基因治疗的策略范例6篇

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基因治疗的策略范文1

【关键词】 难治性;胃食管反流;质子泵抑制剂;原因分析;治疗策略

胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease，GERD)是一种具有慢性复发倾向的消化道动力障碍性疾病，典型表现为烧心和反流，包括反流性食管炎(RE)、非糜烂性反流病(NERD)和Barrett食管(BE)三个类型。难治性GERD(refractory GERD，RGERD)是指经标准剂量质子泵抑制剂(PPI)治疗8周症状仍不缓解的GERD患者，其发生率为10%～40%[1]。但在NERD、RE及BE中， RGERD的发生率有所不同(分别为40%～50%、6%～15%、20%)。GERD复发率高，严重影响患者的生活质量，耗费巨大医疗资源，特别是RGERD发生率高，且治疗棘手。因此，目前已受到消化内科医师的广泛关注。

1RGERD的发生原因分析

1.1PPI治疗失败

1.1.1食管保护因子减弱(1)食管高敏性：临床研究证实，50%的NERD患者无酸反流，而表现为对酸的高敏感，进而导致其对腔内特定刺激的内脏感觉发生改变。在GERD的食管黏膜损伤中，促炎性因子如白介素- 6和白介素-8、粒细胞、氧化应激等起到了非常重要的作用;酸敏感受体、蛋白酶激酶受体及P物质等均与食管高敏性发生相关[2]。多数认为，食管高敏性和非酸反流是造成RGERD最主要的原因。(2)持续性食管收缩：是指体内食管纵平滑肌收缩时间延长，表现为高频内镜超声图像下食管壁增厚。此与烧心的关系比酸反流和烧心的关系更加密切。(3)异常组织抵抗：是指食管上皮屏障功能障碍。食管上皮屏障功能降低，可由胃酸和胃蛋白酶诱导产生上皮细胞间隙增宽。PPI可对抗[1]。

1.1.2攻击因子增强(1)夜间酸突破(NAB)：是指患者服用PPI期间夜间(睡眠后12h内)胃内pH60min。NAB多见于睡眠后

1.1.3患者因素[1，4，8](1)患者依从性下降、投药方式不当：致抑酸不充分及存在功能性烧心等。据报告，GERD患者停用PPI 6个月后复发率达80%，再用PPI虽然有效，但再次停用PPI后再发率可高达90%。(2)饮食习惯与不当生活方式：包括酸性食物、高脂食物、饮酒、咖啡、浓茶、巧克力、大蒜、薄荷、辛辣食物或腌制品、低纤维素食物等习惯。不当生活方式：如晚餐推迟、进食过多或过快、吸烟、右侧卧位、肥胖、紧束腰带、便秘等。(3)个体差异：遗传易感性在GERD发病中起到一定作用。G蛋白β3亚单位基因G825T多态性可导致内脏高敏性，增强对反流的感知。T等位基因中7208C与非特异性腹痛有关，3010G与胃排空延迟有关，线粒体DNA基因与饱感、胃排空和可能的疼痛相关。(4)避免使用抑制胃排空药、钙离子拮剂、茶碱类、抗担碱药、非类固醇抗炎药、多巴胺受体激动剂及地西泮等。

1.2PPI抵抗如质子泵突变、PPI耐药、P4502-C19(CYP2-C19)酶基因多态性(PPI快速代谢表型)、PPI生物利用度(食物、药物)下降等。

1.3其他因素包括胃肠功能降低、十二指肠反流、食管裂孔疝、合并功能性胃肠病、内脏感觉过敏、嗜酸细胞性食管炎、药源性食管损伤、食管相关的自身免疫性皮肤病及精神心理因素[9]等。据研究，自主神经功能紊乱是青年GERD的致病因素，约1/3的GERD患者存在心理问题。幽门螺杆菌根除与GERD发病大多无关，且一般不加重已存在的GERD[4]。据国内一组58例RGERD发病原因分析[10]，在30例明确的发病因素中包括食管高敏性11例，食管功力障碍6例，未按医嘱服药及胆汁反流各4例，生活方式不当3例，食管裂孔疝及BE各1例。高分辨率测压系统下，胃食管交界处双高压条带是GERD复发的预测指标;胃底折叠后伴有食管裂孔疝(距门齿33cm)和BE同时存在，GERD的复发率可高达72%[1]。

转贴于 　2RGERD的治疗策略

GERD治疗的目的是消除症状，提高生活质量，治愈食管炎，预防复发和防止并发症。主要手段为改变生活方式和药物(如PPI)治疗，其中改变生活方式是基础，抑酸为主要措施[4]。关于RGERD的治疗，可采取以下策略。

2.1改变生活方式与调整饮食结构。

2.2优化治疗方案，控制非酸反流(1)更换PPI类型及PPI剂量加倍：据研究，33%的RGERD存在食管异常酸暴露，抑酸治疗不充分。以双倍剂量逐渐减为标准剂量PPI被认为是对大多数RGERD患者的有效治疗措施[11]。经充分的PPI治疗后，GERD患者的症状改善、上皮细胞间隙增宽及升高的促炎性因子可恢复正常[1，4]。(2)减少反流事件[4]：如巴克洛芬、Lesogaberan等。(3)睡前加服H2受体阻滞剂或PPI每日2次用药，可减少NAB。(4)促动力药。(5)内脏感觉调节剂及精神心理治疗。(6)黏膜保护剂：如海藻酸钠可治疗胆汁或胃蛋白酶所致的损伤，其与食管黏膜结合(与黏膜蛋白发生反应)后抑制胃蛋白酶的扩散与活性，并调节免疫功能[4]。

2.3加强抗反流屏障(1)内镜下抗反流治疗：如内镜下缝合(胃食管交界处浆膜对浆膜折叠)、生物聚合物Biopresthes植入、Stretta射频治疗等。(2)近端胃底折叠术[4]。(3)腹腔镜食管磁珠串植入，通过珠间的吸引力辅助下食管括约肌关闭而达抗反流作用。

*基金项目：本课题由重庆市科委资助，项目编号(TK2012-38)

参考文献

1Yang J，Chen GH，Liu M.Combiantion therapy 56 patients of proton pump inhibitor，hydrotalcite and bailemian in refractory gastroesophageal reflux disease (GERD).Int J Dig Dis，2012，32(6).

2Norimasa Y.Inflammation and oxidative stress in GERD.J Clin Biochem Nutr，2007，40(1):13-23.

3Vishal J，Inder M，Wojceiech B，et al.Castell. Immediate-release omeprazole powder:An effective alternative approach to refractory GERD.Practical Gastroenterology，2007，7(1):60-67.

4 Yang J， Liu M，He J，et al.Some study advances of diagnosis， treat-ment and pathosenes of GERD.Lab Med Clin，2012，9(14):1426-1429.

5Mainie I，Tutuian R，Shay S，et al.Acid and non-acid reflux in patients with persistent symptoms despite acid and suppressive therapy:a multricentre study using combined ambulatory impedance pH monitoring.Gut，2006，55(10):1398-1402.

