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生物质谱技术与方法范文1
关键词:蛋白质,质谱分析,应用
前言:
蛋白质是生物体中含量最高,功能最重要的生物大分子,存在于所有生物细胞,约占细胞干质量的50%以上,作为生命的物质基础之一,蛋白质在催化生命体内各种反应进行、调节代谢、抵御外来物质入侵及控制遗传信息等方面都起着至关重要的作用,因此蛋白质也是生命科学中极为重要的研究对象。关于蛋白质的分析研究,一直是化学家及生物学家极为关注的问题,其研究的内容主要包括分子量测定,氨基酸鉴定,蛋白质序列分析及立体化学分析等。随着生命科学的发展,仪器分析手段的更新,尤其是质谱分析技术的不断成熟,使这一领域的研究发展迅速。
自约翰.芬恩(JohnB.Fenn)和田中耕一(Koichi.Tanaka)发明了对生物大分子进行确认和结构分析的方法及发明了对生物大分子的质谱分析法以来,随着生命科学及生物技术的迅速发展,生物质谱目前已成为有机质谱中最活跃、最富生命力的前沿研究领域之一[1]。它的发展强有力地推动了人类基因组计划及其后基因组计划的提前完成和有力实施。质谱法已成为研究生物大分子特别是蛋白质研究的主要支撑技术之一,在对蛋白质结构分析的研究中占据了重要地位[2]。
1.质谱分析的特点
质谱分析用于蛋白质等生物活性分子的研究具有如下优点:很高的灵敏度能为亚微克级试样提供信息,能最有效地与色谱联用,适用于复杂体系中痕量物质的鉴定或结构测定,同时具有准确性、易操作性、快速性及很好的普适性。
2.质谱分析的方法
近年来涌现出较成功地用于生物大分子质谱分析的软电离技术主要有下列几种:1)电喷雾电离质谱;2)基质辅助激光解吸电离质谱;3)快原子轰击质谱;4)离子喷雾电离质谱;5)大气压电离质谱。在这些软电离技术中,以前面三种近年来研究得最多,应用得也最广泛[3]。
3.蛋白质的质谱分析
蛋自质是一条或多条肽链以特殊方式组合的生物大分子,复杂结构主要包括以肽链为基础的肽链线型序列[称为一级结构]及由肽链卷曲折叠而形成三维[称为二级,三级或四级]结构。目前质谱主要测定蛋自质一级结构包括分子量、肽链氨基酸排序及多肽或二硫键数目和位置。
3.1蛋白质的质谱分析原理
以往质谱(MS)仅用于小分子挥发物质的分析,由于新的离子化技术的出现,如介质辅助的激光解析/离子化、电喷雾离子化,各种新的质谱技术开始用于生物大分子的分析。其原理是:通过电离源将蛋白质分子转化为气相离子,然后利用质谱分析仪的电场、磁场将具有特定质量与电荷比值(M/Z值)的蛋白质离子分离开来,经过离子检测器收集分离的离子,确定离子的M/Z值,分析鉴定未知蛋白质。
3.2蛋白质和肽的序列分析
现代研究结果发现越来越多的小肽同蛋白质一样具有生物功能,建立具有特殊、高效的生物功能肽的肽库是现在的研究热点之一。因此需要高效率、高灵敏度的肽和蛋白质序列测定方法支持这些研究的进行。现有的肽和蛋白质测序方法包括N末端序列测定的化学方法Edman法、C末端酶解方法、C末端化学降解法等,这些方法都存在一些缺陷。例如作为肽和蛋白质序列测定标准方法的N末端氨基酸苯异硫氰酸酯(phenylisothiocyanate)PITC分析法(即Edman法,又称PTH法),测序速度较慢(50个氨基酸残基/天);样品用量较大(nmol级或几十pmol级);对样品纯度要求很高;对于修饰氨基酸残基往往会错误识别,而对N末端保护的肽链则无法测序[4]。C末端化学降解测序法则由于无法找到PITC这样理想的化学探针,其发展仍面临着很大的困难。在这种背景下,质谱由于很高的灵敏度、准确性、易操作性、快速性及很好的普适性而倍受科学家的广泛注意。在质谱测序中,灵敏度及准确性随分子量增大有明显降低,所以肽的序列分析比蛋白容易许多,许多研究也都是以肽作为分析对象进行的。近年来随着电喷雾电离质谱(electrosprayionisation,ESI)及基质辅助激光解吸质谱(matrixassistedlaserdesorption/ionization,MALDI)等质谱软电离技术的发展与完善,极性肽分子的分析成为可能,检测限下降到fmol级别,可测定分子量范围则高达100000Da,目前基质辅助的激光解吸电离飞行时间质谱法(MALDITOFMS)已成为测定生物大分子尤其是蛋白质、多肽分子量和一级结构的有效工具,也是当今生命科学领域中重大课题——蛋白质组研究所必不可缺的关键技术之一[5]。目前在欧洲分子生物实验室(EMBL)及美国、瑞士等国的一些高校已建立了MALDITOFMS蛋白质一级结构(序列)谱库,能为解析FAST谱图提供极大的帮助,并为确证分析结果提供可靠的依据[6]。
3.3蛋白质的质谱分析方式
质谱用于肽和蛋白质的序列测定主要可以分为三种方法:一种方法叫蛋白图谱(proteinmapping),即用特异性的酶解或化学水解的方法将蛋白切成小的片段,然后用质谱检测各产物肽分子量,将所得到的肽谱数据输入数据库,搜索与之相对应的已知蛋白,从而获取待测蛋白序列。将蛋白质绘制“肽图”是一重要测列方法。第二种方法是利用待测分子在电离及飞行过程中产生的亚稳离子,通过分析相邻同组类型峰的质量差,识别相应的氨基酸残基,其中亚稳离子碎裂包括“自身”碎裂及外界作用诱导碎裂.第三种方法与Edman法有相似之处,即用化学探针或酶解使蛋白或肽从N端或C端逐一降解下氨基酸残基,形成相互间差一个氨基酸残基的系列肽,名为梯状测序(laddersequencing),经质谱检测,由相邻峰的质量差知道相应氨基酸残基。
3.3.1蛋白消化
蛋白的基团越大,质谱检测的准确率越低。因此,在质谱检测之前,须将蛋白消化成小分子的多肽,以提高质谱检测的准确率。一般而言,6-20个氨基酸的多肽最适合质谱仪的检测。现今最常用的酶为胰蛋白酶(trypsin),它于蛋白的赖氨酸(lysine)和精氨酸(arginine)处将其切断。因此,同一蛋白经胰蛋白酶消化后,会产生相同的多肽。
3.3.2基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法(MALDI-TOFMS)[7]
