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云计算的基本种类范文1
关键词：泸西；园林；植物多样性；应用现状；调查
中图分类号：S688文献标识码：A文章编号：16749944（2014）10012103
1引言
园林植物是城市生态系统的重要组成部分，在净化空气、调节气候、美化景观等方面具有重要的作用。住房与城乡建设部把“编制城市建成区植物物种多样性规划”列入园林城市评选标准。在西方经济发达国家，城市绿地植物多样性水平已经成为城市生态环境建设的一个重要标志。
2调查地概况
泸西县位于云南东南部，红河州北部，地处红河、文山、昆明、曲靖四州市交汇处，与贵州省的黔西南州遥遥相望，处于滇中经济圈的节点上，是昆明的“后花园”、红河州的“北大门”。东北面与师宗县接界，东南面与丘北县相望，西南面与弥勒市毗邻，西北面与路南、陆良县相连。县城中枢镇居县境中部，海拔1710m，距昆明市206km。
县域土壤以红壤为主，属半湿润常绿阔叶林的分布区域，受岩溶缺水地貌影响，植被以次生植被石山灌木林和灌丛为主。年均气温15.2℃，极端最高气温34.1℃，最低气温-7℃，年均日照2122h，年均降雨量979mm，无霜期272.7d[1]。
3调查方法
调查采取实地踏查的方式，于2012年9月至2013年5月对城市建成区内五大绿地进行调查，统计各绿地单元植物种类、生长状况等数据。
4结果与分析
4.1种类及数量
经实地调查，目前泸西县城市绿地共应用园林植物98科243属368种。乔灌草藤竹比例为15∶13∶10∶2∶1，常绿落叶之比为6.5∶3.5。
按进化顺序分，蕨类植物1科1属1种，约占总数的0.27%；裸子植物8科17属31种，约占总数的8.42%；被子植物89科225属336种，约占总数的91.30%。
按生长习性分，乔木种类134种，约占总种数的36.41%，其中常绿植物为81种，落叶植物为53种，常绿落叶比约为1.53：1；灌木种类117种，约占总种数的31.79%，其中常绿植物为84种，落叶植物为33种，常绿落叶比约为2.55：1；草本种类90种，约占总种数的29.17%，其中多年生草本较多，一二年生较少；藤本种类18种，其中常绿藤本为10种，落叶藤本为8种，常绿落叶比约为1.25：1，约占总种数的4.89 %，竹类9种，约占总数的2.45%。
4.2区系组成
4.2.1科的分析
在县城建成区应用的园林植物98科中，应用最多的为蔷薇科，达到27种，占植物总种类的27.84%；其次为桑科、禾本科、木兰科、柏科、百合科、木樨科、蝶形花科、棕榈科、天南星科和五加科，应用种类在10种以上；而樟科、菊科、含羞草科、苏木科、马鞭草科、紫葳科、松科、石蒜科、美人蕉科、夹竹桃科、大戟科、鸢尾科、杨柳科、杉科、忍冬科、槭树科、葡萄科、锦葵科、芸香科、桃金娘科、鼠李科、柿树科、山茶科、莎草科、茄科、黄杨科、海桐花科、杜鹃花科、冬青科、百合科、芭蕉科、紫茉莉科、小檗科、无患子科、卫矛科、苏铁科、睡莲科、山茱萸科、茜草科、千屈菜科、漆树科、牛儿苗科、楝科、金缕梅科