6Zerbib F，Duriez A，Roman S，et al. Determinants of gastroesophageal reflux perception in patients with persistent symptoms despite proton pump inhibitors.Gut，2008，57(2):156-160.

7梁学亚，陈维娜，兰玲，等.PPI治疗GERD患者食管酸暴露的影响.中华内科杂志，2012，51(7)：513-515.

8涂蕾，侯晓华.生活方式与饮食因素对胃食管反流的影响.中华内科杂志，2011，50(8)：636-639.

9Fass R ， Gasiorowska A . Refractory GERD:what is it? Curr Gastroenterol Rep，2008，10(3):252-257.

10黄四海，雍艳艳.RGERD原因分析及治疗对策.吉林医学，2010，31(18)：2903-2904.

基因治疗的策略范文2

1临床资料

1.1一般资料 并发假性动脉瘤6例患者中男5例，女1例，年龄50～70岁，其中5例体型较胖，均为冠脉内支架术后患者，1例体型适中，为射频消融术后患者，术后均采用"8"字交叉法绷带固定。

1.2临床表现 早期表现为穿刺部位渗血、肿胀，触诊穿刺点附近有搏动性包块，触诊患者有明显痛感，听诊有血管杂音，经血管超声证实。

2假性动脉瘤形成机制

2.1压迫时间过短，压迫部位不准确 压迫时间应根据患者体型及术中肝素使用情况具体而定，我院常规指压止血15～30 min（依术中肝素用量而定，造影检查15 min，支架治疗30 min），观察无出血后采用"8"字交叉法绷带固定。压迫部分应以血管鞘的血管穿刺点为主，而不应压迫皮肤穿刺点，否则极容易形成假性动脉瘤。

2.2术中反复穿刺致血管管壁多个创口不利于术后恢复，假性动脉瘤形成概率增加。

2.3过早活动 经股动脉途径介入治疗患者我院常规要求拔管后严格卧床12 h，过早的肢体活动使假性动脉瘤的发生率大大增加，本报道中射频消融术后形成假性动脉瘤患者即为此类，患者术后4 h自行解除股动脉"8"字交叉法绷带，术后第2 d发现形成假性动脉瘤。

2.4抗凝药物的使用 临床上如急性冠脉综合征患者、冠脉支架术后患者需大量使用抗凝药物，抗凝药物的大量使用，使穿刺点附件不易形成血凝块，从而使穿刺点得不到及时修复，假性动脉瘤的形成概率增加。

2.5高血压患者动脉穿刺后由于血管内压力升高而难以愈合。如合并动脉粥样硬化患者血管中层弹力纤维硬化，穿刺后收缩能力差，也易出现假性动脉 瘤[1]。

3避免措施

3.1选择正确的压迫部位，足够的压迫时间。

3.2选择合适的拔管时机。我院造影检查患者一般术后即刻拔出鞘管，支架患者一般术后4～6 h拔管鞘管，拔出鞘管后方选择使用低分子肝素类抗凝药物，避免过早的拔管及使用抗凝剂。

3.3较强健康宣教，向患者交待术后制动的必要性，避免过早的活动，在拔管后12 h可嘱患者适当的下床活动，术后3～5 d避免剧烈活动，若术后仍需使用大剂量抗凝药物，则剧烈活动时间应进一步延长至停用低分子肝素后3～5 d。

3.4加强术后管理，加强局部观察。密切观察术后有无局部的出血、肿胀，应及时触诊有无疼痛，有无搏动性包块，听诊有无血管杂音，一旦疑诊假性动脉瘤时应及时联系血管超声检查以进一步确诊以便及早处理。

4处理策略

4.1局部压迫法 假性动脉瘤若发现及时，瘤体较小时，可选择局部压迫法。压迫部位应为瘤体破口处，压迫时间>1 h最佳，并且应为持续性压迫，压迫后应及时触诊及听诊，并复查血管超声，若假性动脉瘤消失，仍应该局部包扎3～5 d。压迫时应常规心电血压监护，并准备阿托品、止痛药等，以避免持续压迫过程中可能出现的高迷走反射等。本报道中1例患者经局部压迫1 h后，复查血管超声假性动脉瘤消失。

4.2超声引导下凝血酶注射法 自1991年Fellmeh等[2]首先报道了在超声引导下假性动脉瘤压迫治疗法起，近年来，超声引导下凝血酶注射法已经成为一种很好的治疗假性动脉瘤的方法。

该法的操作流程包括：①通过血管超声明确假性动脉瘤位置、大小、血流情况，并确定假性动脉瘤瘤体与载瘤动脉的关系，从而确定选择进针路径。②在超声监测引导下穿刺瘤体，针尖应尽量远离瘤颈部，当针尖到达瘤腔内后，应由超声操作者使用探头向下适度垂直加压直至漏道或瘤口内无血流通过，在保持正常股动脉的血流通畅的同时术者将凝血酶500～2000 u缓慢注入瘤腔后拔除穿刺针，持续按压瘤口处2～5 min。③解除压迫后如果瘤腔内与瘤口或漏道处彩色血流信号消失，代之以团状高回声为治疗成功。同时监测载瘤动脉是否通畅。④术后患者应继续伸直患肢，局部加压包扎，卧床6 h以防止复发。密切注意患者血压及全身情况，检查患者股动脉及足背动脉的搏动情况。该法具有成功率高、患者耐受性好、操作时间短、复发率极低等优点，但临床上仍应谨慎操作，避免凝血酶进入载瘤动脉等而引起血管闭塞等严重并发症。本报道中5例患者均选择超声引导下凝血酶注射法，其中4例患者成功，1例失败。

4.3 DSA下经对侧股动脉途径瘤体内凝血酶注射法。本报道中采用超声引导下凝血酶注射法失败患者后采用本法成功根治假性动脉瘤。

本法操作流程包括：①患者平卧位，穿刺对侧股动脉。②经对侧股动脉送入微导管或TIG导管，造影明确瘤置、大小、血流情况，确定瘤体与载瘤动脉的关系。③沿导管送入BMW等较软冠脉指引导丝进入瘤体，沿导丝送入微导管至瘤体内，撤出导丝，经导管瘤体内凝血酶注射。约1 min后造影复查。

4.4 DSA下覆膜支架植入，该法临床报道较少，可使用与瘤体腔巨大，经上述方法均未能根治者。

4.5外科修补法 该法应临床创伤较大，随着超声引导下凝血酶注射法的不断开展及技术的不断更新，临床已极少使用。

5讨论

基于上述资料笔者认为医源性假性动脉瘤多于压迫部分不准确，压迫时间过短，过早活动以及大剂量使用抗凝药物等有直接关系，因此临床上应加强介入医师的培养，选择正确的压迫方式，加强患者教育，避免多早的活动，从而使医源性动脉瘤的发生几率下降。一旦临床上发生了假性动脉瘤，临床医生应首先给予局部加压包扎，尽快联系血管超声明确诊断，在压迫治疗无效的情况下尽快的选择经超声引导下瘤体内凝血酶注射，必要时可选择DSA下经对侧股动脉途径瘤体内凝血酶注射法。

