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基因治疗的基本策略范文1
【关键词】 六味地黄丸/药理学 肝肿瘤/中西医结合疗法 肿瘤/病理学 细胞凋亡 基因疗法 自杀基因
疾病模型，动物； 小鼠
肝癌的基因治疗，特别是自杀基因治疗，在控制肿瘤的增殖、预防和延缓复发和转移，以及提高病人生活质量方面具有独特的优势，成为肝癌治疗活跃的研究领域［1-3］。从已有的研究结果来看，单纯自杀基因治疗仍难以达到完全根治肿瘤的目的。因此，寻找自杀基因疗法的增效方法是目前各种肿瘤自杀基因治疗的研究热点之一。
免疫机制是旁观者效应产生的重要机制［4-5］，改善自杀基因疗法作用的炎症免疫微环境是自杀基因疗法增效的主要途径［6-7］。六味地黄丸具有增强机体免疫功能和直接抗肿瘤作用［8-13］，我们前期的研究结果显示其对小鼠移植性肝癌HSVtk/GCV自杀基因治疗具有增效作用［14］，本文旨在观察其疗效的病理学机制，现将结果报道如下。
1 材料和方法
1.1 主要试剂与仪器 细胞培养瓶、培养板、滤膜、冻存管等为美国Corning公司和丹麦NUNC公司产品；Polybrene和G418为Sigma公司产品；DMEM、RPMI1640、胎牛血清为Gibco公司产品；新生牛血清为杭州四季青公司产品。主要仪器为BNA3210型CO2培养箱（日本ESPEC），亿鸣200病理图像分析系统（中国亿鸣）等。
1.2 动物 昆明种小鼠，18～22g，雄性占2/3，雌性占1/3，健康，清洁级，由广州中医药大学实验动物中心提供（合格证号：2003A008）。
1.3 细胞株 病毒包装细胞PT67购自美国Clontech公司，已于前期将重组pLXSNtk质粒转染入PT67细胞内记为PT67/tk［15］；小鼠肝细胞癌细胞株H22购自中山大学实验动物中心细胞库。
1.4 药物及配制 六味地黄丸为北京同仁堂产品（批号：4030098），于无菌室内用消毒研钵加少许消毒蒸馏水研磨后，配成浓度为500g/L的药液，小鼠给药剂量为生药10g·kg-1·d-1；丙氧鸟苷（GCV）为丽珠集团湖北科益药业有限公司产品（批号：040701），于无菌室以注射用生理盐水25mL溶解，浓度为10g/L，小鼠给药剂量为100mg·kg-1·d-1。
1.5 小鼠肝细胞癌细胞株H22的感染及GCV体外杀伤效应的观察 复苏包装细胞PT67/tk，吸取其培养上清液，加入H22的培养液中，上清液病毒感染H22细胞后用G418(800mg/L)筛选，获得抗性细胞克隆，命名为H22/tk，将H22/tk和野生型H22细胞分别以2×103、3×103、5×103个/孔接种96孔板，同时加入不同浓度的GCV使终浓度分别为0.01、0.1、1、10、100mg/L，以不加GCV的细胞孔作对照，每一个浓度设4个复孔，于倒置显微镜下观察杀伤效应。
1.6 造模及治疗
1.6.1 小鼠移植性肝癌的造模 将H22/tk和野生型H22按1：4混合（模拟临床体内病毒感染肿瘤细胞比率10%～20%）。混合后的细胞制备成1×1010个/L的细胞悬液，台盼蓝活细胞计数＞90%；按0.2mL/只（含2×106个肿瘤细胞）细胞悬液接种于小鼠的皮下。
