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正向遗传学克隆基因的方法范文1
70年代以来，世界上提出“绿色革命”的口号，其实质是指种子革命。应该说绿色革命首先是从农业开始的。世界人口的爆炸带来粮食的紧缺，建设的需要使耕地越来越少，迫使人们必须加快研究选育和推广应用优良的农作物新品种，及其配套改革栽培管理技术。使作物单位面积的产量越来越高，以解决人类的吃饭问题。随着现代社会的发展，资源短缺以及环境恶化的矛盾日益突出，世界的生态平衡受到破坏，人类的生存受到威胁。此时，人们不仅要考虑吃饭问题，还要考虑生存及可持续发展等问题。因此“绿色革命”从农业延伸到林业等学科。
森林是地球上生态系统中最重要的因素。人们对森林的认识已从单纯索取木材转变到可持续经营的角度上来，提出分类经营思想，即把森林区分为生态林与商品林来经营。用80％～90％的林地建设生态林，采用复层林作业，其主要作用是保护生态环境；把条件较好的10％～20％的林地用于商品林建设，进行高度集约经营，主要用于向人们提供木材等林产品。例如。新西兰的商品林仅占其森林总面积的8％．但提供木材占其总产量的90％以上。其关键的技术是林木种子的革命。我们用“革命”这个字眼。是因为良种对林业生产力起着决定性作用，它的变革是根本性的，可带来翻翻的产量。是现代林业的一个核心技术。
国内外通过林木种子改良取得明显效益的事例，不胜枚举。桉树原产澳大利亚等地，引进巴西后，经过改良，采用无性系营造商品林，5年生时，树高可达25m，7～8年即可砍伐更新，每公顷蓄积量超过600m3。刚果进行的桉树育种计划取得的遗传增益为：种源选择50％-80％；杂交、个体选择、无性系增益100％～150％。
以上事例可以说明，林木良种化带来的效益是十分明显的。林木与农作物有所不同，树木多为异花授粉，多数处于野生或半野生状态，大部分林木是未经过改良的原始材料。它们的变异普遍，变异的性状多、幅度大，蕴藏着大量尚未利用的优良变异类型。这些优良类型一旦被选育出来，就可以显著地提高林业的生产力，加上多数林木具有容易进行基因型“克隆”的特性，一经选择，马上采用无性繁殖，大量复制，就可很快投入到林业生产实践中。
林业上选育良种与农业比较，具有更加经济长效的优点，在生产周期中只需采用一次，即能获得长久的效果。农业上一个品种不行，第二年甚至第二季就可换一个。而林木生长周期长，一粒种子播下后，十几年或几十年才能砍伐，如果选用良种，年年可获取增益。从这个意义上看，林木良种选育具有更为迫切的意义。
2林木品种改良的途径
2．1林木遗传改良的一般过程
林木遗传改良的形式多种多样，可以用如下图式表达其一般过程：
(1)基本群体表型选择优良类型
(2)优良类型遗传测定原种
(3)原种良种繁育品种
(4)品种区域化测定良种
可见一个新品种的培育过程经历了选择——测定——繁育——推广等过程，极为精细复杂，需要耗费大量的时间和经费。
2．2种质资源开发利用
树木基因资源是地球人的宝贵财富，也是选育树木优良品种的物质基础。不论是常规育种，还是诱变育种乃至遗传工程研究，都离不开基因资源。实践证明，搜集的基因资源越丰富、越全面，对它们研究得越深入、越有针对性，就越能满足各种育种目标的要求，选育出人们所期望的新品种。同时，基因资源不仅用于当前的育种，而且要为将来培育更高质量的新品种服务。
据分类学家估计，全世界现有植物5O多万种，高等植物23万多种。经人类长期驯化栽培，提供人类吃、穿、用等方面的植物种类，只不过1％～2％。约有2000多种。常见栽培作物只有175种，其中16种提供了人类食物的2／3。正是这些为数不多的栽培种类，成为人类社会物质文明的重要基础。
譬如树木中的三倍体山杨、直干蓝桉等都是从野生林分中发现的快速生长的优良单株。因此，从某种意义上讲，基因资源的收集和保存比创造新品种更为重要，是一项具有战略意义的工作。
2．3选择育种
选择育种是获得优良品种和生产群体的重要手段，在林木改良中具有极其重要的意义。选择育种可以在较短时间内，得到人们需要的基因型，经过繁育马上就可投入到生产之中。例如笔者在天然马尾松林中发现红心率达8O％以上的马尾松单株，这类马尾松1996年的价格是3000元／m3，为普通马尾松的5倍。
选择的物质基础是所研究材料的变异，材料的变异越大，变异越丰富，选择的效果越好。以往林业上多用天然变异，从野生树木中，筛选符合人们愿望的类型，通过培育为新品种。这种利用天然变异材料仍不失为林木选育新品种的有效途径。但天然变异毕竟有它的局限性，难于满足社会发展的需求。于是人们又创造了人工的变异方法，以扩大变异范围和增加选择机会，成为直接改良品种的有力手段。如19世纪已开始的树木杂交育种，通过不同种质问的有性杂交，使父本母本的基因进行交换重组，产生变异。这种方法不仅可以使杂交亲本双方的性状互补，取长补短。而且可能出现超过亲本的性状，产生原来亲本所没有表现出来的新性状。现已从种内杂交发展到种间杂交。进入2O世纪以来，人工促进遗传变异的技术得到很大的发展。7O年代以前主要用物理和化学因素来诱发植物体的遗传物质发生变异．使基因突变的频率比自然界自发突变高出100～1000倍。但这种诱变的方向和性质不易控制，选种的效率较低，因此进展不快。6O年代以来．植物的生物技术发展得很快，从器官培养到细胞培养、原生质体培养、体细胞杂交等，直到现在的细胞工程、染色体工程、基因工程，新技术、新成果不断涌现，给林业带来革命性的变化。
2．4遗传测定
在目前树木育种工作中，处理的育种材料多数属于未经遗传鉴定的表现型。表现型是树木遗传性与环境条件相互作用的结果．所以优良的表现型并不等于它的遗传性优良。只有经过遗传测定，认定优良的经济性状受遗传控制，从属于优良的遗传性，才能作为原种，进入到更高一级的育种阶段。
2．5林木良种繁育
良种繁育是林木良种化中重要的环节之一。当通过表型测定选育出来的品种．经过区域化试验，确定推广地区后，便要做好良种的繁育工作，直至该品种被更换了为止。良种繁育是育种工作的继续，是前承育种后接推广并不断提高种性的一个重要环节。如果繁育措施不当．使良种变为劣种，就会失去它的增产效益。良种繁育不仅是前一轮育种成果进入生产的唯一手段，而且也是下一轮育种所需要的遗传信息和基础材料获得的来源。
目前林木良种主要采用有性和无性两种形式进行繁育。营建无性系种子园是有性繁育的主要方式，它的营建技术较简单，繁殖系数较大，被广泛采用。其实质是通过选择．改良原有群体的基因的频率，提高其正向选择的遗传增益，达到改良的目的。目前种子园主要的问题是产量低，实生种子的遗传基础不一致，对高度集约的商品林来说，木材以及林产品的不一致性，给利用带来困难。
在无性繁殖的情况下，无性系分株的遗传成分与其原株的完全相同，它们不仅继承了原株的加性效应，而且继承了原株的显性和上位作用效应。所以在选择差相同的情况下，能取得较大的遗传增益，因此近代国内外都趋向于无性系育种和无性系林业。
总之，林木种子从原来的见种就采、见苗就种的局面，到现在选择优良种源、优良林分、优良家系、优良无性系，建立种子园与采穗圃生产良种，已经大大地向前迈进了一步。它已发挥出明显的作用，产生了巨大的效益。从某种意义上说，已经开始了林木种子的革命。但这还不够，现代科技的发展，还要求我们加快生物技术应用的步伐，开展更深层次的林木种子新技术革命。
3生物技术与林木种子革命
近年来生物技术发展迅速．它包括细胞工程、染色体工程和基因工程。
3．1细胞工程
细胞工程主要包括原生质体培养、大规模的工厂化的细胞培养、组织培养和快速繁殖等技术，以生产大量的优良无性系，并可获得人类所需要的多种代谢物质，如黄连素、人参皂甙等。细胞融合，它可打破种属间的界限，在树木新品种的培育上有着巨大的潜力。目前，胚胎分化人工种子等技术的利用也日益普及。
3．1．1林木的组织培养
树木组织和细胞培养的研究也取得了重要的进展。目前由体细胞再生出完整植株的有：欧洲桦、柠檬桉、巨桉、杨树、花旗松、长叶松、杉木、柳杉等几十种树种。林木原生质体培养及细胞杂交也进行了探索，欧洲云杉、花旗松、火炬松、短叶松、杨树、泡桐等树种已分离出原生质体，并进行了培养。日本对杨树种和泡桐的原生质体做了融合试验。
用组织培养繁殖树木，不仅和无性繁殖一样，能保持树木的优良性状，同时还具有如下特点：(1)繁殖系数大；(2)缩短良种的推广周期；(3)培养无菌苗；(4)繁殖难于用常规方法营养繁殖的树种；(5)发育阶段返青；(6)可作用保有基因资源的一种手段；(7)变异培养无性系利用啕。
3．1．2胚胎发生及人工种子
器官与胚胎发生是培养植物细胞分化的两种主要途径。用胚状体形成植株主要特点是增殖迅速、遗传单一。在组培中获得胚状体以后用适当方法加以包裹即可制成人工种子。根据Flick和Ammirato(1983)统计，经胚胎发生途径得到完整植株的植物有91种。其中有火炬松、糖松和挪威云杉获得体细胞胚胎及小苗。我国培育成功的树木体细胞胚胎发生及小苗形成是中国科学院于1988年以华北云杉(Piceawilsomii)为试材研究成功的。人工种子研制的关键是选择适当的方式进行包被．最常见的是凝胶法包裹。随着人工种子研究的深入．将有愈来愈多的人工种皮材料被开发出来。