参考文献：

基因治疗的策略范文3

肿瘤基因治疗是用正常或野生型基因修正或置换肿瘤细胞的某些基因，或引入有治疗价值的其他来源基因，达到治疗肿瘤的目的。自杀基因治疗是肿瘤基因治疗方法之一，是将某些细菌、病毒和真菌中对药物敏感的基因转导人肿瘤细胞，此基因编码的特异性酶类又称为前药转换酶，能将原先对肿瘤细胞无毒或毒性极低的药物前体，在肿瘤细胞内代谢成毒性产物，提高肿瘤细胞对药物敏感性，从而杀死肿瘤细胞而不伤及正常细胞。因此，这类前药转换酶基因被称为“自杀基因”，又称前药敏感基因；自杀基因治疗又称为病毒介导的酶／药物前体疗法。

自杀基因有多种，目前研究应用较多的是单纯疱疹病毒胸苷激酶基因／丙氧鸟苷(TK／GCV)系统。用这种自杀基因转染肿瘤细胞后，能够高特异性地抑制和杀伤肿瘤细胞而不出现明显的毒副作用。1986年，国际上首次报道TK基因用于治疗脑恶性肿瘤，取得了较好效果。2000年，德国完成了治疗多形性恶性脑胶质瘤的III期临床试验。随后，美国及日本等国家也分别报道了结肠癌、卵巢癌及前列腺癌等临床试验结果。我国李宁教授领导的团队利用TK自杀基因治疗肝癌的起步较早，目前已经完成了II期临床研究，显示出对肝癌细胞有较好的抑制和杀伤效果，大多数病人都能够很好耐受。

大家知道，癌症患者早期多没有症状，往往是在体检或就诊时偶然发现，初次诊断时就已经是中晚期，失去了手术治疗的最佳机会。随着肿瘤多学科综合治疗的日趋完善，对这些中晚期肿瘤可以通过术前化疗和术后新辅助治疗，提高治愈率，显著延长大部分患者的生存期。但是由于肝癌本身的生物学特性，其对放、化疗的敏感性较低而副作用非常突出，同时肝脏又是人体重要的代谢器官，放、化疗常常会使患者无法耐受，难以获得和其他肿瘤一样的治疗效果。肝癌是我国常见的恶性肿瘤之一，由于起病隐匿，发现晚，进展快，死亡率高，素有“癌王”之称。自杀基因治疗作为一种有效的生物治疗方法，由于其特异的分子靶向性和低毒性，在肝癌的治疗中发挥重要作用。

自杀基因治疗可以采取局部注射及动脉灌注等多种方式进行，其成功要点是如何有利于提高自杀基因对肿瘤细胞的转染效率。在以往的治疗过程中发现，自杀基因治疗通常会存在基因转染效率较低的情况，也就是说当基因注射到体内以后，真正到达肿瘤细胞内的基因数量有限，因此，对肿瘤细胞的抑制和杀伤就打了折扣。较好的选择是将自杀基因治疗和其他方法联合应用，达到最大限度地杀伤肿瘤细胞、激活免疫系统而保持正常组织功能的目的。由于自杀基因毒副作用较小，其联合应用适应疗比较广泛。对于早期肝癌，自杀基因的术前局部治疗及术后动脉灌注，可以最大限度地清除微小转移灶，防止肝癌的复发和转移，获得根治效果；对于中晚期肝癌，自杀基因可以联合射频及介入治疗，也可单独进行局部或肝动脉灌注治疗。基于肝脏强大的再生和代偿功能，有效的联合治疗可以明显延长患者的生存期，最终达到使肝癌成为人类慢性疾病的目标。

自杀基因治疗目前处于临床转化阶段，无论研究还是临床应用，都存在不少问题和困难。例如，如何检测体内有效的自杀基因浓度，特别是靶部位的有效浓度，对于定量评估自杀基因的疗效具有重要意义。此外，联合其他治疗的有效率也有待循证医学的证实。尽管如此，相信随着多学科综合治疗的日趋完善，在循证医学的指导下，肝癌自杀基因治疗将不断发展和完善，形成自杀基因的规范化治疗与个体化治疗的统一，为肝癌患者造福。

名词解释

基因治疗的策略范文4

【关键词】 六味地黄丸/药理学 肝肿瘤/中西医结合疗法 肿瘤/病理学 细胞凋亡 基因疗法 自杀基因

疾病模型，动物； 小鼠

肝癌的基因治疗，特别是自杀基因治疗，在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发和转移，以及提高病人生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域［1-3］。从已有的研究结果来看，单纯自杀基因治疗仍难以达到完全根治肿瘤的目的。因此，寻找自杀基因疗法的增效方法是目前各种肿瘤自杀基因治疗的研究热点之一。

免疫机制是旁观者效应产生的重要机制［4-5］，改善自杀基因疗法作用的炎症免疫微环境是自杀基因疗法增效的主要途径［6-7］。六味地黄丸具有增强机体免疫功能和直接抗肿瘤作用［8-13］，我们前期的研究结果显示其对小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自杀基因治疗具有增效作用［14］，本文旨在观察其疗效的病理学机制，现将结果报道如下。

1 材料和方法

1.1 主要试剂与仪器 细胞培养瓶、培养板、滤膜、冻存管等为美国Corning公司和丹麦NUNC公司产品；Polybrene和G418为Sigma公司产品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。主要仪器为BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC），亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）等。

1.2 动物 昆明种小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：2003A008）。

1.3 细胞株 病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内记为PT67/tk［15］；小鼠肝细胞癌细胞株H22购自中山大学实验动物中心细胞库。

1.4 药物及配制 六味地黄丸为北京同仁堂产品（批号：4030098），于无菌室内用消毒研钵加少许消毒蒸馏水研磨后，配成浓度为500g/L的药液，小鼠给药剂量为生药10g·kg-1·d-1；丙氧鸟苷（GCV）为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品（批号：040701），于无菌室以注射用生理盐水25mL溶解，浓度为10g/L，小鼠给药剂量为100mg·kg-1·d-1。

1.5 小鼠肝细胞癌细胞株H22的感染及GCV体外杀伤效应的观察 复苏包装细胞PT67/tk，吸取其培养上清液，加入H22的培养液中，上清液病毒感染H22细胞后用G418(800mg/L)筛选，获得抗性细胞克隆，命名为H22/tk，将H22/tk和野生型H22细胞分别以2×103、3×103、5×103个/孔接种96孔板，同时加入不同浓度的GCV使终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的细胞孔作对照，每一个浓度设4个复孔，于倒置显微镜下观察杀伤效应。

1.6 造模及治疗

1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 将H22/tk和野生型H22按1：4混合（模拟临床体内病毒感染肿瘤细胞比率10%～20%）。混合后的细胞制备成1×1010个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数＞90%；按0.2mL/只（含2×106个肿瘤细胞）细胞悬液接种于小鼠的皮下。