、葫芦科等45个科应用种类在2种到9种；酢浆草科、醉鱼草科、泽泻科、榆科、银杏科、杨梅科、鸭跖草科、旋花科、绣球花科、菜科、香蒲科、仙人掌科、西番莲科、梧桐科、商陆科、山龙眼科、山柑科、南洋杉科、毛茛科、马钱科、马齿苋科、罗汉松科、龙血树科、藜科、肋果茶科、蓝果树科、蜡梅科、壳斗科、姜科、胡桃科、厚壳树科、红豆杉科、旱金莲科、珙桐科、凤仙花科、杜仲科、杜英科、唇形科、柽柳科、安石榴科、肾蕨科等41科应用种类仅为1种。
4.2.2属的分析
在科下属的等级中，应用最多的为榕属（桑科），达16种；其次为含笑属（木兰科）、女贞属（木樨科）、梅属（蔷薇科）、扁柏属（柏科）、圆柏属（柏科）、木兰属（木兰科）、樟属（樟科）、沿阶草属（百合科）、美人蕉属（美人蕉科）、鹅掌柴属（五加科），应用种类都达4种以上；而银杏属（银杏科）等多达184个属的植物都仅应用了1种。
在属的等级中，包含种数在3种及以上的共有26属，对这26属根据吴征镒院士的中国种子植物分布区类型进行划分[2，3]，一定程度上能代表泸西县城市园林植物的区系分布总体状况。其中热带区系属15属，占总属数的57.69%，温带区系属11属，占总属数的42.31%，热带成分与温带成分之比约为6∶4。由此可知，泸西县城市园林植物具有较大优势的热带区系成分，能较好地符合该区北回归线以北的位置和典型的北亚热带季风气候特征，也能较好地体现本区植物区系由温带向热带过渡的性质。
4.3应用广泛性及生长状况分析
通过对建成区范围内的103个基本绿地单元进行实地调查，统计同种植物在所有基本绿地单元中出现的次数，得出该种植物在建成区内基本绿地单元的使用频度。经统计，建成区使用较为广泛的树种有86种（使用频度6.80%以上），其中乔木为37种，灌木为34种，草本18种，藤本3种，竹类1种。
4.3.1乔木
应用最广泛的37种乔木中，小叶榕应用最为广泛，38.83%的绿地都有应用；桂花、阴香、加那利海枣、女贞、雪松、滇朴、猴樟、南洋杉、枇杷、紫薇、白兰、杜英、干香柏、广玉兰、龙柏、香樟、银杏、大丝葵、复羽叶栾树、黄连木、清香木、日本樱花应用也较为广泛，应用频度都超过了10%；冬樱花、柳杉、雅榕、圆柏、白玉兰、木莲、云南樱花、侧柏、垂枝槐、二乔玉兰、高榕、红花羊蹄甲、乐昌含笑、球花石楠应用频度也超过了6.80%。
4.3.2灌木
在应用最广泛的40种灌木中，金叶假连翘、红花木和光叶子花应用频度最高也最为突出，都达到40%以上；其次为鹅掌柴、苏铁、萼距花、红叶石楠、锦绣杜鹃、南天竹、金竹等7种，应用频度都在20%以上；再次为灰莉、双荚决明、石榴、金叶女贞、月季、八角金盘、海桐、鸡爪槭、小蜡、江边刺葵、大叶黄杨、华东山茶、毛桃、米仔兰、小叶女贞、金钱榕、杨梅、圆叶榕、紫叶李、垂花悬铃花、垂丝海棠、凤尾丝兰、龟甲冬青、花孝顺竹、雀舌黄杨、紫竹、含笑、花椒、黄金榕、洒金千头柏。
4.3.3草本
应用最为广泛的草本植物为肾蕨，其次为银边沿阶草、春羽、吊兰和美人蕉。
4.3.4藤本
藤本中应用最为广泛的是常春藤和三叶地锦，占有绝对优势，其次为炮仗花和常春油麻藤，其余较少。