简而言之,基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量仪是将多肽成分转换成离子信号,并依据质量/电荷之比(mass/charge,m/z)来对该多肽进行分析,以判断该多肽源自哪一个蛋白。待检样品与含有在特定波长下吸光的发光团的化学基质(matrix)混合,此样品混合物随即滴于一平板或载玻片上进行挥发,样品混合物残余水份和溶剂的挥发使样品整合于格状晶体中,样品然后置于激光离子发生器(lasersource)。激光作用于样品混合物,使化学基质吸收光子而被激活。此激活产生的能量作用于多肽,使之由固态样品混合物变成气态。由于多肽分子倾向于吸收单一光子,故多肽离子带单一电荷.这些形成的多肽离子直接进入飞行时间质量分析仪(TOFmassanalyzer)。飞行时间质量分析仪用于测量多肽离子由分析仪的一端飞抵另一端探测器所需要的时间。而此飞行时间同多肽离子的质量/电荷的比值成反比,即质量/电荷之比越高,飞行时间越短。最后,由电脑软件将探测器录得的多肽质量/电荷比值同数据库中不同蛋白经蛋白酶消化后所形成的特定多肽的质量/电荷比值进行比较,以鉴定该多肽源自何种蛋白.此法称为多肽质量指纹分析(peptidemassfin-gerprinting)。基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法操作简便,敏感度高,同许多蛋白分离方法相匹配,而且,现有数据库中有充足的关于多肽质量/电荷比值的数据,因此成为许多实验室的首选蛋白质谱鉴定方法。
3.3.3电子喷雾电离质谱测量法(electrosprayion-izationmassspectrometry,ESI-MS)[8]
同基质辅助激光解吸电离/飞行时间质谱测量法在固态下完成不同,电子喷雾电离质谱测量法是在液态下完成,而且多肽离子带有多个电荷,由高效液相层析等方法分离的液体多肽混合物,在高压下经过一细针孔。当样本由针孔射出时,喷射成雾状的细小液滴,这些细小液滴包含多肽离子及水份等其他杂质成分。去除这些杂质成分后,多肽离子进入连续质量分析仪(tan-demmassanalyzer),连续质量分析仪选取某一特定质量/电荷比值的多肽离子,并以碰撞解离的方式将多肽离子碎裂成不同电离或非电离片段。随后,依质量/电荷比值对电离片段进行分析并汇集成离子谱(ionspectrum),通过数据库检索,由这些离子谱得到该多肽的氨基酸序列。依据氨基酸序列进行的蛋白鉴定较依据多肽质量指纹进行的蛋白鉴定更准确、可靠。而且,氨基酸序列信息即可通过蛋白氨基酸序列数据库检索,也可通过核糖核酸数据库检索来进行蛋白鉴定。
4.蛋白质质谱分析的应用
1981年首先采用FAB双聚焦质谱测定肽分子量,分析十一肽(Mr=1318),质谱中出现准分子离子[M+1]+=1319强峰。分子量小于6kDa肽或小蛋白质合适用FAB质谱分析,更大分子量的多肽和蛋自质可用MALDI质谱或ESI质谱分析。用MALDI-TOF质谱分析蛋自质最早一例是HillenKramp等[9]于1988年提出用紫外激光以烟酸为基质在TOF谱仪上测出质量数高达60kDa蛋白质,精确度开始只有0.5%,后改进到0.1-0.2%。质谱技术主要用于检测双向凝胶电泳或“双向”高效柱层析分离所得的蛋白质及酶解所得的多肽的质量,也可用于蛋白质高级结构及蛋白质间相互作用等方面的研究[10,11],三条肽段的精确质量数便可鉴定蛋白质。近年来,串联质谱分析仪发展迅猛,其数据采集方面的自动化程度、检测的敏感性及效率都大大提高,大规模数据库和一些分析软件(如:SEQUEST)的应用使得串联质谱分析仪可以进行更大规模的测序工作。目前,利用2D电泳及MS技术对整个酵母细胞裂解产物进行分析,已经鉴定出1484种蛋白质,包括完整的膜蛋白和低丰度的蛋白质[12];分析肝细胞癌患者血清蛋白质组成分[13],并利用质谱进行鉴定磷酸化蛋白研究工作[14]及采用质谱技术研究许旺细胞源神经营养蛋白(SDNP)的分子结构[15]等。
结束语:
在蛋白质的质谱分析中,质谱的准确性(accuracy)对测定结果有很大影响,因此质谱测序现在仍很难被应用于未知蛋白的序列测定。肽和蛋白的质谱序列测定方法具有快速、用量少、易操作等优点,这些都非常适合于现在科学研究的需要。我们相信,随着各种衍生化方法和酶解方法的不断改进,蛋白双向电泳的应用[16]以及质谱技术的不断完善,质谱将会成为多肽和蛋白质分析最有威力的工具之一。
参考文献
1.吴世容,李志良,李根容,等.生物质谱的研究及其应用.重庆大学学报,2004,27(1):123-127.
2.成海平,钱小红.蛋白质组研究的技术体系及其进展.生物化学与生物物理进展,2000,27:584588.
3.陈绍农,潘远江,陈耀祖.多肽及蛋白质质谱分析新进展.质谱学报,1995,16(3):15-21.
4.陈晶,付华,陈益.质谱在肽和蛋白质序列分析中的应用.有机化学,2002,22(2):81~90.
5.解建勋,蒲小平,李玉珍,等.蛋白质组分析技术进展.生物物理学报,2001,17:19-26.
6.刘慧敏,赖志辉,黎军,等.碎片结构分析在MALDITOFMS法测定多肽序列中的应用.生物化学与生物物理学报,2000,32:179-182.
7.Lay.JOJr.MALDI-TOFmassspectrometryofbacteria.[J].MassSpectromRev,2001;20(4):172-194.
8.HarveyDJ.Identificationofprotein-boundcarbohydratesbymassspectrometry[J].Proteomic,2001;1(2):311-328.
9.KARASM,HILLENKAMPF.Laserdesorptionionizationofproteinswithmolecularmassesexceeding10000daltons[J].Anal.Chem,1988,60:2299-2301.
10.龚海霞,陈荣华,郭锡熔.蛋白质组技术及其在临床医学领域的运用.国外医学儿科学分册,2001;28(6):287-289.
11.魏开华,杨松成,王红霞,等.转印到膜上的蛋白质的质谱分析.质谱学报,2000;20(3,4):89-90.
12.司英健.蛋白质组学研究的内容、方法及意义.国外医学临床生物化学与检验学分册,2003;24(3):167-168.
13.王征,阮幼冰,官阳.肝细胞癌患者血清蛋白质组成分的双向凝胶电泳-飞行时间质谱分析.中华病理学杂志,2003;32(4):333-336.
14.黄珍玉,于雁灵,方彩云,等.质谱鉴定磷酸化蛋白研究进展.质谱学报,2003;24(4):494-500.