1.6.2 分组及治疗 昆明种小鼠90只，随机分为5组：正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗组、联合治疗组（自杀基因联合六味地黄丸），正常对照组10只，其他组各20只。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水0.2mL，其他各组右前肢腋下接种肝癌细胞悬液0.2mL。正常对照组和模型对照组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；六味地黄丸治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；自杀基因治疗组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；联合治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。

1.7 疗效观察及病理学机制

1.7.1 肿瘤质量及抑瘤率 实验结束后处死动物，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量，记录结果。计算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。

1.7.2 病理学观察及半定量分析 肿瘤用体积分数10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤细胞的密度、肿瘤坏死、间质反应，并采用盲法评分。肿瘤细胞密度：根据肿瘤细胞大小及密集程度分为+、++、+++3个等级。坏死分为+：灶状坏死；++：网状多灶状坏死；+++：大片状坏死。纤维结缔组织根据肿瘤间质内及瘤周纤维的增生情况由低到高依次分为+、++、+++3个等级。肿瘤细胞核分裂像计数方法为每张HE染色切片随机取5个非坏死区域高倍视野，对核分裂像进行计数。

1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫组化染色及阳性细胞计数 采用免疫组化SP法。切片脱蜡至水，入体积分数1%过氧化氢溶液20min；磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封闭液，20min；滴加增殖核抗原抗体，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素标记二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；联苯二胺(DAB)显色，10min，Mayer苏木素复染5s，干燥后中性树胶封片。胞核呈棕黄色为阳性细胞，每张切片随机取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞个数并取平均值。

1.7.4 肿瘤细胞凋亡的检测 采用原位末端标记（TUNEL）法。切片脱蜡至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反应液，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入体积分数0.3%的过氧化氢，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer苏木素复染，干燥后中性树胶封片。以胸腺组织为阳性对照，不加末端脱氧核苷酸转移酶作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为阳性细胞，每片随机选取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞的个数，以同一视野内阳性细胞占总细胞的百分比表示细胞凋亡指数：p凋亡/%=(n阳性细胞/n总细胞）×100%。

1.8 统计学处理 计量资料采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析；等级资料采用Ridit分析。

2 结果

2.1 体外杀伤效应 铺板48h后，H22/tk100mg/L浓度孔中细胞开始死亡，表现为胞膜不完整，轮廓模糊，不透亮，形状不规则，并且碎裂成小粒状；10mg/L以下组仅见极少数细胞死亡，且增殖明显。野生型H22细胞均呈现明显的细胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上浓度孔中绝大部分细胞碎裂成小粒状，孔内基本无活细胞生存；其他包括野生型H22细胞孔均呈现明显的细胞增殖。表明体外病毒感染肝癌细胞成功，病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性，可用于体内治疗的实验研究。

2.2 肿瘤质量及抑瘤率 表1结果表明，各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻，其中联合治疗组与模型对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05）。

2.3 病理学观察及半定量分析 各组肿瘤细胞均表现为大小不一，核大深染，形状不规则，肿瘤间质内及瘤周有不同程度的纤维结缔组织增生，肿瘤组织内均可见不同程度的大片坏死。模型对照组与六味地黄丸治疗组均见肿瘤组织内细胞密度较大，自杀基因治疗组与联合治疗组见肿瘤组织内细胞密度较低，仅自杀基因治疗组肿瘤细胞密度与模型对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），见表2，图1。

2.4 肿瘤细胞的增殖与凋亡 六味地黄丸治疗组和联合治疗组核分裂像明显少于肿瘤模型组和自杀基因治疗组，其中联合治疗组核分裂像最少。增殖核抗原阳性细胞着色部位位于细胞核，呈黄褐色，六味地黄丸治疗组与联合治疗组阳性细胞数均少于其他两组，以联合治疗组阳性细胞数最少。各治疗组肿瘤细胞凋亡较模型对照组明显增多，以联合治疗组最明显，见表3，图2-4。表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较表2 各组病理分析统计结果表3 各组肿瘤细胞增殖与凋亡检测结果

3 讨论

自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因。目前常用的自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，而这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡［16］。

HSVtk/GCV为目前研究最深入、最具有应用前景的肿瘤自杀基因治疗系统之一，已广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，并已进入Ⅲ期临床实验。HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致细胞死亡［17］。

自杀基因治疗由于存在旁观者效应（bystander effect）的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最具有应用前景的肿瘤基因治疗方法。所谓旁观者效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［18］。由于存在旁观者效应，自杀基因疗法对肿瘤细胞的杀伤作用被有效地放大。旁观者效应形成机制的假说主要包括［18］：(1)"缝隙连接"机制；(2)免疫介导机制；(3)"细胞凋亡"机制；（4）介质机制；(5)抗肿瘤血管生成机制，等等。

由于免疫介导机制在体内自杀基因疗法旁观者效应中的重要作用。改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。现代药理学研究结果表明，滋阴补肾代表复方六味地黄丸（汤）对机体细胞免疫和体液免疫均有明显的增强效应；能明显改善荷瘤机体的免疫状态，并具有一定的直接抗肿瘤作用。我们以六味地黄丸的免疫药理作用与肿瘤自杀基因疗法旁观者效应的免疫介导机制之内在联系为研究的切入点，以实验性肝细胞癌为治疗对象，比较研究了自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗与单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗的抗肿瘤效果。研究结果显示：联合治疗组对肿瘤生长的抑制作用较单纯自杀基因治疗组或单纯六味地黄丸治疗组更为明显［14］。

在进一步的病理学研究中，虽然病理学观察表明自杀基因治疗组与联合治疗组的肿瘤组织内细胞密度较低，各治疗组纤维组织增生均较明显，但通过盲法对肿瘤的病理定量分析研究则显示肿瘤细胞密度、肿瘤坏死、间质反应各组间差异均无统计学意义。造成这种现象的原因最有可能是观察者不能很好地把握分级标准，以及病理半定量分析的不够精确，这有待于通过多次的重复实验及增加样本量或运用更为精确的分析方法（如图像分析等）来解决。 肿瘤的生长速度与肿瘤细胞的增殖与凋亡速度相关。PCNA与细胞核分裂像均为评价细胞增殖能力的重要指标。本实验结果显示：联合治疗组与六味地黄丸治疗组的PCNA阳性细胞数及核分裂像数均少于模型组、自杀基因治疗组，其中联合治疗组与模型组、自杀基因治疗组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，结果说明六味地黄丸可能具有一定的抑制肿瘤增殖的作用；其他各组间的差异均无统计学意义，而自杀基因治疗组从绝对值看略高于模型对照组，其结果与文献报导自杀基因治疗后残存肿瘤细胞会加速增殖相符。同时，从本实验结果来看，各治疗组肿瘤细胞凋亡均有增多，联合治疗也显示了更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。

本研究结果提示：肿瘤细胞增殖抑制和肿瘤细胞凋亡增多都与六味地黄丸对肝癌自杀基因治疗的增效作用有关。其机理可能是在六味地黄丸的参与下，不仅发挥了直接抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的功效，而且通过对机体整体与局部的抗肿瘤免疫的调节或其他机制（如"缝隙连接"机制等），使得自杀基因治疗的旁观者效应在力度上得以增强，在时限上得以延续，从而更好地发挥了自杀基因疗法的抗肿瘤作用。

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基因治疗的策略范文5

基因治疗视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是近年来新型的治疗方法。我们从自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因这三方面对RB的基因治疗现状、相关进展及存在问题作一综述。

【关键词】 视网膜母细胞瘤；基因治疗

AbstractGene therapy of retinoblastoma(RB) is a new type of treatment in recent years. In this paper， We make a review about gene therapy status， progress and problems of RB from three aspects of suicide genes， tumor suppressor genes， antiangiogenic genes.