3．1．3原生质体培养
自从Cocking在1960年用纤维素分解植物细胞壁首获原生质体以来，在原生质体培养和融合方面已取得突破性进展。国内外约有2O种林木获得原生质体，其中一部分已诱导成植株。
3．1．4体细胞融合
体细胞融合试验应在诱导原生质体再生植株的基础上进行。体细胞融合方法对于树木改良特别适合．该法与常规有性杂交比较，具备以下特点：(1)能形成两个亲缘关系较远的种间杂种，克服了有性杂交的配子不亲合性；(2)能获得一些含有另一亲本非整倍体的杂种或胞质杂种；(3)能设计出一次两个以上亲本的融合；(4)能获得在遗传上呈双亲个体基因型总和的杂种；(5)能获得一些有性生殖障碍的植物种类的体细胞杂种；(6)能获得具有不同遗传变化亲本的杂种。
3．2染色体技术
染色体技术在树木的核型、组型、带型分析的基础性研究较为深入。速生丰产树种杉木、杨树、马尾松等既有常规的细胞学研究，也有地理种源的染色体性状比较。经济林树种山茶、油茶、漆树、桑树、猕猴挑等染色体研究资料也较为深入，药用植物杜仲、银杏等有一定的研究。染色体研究在科以上的有杉科、松科、芍药科、银杏、山茶科等；地域性染色体资源研究有云南、广西、宁夏、贵州等地。这些基础性研究为保护植物种质资源，研究树种的分类、分化、系统发育提供了详实的细胞学材料。
3．3基因工程
树木基因工程取得的进展及其作用主要有：
3．3．1DNA分离与转导
基因工程的一个最关键技术是把目的基因转导到目标植物中去，并使其能准确地表达出来。8O年代初．人类首次从细菌中分离出来一些分解抗生素的基因，成功地转移到植物细胞中，并获得能在含抗生素的培养基上生长的植株。此后即出现了一系列转基因植株。同时转基因技术也日益成熟。目前林木转基因技术有不少成功的事例：
(1)抗虫转基因植株。1988年美国依阿华大学林学系利用从马铃薯中提取的蛋白酶抑制剂Ⅱ号(InhibitorⅡ)为目的基因，与以新霉素磷酸转移酶Ⅱ(NoemycinphosphotransteraseⅡ，即NⅡ)为标记基因制成嵌合基因，以根癌农杆菌grobacteriumtumefeciens)的Ti质粒为载体，以叶盘转化再生法(Leafdisktransf~lrmationregenerationme山ed)为组培手段，用杨树杂种无性系(PopuiusalbaxPopulusgrandidentata)为试材，经测定这种抗虫的转基因植株具有高毒性，幼虫取食后死亡率很高。
(2)抗除草剂转基因植株。1987年美国加州和威斯康星州的科学家利用杨树杂种无性系(alba．xP．grandidentata)为试材，从土壤中沙门氏细菌(Salmenellabacteria)提取抗除草剂的DNA．这种基因能控制一种特殊的酶，它能解除除草剂的作用，而对沙门氏菌安全。经培养获得除草剂转基因植株。
(3)通过基因操作控制木素的生物合成。在生产纸桨的过程中，为除去不需要的木素需要大量的能源，处理木素废液还要庞大的设备，于是就产生了培育木素含量少或易提取木素林木的想法。有人用“反意法”研究培育木素含量少的林木。另一项试验是把合成阔叶树型木素的基因导入针叶树，培育含有大量易提取木素结构的林木。
(4)抗大气污染气体的林木的培育。其重点在活性氧解毒上起重要作用的谷胱甘肽还原酶的基因上。有报告指出，把出自大肠杆菌的基因导入杂种杨，培育提高此种酶活性的转化体。在一般情况下，林木对大气污染物质也有很强的吸收和解毒能力。而此种酶活性进一步提高的转化体，作环境绿化木是大有可能的，它具有很强的耐SO：和臭氧的性质。
(5)控制林木形态的形成。对控制柳杉花形态形成的基因和变应原基因进行了分离．利用这些基因培育出能控制产生雄花和合成变应原的柳杉。有报告说：把白葶苈的控制芽分化的基因导入杂种杨，得到了花芽形成时间由通常的8年缩短到仅7个月的转化体。
(6)通过基因操作扩大林木的生育范围。一般来说，植物生长发育的场所是不能变动的，个体或种的维持是靠与光照条件、大气成分、土壤水分、土壤养分、有害物质的吸收、病原菌的感染等环境条件相应的复杂的适应机制。例如，若能对平时出现过剩的基因进行操作。这种基因是控制耐干燥、耐盐基因群的基因，那么，影响出现前转化体就有防御机制，其结果就扩大了生长范围。如果耐冻性、耐寒性、耐高温性、抗紫外线性等受到重视，那么控制林木生长范围(南限和北限、海拔高度界限等)的基因操作就会成功。
3．3．2林木遗传图谱的构建
遗传图谱是选用合适的自然群体或通过人工技术手段构建的人工作图群体，利用各类遗传标记和定位的基因构建的遗传标记与基因的线性排列图。林木遗传图谱是对林木基因组进行系统研究的基础。由于林木生育周期长，利用形态标记来构建遗传图谱几乎不可能，所以过去几乎找不到林木遗传图谱。由于同工酶技术的发展，7O-8O年代构建了一部分树种的同工酶标记的遗传图谱。但同工酶利用的标记有限。难以构建高密度的遗传图谱。由于分子标记的开发，近年林木遗传图谱构建已成为林木遗传学研究的热点，有利于在短期内构建高密度的图谱。共显性以分子标记如RFLP、SSR、STS等适合于任何作物群体的遗传作图；而显性标记如RAPD只适合于单株针叶树构成的群体(因其来自亲本的单倍体胚乳)和DH群体。利用大量分子标记构筑高密度连锁图后，有利于今后未知基因的定位、克隆及分子标记辅助选择等。
3．3．3目标基因定位和克隆
利用已有的遗传图谱及适当的分离群体可以将目标基因或数量性状座位(QuantitativeTraitLoci。简称QTL)定位于某条染色体的某一区段或每两个遗传标记之间。这些被定位的主基因或QTL可利用位置克隆的办法被分离克隆，一些作物的有用基因如水稻白叶枯病抗性基因Xa2，就是这样被克隆到的。
数量遗传学作为遗传学的一个分支一直是独立发展的。但到8O年代却处于低谷。由于分子生物学的崛起，分子标记的开发，数量遗传和分子生物学的结合产生了新的边缘学科——分子数量遗传学，使得数量遗传学重新获得新生。因为利用分子标记对QTL的定位，可象一般主基因那样将QTL克隆出来加以利用。这对林木遗传育种将产生重大影响。因为许多经济性状都是由QTL控制的。
3．3．4分子标记辅助选择育种
分子标记辅助选择(MakerAssistedSelec—tion。简称MAS)。是通过分析与目标基因紧密连锁的分子标记的基因型来判断目标基因是否存在的一种植物育种选择方法。这种方法不受其它基因效应和环境因素的影响，因此结果较可靠，而且可以进行早期选择和对隐性基因的选择，从而大大加快育种进程。提高选择效果。特别对于生育周期长的林木来说更具有重要意义。
3．3．5物种、品种及优良无性系鉴别
不同物种、品种及单株在基因组上均存在差异，不同植株(不同无性系)之间的差异在多数情况下是难以鉴别出来的。但由于分子标记的无限性，总可以将其区分开来。因此分子标记可非常有效地用于林木育种特别是优良无性系的鉴别，还可用于物种、品种分类。利用分子标记可以检测出林木种子园外来其它花粉的污染情况，也可鉴定其生产的种子是否真由种子园亲本之间杂交产生，以检测种子的混杂性。
3．3．6在林木基因研究上的应用
林木的生理现象还有很多是未知的，用基因结构和机能加以说明是验证科学世界的要求。例如把控制形态形成的基因导入钻天杨并出现过剩。那么就会改变叶的形态，或者节间变短或者短化。因此我们认为，这种基因有调节叶的形态、节间长短和树高的可能性。总之，基因操作可称作是解析未知的基因机能的重要技术。林木研究方面也在寻求开发组织特异的或生长阶段特异的促进剂。我们在世界上率先对与裸子植物光合作用有关的基因的促进剂结构与机能进行了解析。分析基因促进剂时。要求在促进剂范围内让信使基因连结。向基因分离了的该生物种类基因转移，通过信使基因的出现，分析促进剂的机能。
3.3.7在林木染色体组研究上的应用
对人及实验动植物的染色体组研究正在蓬勃开展。为了推进林木的染色体组研究，用DNA限制酶断片多型分析，成功地编制了柳杉连锁图。对部分连锁群来说。利用三体生物能使其处于与特定染色体相对应的状态。该连锁图将向未来高密度连锁图发展。与11条染色体的对应及染色体上的基因配置也能得到理解，作为有关柳杉染色体组的结构与机能的基础信息将会起重要作用。
正向遗传学克隆基因的方法范文2
反向遗传技术为在DNA水平上对RNA病毒进行研究和操作提供了极为方便有用的工具。本研究构建了EV71全长cDNA克隆,并将体外转录得到的RNA转染RD细胞,成功获得拯救病毒,为进一步研究EV71病毒基因功能、基因变异与病毒毒力关系、基因疫苗等研究以及防控该病奠定良好的基础。
1材料和方法
1.1 材料
1.1.1毒株与细胞
EV71病毒株FJ08149是2008年从一手足口病病例疱疹液分离获得,经鉴定为EV71 C4基因亚型。RD细胞由中国疾病预防控制中心脊灰实验室惠赠。
1.1.2主要试剂