生物质谱技术与方法范文2
需强调的是,质谱也有局限性,杂质结构最可靠的确证还是依靠杂质单体的获得和结合其他技术的综合解析。手性杂质手性药物中的对映异构体限量检查越来越受关注,旋光光谱(ORD)、圆二色光谱(CD)的测定仍是目前首选的快速检测方法;手性色谱法不仅可以定性而且是更可靠的定量手段[20]。HPLC在手性分离方面仍然占据主要地位,运用相对较广泛的手性固定相多数是多糖类,键合相多糖类手性柱也日趋成熟,如ChiralIC柱。其他如环糊精、手性冠醚类、Pirkle型、蛋白质、配体、离子交换以及大环抗生素等手性固定相以及新型柱前衍生化法方面仍有一些新的发展,采用整体柱技术制备手性色谱柱近年来也成为热点。由于UHPLC的出现,小粒径的手性填料也必将成为今后的研究热点。离子液体在手性药物色谱分析上的研究也日渐增多。传统的气相色谱依托着环糊精衍生物等固定相在手性分离中仍然有一定的运用,而利用离子液体进行手性分离成为手性气相色谱的发展方向之一。其他色谱技术,如超临界流体色谱、模拟移动床色谱、高速逆流色谱等在手性药物分析和对映体制备中继续发挥着积极作用。CE具有独特的分离机制,用于药物光学异构体的分析仍是一个较好的选择。毛细管区带电泳(CZE)和胶束电动毛细管电泳(MEKC)仍是应用最多的模式。在CE研究中非水毛细管电泳、毛细管微乳电动色谱、2D-CE、3D-CE等也已成为热点。另外,对毛细管柱的手性改性也是一些研究者关注的对象。由于毛细管电泳在手性分离上的优势,新的手性添加剂仍是其重要的研究方向。而毛细管整体柱的快速发展,使得毛细管电色谱(CEC)技术在手性药物分析上成为新的增长点[21]。基因毒性杂质的分析[4]171-191基因毒性杂质(GTIs)的毒性阈值水平也是目前关注的热点。2006年欧洲药品局(EMEA)首先颁布了EvaluationofMedicinesforHumanUse,GuidelineontheLimitsofGenotoxicImpurities,FDA于2008年也正式签发了类似指南[22]。要识别这些杂质,应该对涉及合成过程的化学反应、与原材料有关的杂质等进行科学地评价。上述指南同时适用于辅料和药物活性物质。基因毒性杂质的控制在药物研究的初期就应考虑,并贯穿于整个药物研发、生产以及上市过程。基因毒性杂质的检测属于痕量分析,对灵敏度、选择性、重现性和耐用性有更高的要求,最常用的分析方法也是LC和GC,及其与质谱的联用。超临界流体色谱法(SFC)和CZE方法最近在GTIs检测中也有一些报道。对于无紫外可见吸收的GTIs,可以选择电雾检测器(CAD)、蒸发光散射检测器(ELSD)等检测器。如果检测器对于GTIs没有特别的专属性,色谱分离就显得尤其重要。若采用GC,常用的检测器是FID和MS,也可以根据GTIs的结构特征来选择理想的检测器(例如ECD)。处方前和早期阶段的分析方法处方前研究应根据不同检测项目的需要选择适当的分析方法。对于药物的鉴别,赋形剂和包装的鉴定,FTIR,NIR和拉曼等光谱技术依然是重要的手段,一些分析技术如衰减全反射红外光谱法(ATR-FTIR)也开始广泛应用到药物研究中。电感耦合等离子体光谱(ICP),原子光谱和X射线荧光对外来金属污染物的检测已成为必不可少的技术。对于一些新型给药系统,目前药物分析研究的热点集中在高通量的样品前处理技术、自动化技术的研究上。上述研究除了对应的相关技术外,色谱方法仍是最重要和应用最广泛的定性定量手段。HPLC方法液相色谱的发展以色谱填料的发展为基础,新的不同机制的固定相的不断涌现带动了整个液相色谱的发展。由于所研究的化合物实体类型越来越多,对分离的要求也更高,新的功能化和吸附模式的固定相不断涌现,例如用于极性化合物分离的亲水作用色谱(hydro-philicinteractionliquidchromatography,HILIC),多功能有机杂化硅胶、聚合物固定相、核壳型填料和纳米及亚微米填料等。UHPLC方法亚微米颗粒(<2μm)填充的微径和纳米级口径的色谱柱,具有高柱效、高分辨率、高峰容量和高流量等优点,促进了UHPLC在药物定性和定量分析中的广泛应用。特别是针对杂质研究,结合扫描速度更快、分辨率更高的质谱检测更具优势。随着更小颗粒填料的使用,能够在更宽的线速度范围内保持恒定柱效,将大幅度改善液相色谱的分离度与灵敏度,微高效液相(micro-HPLC)[23]和纳米高效液相色谱(nano-HPLC)[24]将成为未来几年药物色谱分析发展的新热点。整体柱技术在药物色谱分析领域,整体柱已成为药物色谱分析研究的热点[25]。近年来它在高效、快速、高通量分离分析方面得到了较快的发展,并开始广泛用于药物小分子和生物大分子的分析。整体柱具有通透性优良、制备简单和背压极低等特点,其在快速分离分析和二维液相色谱中具有明显优势,而通过制备超长柱不仅可弥补整体柱载样量的不足,同时也可有效提高其分离能力。目前整体柱的研究主要集中在有机聚合物整体柱,无机-有机杂化整体柱,β-环糊精硅胶杂化的手性整体柱的研究。基因工程药物质量研究蛋白类药物结构复杂,加上生产过程所造成的微观不均一性的存在,使得这种复杂性倍增,而且在编译DNA过程中,可能产生非预期的蛋白序列。除了生物大分子的常规分析外,药物分析技术的发展主要体现在以下几个研究领域。肽图分析肽图分析的主要手段是利用蛋白酶对特定的位点进行分解,再采用HPLC-UV或LC-MS等方法进行分离和测定,对蛋白质和多肽结构研究和特性鉴别具有重要意义。传统的方法存在酶解时间长、酶的自身分解以及测定重复性较差等问题。一些研究者利用激光照射提高酶解速度[26]。在溶液中加入钙离子、减少甲基化和固定化酶等可以解决酶的稳定性问题。其中,由于固定化酶的再使用性、减少底物稀释以及可连续使用等优势已经越来越被广泛的运用到肽图分析中,并且与LC-MS联用后,可以实现对基因工程药物高通量的肽图分析[27]。另外,由于CE具有样品和试剂消耗低,分离效率高,分析速度快,分离模式多样等优势,加上近年来其检测技术的改善和与质谱联用技术的日趋成熟,使得其在肽图的分析中发挥着越来越大的作用[28]。氨基酸分析目前氨基酸分析研究主要致力于缩短分析时间,随着同位素标记的发展[29-30]和微波技术的成熟,氨基酸的分析速度变得越来越快。毛细管电泳与质谱联用技术快速高效,已经常被用于氨基酸分析,通过同位素标记,其检测的灵敏度大幅提高。而一些在线的前处理技术与色谱技术的联用为高通量的实现提供了帮助。相对分子质量测定基因工程药物相对分子质量测定的传统方法主要是凝胶电泳或者高分辨质谱,利用沉降速度的差异也可以测定大分子物质的相对分子质量[31]。同时,纳米技术的发展也带动了相对分子质量测定技术的发展,研究表明加入碳纳米管可以使得聚丙烯酰胺凝胶电泳分离的效果大大提高[32]。生物大分子结构的研究生物大分子的生物活性取决于它们复杂的空间构象,常规研究方法有圆二色谱、红外光谱、拉曼光谱、X射线衍射和低温电子显微镜等。利用多维NMR进行蛋白质的结构和分子相互作用研究,以及利用生物质谱进行其结构和定量研究仍是目前研究的热点。