4.4主要绿地斑块物种多样性
公园绿地中，植物种类最多的为文化中心绿地，达到113种，其次为阿庐公园、滨河绿地和钟秀公园，分别达到93种、58种和53种。各公园绿地植物造景较能体现地方特色，管理较为规范，造景较为细腻，特别是广场绿地配有民族、地域元素的雕塑和小品，整体效果较好，但各绿地植物搭配也或多或少存在较为同质化的缺点。
道路绿地中，植物种类最多的是泸发大街和迎宾路，其次是阿庐大街，植物种类分别为17种、17种和13种。
单位附属绿地中，应用植物种类超过20种的有12个，超过40种的有住建局和泸西一中，分别为47种和46种。新建单位一般养护管理基本到位，少数单位绿化管养不够规范，导致草坪退化严重，植物生长稍显凌乱。
居住区附属绿地以近年来新建居住区绿地率最高，应用植物种类最多，效果也最好，从侧面也说明政府和民众越来越重视居住环境的营造，生态建设越来越深入人心。
在居住区绿地建设中，应用植物最多的是明珠花园，其次为金桥寨、阳光花园、锦绣园、建馨苑，应用植物种类分别为70种、57种、56种和56种，大部分新建小区物种较为丰富，景观优美，养护到位。
2014年10月绿色科技第10期
宋 鼎，等：泸西县城市绿地植物多样性调查研究园林与景观
4.5观赏特性分析
4.5.1观花植物
泸西县城应用的观花乔木有138种，主要乔木有红花木莲、白兰、醉香含笑、云南拟单性木兰、冬樱花、云南樱花、黑荆、滇合欢、头状四照花等；灌木包括萼距花、石榴、华东茶、光叶子花、八仙花、马缨丹等；藤本包括多花素馨、藤本月季、金银花；草本包括万寿菊、孔雀草、萱草、美人蕉、蜘蛛兰等，以蔷薇科和木兰科植物为最多。
总之，由于该地气候适宜、植物搭配等因素，泸西县建成区园林植物基本能做到四季有花，但以春花植物最多，其它季节开花植物相对较少。
4.5.2观果植物
在调查中发现，泸西县园林绿化所应用的观果植物也相对较多，光乔木种类就有73种，分别为银杏、雪松、华山松、罗汉松、云南红豆杉、望春玉兰、山玉兰、白玉兰、广玉兰、大果木莲、红花木莲、白兰、醉香含笑、深山含笑、峨眉含笑、云南含笑、黄兰、乐昌含笑、紫叶小檗、南天竹、石榴、西番莲、丝瓜、佛手瓜、商陆、山桃、贴梗海棠、云南山楂、枇杷、西府海棠、球花石楠、杏、紫叶李、冬樱花、桃树、光核桃、梅、李、川梨、梨、老虎刺、杨梅、辟荔、大果冬青、冬青、多脉猫乳、枣、葡萄、九里香、花椒、复羽叶栾树、川滇无患子、清香木、核桃、洒金桃叶珊瑚、头状四照花、喜树、毛叶柿、君迁子、柿树、糖胶树、法国冬青、皱叶荚、滇厚壳树、假烟叶树、梓、西南猫尾树、天门冬、山麦冬、银边沿阶草、沿阶草、假槟榔和董棕。
4.5.3色叶树种
泸西县建成区应用较多的常色叶树种按树叶颜色可分为红叶、紫叶类、黄叶类、花叶类，约有42种。紫叶、红叶类的有红花木、红叶石楠、红叶李、紫锦木、红叶桃等5种；黄叶类的有金叶假连翘、香冠柏、黄金榕、金叶大花六道木、金森女贞、金叶女贞、千层金、洒金千头柏8种；花叶类的有花叶假连翘、黄纹万年麻、花叶万年麻、欧洲黄梢刺柏、银姬小蜡、银心吊兰、银边沿阶草、花叶鹅掌柴、花叶榕、花叶叶子花、花叶蔓长春、花叶常春藤等12种。