1.6.2 分组及治疗 昆明种小鼠90只，随机分为5组：正常对照组、模型对照组、六味地黄丸治疗组、自杀基因治疗组、联合治疗组（自杀基因联合六味地黄丸），正常对照组10只，其他组各20只。正常对照组右前肢腋下注射生理盐水0.2mL，其他各组右前肢腋下接种肝癌细胞悬液0.2mL。正常对照组和模型对照组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；六味地黄丸治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射生理盐水每天0.25mL/只；自杀基因治疗组第2～16天蒸馏水灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只；联合治疗组第2～16天六味地黄丸悬液灌胃每天0.5mL/只，第6～16天腹腔注射GCV每天0.25mL/只。
1.7 疗效观察及病理学机制
1.7.1 肿瘤质量及抑瘤率 实验结束后处死动物，用眼科剪分离剥取肿瘤，万分之一电子天平称质量，记录结果。计算抑瘤率［16］:p抑瘤/%=（mmodel－mtreatment）/mmodel×100%。
1.7.2 病理学观察及半定量分析 肿瘤用体积分数10%中性甲醛固定，常规石蜡切片，苏木素-伊红（HE）染色，光镜观察肿瘤细胞的密度、肿瘤坏死、间质反应，并采用盲法评分。肿瘤细胞密度：根据肿瘤细胞大小及密集程度分为+、++、+++3个等级。坏死分为+：灶状坏死；++：网状多灶状坏死；+++：大片状坏死。纤维结缔组织根据肿瘤间质内及瘤周纤维的增生情况由低到高依次分为+、++、+++3个等级。肿瘤细胞核分裂像计数方法为每张HE染色切片随机取5个非坏死区域高倍视野，对核分裂像进行计数。
1.7.3 增殖核抗原（PCNA）免疫组化染色及阳性细胞计数 采用免疫组化SP法。切片脱蜡至水，入体积分数1%过氧化氢溶液20min；磷酸盐缓冲液（PBS）漂洗，5min×3次；滴加封闭液，20min；滴加增殖核抗原抗体，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；滴加生物素标记二抗，30min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记链霉卵白素，60min；PBS漂洗，5min×4次；联苯二胺(DAB)显色，10min，Mayer苏木素复染5s，干燥后中性树胶封片。胞核呈棕黄色为阳性细胞，每张切片随机取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞个数并取平均值。
1.7.4 肿瘤细胞凋亡的检测 采用原位末端标记（TUNEL）法。切片脱蜡至水；蛋白酶K消化10min；PBS漂洗，5min×3次；滴加反应液，37℃湿盒，60min；PBS漂洗，5min×3次；加入体积分数0.3%的过氧化氢，20min；PBS漂洗，5min×3次；滴加辣根过氧化物酶标记的链霉卵白素，30min；PBS漂洗，5min×3次；DAB染色10min，Mayer苏木素复染，干燥后中性树胶封片。以胸腺组织为阳性对照，不加末端脱氧核苷酸转移酶作为阴性对照。细胞核呈棕黄色为阳性细胞，每片随机选取5个非坏死区域高倍视野，计数阳性细胞的个数，以同一视野内阳性细胞占总细胞的百分比表示细胞凋亡指数：p凋亡/%=(n阳性细胞/n总细胞）×100%。
1.8 统计学处理 计量资料采用SPSS10.0统计软件进行单因素方差分析；等级资料采用Ridit分析。
2 结果