体内药物分析及药物代谢体内药物分析逐步从以静态物质为中心向以动态生命科学为基础的方向转变,研究药物的吸收、代谢、分布、排泄、立体选择性、药物的相互作用、药物对内源性代谢的影响,为新药发现提供了新的途径。利用核磁共振、色谱质谱联用等技术,结合化学计量学方法(模式识别、多元校正、多元曲线分辨),采用组学和系统生物学方法,研究生物体整体或组织细胞系统的动态代谢变化,特别是药物对内源代谢、遗传变异乃至各种物质进入代谢系统的特征和影响,发现相关生物标志物,也是体内药物分析近年来发展的重要方向。体内药物分析中的联用技术联用技术是分析体内药物和代谢物最常用的技术,如GC-MS、LC-MS/MS、HPLC/ICP-MS、LC-NMR、CE-ESI-MS等,它将分离、定量和定性融为一体。近年来,UHPLC及其联用技术因其具有较高的分辨率和较快的分析速度使其在药物代谢研究中备受青睐[33]。在体内药物分析中,GC作为一种成熟的方法已发展到一个瓶颈期,新的技术革新主要着眼于色谱柱和原有仪器的改进以及便携式微型GC的发展。GC-MS由于EI离子源较难得到分子离子峰因而也面临着未知物测定的难题,利用HRAM-APCI-GC联用技术可以得到准确的分子离子峰,有效地解决了这一难题。近年来,二维气相色谱(GC×GC)成为GC发展新的增长点,结合TOF/MS的联用技术,使之具有更高的灵敏度和分辨率,特别适合于中药复杂体系分析、兴奋剂检测以及临床和法医毒理学中的药物毒物分析[34]。新的LC与MS的联用技术层出不穷,例如同位素标记/稀释技术可以拓展LC-ESI-MS的线性范围及降低基质效应;微喷雾和纳喷雾(nano-ESI)技术提高了微量样品分析的灵敏度;具有高通量、灵敏度和准确度的HPLC-MAL-DI/TOF-MS;能得到很多的碎片信息和更小的基质效应的LC-(coldEI)-MS技术;LC与线性离子阱(lineariontrap,LIT)质谱的联用,与三维离子阱相比,贮存离子能力提高,空间电荷效应有一定改善;在线分析中SPE与UPLC-QqLIT的联用;LC-Q-TOF,LC-TOF-TOF、LC-线性离子阱静电轨道阱联用质谱仪(LTQ-Orbitrap)等技术的应用将使得药物开发、药物代谢分析、临床医学、毒物学研究以及蛋白质组学等方面的研究将更为广泛和深入[35-36]。在这些技术中,接口是影响联用的一个关键因素,例如CE-MS最成熟的是电喷雾离子化接口(ESI),新发展起来的无鞘流及低鞘流接口在分离效能和灵敏度方面表现出较大的吸引力,扩大了CE-MS的应用范围[37]。芯片电泳中激光解析离子化(LDI)接口也逐渐被应用,此外还有如CE-APEI-MS、CE-IT-MS、CE-API-MS等接口模式。代谢研究中的高分辨质谱技术新型高分辨质谱(HRMS)除了可得到所有待分析物质全扫描MS数据,其系统的精密度目前可与三重串联四极杆质谱相媲美,增强了其定量测定能力。而且HRMS可以得到超过预设质量范围的信息,因而能够对未知待测物进行测定,这是他区别于传统多重检测研究代谢组学的一个特点。未来代谢组学的发展趋势将是利用MS特别是HRMS在更宽的质量范围收集全扫描数据,同时对代谢物进行定性和定量分析。尽管当前MS的检测灵敏度和耐用性得到了显著提高,但许多问题仍不能得到解决,今后还应更加关注代谢物离子的提取效率和仪器分辨率的提高。新型HRMS如LTQ-Orbitrap、傅里叶变换离子回旋共振质谱(FTICR)的推出克服了以往TOF-MS在分析不同浓度待测物时质量准确度变化的缺点,并可在较大的动态范围内进行定量分析[38]。新的解吸附电喷雾离子化(DESI)技术几乎不需要样品前处理,利用喷雾解吸附、离子化,并将待测物导入质谱仪,可用于生物样品中药物代谢物的原位测定。新型MALDI技术(例如硅胶解析以及纳米技术的研究)将更加减少基质对测定结果的干扰[39]。利用13C,15N和34S同位素标记结合HRMS,用于体内生物小分子、蛋白质以及核酸的检测,也是人们关注的焦点。代谢研究中的NMR利用NMR进行代谢产物特别是大分子物质的结构确证是研究代谢的另一重要方法。最突出的技术进步就是2D-NMR方法的发展。它从根本上改变了NMR技术用于解决复杂结构问题的方式,使NMR技术成为解决复杂结构问题的最重要的方法。2D-NMR的发展扩展了杂核磁共振(X-NMR)的研究,如1H-13CHSQC和1H-15NHSQC等的广泛研究和使用[40]。近几年已出现3D-NMR技术来替代2D-NMR方法,用于生物大分子的结构测定。初步探索的结果表明3D-NMR方法可以同时检测13C,15N和1H之间的相互作用,能提供许多2D-NMR方法所不能提供的结构信息,从而简化结构解析过程[41]。近年来,一些新技术的出现也使NMR效能得到显著提高,例如更高的磁场强度、低温探针、微线圈探针、先进脉冲序列、同位素标记等。代谢研究中的CE技术CE技术在生物样品中大分子物质及其代谢产物的分析测定中具有显著的优越性。CE新技术为体内小分子的测定提供了有力工具,微芯片电泳、3D毛细管电泳、毛细管凝胶电泳(CGE),以及在微流控芯片上构建多维分析系统也为大分子物质的分离分析提供了新的技术平台。由于CE的灵敏度仍不够高,所以改进检测方法和样品富集技术一直是CE方法的研究重点[21]。体内药物分析中的前处理技术传统的生物样品处理方法主要是液液萃取、液固萃取以及沉淀等方法。分子印迹技术在色谱分离中由于其存在固有的色谱性能缺陷,使得其在定量药物分析领域应用受到限制,但在样品前处理领域仍有着广泛的应用前景。样品的前处理技术的发展趋势是用样量更少和选择性更高,如液相微萃取、固相微萃取技术、利用离子液体的微萃取技术、膜分离技术、碳纳米管技术、分子印迹技术等。而LC-MS的普及使在线固相萃取变得越来越重要。
现今仍然面临两个挑战:一是色谱分离机制必须与样品成分的理化性质相契合;二是在第一维色谱中分离的样品成分不能在接下来的分离中损失。在中药常量元素和痕量元素的质量控制中,传统的原子光谱技术依然占据主导地位,但一些灵敏度更高,分析速度更快、专属性更好的技术(如ICP-MS)应用越来越多[48]。中药质量控制是中药发展的核心所在,多元化的中药质量控制方法和注重中药的系统化研究将是发展趋势,生物效价和代谢组学等生物检测方法将会更广泛的应用于中药质量控制。中药对照品的建立也是今后工作的重点和难点,借助高速逆流色谱制备及NMR定量等技术手段,将使其能够得以更有效的实现。技术的不断进步和药物研究水平的不断提高,为药物分析学科的发展提供了广阔的空间,药物分析学正经历着前所未有的巨大变化。传统的药物分析学主要侧重于采用常规的分析方法对药物质量进行静态控制,而现代药物分析学科的发展将为新药的发现、药物的制造和药物的有效性和安全性的动态监测提供全方位强大的技术服务和保障,并引导药物科学取得新的进步。