长片段扩增Primescript RT-PCR Kit购自Takara公司;PCR-XL- TOPO TA载体 购自Invitrogen公司;RiboMAXTM LargeScale RNA Production Systems-T7 购自Promega 公司;QIAamp Viral RNA Mini Kit、Transfection reagent和RNeasy Mini kit 购自Qiagen公司;EV71单克隆抗体购自Chemicon公司;FITC标记的二抗购自Dako公司。
1.2 引物设计与合成
根据FJ08149株的序列和酶切位点,设计了一对引物,上游引物 EV71-5T7在其5'引入T7启动子序列及NotI酶切位点,下游引物EV71-3RM在其5'端引入52个Poly(T)及MluI酶切位点。由Takara公司合成。
1.3 RT-PCR扩增基因片段
按照QIAamp Viral RNA Mini Kit 试剂说明提取病毒RNA,最后用适量无RNA酶的双蒸水溶解。根据长片段Primescript RT-PCR Kit说明书,先以EV71-3RM为反转录引物,在42℃反应1小时反转录全长cDNA,然后利用Takara Ex Taq HS进行基因组全长扩增,PCR反应条件为:95℃预变性3 min;98℃ 10sec , 68℃ 9min,40个循环;72℃ 10min。反应产物在0.7%琼脂糖中电泳进行检验。
1.4 全长cDNA 的构建与鉴定
RT-PCR扩增产物经电泳后纯化,以TA克隆方法将带有T7启动子识别序列的基因组全长连入TOPO-XL-PCR载体中,用MluI和NotI酶切鉴定是否插入目的片段。
1.5 体外转录与转染RD细胞
用MluⅠ和NotI将有目的片段插入的质粒进行双酶切线性化,纯化后按照T7体外转录试剂盒说明在体外转录出RNA,用RNeasy mini kit(Qiagen)试剂盒进行RNA纯化后,加30ul无RNA酶的双蒸水洗脱, 定量。按照Transfection reagent说明书要求把RNA转染到培养于6孔细胞板RD细胞中, RNA含量为2μg/孔。转染后每天观察细胞,待细胞病变(CPE)达到75%及以上或观察7天后,收获细胞进行鉴定与传代。
1.6 拯救病毒的鉴定
1.6.1 RT-PCR鉴定及VP1序列测定
用EV71-S(5’-GCAGCCCAAAAGAACTTCAC-3’)和EV71-A(5’-ATTTCAGCAGCTTGGAGTGC-3’)诊断引物对拯救病毒进行鉴定。应用EV71-F(5’-GCAGCCCAAAAGAACT
TCAC-3’)和EV71-R (5’-AAGTCGCGAGAGCTGTCTTC -3’)扩增包括VP1全长在内的1082bp产物,并进行序列测定分析。
1.6.2间接免疫荧光试验鉴定
CPE达到75%及以上或观察7天后,收集细胞及上清,2500rpm离心10min,取细胞沉淀用无菌PBS洗2次后,重悬细胞沉淀,滴加到荧光片,用丙酮将其固定,蒸镏水清洗1次后加入EV71单克隆抗体,37℃湿盒中孵育1 h,PBS 洗涤3次。加入用1∶6000伊文斯兰以1∶40 稀释的FITC标记的兔抗鼠二抗,37℃湿盒中孵育1h,PBS洗涤3 次后甘油封孔,镜检。
1.6.3拯救病毒效价测定
获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后,与母本病毒同时进行TCID50测定。详细方法及步骤参见《WHO脊髓灰质炎病毒实验室手册》[3]。
1.6.4电镜观察
获得拯救病毒经RD细胞传一代扩增后,反复冻融3 次,4500r/min 离心30 min,取上清浓缩5倍后,以1%加入EV71特异性抗体37 ℃孵育2h后,4℃过夜,10000r/min离心30 min,以PBS重悬沉淀,点样、负染,电镜观察。
2结果
2.1 全长cDNA克隆的构建
利用引物EV71-5T7和EV71-3RM,从FJ08149病毒上清扩增出EV71基因组全长约7.5kb,见图1A(marker不够清晰)。应用TA克隆技术,将EV71基因组全长连接入PCR-XL-TOPO TA载体中,构建重组质粒,经MluI和NotI双酶切鉴定,FJ08149T5和FJ08149T25两个克隆质粒均有目的基因插入,见图1B,目的基因约7.5kb,载体大小为3.5kb。
A: FJ08149株基因组PCR扩增产物
1.RT-PCR扩增后的全基因组产物(7.5kb);2.DNA Marker DL15,000;3. 阴性对照。B: TA 克隆NotI和MluI双酶切鉴定结果;1.DNA Marker DL15,000;2.pFJ149T5;3.pFJ149T25
图1基因组PCR产物及TA克隆酶切鉴定
2.2 体外转录制备感染性RNA
应用MluI和NotI双酶切,从pFJ08149T5和pFJ08149T25克隆质粒中切下含有T7启动子的基因组DNA。并将此片段作为体外转录模板,通过T7 RNA聚合酶系统,体外转录成RNA,经电泳鉴定,转录的RNA达到预期的7.5Kb大小,见图2。
1.RNA Marker RL10,000 2. pFJ08149T5 3.pFJ08149T25
图2体外转录RNA电泳图
2.3 病毒的拯救
转录RNA转染RD细胞后72小时,即可见到典型的肠道病毒CPE,见图3A,CPE呈逐日增多,7天后将转染细胞培养上清以20%比例传代,第3天CPE达到75%以上。对照细胞培养7天均仍保持正常形态,见图3B。
A.转染pFJ08149T5后的RD细胞B. 正常的RD细胞
图 3RNA转染RD后CPE形态
2.4 拯救病毒的鉴定
2.4.1间接免疫荧光鉴定
拯救病毒、拯救病毒传1代后和母本病毒株用EV71单克隆抗体进行免疫荧光检测,均可见到特异性的荧光,见图4A,而细胞对照无荧光产生,见图4B。
图4拯救病毒的间接免疫荧光鉴定
2.4.2RT-PCR鉴定及序列分析
拯救病毒培养上清用EV71-A和EV71-S、EV71-F和EV71-R进行扩增,均得到预期大小的目的片段,约226bp和1082bp,见图5。将VP1全长序列测定分析,拯救病毒与母本病毒891个碱基完全一致。
图5 拯救病毒的RT-PCR鉴定
2.4.3拯救病毒毒力效价测定
将拯救病毒与母本病毒同时进行病毒效价测定,结果pFJ08149T5的效价为105.25TCID50/0.1ml,pFJ08149T25效价为107.25TCID50/0.1mL,母本病毒FJ08149的效价为107.505TCID50/0.1mL。其中pFJ08149T25与母本病毒对细胞的感染力相近,而pFJ08149T5约低100倍。
2.4.4病毒粒子的形态
浓缩后的FJ08149T5拯救病毒与EV71抗体作用后,形成免疫复合物,经负染色,电镜下观察到球形病毒粒子,直径约22nm,见图6。
图6拯救病毒的免疫电镜
3讨论
自1981年Racaniello VR和Baltimore D 首次应用反向遗传学技术成功拯救出脊髓灰质炎病毒(PV)后[4],翻开了RNA病毒研究的新篇章,实现了在DNA水平上研究RNA病毒。通过构建cDNA感染性克隆,应用DNA基因操作方法,如定点突变、重组、缺失和嵌合等手段,研究拯救病毒基因水平的改变对表型的影响,进而达到对病毒基因功能与结构、致病机制、表达调控、分子免疫机理等的全面认识,开发出新型疫苗。日本学者Arita等,于2005年首先构建了EV71标准株BrCr的感染性克隆,然后利用基因置换,引入PV疫苗株(Sabin I)影响温度敏感与病毒毒力的突变位点,在猴子模型上证实了温度敏感的病毒株对猴子毒性减弱[5];2008年,他们又在NOD/SCID鼠模型中证实了几个决定温度敏感的突变位点在神经毒力减弱中起协同作用[6]。2008年以来EV71在中国大陆流行,迫切需要利用本土流行株构建感染性克隆,为研究其致病机理、病毒变异与毒力关系以及疫苗的研究提供技术支持。
由于PV等小RNA病毒的基因组是单股正链RNA分子,裸RNA分子就具有感染性,且基因组较小,如EV71等肠道病毒属仅有7.5Kb大小,无帽子结构。理论上构建其感染性克隆可能较为容易,但在实际操作中仍然面临着不少的困难。首先需获得完整基因组的cDNA序列,先前基本上采取分段扩增后逐步克隆拼接出完整的cDNA序列,操作过程烦琐,且多次克隆、连接也给基因序列突变增加了机率。本研究中通过长片段RT-PCR一次性扩增出全长基因组,一次克隆操作以尽量减少可能引入序列变异。第二,基因组3’端需有足够长的Poly(A)尾,一定长度的Poly(A)对维持基因组稳定性及保证其感染性均有作用[7]。据报道,PV的Poly(A)如果少于20个,RNA的感染性比野生株会低20倍[8]。Sarnow等对3’端Poly(A)组成不同对PV体外转录本感染性影响的研究得到,Poly(A)尾越长其感染性越接近野生株,但非同源聚合序列反而使其感染性降低[7]。本研究设计时利用3’端引物直接带入52个Poly(A)尾和一个MluI酶切位点,达到保证感染性同时可进行线性化的目的。第三,保证基因组忠实性,减少其它非基因组序列引入。本研究直接将T7启动子特异性识别序列通过引物精确加到基因组5’端,并带入NotI酶切位点,转录前通过双酶切,避免将载体序列引入。第四,克隆扩增时如何避免因细菌增殖可能引起的序列变异,导致序列缺失或插入从而导致基因组序列不完整性。在本研究过程中也曾发现过类似的情况,因此采用了28℃、150rpm/min的低温低转速的优化培养条件,这是乙型脑炎病毒等其它感染性克隆构建过程也曾采取的措施[9]。本研究还发现如果基因组正向插入到载体T7启动子下游,不仅细菌增殖缓慢且量少,质粒拷贝数低,且转染也无感染性;而如果基因组以反向插入,则细菌不仅增殖快量大,质粒拷贝数高,且所获得的几株感染性克隆均为此反向插入的。这是否因不同方向插入时,潜在表达的蛋白质不同导致的,有待于进一步深入研究分析。