2.1 体外杀伤效应 铺板48h后，H22/tk100mg/L浓度孔中细胞开始死亡，表现为胞膜不完整，轮廓模糊，不透亮，形状不规则，并且碎裂成小粒状；10mg/L以下组仅见极少数细胞死亡，且增殖明显。野生型H22细胞均呈现明显的细胞增殖。72h后，H22/tk的GCV100mg/L以上浓度孔中绝大部分细胞碎裂成小粒状，孔内基本无活细胞生存；其他包括野生型H22细胞孔均呈现明显的细胞增殖。表明体外病毒感染肝癌细胞成功，病毒携带的外源性自杀基因已表达且具有生物学活性，可用于体内治疗的实验研究。
2.2 肿瘤质量及抑瘤率 表1结果表明，各治疗组肿瘤质量均较模型对照组轻，其中联合治疗组与模型对照组比较，差异有显著性意义（P＜0.05）。
2.3 病理学观察及半定量分析 各组肿瘤细胞均表现为大小不一，核大深染，形状不规则，肿瘤间质内及瘤周有不同程度的纤维结缔组织增生，肿瘤组织内均可见不同程度的大片坏死。模型对照组与六味地黄丸治疗组均见肿瘤组织内细胞密度较大，自杀基因治疗组与联合治疗组见肿瘤组织内细胞密度较低，仅自杀基因治疗组肿瘤细胞密度与模型对照组比较差异有显著性意义（P＜0.05），见表2，图1。
2.4 肿瘤细胞的增殖与凋亡 六味地黄丸治疗组和联合治疗组核分裂像明显少于肿瘤模型组和自杀基因治疗组，其中联合治疗组核分裂像最少。增殖核抗原阳性细胞着色部位位于细胞核，呈黄褐色，六味地黄丸治疗组与联合治疗组阳性细胞数均少于其他两组，以联合治疗组阳性细胞数最少。各治疗组肿瘤细胞凋亡较模型对照组明显增多，以联合治疗组最明显，见表3，图2-4。表1 各组小鼠肿瘤质量及抑瘤率比较表2 各组病理分析统计结果表3 各组肿瘤细胞增殖与凋亡检测结果
3 讨论
自杀基因是指在一定条件下，可以引起细胞自动死亡的基因。目前常用的自杀基因是通过编码病毒或细菌的酶介导敏感性，而这些酶能把药物的无活性形式转化为毒性代谢产物，从而抑制核酸合成，导致细胞死亡［16］。
HSVtk/GCV为目前研究最深入、最具有应用前景的肿瘤自杀基因治疗系统之一，已广泛应用于各种恶性肿瘤的治疗，并已进入Ⅲ期临床实验。HSVtk基因在肿瘤细胞内表达胸苷激酶，可催化核苷类似物，如丙氧鸟苷（GCV）等形成单磷酸化产物，并在细胞内磷酸激酶作用下形成三磷酸产物，干扰细胞分裂时DNA合成，从而导致细胞死亡［17］。
自杀基因治疗由于存在旁观者效应（bystander effect）的独特机制已成为恶性肿瘤基因治疗的研究热点和最具有应用前景的肿瘤基因治疗方法。所谓旁观者效应是指导入了自杀基因的肿瘤细胞加入前体药物后，不仅自身被杀死，其邻近未导入自杀基因的细胞也被杀死的现象［18］。由于存在旁观者效应，自杀基因疗法对肿瘤细胞的杀伤作用被有效地放大。旁观者效应形成机制的假说主要包括［18］：(1)"缝隙连接"机制；(2)免疫介导机制；(3)"细胞凋亡"机制；（4）介质机制；(5)抗肿瘤血管生成机制，等等。
由于免疫介导机制在体内自杀基因疗法旁观者效应中的重要作用。改善自杀基因抗肿瘤作用的炎症免疫微环境是提高自杀基因疗法疗效的重要策略。现代药理学研究结果表明，滋阴补肾代表复方六味地黄丸（汤）对机体细胞免疫和体液免疫均有明显的增强效应；能明显改善荷瘤机体的免疫状态，并具有一定的直接抗肿瘤作用。我们以六味地黄丸的免疫药理作用与肿瘤自杀基因疗法旁观者效应的免疫介导机制之内在联系为研究的切入点，以实验性肝细胞癌为治疗对象，比较研究了自杀基因疗法联合六味地黄丸治疗与单纯自杀基因治疗或单纯六味地黄丸治疗的抗肿瘤效果。研究结果显示：联合治疗组对肿瘤生长的抑制作用较单纯自杀基因治疗组或单纯六味地黄丸治疗组更为明显［14］。