需要指出的是，由于该区处于南亚热带，植物季相变化极不明显，一些很好的秋色叶植物如枫香、银杏、西府海棠、垂丝海棠、冬樱花、川滇无患子、槭树类等虽然落叶，但落叶期短，基本无秋色叶观赏价值。
4.5.4特色观赏植物
（1）万寿菊。万寿菊在该地区已形成产业规模，同时花大，具特殊香味，花期长，具有较高观赏价值，具有泸西特色。
（2）珙桐。珙桐在园林中应用较少，但在泸西文化中心绿地中已有批量应用，效果较好。
（3）永椿香槐。永椿香槐也具有较高观赏价值，为香槐属发现的一个新种，在向阳乡有胸径接近2m的大树，但目前园林中尚未应用，具有较高开发价值。
（4）红花木莲。红花木莲具有较高观赏价值，花果俱美，但由于其对气候适应性较差，目前园林上使用受到限制，但在泸西园林中表现良好。
（5）短萼海桐。短萼海桐株型秀丽，花芳香醉人，目前尚未在园林中大量应用，泸西作为石灰岩分布区域，有较大量短萼海桐野生分布，少量在园林中应用，植株表现良好。
（6）灯盏花。灯盏花也是泸西高园特色产业的重要组成部分，部分乡镇有大量栽培，但目前在园林中尚未发现有应用。
4.6乡土植物应用
由于良好的适应性、较低的养护管理成本，加上丰富的文化底蕴和明显的地域特色，乡土树种的应用近年来越来越受到重视。
泸西县地处北亚热带地区，境内野生植物种类繁多，特别是石灰岩山地植物，具有较高代表性。目前泸西县建成区应用的乡土树种约有177种，主要有肾蕨、云南红豆杉、山玉兰、大果木莲、红花木莲、云南拟单性木兰、猴樟、阴香、香樟、云南樟、野香橼花、短萼海桐、肋果茶、云南山楂、球花石楠、冬樱花、蒙自合欢、滇合欢、枫香、杜仲、清香桂、杨梅、铁橡栎、滇朴、大果冬青、复羽叶栾树、川滇无患子、小叶青皮槭、黄连木、清香木、头状四照花等。
5讨论及建议
（1）大量野生观赏植物资源有待开发。虽然泸西县应用乡土园林植物种类较多，也一定程度上体现了泸西特色，但应当看到，这些种类只占应用植物总种类的48.10%，乡土园林植物的比例还有待提高，按可开发观赏植物资源种类占植物总种类的1/3计算，光泸西县有野生分布的园林植物资源就有700种以上，尚有500种以上有待开发。
（2）加强资金及人才支持力度。一些新建道路、单位、小区的绿化正越来越重视乡土树种，乡土树种的利用强度正不断加大，开发利用的种类也进一步增多，呈现趋好发展态势，但也应看到，泸西县尚无专门的公司从事乡土树种的引种驯化及开发，限于技术条件、人才引进和资金等问题需要走的路还很长。
（3）提高绿地建设和养护管理水平。特别在以后的植物配置中，可适当增加常绿树种比例，丰富群落结构，更好地营造北亚热带季风气候的区域景观。
（4）做好相关规划编制和实施。做好城市生物多样性规划及树种规划编制工作，加强规划的管理控制。
参考文献：
[1]云南省泸西县志编纂委员会.泸西县志[M].昆明：云南人民出版社，1992.
[2]吴征镒.中国种子植物属的分布区类型[J].云南植物研究，1991，13（增IV）：1～139.
[3]吴征镒.中国种子植物属的分布区类型的增订和勘误[J].云南植物研究，1993，15（增IV）：141～178.