KEYWORDS: retinoblastoma; gene therapy

0　引言

视网膜母细胞瘤（retinoblastoma，RB）是婴幼儿眼病中性质最严重，危害最大的一种恶性肿瘤。RB的治疗大多采用患眼眼球摘除术，局部保守治疗包括化学治疗、光凝治疗、冷冻治疗、加热治疗等。基因治疗是多种肿瘤治疗研究的热点，因为肿瘤的发生往往与人体内基因的变异或表达异常密切相关，基因治疗的目的就在于从基因水平上对这些异常予以纠正。作为基因治疗的靶组织，眼球因为其特殊的部位和结构，便于准确地将目的基因导入靶细胞，具有独特的优势。关于RB的基因治疗的研究已有十几年，现对近十年其研究现状、存在的问题及发展方向予以综述。

1　自杀基因的治疗

自杀基因疗法又称药物敏感基因疗法，即利用转基因的方法将前药酶解基因导入肿瘤细胞内，其基因表达产物能将原本无毒性的药物转化为细胞毒性物质，从而杀死细胞[1]。其中将单纯疱疹病毒胸腺嘧啶核苷激酶 (herpes simplex virus thymidine kinase，HSVtk)基因导入肿瘤细胞中表达，联合应用更昔洛韦 (gancyclovir，GCV)进行自杀基因治疗是目前最为有效的一种治疗方法。Hurwitz等[2]采用腺病毒作为载体，在体外观察到HSVTK/GCV系统可以杀死视网膜母细胞瘤细胞（Rb）。在体内采用裸鼠的玻璃体腔内注射制造RB模型，经HSVTK/GCV系统治疗后，70%的肿瘤消失。治疗组的生存期较对照组显著的延长。自杀基因还有“旁观者效应”，有人称之为“代谢协同”、“相邻细胞杀伤作用”等。当肿瘤细胞被转导自杀基因后，不仅转导细胞被杀死，而且相邻的未转导的细胞也被杀死。Hayashi等[3]报告在体外 Rb肿瘤细胞实验中用细胞生存分析测试旁观者效应证明，将10％的 Y79Rbtk细胞和 90％的 Y79Rb细胞共同培养并用 GCV敏感，5d内有80％以上的未转染的Y79Rb细胞死亡，50％的 Y79Rbtk细胞死亡。由于不可能通过载体将所有的肿瘤细胞都转入HSVtk基因，而“旁观者效应”明显扩大了自杀基因的杀伤作用，在相当程度上弥补了对肿瘤细胞转染效率低的问题，因此对恶性肿瘤的治疗有着十分重要的意义。关于旁观者效应的机制尚不十分清楚。目前，多数研究者认为，旁观者效应是由于转基因细胞产生的杀伤性物质通过细胞间的缝隙连接传递到邻近细胞，引起细胞死亡，这需要转基因与邻近细胞的直接接触[4]。还有学者认为凋亡的HSVtk (+)细胞释放凋亡小体，引起 HSVtk ()细胞凋亡[5]。李涛等[6]观察到 HSVtk/GCV系统对 Rb细胞的杀伤过程中存在明显的“旁观者效应”，当只有 10%的 HXORb44/tk细胞存在时，前体药物即可对混合细胞产生明显的杀伤作用。进一步对其机制进行研究发现，GCV作用下的HXORb44/tk上清对HXORb44细胞不具有杀伤作用，表明GCV的代谢产物不能弥散进入培养基，旁观者效应的发生需要细胞间的相互接触，从而说明GCV代谢产物通过细胞间缝隙连接进行转运可能是此旁观者效应的主要机制。Rb自杀基因治疗的研究已取得了相当可喜的成果，展示了良好的发展前景。但是由于研究的时间太短，还远未达到成熟的程度，要真正走向临床还有很长的路要走。目前的研究绝大部分仍是基础方面的，还有相当多的问题尚待解决与完善： （1）有待开发新一代的自杀基因系统，进一步提高对肿瘤的杀伤功效。（2）由于旁观者效应对自杀基因疗法抗肿瘤作用的重要意义，应进一步以各种措施加强其效应。（3）进一步研究自杀基因疗法与其它治疗手段的联合，采用多系统综合疗法治疗RB，如基因与细胞因子的联合疗法，可一方面抑肿瘤生长，另一方面又提高机体对肿瘤的免疫应答，增加抗肿瘤作用，因此是一条行之有效的途径。

2　导入抑癌基因的治疗

Rb基因是与RB形成关系最为密切的基因，其定位于人13号染色体的长臂1区4带（13q14）上。Rb基因经两次突变而失活被公认为是RB发生的重要分子机制。Rb基因作为一种抑癌基因，其抑制肿瘤细胞生长的机制与细胞周期阻滞作用有关[7]。当Rb基因失活后，促使细胞提前从G1期进入S期。细胞分裂加速，使DNA损伤修复不完全，进而导致肿瘤的发生。张晓玮等[8]以逆转录病毒为载体，用脂质体Dosper介导法将Rb基因导入裸鼠眼玻璃体腔RB移植瘤内，Rb基因可诱导RB移植瘤细胞凋亡。近期研究发现，去除 N端的Rb蛋白PRb94(野生型全长 PRbll0的NH2末端缺失 112氨基酸残基)在头颈部癌[9]、膀胱癌[10]、前列腺癌[11]细胞系及体内肿瘤中具有比PRbl10更强的肿瘤抑制效应。有研究显示，转染Rb94基因的膀胱癌细胞停滞于G1期，G2和S期细胞减少[12]。G1期细胞增加使转入S期的肿瘤细胞减少，表明肿瘤细胞的 DNA合成受到了抑制，从而影响肿瘤细胞的分裂和增生。提示Rb94基因有助于细胞保持在静止期，可有效抑制肿瘤细胞的异常增生。在RB的发生发展中除Rb基因外，p53和p21等基因在其中起着重要作用。p53基因是迄今发现的与人类恶性肿瘤相关性最高的一种抑癌基因。大量的体外实验已证实了野生型p53基因转染肿瘤细胞可以抑制其生长，诱导肿瘤细胞出现凋亡。相应的动物实验对肿瘤细胞动物模型经血液或肿瘤局部注射含一定浓度的p53基因重组体，可以观察到肿瘤不同程度的缩小，动物生存期延长[13]。国内已有学者研究证实野生型p53基因对Rb细胞有明显抑制生长的作用[14]。正常p53基因的导入还可以诱导肿瘤细胞对化疗药物及放疗的敏感性，加快肿瘤细胞的凋亡[15]。