本研究应用本地分离株成功地构建了中国大陆流行C4基因亚型EV71感染性克隆,转染RD细胞成功获得了拯救病毒,经鉴定与野生株具有相似的遗传特性与生物学性状。此感染性克隆构建成功,可为下游研究提供了技术支持。
参考文献:
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正向遗传学克隆基因的方法范文3
【关键词】 人Era基因
关键词: 人Era基因;基因表达;蛋白纯化
摘 要:目的 在大肠杆菌中对人的era基因（简称hera）进行表达、纯化. 方法 PCR扩增hera基因，测序正确后克隆入大肠杆菌融合表达载体pRSET-C，重组质粒pRSETC-hera以大肠杆菌BL21（DE3）为宿主菌，用IPTG进行诱导表达.然后利用亲和层析的方法对表达蛋白进行纯化. 结果 克隆了hera基因，测序正确;利用pRSET-C载体在大肠杆菌中融合表达了全长hera-cDNA基因，表达量占细菌总蛋白的59.6%.融合蛋白在菌体内主要以包涵体形式存在，在变性条件下用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白，其纯度达到了98.0%. 结论 利用基因重组技术在大肠杆菌中高表达了hera基因.并对融合蛋白进行了初步纯化.
Keywords:human Era gene;gene expression;protein purifi-cation
Abstract:AIM To express human Era protein in E.coli and purify it preliminarily.METHODS After being amplified by PCR and identified by sequencing the human era gene was in-serted into expression vector pRSET-C.The recombinant plasmid pRSETC-hera was transformed into BL21（DE3）and induced with IPTG.The expressed protein was purified by affinity chromotography.RESULTS The human era gene was amplified and the sequence proved to be correct.The hera-cDNA gene had been cloned into the vector and ex-pressed in E.coli，and the expressed protein took59.6%of the total bacterial protein.The fused protein existed in the pattern of inclusion body，and it was purified on denatured condition by using Ni-NTA affinity chromotography column.CONCLUSION The hera gene could be expressed with high efficiency in E.coli by using gene recombination technique.The fused protein is purified preliminarily.
0 引言
era基因是1986年在测定大肠杆菌基因组序列时，在编码RNaseIII的rnc基因下游发现的一个开放读框，因其编码的氨基酸序列与人及酵母的Ras蛋白有部分相似之处，命名为E.coli Ras-like（era）基因［1］ .era基因在原核生物中普遍存在，在真核生物如蠕虫、小鼠、人、植物中也存在与细菌era高度同源的基因.Era蛋白是小G蛋白家族的新成员.它由两个结构域组成:N端是一个典型的GTPase结构域;C端结构域为Era所特有，其中含有一个KH结构域［2］ .在大肠杆菌中era基因和rnc基因同属于rnc操纵元，rnc基因和era基因的表达共同受RNaseIII的负调控［3］ .era是大肠杆菌中可以正常表达的基因，但表达水平极低.遗传学实验证实era基因与细胞周期和细胞分裂有关，是细菌生存繁殖所必需的重要基因 ［4］ .高表达的细菌Era蛋白有GTP结合及GTPase活性［5］ .最近发现细菌Era蛋白可以特异地与16S-rRNA结合［6］ .
本室陈苏民教授通过计算机寻索，发现从线虫、小鼠到人都有与细菌era同源的EST序列，并且相继克隆了人及小鼠全长的era-cDNA基因.人era-cDNA基因全长约2.2kb，含长度为1038bp的开放读框，编码346氨基酸的蛋白质［7］ .人Era（hEra）与大肠杆菌Era（eEra）蛋白全序列比较，有31.0%相同、53.0%相似.同样，hEra也是由N端的GTPase结构域和C端KH结构域所构成［8］ .新近克隆的人及小鼠era基因为整个era基因家族的功能研究提供了重要的资料.本研究目的是将hera基因在大肠杆菌中进行高表达、纯化.这为进一步研究hEra蛋白的功能打下了良好的基础.
1 材料和方法
1.1 材料
大肠杆菌BL21（DE3）菌种购自Promega公司.pUC19质粒均为本教研室保存;表达质粒pRSET-C为Invitrogen公司产品.pBS-hera为陈苏民教授提供.各种限制性内切酶、连接酶、核酸修饰酶及Taq酶均为Gibco公司产品.DNA marker和蛋白marker为Takara公司产品.柱式质粒纯化试剂盒为华舜公司产品.NucleoTrap Gel Extraction试剂盒购于CLONTECH公司.Ni-NTA spin kit为QIAGEN公司产品.
1.2 方法
1.2.1 PCR反应及产物的鉴定
PCR引物:正向:5'-AAGGATCCAACAGAGATGAGCAGG，反向:5'-AA-CTGCAGTTATCACTTGAGGAGCTTC.PCR反应以pBS-hera为模板在PE公司9600反应仪上进行.PCR反应条件为:96℃30s，55℃45s，72℃60s，30个循环.纯化的PCR产物用BamHI和PstI双酶切定向克隆入pUC19质粒，转化E.coli JM109，进行蓝白筛选，并经酶切鉴定筛选出含插入片段的阳性克隆.重组的pUC19质粒经提取纯化后，以此作为测序模板，在PE公司310型测序仪上进行核苷酸序列分析.
1.2.2 重组表达载体构建
从重组的pUC19质粒上用BamHI和PstI切下目的片段，再用BamHI和PstI双酶切pRSET-C载体.目的片段与载体片段均用NucleoTrap Gel Extraction试剂盒从琼脂糖凝胶内回收.然后进行DNA的连接，将DNA连接液转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞，用氨苄抗性进行筛选，经酶切鉴定出含插入片段的阳性克隆.
1.2.3 蛋白诱导表达
挑取pRSETC-hera重组表达菌株，接种于5mL含Amp的2xYT培养基（胰蛋白胨16g L-1 ，酵母提取物10g L-1 ，NaCl5g L-1 ），37℃培养过夜，次日按4.0%转接于含Amp的2xYT培养基，37℃振荡培养3h，加入IPTG至终浓度1mmol L-1 诱导表达，37℃振荡培养2～7h.取菌体，做120g L-1 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）.
1.2.4 SDS-PAGE 4℃9000g离心5min收集菌体，用含3mL L -1 巯基乙醇加样缓冲液处理（100℃， 10min），12000g离心10min，采用Laemmli不连续PAGE，150g L-1 分离胶，考马斯亮蓝R-250染色.