云计算的基本种类范文2
摘 要：来自哥本哈根大学的安娜.克里斯蒂娜.赫尔特格伦教授基于对世界上四个国家和地区—丹麦，英国，香港和菲律宾的呼叫中心所做的调查，收集了一系列的数据和资料，经过对数据和资料的仔细对比和分析，她得出结论：英语的全球化传播不一定必须是语言本身替代或者同化了当地语言，也可以通过影响当地言语风格来做到。而言语风格的全球化传播是社会语言学研究的一个重要的方面，也是还未被充分的意识和研究到的一个方面，笔者尝试运用礼貌原则去进一步发展赫尔特格伦教授这一观点，以期引起相关研究人士的注意，去进一步探索这一较新的研究领域。
关键词：呼叫中心，言语风格，全球化，礼貌原则，面子理论
1.引言
关于英语的全球化表现，传统的观念是认为英语通过商业，政治和高等教育等途径，要么取代了当地的语言，要么逐渐与当地的语言实现了共存。然而经最新的研究发现，在语言的传播中，言语风格独立于语言本身，得到了发展。言语风格的传播既非取代当地语言成为一种纯粹的英语，也并非是与当地的语言共存，杂糅而成一种新的语言，其中一个典型的例子就是呼叫中心言语风格的全球化传播。
2.英语的全球化
言语风格的全球化传播是全球化的社会语言学研究的一个重要的方面，也是却还未被充分的意识和研究到的一个方面。最近的社会语言学的普遍观点认为不能仅仅把英语成功取代当地语言与否作为衡量全球化的唯一标准，这一观点对于语言危险论而言非常重要，因为这个观点意味着在英语的全球化传播中，它的成功与否不仅仅是从这个国家的民族语言或者少数民族语言是否得以保存完整来判断。有的语言它的词汇或者发音等等方面在英语的全球化冲击下都没有发生任何大的变化，但是它在语言风格上却深受非传统特征的影响，发生了较大改变。对于全球化的社会语言学研究，其中一个的最大的争议就在于当地在全球化的压力下的不同的反击表现。当地人和当地文化可能是全盘接受，彻底抵触亦或是介于这两者之间的程度。
3.以呼叫中心为例
所谓呼叫中心，它是充分利用现代通讯与计算机技术，如IVR（交互式语音800呼叫中心流程图应答系统）、ACD（自动呼叫分配系统）等等，可以自动灵活地处理大量各种不同的电话呼入和呼出业务和服务的运营操作场所。呼叫中心在目前的企业应用中逐渐被认为是电话营销中心。电话呼入型呼叫中心的特点是接听顾客来电，为顾客提供一系列的服务与支持，例如在IT行业中的技术支持中心，保险行业中的电话理赔中心等。呼叫中心是在一个相对集中的场所，由一批服务人员组成的服务机构，通常利用计算机通讯技术，处理来自企业、顾客的电话垂询，尤其具备同时处理大量来话的能力，还具备主叫号码显示，可将来电自动分配给具备相应技能的人员处理，并能记录和储存所有来话信息。它作为企业面向客户的前台，面对的是客户，强调的是服务，注重的是管理。充当企业理顺与客户之间的关系并加强客户资源管理和企业经营管理的渠道。它可以提高客户满意度、完善客户服务，为企业创造更多的利润。呼叫中心通常首先处理大多数客户询问或是基本种类的服务。
呼叫中心作为一种组织原型，发源于美国，也由于美国的强大影响，世界上很多的呼叫中心都采用其话语风格模式，发音也与之努力接近，避免当地化。通过研究发现，全球化的呼叫中心都有一套规约式的讲话模式，诸多文件都标明以及对员工的训练中也是采用统一的风格。但是全球化统一下，不同的当地文化和人民也会对此有着不同的理解和反应。
4.“面子”
赫尔特格伦通过对这四个不同的国家和地区进行的调查和总结发现，尽管地区不同，但是呼叫中心的规约性的言语风格却非常接近。其中一点就是呼叫中心的工作人员都必须遵循礼貌原则，让顾客感觉到他们有受到尊重。关于礼貌原则，利奇（Geoffery Leech，1983）提出过他的礼貌原则：（1）得体准则：尽量少让别人吃亏，尽量让别人多得益。（2）慷慨准则：尽量少让自己得益，尽量多让自己吃亏。（3）赞誉准则：尽量少贬损别人，尽量多赞誉别人。（4）谦逊准则：尽量少赞誉自己，尽量多贬损自己。（5）一致准则：尽量减少双方的分歧，尽量增加双方的一致。（6）同情准则：尽量减少双方的反感，尽量增加双方的同情。Brown和Levinson将“面子”定义为“每一个社会成员意欲为自己挣得的一种在公众中的个人形象”（Brown& Levinson，1987）。