3　抗血管生成基因治疗

1971年，Folkman正式提出“肿瘤生长依赖于血管生成”的观点。肿瘤生长分为两个阶段，血管前期和血管期。血管前期肿瘤主要通过弥散作用获得营养和氧，并运走代谢废物。当肿瘤体积增至1～2mm以上时，如无新血管长入，肿瘤组织将保持静止状态或退化[16]。一旦血管长入肿瘤，血液供应变为灌注，新生血管不仅为肿瘤组织提供足够的营养和氧，还提供大量的生长因子，促使肿瘤迅速生长。抗血管生成治疗以肿瘤新生血管为作用靶点，目的是切断肿瘤生长转移所需要的营养，从而达到“饿死”肿瘤的目的，目前已成为重要的抗癌策略。VEGF是目前发现的最重要的促血管生成因子之一，在肿瘤血管生成过程中发挥重要的调节作用。在众多血管调控因子中，VEGF是唯一能特异作用于血管内皮细胞的有丝分裂素。它一方面可以增加血管通透性，有利于血浆蛋白、纤维蛋白原外渗，促进血管生成和新基质形成，另一方面，VEGF促进血管内皮细胞有丝分裂，刺激血管内皮细胞增殖[17]。Jia等[18]将针对VEGF的小干涉性RNA质粒转染入人Rb细胞内，发现稳定转染的血管内皮生长因子siRNA可以抑制Rb细胞VEGF的表达，对RB瘤体血管的生成和肿瘤的发生起到了抑制作用。Mahasreshti等[19]采用鼠皮下的RB模型，以重组腺病毒为载体，将编码可溶性VEGF受体1的cDNA导入，发现肿瘤体积明显缩小。微血管密度被证实了在肿瘤的发生和机制上所起的作用。Rossler等[20]在107例RB患者中，通过CD31免疫组织化学法来检测微血管密度，发现血管化程度的增高与侵入脉络膜与视神经有关。18例转移癌患者的微血管密度显著性的高于未发生转移的癌症患者。Marback等[21]做了类似的研究，在25例RB患者中，研究人员用CD34检测肿瘤血管区，发现肿瘤的血供越丰富发生转移的可能性越大。目前，抗肿瘤血管生成基因治疗尚处于实验研究阶段，但初步结果是令人鼓舞的。由于肿瘤血管的新生是一个复杂的生理、病理过程，肿瘤生成涉及诸多方面，对于其分子机制还有待于进一步研究。目前尚未明确肿瘤血管的特异性标志，即肿瘤血管与正常血管的差异性标志，如果能在这方面取得更多的发现，将有助于开发出特异性的抗肿瘤血管生成抑制剂。但由于抗血管生成基因治疗较传统抗癌治疗具有不可比拟的优势：（1)抗血管新生基因治疗的靶向性：内皮细胞具有遗传稳定性，不易产生耐药；(2)直接作用于肿瘤血管内皮细胞，局部浓度高。总之，血管生成是肿瘤生长转移过程中的重要环节，抗血管生成治疗，尤其是抗血管生成的基因治疗作为抗肿瘤治疗的新靶点，具有广阔的应用前景。在整个基因治疗的研究领域中，安全、高效、靶向基因载体的研究和开发是关键和瓶颈问题[22]。目前关于基因转移多采用病毒载体，具有较高的转染率和高表达能力，这是其他非病毒载体无法比拟的优势。但把一个外源性病毒引入体内，会引起机体的免疫反应和潜在的致突变性，导致目的基因不能持续表达进而需要反复治疗，而对眼球进行反复操作势必带来不必要的损伤。使用短效免疫抑制剂可使目的基因表达时间延长，但免疫抑制的副作用又会接踵而至。况且某些病毒本身就具有一定毒性，对机体是一个潜在的危害[23]。也有少数学者采用脂质体等非病毒载体进行试验，但转染效率较低[24]，在体内应用具有一定毒性。近年来，有学者在研究中发现，携带有目的基因的微泡造影剂经静脉注入体内后能够通过肺循环到达全身各个器官的靶组织，用低强度超声作用于靶组织，可使微泡在超声的“空化作用”下爆破，使目的基因释放到靶组织[25]。微泡在一定声能的作用下使靶细胞的胞膜发生“微穿孔效应”，携带有目的基因的质粒可从胞膜上的微孔进入靶细胞内达到基因转导的目的[26]。这种声能的调控可使微孔的开放呈可逆性的，即不损伤靶细胞；也可使微孔的开放呈永久性的，即引起靶细胞的破裂死亡。超声微泡介导基因治疗仍处于实验研究的起步阶段，还面临许多亟待解决的问题。

总之，基因治疗如能在靶向性、安全性和高效表达等方面加以完善和发展，基因治疗在肿瘤治疗中的地位将会越来越重要。综合治疗将是RB治疗的发展趋势。因此，基因治疗若能协同或增强化学药物治疗、放射治疗、激光光凝、PDT，TTT等的疗效，将会在RB的治疗中起重要作用。 参考文献

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基因治疗的策略范文6

【关键词】 CDTK基因;视网膜母细胞瘤;自杀基因治疗;5FC;GCV

Abstract

AIM: To investigate the killing effects of tumor cells specific vector of suicide gene of CDglyTK driven by hTERT promoter on retinoblastoma Y79 cells in vitro.

METHODS:At first，the recombinant plasmid was transfered into Y79 cells with electroblot as a delivery system. RTPCR and Western blot analysis were used to determine the CDTK mRNA and protein expression in Y79 cells which had been transfected by pcDNA3.1CMV hTERT CDTK plasmid vector. The conversion efficiency of 5FC into 5FU in CDglyTKexpressing Y79 cells was measured by HPLC. The killing effects of double suicide genes on Y79 cells that treated with 5FC，GCV of different concentrations were determined by the method of MTT.

RESULTS:The expression of CDTK gene in Y79 cells was certificated by RTPCR and Western blot and a 59kD protein was obtaind which was equal to the sequence expection of CDTK gene. In MTT analysis，there was significant difference between transfected and nontransfected survival Y79 cells(P

CONCLUSION:The recombinant plasmid vector pcDNA3.1CMV hTERT CDTK can be transcribed and translated into CDTK fusion protein in Y79 cells.The transfer of the CDglyTK fusion gene into Y79 cells followed by the administration of 5FC or GCV can kill Y79 cells in vitro. The killing effect of two predrugs is stronger than that of one predrug.