1.2.5 蛋白质的纯化
离心收集100mL诱导菌液的菌体，按每克湿菌体10mL加入超声缓冲液（0.05mol L-1 NaH2 PO4 ，0.3mol L-1 NaCl）悬浮，-20℃冻融2次，再加入溶菌酶至1g L-1 ，室温放置30min，然后超声裂解（150W，每次1min，共5次），4℃下12000g离心20min.再加入超声缓冲液10mL悬浮包涵体，4℃下12000g离心20min，收集包涵体沉淀.用5mL缓冲液B（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris Cl，pH8.0）悬浮包涵体，Vortex，室温放置2h，4℃下12000g离心15min，取上清，4℃下12000g再离心15min，留上清上Ni-NTA亲和色谱柱.先用缓冲液B预平衡Ni-NTA柱，上样，用缓冲液C（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH6.3）洗涤，接着用缓冲液D（8mol L-1 尿素，100mmol L-1 NaH2 PO4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH5.9）洗涤，再用缓冲液D1（缓冲液C，250mmol L-1 咪唑）洗脱，用缓冲液E（8mol L-1 尿素，100mmol L－1 NaH 2 PO
4 ，10mmol L-1 Tris HCl，pH4.5）灌洗.在280nm监测下，收集每个吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE.
2 结果
2.1 hera基因的扩增
以pBS-hera质粒为模板，经PCR扩增获得hera基因片段，扩增产物经1.0%AGE，与编码hEra全长的cDNA（1038bp）大小相符（Fig1）.将全长hera基因片段克隆入pUC19质粒，重组质粒转化DH5α感受态细胞，从培养板上随机挑选白色克隆，从中提取质粒，用BamHI和PstI双酶切鉴定，含有插入片段的重组质粒命名为pUC19-hera.酶切鉴定结果见Fig2.提取重组质粒pUC19-hera，以pUC19通用测序引物进行核苷酸序列测定.测序结果表明，所扩增的hera基因与已知序列完全相符.
2.2 pRSETChera表达质粒的构建和诱导表达
将hera-cDNA基因全长从pUC19-hera亚克隆到表达载体pRSET-C中，经酶切鉴定，将重组表达质粒命名为pRSETC-hera.酶切鉴定结果见Fig3.将pRSETC-hera质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，在2xYT培养基中生长，转接后用IPTG诱导4h，由120g L-1 SDS-PAGE结果可见:与未诱导的对照菌相比诱导菌在Mr 42×103 处有明显的新蛋白表达带出现，大小和预期的6His-hEra融合蛋白相符（Fig4），激光薄层扫描结果表明此表达条带占菌体总蛋白的59.6%.表达产物主要以包涵体的形式存在.
2.3 6HishEra融合蛋白的纯化
收集100mL诱导菌液的菌体，经裂菌、离心、洗涤、再离心后获得包 涵体沉淀.包涵体被变性溶解后上Ni-NTA柱，用缓冲液C，D洗涤，用含咪唑的缓冲液D1洗脱，再用缓冲液E灌洗.在280nm监测下，观察蛋白的流出情况.收集每个吸收峰并行120g L-1 SDS-PAGE（Fig5）.激光薄层扫描结果表明，用Ni-NTA亲和色谱柱纯化此融合蛋白的纯度达到了98.0%.
3 讨论
我们利用基因工程的手段在pRSET-C载体内高表达了hEra蛋白.pRSET-C是一个受PT7 强启动子驱动下的融合表达载体，因而易于在原核进行的目的基因高表达.另外，在目的基因的5'端融合了6个组氨酸的纯化标签，可以用金属螯合亲和层析来分离纯化表达的融合蛋白.组氨酸与金属离子的结合与蛋白质的空间结构无关，因此表达的融合蛋白就可以在变性条件下得到纯化，然后复性，这就避免了复性后的蛋白质由于纯化条件的改变而丢失.
不同的培养条件对外源基因的表达效率也有一定的影响.含pRSETC-hera质粒的BL21（DE3）菌在LB培养基中IPTG诱导6His-hEra融合蛋白表达时，表达产物占菌体总蛋白的30.0%;当改用2xYT培养基时，外源基因的表达效率明显提高，表达产物达菌体总蛋白的59.6%.在不同培养基培养条件下，表达产物均以包涵体形式存在.我们先对包涵体进行了分离、洗涤和纯化.然后用金属亲和层析的方法对其进行了进一步的纯化、复性.当pH≥6.3时，融合了6个组氨酸的蛋白质能和螯合了Ni2+ 的金属亲和层析柱相结合;而当pH=5.9或在咪唑存在的情况下，融合蛋白不再与Ni2+ 结合而被洗脱下来.我们在实验中发现，用含咪唑的洗脱液进行洗脱的方法要好于通过降低pH值进行洗脱的方法.首先降低pH值不能将融合蛋白洗脱干净，我们用pH=5.9的洗脱液进行洗脱时（Fig5），就不能将融合蛋白洗脱下来.另外，结合缓冲液的pH值与洗脱缓冲液的pH值相差仅0.4，溶液的pH值又易受环境的影响，因此在每次实验前需精心调试，给实际操作带来诸多不便.
随着基因组计划的进展，许多生物的基因组序列测定工作已经或即将完成.但是序列测定后，基因的功能及其表达调控的研究将成为后基因组时代最重要的任务.era基因是一个从细菌到人高度保守的小G蛋白基因.以前era基因的功能研究都局限于原核生物，难以揭示整个era基因的功能.本研究为era基因在真核生物的功能研究打下了基础.
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正向遗传学克隆基因的方法范文4
关键词：植物根系；禾本科植物；QTL；育种
中图分类号：S184文献标识码：A文章编号：0439－8114（2011）12－2380-03
Research Advances on the Molecular Mechanisms of Root Development
in Gramineous Plants
REN Yong－zhe，XU Yan－hua，ZHANG Qing－chen，LIANG Feng
（Department of Life Sciences，Shangqiu Normal University， Shangqiu 476000，Henan，China）
Abstract： Plant roots are required for the acquisition of water and nutrients， and fixition of plant． The proper establishment of root system architecture is of vital importance to fulfill its functional requirements， particularly in agronomically important crops such as cereals， which account for 70％ of food production worldwide． In recent years， studies on the molecular mechanisms regulating root development have also been initiated in monocot cereals which have been well studied in Arabidopsis in the past ten years． The achievements of root development in cereals were reviewed in this paper． The application of quantitative trait locus mapping in studying root development and the application of root trait information in breeding were also discussed．
Key words： plant roots； gramineous plants； QTL； breeding
根系的主要功能是从土壤中获取矿物元素和水分，并起到固定植株的作用；根系还可以与多种微生物形成共生结构，以提高植物的养分效率和抗逆性；此外根系还有一些其他功能比如光合产物的储存、植物激素的合成、无性繁殖等。在进化过程中，植物根系从非常简单的结构（比如根状茎）逐渐进化成了具有较为复杂结构的专门器官［1］，这正说明了根系的重要作用。被子植物的根系通常被分为两种根系构型：直根型和须根型。重要的粮食作物水稻、小麦和玉米所属的禾本科植物的根系则属于须根型根系。两种根系形态表现出明显的差异，这预示着内在的遗传基础决定了它们的根系形态。目前根系发育的分子机制方面所取得的研究进展多数是以直根型的拟南芥作为模式植物而得到的，对禾本科植物根系发育的分子机制研究远远落后于拟南芥，不过最近几年通过对重要作物水稻、玉米和小麦的根系进行研究，须根型根系的分子机制研究也取得了一定的进展［2，3］。结果表明，禾本科植物根系发育的分子机制与拟南芥相比既有一定的保守性，又存在一些差异。目前国内外还较少对禾本科植物根系发育的分子机制进行综述报道，该文比较了禾本科植物根系发育的分子机制与拟南芥的异同，并对根系表型鉴定的方法以及QTL分析在根系发育分子机制研究中的应用进行了介绍。
1禾本科植物根系发育的分子机制与拟南芥的异同
以前人们对拟南芥和禾本科植物根系方面的差异研究主要集中在形态学上，最近几年才开始探讨禾本科植物根系发育的分子机制。通过与在拟南芥中得到的研究结果进行对比，发现二者的分子机制既存在一定的保守性，又有一定的差异。