他们认为每个交际参与者都具有两种面子：积极面子（positiveface）和消极面子（negative face）。积极面子是希望得到别人的赞同、喜爱、欣赏和尊敬；消极面子是指不希望别人强加于自己，自己的行为不受别人的干涉、阻碍，有自己选择行动的自由。（Brown & Levinson，1987）。他们认为在会话过程中谈话双方的两种面子都会受到侵袭，即说话人和听话人同时面临着积极面子和消极面子的威胁。因此，绝大多数言语行为都是威胁面子的行为（Face Threatening Acts，FTA）（Brown &Levinson，1987），而礼貌的会话功能就在于保护面子，降低面子威胁行为的威胁程度。在交际中，一方面，说话者必须要关注对方，或向对方给予关注；另一方面，说话者要维护一定的独立性，同时对对方的独立需求也表示尊重。呼叫中心规定要让打电话的人（顾客）感觉到有被倾听，给足客人面子，这很关键。而且在多数情况下，仅仅做到消极面子还远远不够，与客人的交谈中，在允许的情况下还要进行移情（设身处地地为顾客考虑，站在顾客的角度看待问题）；在等待问题处理的间隙，谈点与待处理的问题无关的话题也不错，最好带有当地色彩。
5.结束语
面对被英语同化的压力，这里似乎并没有一个全球的合约表明要去建立一个合适的“呼叫中心风格”，但是在英语的全球化传播中，语言风格确实独立于语言本身也得到了传播，这使得诸多国家都深受英语风格的影响，通通采用这一风格，然后用自己的语言表达出来。而对于社会语言学家而言，对呼叫中心的规约性言语风格的研究，其研究价值就在于：分析不同语言下的规约性言语风格，找出它们的共通点。语言的统一并非一定使人们去讲一种统治语言，而是采用他人的一种可以令多数人都能接受的言语风格，用自己的语言表达出来，所以全球化并不等同于语言和文化的同化，也可能是是在全球化的过程中影响到当地的言语风格。当然无论是英语语言本身的传播亦或是英语言语风格的传播，很大程度上都是由于资本主义的力量的影响而造成的。（作者单位：重庆师范大学外国语学院）
参考文献
[1] Anna Kristina Hultgren， Building rapport with customers across the world：The global diffusion of a call center speech style， Journal of Sociolinguistics， 36-64，2011
[2] Bagnara， Sebastiano and Patrizia Marti. 2001. Human work in call centers： A challenge for cognitive ergonomics. Theoretical Issues in Ergonomics Science2：223-237
[3] Brown， Penelope and Stephen C.Levinson.1987. Politeness：Some Universals in Language Usage. Cambridge U.K：Cambridge University Press.
[4] De Swaan，Abram.2001. Words of the world： The Global Language System. Cambridge U.K：Polity.
[5] Heller.Monica.2008. Language and the nation-state：Challenges to sociolinguistic theory and practice. Journal of Sociolinguistics12：504_524
[6] Pennycook，Alastair. 2010. Language as Lical Practice.Abingdon， U.K：Routled
[6] Leech， G. Principles of Pragmatics，London： Longman，1983.