KEYWORDS: CDglyTK gene; retinoblastoma;suicide gene therapy;5FC; GCV

自杀基因治疗是近年来肿瘤研究的热点领域之一，也是目前最有可能有效应用于临床的肿瘤基因治疗策略之一。构建安全高效的载体是基因治疗的关键。我们已经成功的构建了含有hTERT启动子的肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK[1]。我们将探讨该载体对人视网膜母细胞瘤Y79细胞在体外的作用。

1材料和方法

1.1材料

Y79细胞株[美国模式菌种收集中心(ATCC)];RPMI1640细胞培养基(Gibco);胎牛血清(Gibco);5FC，5FU，GCV(Sigma);Reverse Transcription system kit(Invitrogen);Trizol(Gibco); QIAfilterTM plasmid Maxi kit(Qiagen); Triton X100(CalBiochem); ECL试剂盒(Amersham pharmacia biotech); PVDF膜(Amersham pharmacia biotech);双丙烯酰胺(BioRad); MTT(Sigma);鼠TK mAb(QED公司);兔抗鼠IgG二抗(KPL公司);蛋白质Marker(上海生化试剂公司);实验所用引物 (上海生工生物工程有限公司)：yCDrt：5’ACGCTGTGTTGTCGGTGAGAA3’;TKrt：5’CAC CACCACGCAACTGCTG3’;βactin F：5’CACCCTGAAGTA CCCCATCG3’;βactin R：5’TTGCCAATGGTGATGACCTG3’。

1.2方法

将经过证实的含有pcChCDTK质粒的JM109菌液0.2mL接种到200mL含50mg/L氨苄青霉素的LB培养基中，37℃，280r/min的摇床上培养16h，将菌液转移到离心瓶中。然后按照QIAfilterTMplasmid Maxi kit提供的步骤进行操作提取质粒pcChCDTK，干燥后，加无菌水溶解质粒300μL，用Duc 640分光光度计测定DNA含量，20℃分装保存。用RPMI1640培养液培养Y79细胞，每日在倒置相差显微镜下观察。Y79细胞悬浮生长，培养中细胞可聚集成团并沉集于培养瓶底部，当细胞基本铺满瓶底即可传代，按照1∶2～1∶4传代。将传代后的Y79细胞培养24h后，细胞进入对数生长期，即可用于电转化。未转染Y79细胞生长迅速，传代后培养24h后，细胞进入对数生长期。取上述进入对数生长期并基本铺满瓶底的细胞，在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞。用0.01mol/L PBS 10mL重悬细胞，取细胞悬液20μL，用细胞计数板计数，其余细胞在22℃，1000r/min条件下，离心10min，重新收集细胞;根据计数结果，用0.01mol/L PBS以6.25×109/L的密度重悬细胞。取800μL细胞重悬液加入到含有pcChCDTK质粒20μg的EP中，吹打混匀，然后转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，迅速将电击产物分至已加入10mL 200mL/L胎牛血清的RPMI1640培养液的75cm2培养瓶中，置37℃，50mL/L CO2的细胞培养箱内培养。电转染后的Y79细胞生长与未转染细胞相似。倒置相差显微镜下见细胞悬浮生长，形状饱满，色泽鲜亮，聚集成团。

1.2.1 CDTK基因表达的检测

提取Y79细胞RNA;参照reverse transcription system kit进行RTPCR反应;取逆转录产物2μL作为模板，以yCDrt和TKrt为引物扩增CDTK，同时用βactin扩增引物作对照，RTPCR产物用8g/L琼脂糖凝胶跑胶检测。另取未转染的Y79细胞设为对照，同法处理。取转染48h和未转染的Y79细胞预处理;固定玻片;配制分离胶和堆积胶;上样;跑胶;转膜;封闭;加一抗;洗一抗;加二抗;洗二抗;显色;曝光。

1.2.2 5FU浓度的检测

人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。细胞在转染肿瘤特异性杀伤载体pcChCDTK前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满瓶底。将细胞在22℃，1000r/min的条件下，离心10min，收集细胞，用适当体积的无血清的RPMl1640培养液重悬，细胞计数，使之密度为6.25×109/L。取细胞悬液800μL加入自杀基因载体pcChCDTK 20μg，将其混匀，转入0.4cm的电击杯中，以2kV，25μF的条件进行电击。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后收集细胞并用1×PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个细胞的浓度植入24孔板，每孔培养液体积1mL。24h后加入前体药物5FC(200mg/L)。在加5FC 24h后取其细胞上清，用高效液相色谱仪(HPLC)检测其5FU的浓度。配5FC及5FU标准品的浓度梯度做标准曲线。LC10A高效液相色谱仪;分析柱: Shimpack CLCODS(5μm，150mm×4.6mm，ID);预柱YWGODS(10μm，10mm×4.6mm，ID);流动相：甲醇/水(20/80);流速1mL/min;检测波长266nm;柱温37℃。10μL进样。

1.2.3前体药物对细胞毒性的检测

采用Western Blot技术检测新融合自杀基因CDTK在视网膜母细胞瘤Y79细胞中的蛋白质水平表达。人视网膜母细胞瘤细胞株Y79用含200mL/L胎牛血清RPMI1640培养液在37℃，50mL/L CO2细胞培养箱中正常培养。以2×105个细胞的密度将细胞接种到96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后，加入不同浓度的前体药物100μL，即5FC以0，25，50，100，200，400，800mg/L;GCV以0，2，4，8，16，32，64mg/L加入96孔板。每个浓度梯度有4孔。留1孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。在37℃，50mL/L CO2的条件下，细胞不换液培养5d后，每孔加入(5g/L) MTT溶液20μL，37℃，继续孵育4h，终止培养，吸去培养上清液。每孔加入DMSO 150μL，振荡10min，使结晶物充分溶解。比色：选择490nm波长，在酶联免疫检测仪上调定各孔吸收值。以每天进行换液的细胞做对照，假设细胞存活率为100%，将其它各细胞孔的吸收值与其比较得出各处理组细胞的平均存活率。另视网膜母细胞瘤细胞在转染前24h换液，调整细胞密度使之在转染时达基本铺满培养瓶底。将pcChCDTK载体电转染Y79细胞。电击后，细胞接种入培养瓶中培养，24h后，收集细胞并用0.01mol/L PBS洗3次，然后用含200mL/L胎牛血清的RPMl1604培养液配成细胞悬液，以每孔2×105个的密度植入96孔板中培养，每孔体积200μL。24h后加入不同浓度的前体药物100μL，5FC+GCV以两药的对应浓度加入96孔板，每个浓度梯度有4孔。留一孔不加细胞，只加培养液做空白对照孔。然后用MTT法检测细胞存活率。统计学分析：所得数据用SPSS 11.5统计软件包进行统计，采用StudentNeuman Keuls(SNK)检验，以P

2结果

2.1 Y79细胞转染后CDTK基因的表达

RTPCR检测结果显示，转染组可见一403bp特异条带，与预期大小一致(图1)。而在未转染的对照组细胞中，未扩增出403bp特异条带。在两组中均扩增出作为内对照的βactin产物561bp条带。分析结果显示：大小为42kD的内参βactin蛋白条带在转染和未转染的Y79细胞中均可见，一个大小为59kD的条带，在转染了pcChCDTK载体的Y79细胞中可见，这与yCDTK基因序列分析的预期蛋白大小一致，为自杀基因yCDTK蛋白。未转染pcChCDTK的Y79细胞中则没有59kD的条带出现(图2)。