在拟南芥中，辐射状的根系形态是由GRAS基因家族的两个成员SHORTROOT（SHR）和SCARECROW（SCR）调控的［4－6］。SHR蛋白能通过向附近细胞的扩散诱导内皮层的形成和SCR的表达，SCR具有正向反馈调节机制，它能增加SCR基因的表达。SCR能与SHR相互作用激活下游基因表达，高丰度的SCR还能阻止SHR蛋白向附近细胞的扩散，从而避免形成更多的内皮层，这种机制似乎在包括禾本科植物在内的所有植物中都是保守的，因为这种机制已经在水稻和玉米中得到了一些验证：首先，SHR和SCR在水稻中的同源蛋白均表现出与拟南芥相似的表达模式，并且能够相互作用［7］； 其次，ZmSCR在从玉米根尖重新长出辐射状根系构型的过程中也是最重要的决定因子［8］。并且用拟南芥SCR基因的启动子接玉米的SCR基因在拟南芥中表达可以互补scr突变体表型［9］。这些证据表明，在禾本科植物中可能也存在着与拟南芥类似的机制来调控辐射状的根系形态。
小麦的基因组庞大，目前对调控小麦根系发育的分子机制了解的十分有限。已知在拟南芥中超量表达一个小麦的GTPase基因（TaRAN1）可抑制拟南芥主根的伸长和侧根的发育，并表现为对生长素超敏，因此推测该基因可能参与了生长素的信号转导［10］。这说明小麦根系的发育可能与拟南芥一样受到生长素的密切调控。有人用巴西固氮螺菌研究了生长素对小麦根系的作用，野生型的巴西固氮螺菌Sp6可以分泌IAA，有一个突变的菌株SpM7918只能产生分泌非常少量的IAA，他们用Sp6和SpM7918同时接种小麦的幼苗，发现与野生型的Sp6菌株接种结果相比，SpM7918减少了促进小麦侧根形成、伸长以及根毛分布的能力。这说明生长素的确对于小麦侧根的形成、侧根的伸长及根毛的发育都有促进作用［11］，这也与拟南芥中得到的结论基本一致。
水稻的等位基因crl1［12］和arl1［13］、玉米的rtcs［14］与拟南芥LBD16和LBD29［15］基因位于系统进化树上相近的位置。但有趣的是，这4个基因被证实参与到根系发育的不同方面。crl1／arl1和 rtcs位于水稻和玉米的染色体共线性区段，并且功能上都与茎生根的形成有关［13，14］。而在拟南芥中， LBD16和
LBD29则是参与到了侧根的形成，过量表达能促进侧根的发生。研究表明，生长素反应因子ARF7和ARF19能直接激活LBD16和LBD29基因表达，说明LOB domain是生长素的早期响应基因［16］。同样，水稻的CRL1／ARL1和玉米的RTCS基因的启动子区也存在生长素的反应元件，说明无论是单子叶植物还是双子叶植物，这些含有LOB domain的蛋白可能都是扮演了生长素早期响应信号的角色，只不过在水稻、玉米和拟南芥中分别参与调控了不同种类根系的形成。
在禾本科植物中第一个被克隆的调控根毛发育的基因是一个SEC3同源基因［17］，但在拟南芥中这个基因目前还没有证据表明与根毛的发育有关系。GLUTAMATE RECEPTOR－LIKE 3．1（GLR3．1）是一个维持水稻RAM活性调控因子［18］，与水稻的glr3．1突变体不同的是，拟南芥glr突变体没有明显的根系表型，但是GLR3．1在水稻中是单拷贝的，而在拟南芥中却有20个GLR基因，也许是由于在拟南芥中存在功能冗余才造成一个基因的突变没有明显表型，但也可能该基因只在水稻根系发育中起着重要的作用。此外，玉米的胚根鞘是禾本科植物特有的结构，它在胚胎形成以及以后的萌发过程中起着保护根系分生组织的作用［19］，原位表达分析显示，玉米胚根的形态建成依赖于ZmSCR基因的活性［20］，因此，这可能也是ZmSCR基因在禾本科植物根系发育中所具备的特定功能。
2利用QTL分析研究禾本科植物根系发育的分子机制
QTL定位是研究调控根系发育的分子机制和遗传机制的一种常用方法。对于模式植物（比如水稻）来说，通过QTL定位的方法，可以找到那些对于根系发育只有微小贡献的基因（微效QTL），因为这些基因往往很难通过突变体的方法被鉴定出来。并且由于基因组序列已知，可以很容易地对这些QTL位点进行鉴定。也可将这些QTL位点构建成目标性状只有单个孟德尔因子的近等基因系进行基因分离。其次，QTL分析能够检测到复杂的遗传互作过程。随着人们对调控根系性状的基因了解的信息越来越多，QTL分析的这种作用会日益明显。此外，QTL分析还可以对已知调控根系构型的基因进行功能再验证以及其调控网络分析。QTL分析的另一个突出优点是可以对复杂基因组（例如小麦）的复杂性状（例如根系构型）进行遗传研究，而且这种QTL分析并不依赖于基因组是否测序。
2．1根系表型鉴定的方法
在根系发育的QTL定位研究中，准确地收集大量的表型数据是非常重要的。但在土壤条件下，很难对较大的遗传群体进行表型鉴定。利用琼脂凝胶室培养的方法可以在一定程度上模拟土壤环境［21］，但也难以进行大规模的群体试验。有人使用电子设备间接地对根系构型和土壤状况进行研究，比较适合在大田条件下应用，不过这种方法难以得到关于根系构型直接的数据［22］。在过去的10多年中，人们尝试着去开发一些非破坏性的成像技术来直接研究根系，建立了一系列基于计算机X射线断层摄像技术的方法，这些方法能够高通量实时检测根系的3D结构、土壤的养分和水分状况［23，24］。但是这种方法对于遗传学研究来说，最大的限制是获取数据的时间只有一到几个小时，利用基于X射线吸收和光透射的2D成像技术可以对其不足进行弥补［25］， 不过上述方法需要一定的技术和较为昂贵的设备。水培方法是目前进行根系形态研究的一种常用方法，它的优点在于能获得较为准确的表型数据，还很容易对植物生长的环境进行控制，减少其他因素对根系发育内在机制研究的干扰，并可以将影响根系发育的因素进行分解，用于研究根系对不同因素的响应机制。不过，水培方法也有其局限性，由于根系发育具有高度的可塑性，在这种条件下得到的数据需要进一步的验证。
2．2QTL分析在禾本科植物根系性状研究中的应用
到目前为止，对根系性状的QTL定位已经在包括拟南芥在内的十几种植物中相继开展，在禾本科植物中也有了较多的报道。一些调控根系性状的主效QTL位点和调控根系构型对环境响应的QTL位点甚至可以解释30％以上的表型变异，有些QTL位点甚至有在生产上直接应用的潜力。例如水稻中控制根系深度的QTL位点有利于提高植物的抗旱性和对移动性强的营养元素的吸收［26］。能够在不同遗传群体重复检测到的QTL位点似乎在根系育种中是最有应用价值的。比如在水稻和玉米中，已经有成功利用分子标记辅助选择技术（MAS）对调控根系的QTL位点进行选择的报道［26-28］。在水稻9号染色体上定位到一个调控根系深度的QTL位点，这个位点在干旱条件下存在着与环境的互作效应，这就暗示着该位点在干旱胁迫中可能发挥更大的作用［26］。
对于那些尚未完成基因组测序，且基因组结构比较复杂的作物（例如小麦），QTL定位是目前研究根系发育的主要方法之一。例如在小麦上已经有了不少相关的报道。An等［29］利用一套“旱选10号×鲁麦14”小麦DH群体进行苗期水培试验，定位了5个调控根系干物重的QTL位点，单个QTL位点可解释根干重表型变异的8．6％～19．6％，其中3个位点与大田成熟期吸氮量的QTL位点共定位。李振兴等［30］检测到与小麦根系性状（最长根长、根数和根干重）及其磷胁迫响应（磷饥饿和低磷处理与正常供磷根系性状的相对值）有关的QTL位点30个，分布在14条染色体上。周晓果等［31］在水分胁迫及非胁迫两种条件下检测到调控根系性状的11个加性效应QTL 和15对上位性互作QTL，分布在除5A、4B、2D、6D和7D以外的所有染色体上。李卓坤等［32］利用一套永久F2群体分析了小麦幼苗8个根系性状的QTL，共定位到7个加性QTL位点和12对上位性QTL位点，这些QTL位点主要分布在1A、1D、2A、2B、2D、3A、3B、5D、6D 和7D 染色体上。Laperche等［33］用根盒方法定位6个调控缺氮条件下小麦根系形态的QTL位点，分布于4B、5A、5D和7B上。随着人们对根系性状研究的深入以及对基因组信息知道的越来越多，这些定位到的QTL位点将会为人们理解调控根系发育的复杂网络以及利用分子标记辅助选择的方法进行根系育种提供重要帮助。
3根系育种的重要性及其困难
3．1根系在作物生产中的重要性
由于在大田条件下对根系性状进行调查存在着很大困难，再加上根系形态能够对很多环境因素产生响应，即根系具有很强的可塑性，所以人们对根系形态的研究非常有限。早期的研究认为根系形态可能对土壤移动性差的营养元素吸收非常重要［34］，对于那些移动性强的营养元素（例如NO3－和 NH4＋），其作用就会小的多［35］，深根型的品种可能有利于这些元素的吸收。但是，因为植物在整个生活周期中会受到很多可变的环境因素影响，所以最终能否反映到产量上则存在很大的变数。不过已有研究表明，调控根系性状的一些QTL位点与调控吸氮量的位点共定位，说明在育种过程中对根系性状进行选择有可能是提高氮利用效率的一种有效途径［29－36］。Coque等［37］也发现不管是在高氮还是低氮条件下根系的构型对玉米的产量都有重要的影响。这些证据都表明了对根系性状进行选择的重要性。
事实上，在作物的驯化和育种过程当中，育种家在对地上部分性状进行选择时无意之中已经对根系性状进行了间接的选择，使作物的根系构型发生了很大的变化［22，38］，这充分说明了根系构型在作物生产中的重要作用。还有一些调控根系性状的QTL位点与调控生产力（产量、水分或营养吸收）的位点共定位，这进一步说明了根系性状的重要性［29，39］。这些研究表明，对调控根系的分子和遗传机制进行研究对于提高作物水分和养分的利用效率，进而对提高在环境胁迫条件下或中低产田的作物产量具有重要的意义。
3．2根系育种面临的困难与机遇
然而，将调控根系发育的遗传信息应用到育种当中还存在很多困难。首先，由于根系生长在地下，表型鉴定存在很大难度，目前对于植物根系的研究与其重要性是极不相称的，在作物中还没有一个调控根系构型的QTL位点被成功克隆。其次，根系构型的可塑性非常大，将其应用到常规育种时必须要考虑田间的土壤状况和农田气候等环境因素的影响［23］。再次，根系构型会对植物养分、水分利用效率产生非常大的影响，但其可塑程度依环境的不同而有所不同。人们对作物根系构型的调控还所知甚少，这极大地限制了其在育种上的应用。