[7] 贺芸，庄成余，论英语全球化传播的原因及其影响，云南师范大学学报，2004
云计算的基本种类范文3
关键词：显性标记；广两优476；纯度鉴定
中图分类号：S339.3；Q78 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2013）23-5884-03
广两优476是利用不育系广占63-4S和恢复系R476配组育成的两系中籼新组合，具有产量高、品质优和熟期适宜等特点，并于2010年3月通过了湖北省农作物品种审定委员会的审定[1]。2011-2013年，广两优476连续3年被湖北省农业厅确定为水稻主导品种之一，正在生产上大面积推广应用。
由于光温敏不育系在自然环境条件下易受到光温等条件的影响，因此在制种期间若出现异常低温可能引起不育系育性波动，导致不育系部分自交结实从而影响杂交种子的纯度；另外，由于制种时隔离不严，或收获、装运等环节人为因素的影响，也可能造成串粉混杂或机械混杂。因此，探索一种简单、准确、快速地鉴定两系杂交稻种子纯度的方法是保证两系杂交稻安全推广应用的关键环节。
分子标记鉴定杂交水稻种子纯度已有不少报道[2-4]，但大多是利用共显性SSR标记，由于SSR标记往往在亲本间差异较小，需要使用聚丙烯酰胺凝胶电泳或高分辨率的琼脂糖凝胶电泳才能区分。这就增加了分子检测的难度和鉴定成本，而一般的显性标记对于某一个品种来讲由于特异性不强而无法使用。抗褐飞虱基因Bph14来自于野生稻，已经被定位[5]和克隆[6]，与其紧密连锁的分子标记MRG2329也已经成功应用于分子标记辅助育种中，通过分子标记辅助选择鉴定了育成的恢复系R476及其杂交组合广两优476带有抗褐飞虱基因Bph14[7，8]。本研究针对杂交组合广两优476，利用Bph14基因特异的显性标记76-3对种子纯度鉴定的方法进行了研究。
1 材料与方法
1.1 材料
不育系广占63-4S、恢复系R476和广两优476种子采自湖北鄂科华泰种业股份有限公司制种基地。不同制种田收获的种子编号后随机抽样分成2份，一份在海南省进行田间种植鉴定，设计3次重复，每重复单本种植500苗；另一份取200粒种子浸种催芽后放置培养箱中生长，1周后取单株叶片，采用CTAB法[9]从叶片中提取DNA，利用显性标记76-3鉴定种子纯度。
1.2 试剂
Taq酶、dNTPs、聚丙烯酰胺凝胶、琼脂糖等均购自宝生物工程（大连）有限公司；MRG2329引物序列由武汉大学何光存教授提供，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，序列见表1。
1.3 PCR扩增
PCR反应体系为：1.5 μL 10×PCR Buffer （100 mmol/L Tris-HCl，500 mmol/L KCl，15 mmol/L MgCl2，pH 8.3），1.2 μL dNTPs（2.5 mmol/L），0.6 μL 上、下游引物（10 μmol/L），0.2 μL Taq酶（5 U/μL），1.0 μL 模板DNA，补ddH2O至15 μL。PCR反应程序为：95 ℃预变性5 min； 94 ℃变性30 s，退火 30 s（MRG2329的退火温度为60 ℃，76-3的退火温度为58 ℃），72 ℃延伸1 min，35个循环； 72 ℃延伸10 min，4 ℃保存备用。MRG2329的PCR扩增产物用0.6%非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳检测[7]，76-3的PCR扩增产物用1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。
2 结果与分析
2.1 分子标记MRG2329和76-3在广两优476亲本及杂交种中的多态性
MRG2329为共显性标记，PCR扩增产物片段大小为180 bp，由于亲本间差异较小，需使用聚丙烯酰胺凝胶电泳才能分辨，电泳结果见图1a。含Bph14基因的恢复系R476片段稍大，不育系广占63-4S的片段较小，杂交种广两优476为杂合带，利用MRG2329扩增片段大小的差异能将恢复系、不育系和杂交种区分。76-3为显性标记，PCR扩增产物片段大小为570 bp，电泳结果见图1b。含Bph14基因的恢复系R476和杂交种广两优476有扩增产物，不育系广占63-4S无扩增产物，利用扩增产物的有无能将杂交种和不育系区分，因此用显性标记76-3可以检测出杂交种中混杂的不育系种子。