2.2 Y79细胞转染后5

FC转化效率 加5FC 24h后上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，5FC向5FU的转化效率约为84.5%。

2.3前体药物对Y79细胞的毒性

将生长良好的人视网膜母细胞瘤Y79细胞，按每孔2×105个细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为98.2%，94.7%，90.5%，88.2%，89.4%，86.4%和83.9%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P

2.4前体药物对用肿瘤杀伤载体转染的人视网膜母细胞瘤细胞的毒性检测

将电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤细胞，按相同的密度将细胞接种到96孔板中培养。加入不同浓度的前体药物5FC培养5d，平均细胞存活率分别为94.0%，91.6%，85.1%，80.0%，72.7%，69.9%和62.7%。SNK检验表明，各梯度间的细胞存活率存在显著性差异(P

3讨论

目前，相对于传统的视网膜母细胞瘤(retinoblastoma，RB)治疗方法而言，RB基因治疗不仅可以弥补光凝固治疗、光动力学治疗、温热治疗、冷冻治疗的应用局限性，而且不会产生诸如化学治疗、放射治疗的副作用，更不会因为眼球摘除所导致的致残性而造成患儿心理障碍影响生图1RTPCR产物凝胶电泳图 M:DL2000 Marker;1:转染组可见预期的CDTK(403bp)目的片段和βactin(561bp);2:未转染组;3:阴性对照。图2Western Blot检测CDTK的表达 A：1，2:βactin(42kD);B：1:转染pcChCDTK的Y79细胞，出现一条约59kD蛋白;2:未转染的Y79细胞。

存质量。因此，RB基因治疗的研究越来越为人们所重视，并且通过不同的治疗策略取得了一系列的研究进展。现阶段对RB基因治疗的研究主要集中在4种不同的基因上，包括自杀基因、抑癌基因、抗血管生成基因以及促凋亡基因。RB发生的分子机制还不是太清楚，而且与RB形成相关的抑癌基因凋亡诱导基因种类繁多，与肿瘤血管形成相关的诱导因子和抑制因子多种多样，且分子机制仍有待于进一步研究。我们选择双自杀基因CDTK作为目的基因，实施RB的自杀基因治疗。首先，自杀基因作为肿瘤基因治疗的候选基因，已经在多种肿瘤开展研究[27]。其表达产物和前体药物相互作用来实现肿瘤基因治疗的机制比较清楚。其次，自杀基因和前体药物相互作用产生的毒性物质能通过不同方式实现对邻近肿瘤细胞的旁杀效应，包括直接分泌到细胞外旁杀，或通过细胞间隙连接旁杀，或通过产生凋亡小体、免疫介导来实现旁杀。同时，目前的研究表明，自杀基因系统治疗RB是安全有效的[8]。我们设计的含有双自杀基因CDTK的载体通过电转染的方式导入了视网膜母细胞瘤细胞株Y79细胞。48h后，提取转染Y79细胞RNA，RTPCR的结果可见一403bp特异条带，与预期大小一致，显示双自杀基因CDTK在细胞中mRNA水平得到了表达。Western blot的结果也同样显示，载体转染的Y79细胞中，59kD的目的基因蛋白有明显的表达。这两个实验结果充分说明，我们构建的双自杀基因CDTK在靶细胞Y79中得到表达。先前的研究显示，被设计得的融合基因yCD/UPRT、大肠杆菌CDglyTK以及yCDglyTK具有最强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力。我们通过HPLC检测5FU的浓度，上清中5FU的浓度平均含量为169mg/L，故5FC向5FU的转化效率约为84.5%，说明我们所构建的肿瘤特异性双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒性物质转化的能力。

双自杀基因疗法是将两种自杀基因整合在一起，通过载体转导进入肿瘤细胞，其在肿瘤细胞内表达的融合基因产物具备两种酶的活性。因此，双自杀基因疗法可以大大提高抑制肿瘤生长的功效，同时使得前体药物的用量减半。大量资料表明双前体药物对肿瘤细胞的杀伤作用要强于单前体药物。但也有资料显示双自杀基因之间可能存在拮抗效应。在体外实验中，单独加5FC的细胞杀伤最强，要高于5FC和GCV都加的组，而单独加GCV的细胞杀伤力最低， CD和TK之间没有协同作用，反而可能会相互干扰各自功能的运行。原因可能有两个方面：(1)可能是融合基因yCDglyTK在同时加5FC和GCV时，CD/5FC和TK/GCV两种系统的功能出现拮抗效应;(2)可能是在yCDglyTK融合基因中，由于某种原因，CD和TK的活性在这个融合基因中得到提高，使CD/5FC和TK/GCV两种系统的抑瘤能力同时或其中一种得到增强。当E.coli CD和HSV1 TK基因同时在一种细胞中表达时，会存在相互干扰作用。这种干扰作用的机制到目前还没搞清楚，但干扰作用可能不是发生在基因的转录期，而是在转录之后，TK介导的5FUMP的磷酸化会产生无毒的5FdUDP和5FdUTP，而不是毒性产物5FUDP和5FUTP，从而减低了CD/5FC的细胞毒性作用;或者CD介导的对GCV，ACV等的脱胺反应减低了TK/GCV系统的细胞毒性。yCD/UPRT基因中UPRT的酶活性与单独的UPRT酶活性大致相等，但是yCD/UPRT基因中的CD酶活性要高于单独CD酶活性100倍。这种酶活性的改变可能与这3种酶的蛋白质特性不同有关。加入不同浓度的前体药物5FC，GCV或5FC+GCV于电转了pcChCDTK的人视网膜母细胞瘤Y79细胞培养5d， SNK检验表明，与未转染的细胞对应浓度组比较，当5FC浓度达到100mg/L后各对应浓度平均细胞存活率组间均存在差异(PGCV >5FC。在本实验中，单前体药物对双自杀基因CDTK载体转染的Y79细胞均有杀伤作用，但双前体药物的杀伤作用要强于单前体药物。分析产生这种结果的原因，我们认为：(1)双自杀基因载体具有很强的催化前体药物向细胞毒物转化的能力;(2)这可能与我们加入的CMV增强子能大大促进hTERT启动子启动下游目的基因的表达有关，因为CMV增强子具有强大的增强转录能力，且没有组织特异性。

参考文献

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3陈海金，苏国强，黄宗海，等.慢病毒介导的双自杀基因对乳腺癌细胞的杀伤作用.广东医学2006;27(7)：965967

4谭万龙，谢毅，吴元东，等.腺病毒介导融合双自杀基因治疗膀胱癌.南方医科大学学报2006;26(5)：594597

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6黄嘉凌，刘艳燕，刘然义，等.肝癌特异性HSVTK/CD基因表达质粒的构建及其杀伤活性.中山大学学报(医学科学版)2005;26(2)：142145