作者:狄斌 苏梦翔 单位:中国药科大学 教育部药物质量与安全预警重点实验室
生物质谱技术与方法范文3
关键词:仪器分析 食品 检测 农药残留 兽药残留
中图分类号:O657 文献标识码:A 文章编号:1672-3791(2012)05(b)-0225-01食品消费安全是人们日常关注的重大问题之一,食品中的农药残留、兽药残留、非法添加剂、重金属等有害物质的残留问题依然存在。
在经历过三聚氰胺、瘦肉精、上海染色馒头,到如今的塑化剂等事件后,食品安全问题已然成为我们心中挥之不去的梦魇。
当面对这些丧失道德和法制基准的食品安全事故的时候,我们应该全面反省在食品安全方面的不足,同时加强对食品安全的监督与检测。
1 食品安全检测的特点
1.1?样品基质复杂
在我们的日常检测中,样品的来源复杂,种类繁多。样品包含了有人们日常食用的各种产品,如:蔬菜,水果,肉类,水产品等等。这些食品或其制品的成分都是一些结构复杂的有机物,这给检测工作带来了极大的干扰。将样品进行前处理后,复杂的样品基质干扰仍难完全解决。
1.2?检测项目种类和检测组分多
(1)农药残留。
目前世界各国的化学农药品种约有1400多个,常见的主要有:有机氯、有机磷、氨基甲酸脂、拟除虫菊脂、有机硫、取代脲、杂环类、酰胺类、酚类等400种以上[1],作为基本使用的就有40种左右。基层常需检测其残留组分的是前四类,多达100种。
(2)兽药残留。
目前的兽药残留分为七类,分别为:抗生素类,驱肠虫药类,生长促进剂类,抗原虫药类,灭锥虫药类,镇静剂类和β-肾上腺素能受体阻断剂。根据欧盟96/23/EC指令为例(2000版),规定要检测的兽药残留组分约100多种,如:二苯乙烯及其衍生物、甲状腺抑别剂、类固醇、二羟基苯甲酸内脂、β-激动剂、磺胺类、唑诺酮类、四环素类、β-内酰胺、头孢霉菌素类、大环内酯类氨基(糖)苷类、驱虫药、镇静剂、抗球虫药、氯羟吡啶类、氨基甲酸脂类等等。
(3)重金属污染。
随着我国重工业、轻工业、农业、畜牧业、交通业、旅游业等行业的发展,自然生态环境受到的破坏越来越严重,直接或间接的影响着人类的健康。当今对人类健康威胁最大的污染物质有十大类,其中常见的重金属污染有的汞(Hg)、镉(Cd)、铅(Pb)、铬(Cr)和砷(As)等。
1.3?检测组分含量低
一般情况下,样品中的检测目标物浓度常为ppb(μg)级,ppn(ng)级甚至是ppt(pg)级,含量很低。
2 食品安全检测常用的分析仪器
2.1?气相色谱
气相色谱是20世纪50~60年展起来的一种高效、快速分析的方法。在食品安全检测中,只要样品能在气相色谱仪操作许可的温度下,直接或间接气化,均可采用气相色谱仪进行定性、定量分析,如蛋白质、氨基酸、核酸、糖类、脂肪酸、农药多残留等。
2.2?液相色谱
高效液相色谱法是60年代末、70年代初发展起来的快速分离分析的方法。它的基础是液相柱层析[2]。由于新型固定相、性能良好的高压输液泵以及具有选择性的高灵敏的检测器的使用,尤其是近年来利用电子计算机进行自动化控制及数据处理,使液相色谱法得到了很大的发展。高效液相色谱法被广泛应用于许多领域,同样亦被应用于食品安全检测领域。
它不仅可以对食品中各类营养成分及含量进行分离和测定,而且还可以对食品中残留的一些有害的微量物质及在食品腐败过程中产生的各种毒素进行分析[3],从而向人们展示出高效液相色谱法在食品安全检测中的重要地位。
近年来很多新型专用的高效液相色谱仪不断问世,如氨基酸分析仪、糖分析仪等,分别在检测食品中的污染物、营养成分、添加剂、毒素等方面得以充分应用。
2.3?质谱
随着科学技术的发展,质谱技术在食品安全检测中发挥着越来越大的作用,主要有气相色谱-质谱联用,高效液相色谱-质谱联用,气相色谱-原子光谱/质谱联用,超临界流体色谱-电感耦合等离子-质谱联用,高效液相色谱-原子光谱/质谱联用,高效液相色谱-电感耦合等离子/质谱联用等。
这些高新技术具有传统方法无法比拟的优势,它们既发挥了现代色谱对复杂样品的高分离能力,又应用了质谱具有的高选择性、高灵敏度以及能够准确提供化合物的分子量与结构信息的优点。
色谱与质谱的结合,帮助人类在自然界中寻找和发掘新的物质,并分离鉴定出了某些微乎其微的痕量物质。高效液相色谱-质谱联用技术始于20世纪70年代,其分析的化合物多数无需经过衍生化处理而直接进样在HPLC上得到分离,并进一步在MS上获得准确的定性和定量,从而大大地缩短了分析时间,提高了分析的灵敏度和准确性。由于色谱-质谱联用技术化合物的分离和鉴定具有独特的优势,因此广泛地应用于食品、医药、生化、环保等各方面[4]。
在食品检测中能够定性或定量地检测出食品中挥发性成分、糖类组成、氨基酸(蛋白质)、香味成分及有毒有害物质等成分。
2.4?原子吸收光谱
20世纪60~70年代原子吸收光谱仪日渐普及,目前,与其他分析技术联用促进了原子吸收光谱法的发展。与流动注射联用,消除了基体效应,提高了测定灵敏度和精密度。与氢化物发生器联用,使测定Ge、Sn、Pb、Sb、Bi、Se、Te、In等元素的检出限降低到ng以至pg级。原子吸收光谱已在食品分析、食品营养、食品生物化学、食品毒理学等诸多领域得到了广泛应用。
2.5?原子荧光光谱
原子荧光光谱在元素及其形态分析方面有着广泛的应用,特别是与氢化物发生进样技术的结合,在测定食品、生物样品等中的As、Bi、Se、Te和Hg等元素都有很好的效果。原子荧光光谱法和原子吸收光谱法相互补充,在食品安全检测中同样得到了日益广泛的应用。
3 食品安全监控建议
人们对自然的认识和对自身健康的关切是无止境的,在日新月异的社会新环境下,对于食品安全的监管似乎还不够,要杜绝食品安全事故的发生,本文提出以下监控建议。
(1)严格审查和检查食品生产许可证制度,提高食品生产的进入门槛,规范生产流程和有效监督生产过程。
(2)完善食品安全生产规章制度,建立食品安全事故追责制,加大对食品安全事故的惩治力度。
(3)普及现代分析仪器的应用,建设日常性的食品、农产品质量安全检测机构,针对地区性的食品、农产品质量安全进行日常性的检测,防止问题食品流出市面。
参考文献
[1] 中国农业百科全书《农药卷》[M].北京:农业出版社,1993.
[2] 曾泳怀.分析化学(仪器分析部分)(第3版).