不过机遇与挑战并存。育种家正在逐步将根系构型纳入到育种实践当中并取得了一些可喜的成绩［40］。随着一些主要的禾本科植物已经完成或正在测序，相信这些将会为在禾本科植物中鉴定和克隆调控根系性状的QTL位点／基因提供重要帮助，并进而为育种家开展根系育种提供更多的信息。
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正向遗传学克隆基因的方法范文5
effects of selective cox?2 inhibitor on dna repairing after irradiation
xu hui?ting, yu shi?ying, xia shu,xiong hua，zhuang liang
cancer center, tongji hospital, tongji medical college, huazhong university of science and technology, wuhan 430030, china
corresponding author: yu shi?ying,e?mail：abstract：objective to investigate the effects of a selective cox?2 inhibitor?celecoxib on dna repairing after x?rays irradiation，in order to elucidate the possible mechanism of the radiosensitization of selective cox?2 inhibitor.methods human cervical carcinoma cells (hela) were cultured in vitro and exposed to different doses of celecoxib for 48h then with and without radiation（6gy）, flow cytometry sub?g1fluorescence parameter line was performed to analyze the change of the apoptosis and cell cycle distribution.the dna damage and repair were detected by single cell gel electrophoresis assay.semi?quantitative rt?pcr and western blot were used to measure the mrna and protein level of ku70 and ku80 in hela cell lines treated with celecoxib.results celecoxib had no effect on the cell cycle distribution of hela cell lines,but it induced apoptosis increasing dependent on celecocib doses.radiation?induced apoptosis was enhanced after hela cells treated with celecoxib (enhancement factor=6.96 at100μmol/l), and the radiation?induced g2/m arrest was markedly decreased by celecoxib〔radiation group(rt): g2/m 32.35%, 100μmol/l celecoxib+rt: g2/m 5.95%〕. the dna damage induced by radiation was not increased,but the dna repair was reduced in hela cells treated with celecoxib (60μmol/l) for 48h, the mrna and protein level of ku70 and ku80 were also significantly decreased( p<0.05). conclusion the results suggest that the possible mechanism of radiosensitization of a selective cox?2 inhibitor was related to inhibition of dna repair including reduced g2/m arrest cells and decreased dna?pk expression.
key words：cyclooxygenase?2; celecoxib; g2?m phase; dna repair; radiation damage
环氧化酶（cyclooxygenase，cox）是花生四烯酸生物合成前列腺素(prostaglandin,pg)的限速酶, cox分为cox?1型和cox?2型。多数恶性肿瘤呈cox?2过度表达，且其表达水平与肿瘤的发生、发展、预后与转移有密切的关系。选择性cox?2抑制剂不仅具有抗肿瘤活性，在体内外试验[1]和临床试验[2]中还证实其对肿瘤具有放射增敏效应。但其放射增敏机制还不是很清楚，可能与降低pge2水平、促进凋亡、改变细胞周期、抑制dna损伤的修复、抑制血管生成等有关。本文采用人宫颈腺癌hela细胞株，观察选择性cox?2抑制剂celecoxib对放射引起的dna损伤修复的影响，旨在进一步阐明选择性cox?2抑制剂的放射增敏机制。1 材料与方法
1.1 材料与仪器
宫颈癌hela细胞系由华中科技大学同济医学院附属同济医院肿瘤中心实验室冷藏；celecoxib药粉购自安徽森瑞有限公司；碘化丙啶(pi)、 rna酶a(rnase a)购自sigma公司；正常熔点、低熔点琼脂糖（nma，lma）购自gibco公司；rt?pcr主要试剂trizol购自上海华舜生物工程有限公司，逆转录试剂盒、taqdna polymerase、dntp mix均系美国fermentas公司产品，dna修复基因ku70、ku80引物由上海赛百胜公司合成；鼠源性单克隆抗体ku70、ku80购自neomarkers公司；fac sort 流式细胞仪(美国becton dickson 公司)。
1.2 细胞培养及处理
对数生长期hela细胞，0.25%胰酶消化分离，常规传代培养于rpmi?1640完全培养液中37℃、5%co2培养箱中培养。细胞分为空白组、给药组（celecoxib作用48h）、放射组(6mv x线 6gy) 、药放组（celecoxib作用48h后给予6mv x线 6gy），其中celecoxib再按浓度梯度分为20、40、60、80、100μmol/l组。
1.3 流式细胞仪sub?g1法检测细胞周期分布及凋亡率
按每孔105个细胞接种于6孔板，待24h后给予不同浓度的celecoxib, 使其终浓度分别为20、40、60、80、100μmol/l，空白组加同等体积的dmso，培养48h后收获细胞并以80%冰乙醇固定，?20℃固定过夜。同上另设6个浓度组celecoxib作用48h后予6mv x线6gy照射处理，继续培养24h后收获固定细胞。固定后细胞用pbs洗涤2次,100μl pc缓冲液冰上孵育30min。pbs 洗涤细胞,加10mg/ lpi10μl、50mg/mlrnasea10μl 、pbs500μl室温、暗处进行dna 染色20min。应用流式细胞仪经488nm 激光激发进行检测，应用cellquest 软件(美国becton dickson公司)分析结果。
1.4 单细胞凝胶电泳（single cell gel electrophoresis assay,scge）检测dna损伤
4组细胞（celecoxib只取60μmol/l组）每组均设平行对照组。将各组细胞消化制备成pbs单细胞悬液（5×105个/ml），并在处理后分别于0、15min、30min、1h、2h时间点收取细胞悬液置冰上。碱性单细胞凝胶电泳法检测dna单链断裂(ssb)：参照singh np [3]的方法，略修改。将上述各时间点收取的细胞在30min内铺入附着于载玻片上的琼脂糖胶内，4℃15min使胶完全凝固。后将胶板浸在碱性细胞裂解液中（2.5m nacl、0.1m edta、1%tritox?100、10%dmso）4℃避光作用2h或过夜；将裂解处理后的载玻片用蒸馏水清洗2次，置于解旋液（0.3mol/l naoh）中，4℃避光静置20min。随后将玻片移至盛有新鲜冰冷电泳缓冲液的水平电泳槽中25v，300ma电泳25min。停止电泳后将载玻片转移至中和缓冲液中10min，蒸馏水柔和冲洗2～3遍，略干后滴加浓度为20μg/ml的溴化乙啶50μl/片，盖上盖玻片放在湿盒中，2天内拍照保存。中性单细胞凝胶电泳法检测dna双链断裂（dsb）：制胶同碱性单细胞凝胶电泳法。将制好的胶板置入新配的中性裂解液(2mol pl nacl、30mmol/l edta、1%十二烷基肌氨酸钠、10mmol/l tris、1%triton x?100、10%dmso、ph8.2～8.5)中于4℃裂解2h或过夜；0.5%tbe(2mmol/ledta、90mmol/l tris、90mmol/l 硼酸、ph8.2～8.5)浸没漂洗3次,每次1h；在盛有0.5%tbe电泳缓冲液的水平电泳槽中0.6v/cm ，电泳25min；后同碱性单细胞凝胶电泳法。在荧光显微镜下每样本观察100个细胞，用casp comet assay software project对彗星图像进行分析，计算各组彗星的oliver尾矩（oliver tail moment，otm，即尾部dna百分含量×迁移dna中心密度）。
1.5 半定量rt?pcr