在进一步的病理学研究中，虽然病理学观察表明自杀基因治疗组与联合治疗组的肿瘤组织内细胞密度较低，各治疗组纤维组织增生均较明显，但通过盲法对肿瘤的病理定量分析研究则显示肿瘤细胞密度、肿瘤坏死、间质反应各组间差异均无统计学意义。造成这种现象的原因最有可能是观察者不能很好地把握分级标准，以及病理半定量分析的不够精确，这有待于通过多次的重复实验及增加样本量或运用更为精确的分析方法（如图像分析等）来解决。 肿瘤的生长速度与肿瘤细胞的增殖与凋亡速度相关。PCNA与细胞核分裂像均为评价细胞增殖能力的重要指标。本实验结果显示：联合治疗组与六味地黄丸治疗组的PCNA阳性细胞数及核分裂像数均少于模型组、自杀基因治疗组，其中联合治疗组与模型组、自杀基因治疗组比较，差异均有显著性意义(P＜0.05)，结果说明六味地黄丸可能具有一定的抑制肿瘤增殖的作用；其他各组间的差异均无统计学意义，而自杀基因治疗组从绝对值看略高于模型对照组，其结果与文献报导自杀基因治疗后残存肿瘤细胞会加速增殖相符。同时，从本实验结果来看，各治疗组肿瘤细胞凋亡均有增多，联合治疗也显示了更明显的诱导肿瘤细胞凋亡的效果。
本研究结果提示：肿瘤细胞增殖抑制和肿瘤细胞凋亡增多都与六味地黄丸对肝癌自杀基因治疗的增效作用有关。其机理可能是在六味地黄丸的参与下，不仅发挥了直接抑制肿瘤细胞增殖和诱导肿瘤细胞凋亡的功效，而且通过对机体整体与局部的抗肿瘤免疫的调节或其他机制（如"缝隙连接"机制等），使得自杀基因治疗的旁观者效应在力度上得以增强，在时限上得以延续，从而更好地发挥了自杀基因疗法的抗肿瘤作用。
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基因治疗的基本策略范文2
【关键词】 系统观 肿瘤 综合治疗
肿瘤是机体中正常细胞在不同始动与促进因素长期作用下，所产生的增生与异常分化形成的新生物。随着疾病谱的改变，肿瘤已成为目前导致死亡的常见原因之一，随着现代科学技术的发展和突飞猛进，给科学技术方法研究带来革命性变化，肿瘤逐渐地被看成为一种全身性疾?S纱硕矗琢鲋瘟乒勰畋惴⑸嗣飨缘淖颍琢鲎酆现瘟葡低彻塾υ硕＜创酉低彻鄣慕嵌雀莶∪说幕遄纯霾±聿∑谟敕⒄骨魇?有计划地、合理地综合应用现有的各种治疗手段，以期较大幅度地提高病人的生存率，改善病人的生存质量。
1 肿瘤发生、发展的系统观
所谓系统是指若干要素按一定的结构相互联系组成具有特定的功能的有机整体，而这个整体本身又是它所从属的一个更大系统的一个组成部分。系统科学的观点，就是要求把研究对象视为系统，把事物的普遍联系和永恒运动看成一个整体过程，全面的把握和控制，综合的探索系统中要素与要素、要素与系统、系统与环境、系统与系统的相互作用和变化规律，把握住对象的内环境与外环境的关系，以便有效地认识和改造对象［1］。任何系统都是开放的系统，每一个系统的存在都有整体性、层次性及动态平衡性等基本特征。一个生物学意义上的人，也完全可以看成是一个开放系统。这一系统本身就由各个子系统（循环、呼吸、消化等系统）组成，各系统之间并非独立存在，有相互影响、相互制约的作用关系，这一大系统和外界进行不断的物质和能量的交换，借以维持自身的稳态，达到功能的最优化，即生存质量最佳化。