生物质谱技术与方法范文4
关键词:仪器分析;食品微生物;快速检测
食品是人们赖以生存和发展的基础,而食品安全关系到整个社会稳定以及人们的身体健康。现阶段无论是国内还是国外的食品安全都呈现出一副十分不乐观的局面。根据相关部门的研究数据表明,全球每年因为食品问题而染病的数量大约在15亿人左右,而在15亿人之中,大约有70%是由于食品中微生物发生污染而导致食品安全存在着问题,继而危害到人的姓名。因此,这就要求相关部门必须要加强食品中微生物质量的检测,继而避免食品污染威胁人群身体健康。而传统的检测方式存在着许多不容忽视的问题,这就表明我们要改进传统的检测方式,采用精确程度高的仪器进行分析。本文主要介绍几种仪器分析检测方法。
1 气相色谱法和高效液相色谱法
这两种分析方式主要是根据微生物具有不同的化学组成部分或者产生的代谢物品成分不同,利用色谱检测可以直接分析不同代谢产物,以及不同微生物细胞中的蛋白质、多肽、氨基酸等,从而确定微生物表现出来的特异性的成分,继而协助各种的诊断进行检测和分析。
而在两种色谱分析方法中,气相色谱方法用的频率更高,并且更加简单快速。因为微生物细胞主要通过水以及甲醇的分解,在被相关物品进行提取和使用甲基化等衍生处理方式进行处理之后,将其尽可能多的分离出来化学成分,继而使用气象色谱防范进行分析。不同的微生物在色谱图中,大多数的峰值是相同的,但是有一些成分表现出不同的峰值,正是这些特殊性可以用来进行微生物的检测和鉴定。顶空气相色谱法也在现代社会中得到十分广泛的运用,通过对各种培养基进行检测或者是整个食品密封系统顶部微生物的挥发和繁衍过程中产生的各种代谢物来分析和判断微生物的种类。这种方法尤其是使用于食品受到酵母菌、霉菌以及大肠菌群和乳酸菌群等霉菌的受污染程度,同时还能够对食品内不得沙门氏菌进行筛选,这对于食品品质的评价以及整个食品安全性的判断起着十分重要的作用。这种方法的优点在于,具有极高的灵敏程度,能够实现快速检验,并且在固定范围之内具有良好的线性优势。
不同于气象色谱分析方法,高效液相色谱分析方法的运用广泛程度差,主要是用在多种混合物的分离。这种分离方式不仅仅能够使得柱色谱法达到高速化,并且使得分离性能程度提高曾有专家用HPLC检测饮用水中所含有的蓝细菌毒素,并且在整个结果显示中发现,这种防范具有极高的敏感特性,并且在选择方面表现出来的独特的有异性。另外,这种方法十分的快捷,有利于在整个实验过程中,实验者自身的安全程度得到明显的提高。另外,变性高效液相色谱还可以用于微生物中用来致病的基因检测,主要是原理利用离子配对逆向层析的原理来分析细胞核中的核酸。整个色谱分析系统对于DN段的分析是以DNA的强度为基础。如果DNA的长度越长,各种磷酸基团就越来越多,因此会有更多的TEAA与其结合,并且保留的时间得到明显的增长。与其他方法相比,这种技术具有自动化程度高、经济型的优势,还能够省下大量的工作量,已经在众多实验中得到广泛的具体应用。
2 毛细管电泳技术
毛细管电泳技术(CE技术)主要是将高压电作为主要的驱动力,将毛细管作为主要的分离通道来实现对样品中各种成分之间实现分离的分离技术。与传统的方法相比,速度快,分离程度高、分离方法多的特点。现阶段毛细管电泳技术已经被广泛的用于为生物的分析检测之中,并且与其他方法相比,这种方法在前期处理更加简单,并且不需要使用提取的方式来进行所需要检测的对象的提取,更加简便,更加快捷。
整个毛细管电泳技术可以将细菌看做一种离子,因为在能够生存的生理条件之下,整个表面多表现出来的电离状态是一种函数,可以通过这种函数来优化各种参数,继而分离出来各种不同类型的细菌。从这一角度我们就可以看出,毛细管电泳技术在分离方面表现出一种独特的优势。CE以细菌表面的特征信息为分析分离的基础,因而CE能反映细菌的特征信息,如基因表达产物在表面积累,特殊时期生理特征。
毛细管电色谱是近年来发展十分迅速的一种新型分离技术。目前,对于其在蛋白质、多肤以及其它生物分子方面的探索引起了人们的兴趣。它是在毛细管两端施加高电压,以电渗流(EOF)作为流动相的推动力,根据样品中各组分在固定相和流动相间分配系数的差异以及在电场中迁移速率的不同而实现分离的一种高效微分离技术,是高效液相色谱法和高效毛细管电泳的有机结合。它不仅克服了液相色谱中压力流本身流速不均匀引起的峰扩展的问题,而且峰扩展只与溶质扩散系数有关,从而获得了接近于毛细管电泳水平的高柱效,同时还具备了液相色谱的选择性。
3 质谱技术在微生物检测和鉴定中的应用
传统技术对于微生物的检测和鉴定周期较长,并且灵敏度低,特异性差。近期快速发展起来的质谱凭借其诸多优点己成为一种新型分子水平技术四。一个微生物的质谱鉴定实验,包括样品的采集和制备,整个过程不到10min。此外,质谱还是一种通用技术,它可以检测到所有类型的病原体,包括病毒、植物细菌、真菌及其抱子、寄生原生动物,并且需要样品量很少,可少于104个微生物。
目前采用质谱检测和鉴定微生物主要基于质谱图中是否存在特异性生物标记物的分子离子。因此,不同微生物具有不同的质谱图,即微生物指纹图谱。采用新型的质谱软电离方法,可获得微生物的质谱图。为了鉴定微生物,可将实验得到的质谱图与己被编入质谱指纹图库中的己知微生物的指纹图谱进行比对。最近人们提出了一种基于生物信息学策略的微生物质谱鉴定方法。当对应生物体的基因序列己知时,可根据可能表达的蛋白质序列来预测质谱图中是否存在蛋白生物标记物。
MALDI-TOF-MS是一种强大的分析工具,其优点是灵敏度高,分析时间短,解吸完整分子的质量高达500000u,在快速鉴定检测微生物方面有很多潜在的应用,如食品中致病菌的检测等。
结束语
民以食为天,食以安为先。面临日益严峻的食品安全形势,我们需快速、有效的微生物检测技术和方法,而仪器分析方法是一种相对精确简单的方法。目前,国外仪器分析技术较为先进,应用较多的有气相色谱、高效液相色谱、毛细管电泳以及质谱技术等,并己广泛应用到食品检测分析领域中,而国内应用相对较少。随着科技的进步,将会有越来越多的食品微生物分析方法和技术应用到生产实践和生活中,如液质联用、气质联用、多级质谱、高效液相一毛细管电泳技术联用等,必将在微生物快速检测鉴定领域开辟一个新的应用时代。
参考文献
[1]缪佳铮,张虹.仪器分析方法在食品微生物快速检测方面的应用[J].食品研究与开发,2009,30(3):166-169.
