了诊断的准确性。1996年，Kozal等[15]研制出一种DNA芯片，对HIV-1逆转录酶及蛋白酶的基因突变进行筛选，并跟踪监测HIV拮抗药物的产生和突变、疾病相关基因型以及患者在治疗中的反应。1998年，Hauser等[16]应用DNA芯片技术在艾滋病患者出现抗体反应前检测HIV，对艾滋病的早期诊断有十分重要的意义。Affy-nletrix公司和Roche Mo1ecular公司合作生产的新一代诊断试剂盒，利用RMS实验室的PCR扩增技术和DNA芯片技术结合检测艾滋病患者的HIV耐药反应。HIV PRT440也已广泛用于HIV-l病毒的测序、分型及多态性分析[17] 。基因表达谱研究可以高通量在检测基因表达信息[18]。国内也有文献报道采用基因芯片检测HIV[19，20] 。由此可见，基因芯片在鉴定HIV感染中具有其他方法无可比拟的优越性。
尽管基因芯片技术需要进一步的不断完善，但完全可以预计在不久的将来其应用前景会锦上添花。不单限于HIV的耐药性检测和基因诊断，可以让许多感染性疾病病原体的基因集中在一张芯片上，同时对其进行感染诊断。
总之，分子生物学检测技术有助于HIV感染者的早发现、早诊断、早治疗，也有助于对治疗艾滋病药物的疗效评价、预测和监测疾病进程，减少艾滋病对个人、家庭及社会的危害。随着HIV分子生物学技术在高特异性、高敏感性、快速、自动化等方面的不断进步，HIV分子诊断可望成为艾滋病诊断标准之一，并通过对HIV突变及个体遗传差异的检测指导抗病毒治疗，为人类遏止艾滋病的流行发挥重要的作用。
参考文献：
[1] 杨绍基，任红.传染病学[M].第7版.北京：人民卫生出版社，2008：113.
[2] 倪语星，尚红.临床微生物学检验[M].第5版.北京：人民卫生出版社，2012：112-116.
[3] Constantine NT，Zink H.HIV testing technologies after two decades of evolution[J].Indian J Med Res，2005，121（4）：519-538.
[4] 陈勤.HIV-1感染机体的分子生物学基础[J].现代医学，2004，4：7-9.
[5] 沈霞.艾滋病的实验室诊断[J].中华检验医学杂志，2003，26：327-328.
[6] 普冬，赵勤，汪亚玲，等. 巢式PCR方法检测艾滋病毒载量结果评估[J].实用临床医学，2008，9（12）：25-26.