所以有学者认为：决定疾病发生发展的，不仅仅在于器官、组织、细胞、基因等各种要素的性能，更重要的是要素和要素之间，系统和环境之间的相互联系和作用，考察疾病的本质，必须把注意和焦点放在相互联系和相互作用上［2］。上述说法就是从系统水平进行考察，而不同局限于单个细胞或基因的功能行为。那么，在肿瘤的发生学上，是否肯定“基因决定论”的观点呢？近几年的研究提出，细胞基因的缺失、突变等导致的细胞生长失控、恶变是发生肿瘤的主要机制。从分子水平看，肿瘤的病因主要有癌基因的激活和抑癌基因的失活，细胞周期调控基因的改变，前者是发病的基础，并通过后者发挥作用。但对于这么一个子系统（核酸系统）的考察，并不能完全解释肿瘤的发生。核酸系统之间，核酸与蛋白质系统之间，核酸与神经-内分泌系统之间，核酸与内、外环境之间均存在着千丝万缕的联系。癌基因的激活和抑癌基因的失活并不会无缘无故发生，研究已表明，肿瘤的发生和发展是一个多基因、多步骤、多因素的渐进过程。环境污染致癌因素的刺激，化学致癌因素如苯、氯霉素、亚硝酸胺的影响，物理致癌因素，肿瘤的病毒病因，其他如人体内分泌失调、遗传、慢性刺激和创伤均可致瘤。而且单因基因突变而产生的肿瘤细胞也未必能发展成肿瘤，在人体这样一个复杂的系统中，神经-内分泌-免疫等内环境随时进行警惕的监视，只有整个大系统紊乱，监视功能障碍，肿瘤细胞才能逃脱系统监视，才能进一步发展。而真正发展到器官的癌变，往往要经历数年甚至几十年的时间，因为一旦系统的功能恢复正常，肿瘤细胞可被机体清除，只有在内外环境的反复作用下，机体各系统功能的紊乱无法再协调一致，才使得肿瘤得以发展甚至转移。综上所述，肿瘤的发生和发展并非“基因决定论”可以完全解决，相反的，只有从系统的整体的水平去考察外界环境和机体的作用，机体自身各个子系统的相互作用，每个子系统内部各要素的相互关系，才能很好地认识其病因和发病机制。
2 系统方法论原则对肿瘤治疗的思路指导
进入20世纪之后，医学渐渐进入理性阶段。随着对肿瘤本质认识的不断深入，更由于肿瘤局部治疗方法的停滞不前，局部治疗后预后不佳，使更多的学者意识到局部治疗的弊端。20世纪80年代，恶性肿瘤的治疗方式有手术、放疗、化疗、生物治疗，其中以根治性手术为主，对失去手术机会的中晚期恶性肿瘤只通过单一的放疗或化疗来延长生存期，有效率低，易于复发，治疗手段单一。80年代后期，由于化疗药物的不断推陈出新，肿瘤学理论的不断完善，化疗的地位日益被重视，发展了诱导化疗、术后化疗、放化疗、热化疗等各种综合治疗模式，手术方式也由根治性手术向保守性手术、保留器官功能方向发展，因此，21世纪的肿瘤治疗更注重强调根据病人的身体状况、肿瘤的病理类型、侵犯范围（病期）和发展趋向，有计划合理地应用现有的治疗手段，以期较大幅度的提高治愈率，改善病人的生活质量，肿瘤治疗观念由此发生了根本性的转变，肿瘤综合治疗应运而生［3］。所谓肿瘤综合治疗是指：根据病人的机体状况，肿瘤的病理类型，侵犯范围（病期）和发展趋势，有计划地、合理地应用现有的治疗手段，制定个体化治疗方案，以期大幅度地提高治愈率，改善病人的生存质量［4］。可以说，肿瘤治疗学研究显示出多学科的合作与补充，肿瘤的治疗也已进入综合治疗的时代。按照系统论整体性原理来讲即系统论中各组分相加的和大于各组分的代数和。恶性肿瘤综合治疗个体化的决策，将手术、化疗、放疗、中医中药治疗及生物基因治疗，依照不同病例特点，进行有机组合，以期达到最佳的治疗效果［5］。但它不是将各种治疗手段的简单叠加或随意轮番应用，孰先孰后，孰轻孰重，均要因人而异，要经过多学科的充分讨论协商后决定。