生物质谱技术与方法范文5
1.1液质联用技术液质联用技术将高效液相色谱仪与质谱仪联接起来使用,即把色谱对复杂样品的高分离能力与质谱的强定性能力结合起来,在氨基酸分析中得到了广泛的应用。与一般的液相色谱法相比,液—质联用技术不但可分离各种氨基酸,而且可以对未知的氨基酸成分进行鉴定;由于使用质谱仪作为检测部件,还可以不用对样品进行衍生。王萍等采用高效液相色谱—电喷雾质谱法鉴定出了青稞幼苗提取物中的13种氨基酸,证明是一种理想的全谱氨基酸分析方法。Maoetal也利用液质联用技术测定了生物样品中6种硒代氨基酸。此外,串联质谱技术在氨基酸分析中的应用也受到了关注。汤新星等基于高效液相色谱—电喷雾串联质谱及固相萃取技术,建立了分析大鼠血浆中氨基酸的方法,为筛选新的急性辐射损伤标记物提供了实验依据。
1.2气质联用技术氨基酸也可通过气相色谱法进行分离,但氨基酸沸点高,必须通过衍生化处理成为低沸点、易气化的化合物,再利用试样中各组分在两相间的分配系数不同进行分析。目前最常用气质联用技术对氨基酸进行检测。王建等利用盐酸把菌体蛋白水解成氨基酸,再通过分离、浓缩、真空干燥、N-(叔丁基二甲基硅)-N-甲基三氟乙酰胺衍生化后得到的衍生物进行气相色谱分离和质谱法检测,获得了15种菌体蛋白氨基酸的13C标记丰度信息。李长田等采用气相色谱—质谱法测定了松茸子实体和液体发酵菌丝体氨基酸等物质,结果表明,松茸子实体和发酵菌丝体二者氨基酸的种类相同,但发酵菌丝体中某些氨基酸的含量高于子实体中的含量。Mudiametal则首次应用固相微萃取—气质联用技术测定了尿液和毛发中的20种氨基酸,在分离前采用氯代甲酸乙酯对氨基酸进行柱前衍生化处理,该方法灵敏、快速。
1.3超高效液相色谱技术超高效液相色谱技术是色谱分析技术的最新发展成果之一,与常规高效液相色谱相比,最主要的差别是采用了超微细度的固定相颗粒,因而单位柱长的柱效大大提高,实际使用中就可用更短的色谱柱达到常规色谱柱的分离效果,使得整个分析时间大大缩短。该技术已应用于许多样品中氨基酸成分的分析[1,15,19]。孙言春等利用超高效液相色谱法测定了史氏鲟、达氏鳇和小体鲟卵中17种氨基酸的含量,完成一次分析仅需10min。超高效液相色谱法还被应用于快速分析和鉴定3种生菜中的氨基酸,并发现了10种由已知氨基酸和倍半萜内酯所形成的新结构单元,为生菜等植物所具有的潜在生物活性找到科学依据。
2蛋白质分析
蛋白质是生命的物质基础,几乎参与生命活动的每一环节,在机体的生长、发育、代谢、衰老等过程中发挥重要作用。但蛋白质种类很多,在分子量大小、带电性、分子结构和生物特异性等方面均有很大差异。因此在分离模式、定量和定性方法上都有很大差别。根据分离原理的不同,用于蛋白质测定的液相色谱法主要可分为反相色谱法、排阻色谱法、离子交换色谱法、亲和色谱法、疏水相互作用色谱法和逆流色谱法等。此外,还包括基于色谱分离技术和检测技术等发展而来的液质联用技术、多维液相色谱法和超高效液相色谱法等。目前用于生物样品中蛋白质检测的主要方法及其典型应用见表2。
2.1反相色谱法反相色谱法主要利用被测组分对极性流动相和非极性固定相的作用力不同加以分离。这种分离系统在液相色谱分离模式中使用最为广泛。对于生物大分子、蛋白质及酶的分离分析,反相液相色谱正受到越来越多的关注。Silvaetal采用反相色谱—质谱技术分离测定了人血清中的11种常规蛋白的浓度;王娟等采用AgilentZorbax300SB-C8色谱柱,建立了测定牛奶中主要蛋白质(4种酪蛋白与乳清蛋白)的反相高效液相色谱法,在波长214nm处对分离后的蛋白质进行紫外检测。于海洋等则用纳升级反相液相色谱—串联质谱系统分析了锦灯笼果实提取物中蛋白质的酶解产物,鉴定得到60种蛋白质,其中与抗氧化相关的蛋白质有3种。
2.2排阻色谱法排阻色谱法是根据被测组分在固定相中的渗透能力不同而分离的。这种色谱法采用多孔性凝胶为固定相,较小的分子较易被保留,因而是依照分子量的大小顺序出峰。生物体中各种蛋白质分子量常常差异很大,很适合用排阻色谱法进行分离。利用排阻色谱法将溶液中的蛋白质按照分子量大小进行分离,再配合特征波长的紫外检测器,可有效地将目的蛋白捕获并测定。Bondetal借助排阻色谱技术,并配合双波长紫外检测,研究了在不同环境条件下IgG1单克隆抗体的含量水平及聚合降解等特性。重组人白介素-1受体拮抗剂蛋白的测定也可采用这种方法,在0.018-2.4mg•mL-1范围内,该方法的线性关系良好,回收率为99.1%,相对标准偏差为1.09%。
2.3离子交换色谱法离子交换色谱法主要是利用蛋白质在pH值高于或低于等电点时可分别带负电荷和正电荷的特点而进行分离。不同蛋白质组分离子对作为固定相的离子交换剂的交换能力不同,保留时间也不同。在大孔硅胶表面通过聚合键入甲基丙烯酰氧乙基三甲基氯化铵制得的强阴离子交换色谱填料,可用于鸡蛋中卵清蛋白的分离纯化,所需时间在20min之内。隋少卉等则用强阳离子交换色谱分离了肝癌细胞中磷酸化蛋白,并与等电聚焦技术进行比较,结果表明,在分离效果方面前者优于后者,但在定量分析的稳定性方面,后者则优于前者。在多维色谱分离系统中,离子交换色谱常被作为第一维,以实现对蛋白质混合物的预分离。
2.4液质联用技术蛋白质在紫外区有吸收,因此在分离之后可以不经衍生直接用紫外检测器测定,但紫外检测器对蛋白质的鉴定能力差。液质联用法兼具强分离和强定性能力,而且灵敏度高,更适合于复杂蛋白质的分析。各种类型的色谱分析法都可与质谱法联用,实现对蛋白质的高效分析。这种色质联用技术已用于毛白杨次生维管系统蛋白、人体肠组织运输蛋白和晶状体蛋白等的分析测定。
2.5多维高效液相色谱法多维高效液相色谱法是利用两根或多根性质不同的色谱柱,通过一定的接口和切换技术进行不同色谱分离模式的组合,完成对复杂样品中待分析组分的分离。与一维液相色谱相比,多维液相分离系统具有更高的峰容量和分离能力,因而已在蛋白质分析和蛋白质组学研究中得到越来越多的应用。其中,离子交换色谱—反相高效液相色谱是最常用的分离系统。血浆中高丰度蛋白质的存在严重干扰低丰度蛋白质的检测,利用强阴离子交换色谱—反相高效液相色谱二维液相色谱技术,可使血浆蛋白质得到充分分离,再借助串联质谱对血浆中的高丰度蛋白质进行色谱定位并去除。