分析给药组（60μmol/l celecoxib作用48h）与空白组hela（只给相当dmso）细胞ku80、ku70 mrna的表达。按试剂说明书完成rna抽提纯化和cdna的合成，以逆转录产物为模板进行pcr扩增。
ku70引物为：5′ctctatcgggaaacaaatgaaccag?3′25bp（正向），5′gtatctgcacaatgctgcaacctcc?3′25bp（反向），退火温度54℃，扩增产物339bp；ku80引物为：5′tatgctcccaccgaggcacagttga?3′25bp（正向），5′actgccttcagccagactggagacg?3′25bp（反向），退火温度56℃，扩增产物478bp；β?actin引物为：5′cctagaagcatttgcggtgg?3′，20bp (正向),5′gagctacgagctgcctgacg?3′，20bp （反向），退火温度56℃，扩增产物416bp。pcr产物经1.5％琼脂糖凝胶电泳分离，紫外灯下观察并拍照。
1.6 western blot检测
按给药组（60μmol/l celecoxib作用48h）与空白组hela（只给相当dmso）提取细胞总蛋白。具体方法如下：冷的pbs溶液洗3遍，适量细胞裂解液（150mmol/l tris?cl、0.02%叠氮钠、0.1%sds、100μg/ml pmsf、1μg/ml aprotinin、1%np40、0.5%去氧胆酸钠、150mmol/l nacl）裂解提取总蛋白，用10%的分离胶做sds?page，然后转移至nc膜上，5%脱脂奶tbst室温封闭1h，分别加入一抗4℃孵育过夜，tbst洗涤10min×3次，辣根过氧化物酶二抗室温孵育1.5h， tbst洗涤10min，洗3次，ecl曝光试剂盒曝光底片显影。
1.7 统计学方法
以上实验均重复3次，组间和组内采用t检验和方差分析，数据分析由spss11.0软件完成。
2 结果
2.1 celecoxib与射线单独和联合作用后hela细胞周期及凋亡率的变化 单独 celecoxib作用48h后对hela细胞的周期分布无明显改变，但celecoxib可引起hela 细胞发生剂量依赖性的凋亡，见表1。表1 celecoxib对细胞周期和凋亡率的影响
celecoxib+放射组与单纯放射组相比,可明显提高放射引起的凋亡率，在celecoxib浓度为60、80、100μmol/l时，可分别增强放射诱导的凋亡率达3.18、4.16、6.96倍。同时celecoxib对6gy x线引起的g2/m期阻滞有明显的减弱作用，见图1。
2.2 celecoxib与射线联合作用对hela细胞dna损伤的影响
2.2.1 碱性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞ssb如表2所示，空白组与加药组的ssb损伤之间差异无统计学意义（p>0.05），表明适当剂量的celecoxib（60μmol/l）并不引起明显的ssb。药放组与放射组相比，其初始ssb（照射后0min时的ssb）无差异（p>0.05），而药放组照射后各时间点的ssb均高于放射组（p<0.05）；并且放射组的ssb于照射后2h基本修复完全（与空白组相比差异无统计学意义，p>0.05），药放组的ssb修复较慢，至照射后2h仍有明显残留的ssb未修复。
2.2.2 中性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞dsb 如表3所示，与ssb的检测结果相似，药放组与放射组相比，其初始dsb也无差异（p>0.05）；而药放组与放射组相比，药放组的dsb修复速度明显低于放射组（p<0.05）, 至照射后2h药放组仍有约37％的残留dsb未修复。
2.3 半定量rt?pcr方法检测celecoxib对hela细胞ku70，ku80 mrna表达水平的影响
空白组ku70(1.030±0.066)，ku80(1.335±0.082)mrna表达水平明显高于给药组ku70(0.744±0.066)，ku80(0.596±0.024)mrna表达水平（p<0.05），见图2。
2.4 western blot检测celecoxib对hela细胞ku70和ku80蛋白表达的影响表2 碱性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞ssb尾距（otm）rt* ：radiation; n=9；rt+celecoxib组与rt*组的0min相比，p>0.05；rt+celecoxib组与rt*组其余时间点相比，p<0.05；celecoxib组与control组相比，p>0.05表3 中性单细胞凝胶电泳法检测hela细胞dsb尾距（otm） 结果显示宫颈癌hela细胞经60μmol/l celecoxib作用48h后，ku70（0.390±0.058），ku80（0.647±0.120）蛋白表达水平均较空白组ku70(0.785±0.113)，ku80(1.232±0.167)（p<0.05）有明显下调，见图3。
3 讨论
目前已有临床研究表明，放射敏感的肿瘤表达的cox?2蛋白水平普遍低于放射抗拒的肿瘤，且cox?2蛋白的表达水平与肿瘤的放射敏感性呈正相关[4,5]。体内试验和体外试验早已证明，非甾体消炎药（nsaids）如吲哚美辛（indomethacin）或布洛芬（ibuprofen）可提高肿瘤放射效应。近期研究表明选择性cox?2抑制剂的放射增敏效应显著高于非选择性cox抑制剂，如在相同的鼠移植瘤模型中，以肿瘤生长延缓(tumor growth delay，gd) 为评价标准，sc?236和吲哚美辛的放射增强因子(enhancement factor, ef)分别为3.64和1.39[1,6]。其放射增敏机制可能与抑制cox?2的活性，降低细胞内pge2水平；促放射诱导的凋亡；细胞周期改变和抑制dna损伤修复有关。该实验室曾在体内外实验中证实，celecoxib对宫颈癌hela细胞具有放射增敏作用，并在其小鼠移植瘤模型中证实hela细胞具有高cox?2表达[7]。该实验研究了选择性cox?2抑制剂celecoxib与放疗结合时对宫颈癌hela细胞dna损伤修复的影响。
3.1 细胞周期与放射敏感
处于不同周期的细胞，对低let射线放射敏感性不同，多数实验提示处于m期和g2期的细胞放射敏感性最高。raju等[8]发现用sc?236处理nfsa(一种鼠源肉瘤细胞)也可引起g2/m期细胞的累积（67％），同时 cyclin a、b以及cdk?1的表达下调。另外，阻滞pg的合成也可能导致g2/m期细胞的堆积。这说明选择性cox?2抑制剂的放射增敏机制可能与细胞周期的再分布有关。但petersen等[9]的研究发现，经sc?236处理2天，u251的细胞周期没有明显改变。也就是cox?2抑制剂诱导细胞周期阻滞与肿瘤细胞类型或其他未知因素有关。该实验也发现单独celecoxib作用于hela细胞不显著影响细胞周期分布，但可使放射引起的g2/m期阻滞作用明显减弱。见图4。与此类似，park等 [10,11]的研究也发现celecoxib可以显著削弱放射引起的cox?2阳性表达细胞的g2/m期阻滞，并认为这种作用与celecoxib阻止cdk1、cdk2的磷酸化有关。
真核细胞受照射后，可以广泛诱导g2期阻滞出现，这在保证细胞的完整性、损伤后细胞的存活和保持细胞的遗传稳定性方面具有重要生物学和遗传学意义。哺乳动物细胞预先用咖啡因[12]（可以解除照射诱导的细胞g2期阻滞）处理后照射，可以使细胞存活率明显下降，这说明辐射诱导的细胞g2期阻滞是机体的一种保护性调节。cyclinb1?cdc2复合物的活性状态在g2/m期进程调控中起关键作用， 目前普遍认为，atm/atr激酶?chk1/chk2?cdc25c?cdc2是放射诱导g2/m期阻滞的主要途径。但celecoxib如何影响上述途径，使g2/m期阻滞缺失和凋亡促进的分子机制还有待进一步研究。
3.2 dna修复与放射敏感性
dna是电离射线杀伤细胞的主要靶分子，辐射诱导的dna断裂及修复,与细胞内在放射敏感性有很好的相关性,可为细胞内在放射敏感性的预测指标。细胞受到分割的低剂量放射后，少部分细胞呈亚致死性损伤（sld），在细胞存活曲线上出现亚致死性损伤的累积，表现为存活曲线出现肩部及肩区的dp值（即阈值剂量）。raju等[8]发现用sc?236（50um,3天）可消除放射存活曲线上的肩区，并通过分割照射（3gy/次，2次间隔4h）证明单纯放射组（1.4）较sc?236＋放射组（1.1）有较高的修复能力。
双链断裂(dsb)是辐射所致细胞死亡的最重要的dna损伤形式，它的修复是通过两种形式的重组修复进行的：同源重组（homologous recombination repair，hr）和非同源末端结合重组（non?homologous end joining, nhej），前者是低等生物修复形式,而高等生物主要是后者。dna依赖的蛋白激酶(dna?pk)是参与nhej的重要分子，在dna损伤修复时，首先由其ku亚基结合损伤dna激活dna?pkcs后启动dna损伤修复机制。已经证实,一些哺乳动物辐射敏感细胞系不能进行dsb修复的原因是由于dna依赖的蛋白激酶(dna?pk)成分ku的缺失。lim等[13]研究发现cox?2抑制剂可以下调ku70,ku80这两种dna修复相关基因的表达。md anderson的raju等[14]的实验也不仅在蛋白水平证明celecoxib抑制ku70的表达，同时证明celecoxib还可降低dna?ku的结合活性。
综上所述，cox?2 选择性抑制剂celecoxib对肿瘤细胞的放射增敏机制可能与抑制dna损伤修复有关，其作用可能通过减弱细胞周期g2/m检测点（checkpoint）作用和减弱dsb重组修复酶dna?pk成分ku的表达得以实现。但celecoxib如何影响细胞周期和dna损伤修复的分子机制还有待进一步研究。
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