2.2 利用显性标记76-3鉴定杂交水稻广两优476种子的纯度
为了便于操作，每组样品随机提取94个单样，以父本R476和母本63-4S分别作为阳性和阴性对照，利用显性标记76-3对待测样品进行检测，PCR扩增时使用96孔PCR板，扩增产物以1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。为了节约成本，第一次点样的产物在200 V电压下电泳20～30 min后进行第二次点样，电泳结束后拍照统计无扩增产物样的个数（图2）。1号样品的检测结果，第52个样和第86个样与对照63-4S （第95个）无扩增产物，表明94个检测样品中鉴定出2个不育系，最后计算出1号样品种子的纯度为97.9%（表2）。
2.2 分子标记鉴定与田间种植鉴定结果的比较
本研究中田间鉴定的结果见表2。从表2中可以看到，3次重复的平均值与分子鉴定结果之间存在一定的差异，两者的差值在-7.9～2.4之间。13号样品分子鉴定纯度比田间鉴定纯度高出7.9个百分点。部分样品的田间鉴定纯度大于分子鉴定纯度，如4号、5号、7号、9号、10号和12号；另一部分样品的田间鉴定纯度小于分子鉴定纯度，如2号、3号、6号、11号和13号，只有1号和8号样品的田间鉴定与分子鉴定结果相同。在13个样品中，除3号、4号和13号外，其他样品的田间鉴定与分子鉴定结果差值都在1个百分点内，说明分子鉴定的结果基本能反映出所鉴定样品的种子纯度。同时从表2还可看到，田间鉴定3次重复的结果也存在一定的差异，重复间差异最小的是4号，其差值在0.4%～1.0%之间，差异最大的是5号，其差值在2.4%～13.2%之间；田间鉴定与分子鉴定差异最大的是13号，3次重复间的差异也较大，其差值在5.4%～10.8%之间，说明抽样过程中不同的样本带来的鉴定结果的差异是不可避免的，只有通过加大检测样本或取平均值的方法来加以修正。
3 小结与讨论
3.1 显性标记鉴定杂交稻种子纯度的优点
在两系杂交稻制种过程中，如果隔离条件符合技术要求，并且没有发生机械混杂，对种子纯度产生影响的因素主要是不育系自交结实。在这种情况下利用恢复系特异的显性标记就能准确鉴定种子纯度。与田间鉴定相比，待测样品在培养箱中生长1周后就可以提取叶片DNA，缩短了鉴定时间。与共显性标记相比，显性标记只需判断PCR扩增产物的有无，容易识别，而且电泳时间短，一排点样孔上可多次上样，节约了时间和成本，提高了效率。
3.2 影响分子鉴定结果准确性的因素
在田间鉴定中发现广两优476中有少量的籼粳交杂株、异型株和恢复系。对于串粉混杂和异型株等类型的杂株，由于不带有Bph14基因，用显性标记76-3鉴定时这类杂株与混杂的不育系一样扩增不出目的条带，只能鉴定为杂株而无法判定是哪种类型，但并不影响鉴定的结果；对于混杂的恢复系，由于带有Bph14基因，用76-3也能扩增出目的条带，无法与真杂种区分，可能会影响鉴定结果。本研究中只在2号和9号样品中各发现了1株恢复系，所占比例较小，对分子鉴定结果并未产生影响。而恢复系对杂交种子纯度的影响，在制种过程中可以通过严格管理人为控制。
用显性标记76-3鉴定广两优476种子纯度，扩增无目的条带即判定为杂株，但由于DNA质量的问题也可能引起扩增无条带，增加了杂株的比例。这就要求在提取DNA时，保证所提取DNA的质量。由于无扩增条带的样品所占比例较少，还可以使用显性标记MRG2329将这些样品重新检测一次，排除DNA的影响，确定杂株的数量。
统计学上一般抽样的样品数量越多统计数与总体参数之差就越小。在实际工作中，只要误差在允许范围内，抽样数量要尽可能小，否则工作量加大，会相应增加检测费用[10]。根据现行国家标准GB/T 3543.5-1995中对聚丙烯酰胺凝脉电泳法测定大麦、小麦种子纯度的规定，一般每个样品测定100粒种子[11]。在本研究中PCR扩增时使用的是96孔板，每次扩增94个待测样品，如果鉴定结果在90%以下，可直接判定为种子纯度不合格，如本研究中的3号、5号和13号样品。如果鉴定结果在96%左右（根据国家规定标准杂交稻种子纯度不低于96%），可根据需要重新提取DNA再检测94个样品或更多的样品。
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