2.6超高效液相色谱技术超高效液相色谱技术已用于大鼠肝组织、人体膜组织蛋白及奶粉等生物样品中蛋白质的快速检测。Jietal建立了超高效液相色谱—多反应监测串联质谱法,可同时测定3种人细胞膜运输蛋白,线性范围为0.2-20μg•mL-1,精密度和准确度均可控制在15%以下,为膜蛋白在人体内外表达的研究提供帮助。Zhangetal把超高效液相色谱—串联质谱法应用于婴幼儿配方奶粉和乳清蛋白浓缩物中牛乳清蛋白含量的测定,该方法的回收率、重现性和检出限均符合实际样品测定的要求。
3小结
生物质谱技术与方法范文6
关键词:丙烯酰胺; 苯胺; 联苯胺; 水样; 直接进样; 高效液相色谱串联四极杆质谱
1引言
丙烯酰胺是一种不饱和酰胺,是有机合成材料的单体,生产医药、染料、涂料的中间体。由于其常作为生产水处理剂——聚丙烯酰胺的原料,常可在废水和地表水中检测出。同时,丙烯酰胺也是油炸食品的副产物。作为一种水溶性的不饱和酰胺,丙烯酰胺可通过皮肤、呼吸道和消化道进入人体,对人体的神经系统、生殖系统产生严重的危害,国际癌症研究机构(IARC) 也将丙烯酰胺列为2类致癌物(2A)[1]。丙烯酰胺在环境水样中常常以亚μg/L级的含量存在,同时由于其对人体存在的潜在毒性,世界卫生组织规定其在水中的限值不超过0.5 μg/L[2]。
苯胺和联苯胺同为芳香胺族,二者化学性质非常相似。它们是化工行业中重要的生产原料,广泛用于橡胶、印染等行业。苯胺是最简单的一级芳香胺,它及其系列衍生物可通过吸入、食入或通过皮肤渗入人体,对肝脏、血液系统、神经系统等造成严重损伤,还具有致癌、致突变等作用。联苯胺是联苯的衍生物,是IARC第一类致癌物,有强烈的致癌作用,也可经呼吸道、胃肠道、皮肤进入人体。
在环境水样中,丙烯酰胺、苯胺和联苯胺常有不同程度的检出,鉴于其对环境、人体的危害,我国《地表水环境质量标准》(GB38382002)将其列入了特定的监测分析项目,同时规定了三者的含量限值分别为0.5 μg/L,0.1 mg/L和0.2 μg/L。目前,检测丙烯酰胺的主要方法有气相色谱法[3]、气相色谱质谱法[4]、液相色谱法、液相色谱质谱[5,6]、紫外分光光度法[7]。胺类化合物目前的主要分析是液相色谱法[8],液相色谱质谱法[9],气相色谱质谱法[10],也有光谱法[11],光度法[12]等。在上述已有的文献报道中,不同方法灵敏度差异较大,采用直接进样分析水中丙烯酰胺的检出限一般控制在0.1~0.5 μg/L之间,使用固相萃取技术富集浓缩后的检出限可达到ng/L级。水中苯胺和联苯胺的测试常采用固相萃取或液液萃取对水样进行浓缩,在取样量为102 mL的情况下,检出限可达ng/L;直接进样时,联苯胺检出限一般在0.024~0.3 μg/L之间,苯胺检出限在0.023~2.0 μg/L之间。
由于3种物质的化学性质有所差异,目前还未见三者同时分析的文献报道。但是由于其同属于我国环境质量标准中严格控制的特定分析项目,为缩短分析时间,提高分析效率,简化分析方法,本研究通过对色谱条件和质谱参数的研究、优化,建立了高效液相色谱串联质谱同时分析三者的方法。本方法在不需要对水样进行固相萃取(SPE)、液液萃取等繁杂前处理的前提下,只需过水相滤头去除大颗粒杂质,直接使用高效液相色谱串联质谱进行分析,10 min即可同时获知3种物质的含量,方法快速、简单,进样体积为25 μL时,丙烯酰胺和苯胺检出限可达0.1 μg/L,联苯胺可达0.03 μg/L,大大低于目前环境标准对水中3种物质的含量限值要求。同时本方法不需要进行SPE,在一定程度上避免了SPE过程中由于萃取小柱、操作技术水平等导致样品重复性差的问题,使得样品精密度得到极大的改善。在实际样品的分析中,直接进样可使样品的自然成分得到最大的保留,能够更好地反映样品的真实性和代表性。
2实验部分
2.1仪器、试剂及材料
高效液相色谱串联质谱联用系统:高效液相色谱仪(日本岛津公司);带TIS源API4000QTrap三重四极杆质谱仪(美国AB Sciex公司);MiliQ去离子水发生器(美国Millipore公司)SHIMADZU Shimpack FCODS柱(75 mm × 4.6 mm,3 μm, 日本岛津公司);0.22 μm聚醚砜(PES)水相针式滤头(上海安谱科学仪器有限公司);0.22 μm聚醚砜(PES)水相滤头(德国Membrana公司)。
甲醇(HPLC级,国药集团化学试剂有限公司);1000 mg/L的联苯胺、苯胺、丙烯酰胺标准物质(纯度99.99%,美国AccuStandard公司,);100 mg/L混合标准储备液:分别吸取100 μL上述3种化合物,并加入甲醇溶液700 μL;临用时用超纯水稀释成浓度为0.10~100 μg/L的标准系列使用液。
2.2样品采集及前处理
用1000 mL棕色玻璃瓶采集满瓶水样,不留顶空,采集后储存在4 ℃暗处,当天分析。地表水及饮用水源地等干净水样可直接进样,废水或较脏的水样可过0.22 μm水相滤头后再进样。
2.3分析条件
2.3.1色谱条件 选择SHIMADZU Shimpack FCODS柱(75 mm× 4.6 mm,3μm)为分析柱,甲醇(A)和0.1%甲酸(B)作流动相,流速0.2 mL/min,柱温40.0 ℃。采用梯度洗脱:0~2 min, 20%~95% A; 2.0~2.01 min, 95%~20%A; 2.01~11.0 min, 20% A。在上述条件下, 联苯胺、丙烯酰胺和苯胺的保留时间分别为4.67, 5.02和5.34 min。
2.3.2质谱条件采用多反应监测(MRM)模式,使用TIS(+)源分析。多反应监测(MRM)参数见表1。
3结果与讨论
3.1色谱条件优化
3.1.1滤头选择选择了两种不同品牌的同材质(PES)、同内径(0.22 μm)的水相滤头进行实际水样、加标水样的比较,发现样品测试结果和加标回收率无差别,因此选择相对较便宜的国产滤头进行水中颗粒物等杂质的去除、净化。
3.1.2标准溶液溶剂的选取分别比较了甲醇、超纯水、0.1%甲酸。使用甲醇作溶剂时,3种化合物的峰型毛刺很多,甚至出现双头峰。使用超纯水和甲酸水溶液作溶剂时3种峰的峰型对称且尖锐,同时考虑到与实际水样分析时的一致性,故选择超纯水作溶剂。