在决策过程中，既要注意尽量避免盲目一味强调某一学科在肿瘤治疗中的重要性和单一治疗方法在肿瘤治疗中的过分扩大应用，又要注意各个学科之间的密切合作，相互配合，互补应用，共同来承担对患者的综合治疗。这就要求无论是哪一个学科的医生，都要做到不仅能够了解自己本学科治疗手段的特点和不足，还要了解其他相关学科治疗手段的特点和不足，真正做到心中有数。要能够善于应用其他相关学科的成果和特长来对自己本学科的治疗加以充实、完善和提高。特别是在科学技术迅猛发展和技术更新速度不断加快的今天，及时了解并掌握专业技术的发展动态和引进先进技术并加以应用与创新，以跟上时代和科技发展的步伐。当前，越来越多的肿瘤病人首诊时都选择到肿瘤内科，主要是因为肿瘤内科的医生能够善于接受和利用新的医学研究成果，以病人利益为重，改变过去谁先接诊谁收治的不规范医疗行为，在对肿瘤病人的诊断以及设计和规划总体治疗策略上起到了主导作用，不仅能够使肿瘤病人真正享受到现代肿瘤综合治疗模式与治疗方案个体化所带来的益处，而且也充分体现了社会的文明进步与人文关怀［6～13］。 我们在临床工作中必须要按照医学伦理学“ 医乃仁术”和“ 循证医学”，谨慎、准确和明智地应用当前所能获得的最好的研究证据，结合个人的专业技能和多年的临床经验，考虑病人的经济承受能力和意愿，并将此结合最优化的原则来作出具体的治疗决策。例如目前放化疗综合治疗的临床应用多集中于头颈部癌、食管癌、乳腺癌以及肺癌中，通过放化疗综合治疗所获得的较高的局控率和较晚发生远处转移，为我们提供了一条中晚期恶性肿瘤治疗的新途径。静脉化疗起到了全身治疗的目的－在于彻底清除微小转移灶，放疗作为一种局部治疗，二者联合应用的优点不言而喻，中晚期恶性肿瘤传统的单一治疗模式已远远不能适应目前临床要求，放化疗综合治疗不仅提高生存率，对延缓发生远处转移也显示出了不可比拟的优越性，尤其是同期放化疗的应用将中晚期恶性肿瘤的治疗带上一个新的台阶［14］。
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随着分子生物学技术的发展，作为生物医学前沿的人类基因组计划研究步入实质性阶段，基因治疗肿瘤成为热门。基因治疗能否给人类带来巨大的革命，已成为现代医学大家的研究方向。所谓基因治疗是指把目的基因导入靶细胞和宿主体内，通过基因组合，成为宿主遗传物质的一部分，纠正错误的基因表达和基因表达的错误，以达到治疗的目的［15］。通常包括四方面的内容：基因修正-纠正缺陷基因的突变碱基序列；基因置换-由正常基因换掉疾病基因；基因修饰-将目的基因导入病变细胞的基因，其表达产物用以修饰缺陷基因导致的细胞功能异常，或使正常功能得以加强；基因失活-应用反义技术封闭不该表达的基因，以抑制有害基因，或直接抑制有害基因的表达。虽然就基因治疗的概念来说，体现的是分子水平的基本理论和原则，但其治疗的目的是为了抑制肿瘤的生长或达到逆转、杀死肿瘤细胞，所以在治疗过程中仍需考虑所作用的个体系统，如外界的环境因素，机体的内环境和免疫功能的影响等。因为将基因导入细胞，使正常基因得以表达，或使病变基因不表达，或诱导已有的肿瘤细胞分化、凋亡，都不是单单一个分子水平可以解决的。例如将反义基因导入细胞，以封闭有害基因的表达，在体外实验中，所要观察的指标限于细胞水平，如基因转染的百分率，对肿瘤细胞生长和抑制率等。但一旦进入体内实验阶段，就不能不考虑机体的整体性，如反义核苷酸对肿瘤细胞有抑制作用，那么对正常细胞或组织器官是否有毒性作用呢？在体内，在各种调节机制的作用下或各种核酸酶等水解酶的作用下，反义核苷酸是否能成功地进入细胞封闭有害基因呢？再如用逆转录病毒载体介导的基因转移有效性高并容易获得稳定表达，但这一插入突变是否会引起潜在的癌基因激活，从而又引发新的肿瘤呢？显然，在肿瘤的基因治疗的研究中，在体外细胞水平中有良好的效应，但进入机体系统中，其效果不一定良好，而且历史上也有基因治疗失败的例子。这正是因为人体是一个复杂的系统，各个子系统之间有复杂的相互关系，而肿瘤的发生和发展也并非由基因单独决定，如果单从基因这一方面去考虑，而忽略了治疗所处的整体环境，忽略了治疗应采取的整体措施，往往会导致实验的失败。任何对肿瘤疾病的治疗方法需经过人体内试验，要从系统和整体的水平观察治疗有效性和可能存在的副作用，肿瘤基因治疗也需遵循系统观点，用整体性、动态性、联系性的原理，达到最佳的预期效果。但在实际工作中，尚有许多疑难问题，对于这些问题解决离不开系统科学观的支持，我们不能忽视机体的整体性，不能用局限、部分、分子细胞水平来以偏概全，只有用系统的环境中解决这些难题，才会有实用价值和临床价值。所以从肿瘤的综合治疗可以看出，综合手术、化疗、放疗及生物基因治疗、中医中药治疗、内分泌治疗等手段，依据具体情况具体分析的原则，针对具体的病例，制订相应的个性化的治疗方案，最终达到最佳综合疗效，在某些领域已显示了令人鼓舞的前景。随着人类基因组计划的完成，人类表观基因组协会（humnan epigenome consortium， HEC）在2003年10月正式宣布开始实施人类表观基因组计划（human epigenome proiect， HEP） ，通过大规模检测人类基因组，基因组学研究进入一个新的阶段，也为解开生命奥秘及征服肿瘤等疾病带来了希望［16］。人类攻克癌症近在咫尺，但仍有很长的路要走，尚有不少难题有待在今后实践中予研究解决。让我们记住著名的系统科学家拉兹洛教授的话：“今天我们正目睹一场思维方式的转化：转向严谨精细而又整体的理论。这就是说：要构成拥有它们自己的性质和关系集成的集合体，按照同整体联系在一起的事实和事件来思考。”［17］。
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基因治疗的基本策略范文3
[关键词]RNAi；dsRNA；siRNA
[中图分类号]R394[文献标识码]A[文章编号]1673-7210（2007）10（b）-007-03
RNAi（RNA interfering，也称RNA干扰）是利用小双链RNA特异阻断特定基因的表达，并促使靶mRNA降解，从而使细胞表现出某种特定基因缺失表型的现象。由于RNAi对基因表达的阻断具有高效、特异性，已迅速发展成为代替基因敲除的遗传工具。
1 RNAi的分子作用机制
经过众多学者的研究，现已基本阐明了RNAi的作用机制。在不同生物中RNAi的作用机制各有不同,主要分为两种：大于30 nt（核苷酸，nucleotide,nt）的长双链RNA的非特异效应和21～23 nt的短双链RNA的特异效应[1]。RNAi的特异效应作用机制是在转录水平、转录后水平、翻译水平等多个不同的水平上实现的。其中以siRNA转录后水平的RNAi研究最为深入，应用最为广泛，下文将做主要介绍(图1)。
1.1 转录后水平的RNAi机制
转录后水平的RNAi机制是在对线虫、果蝇等生物体进行研究而进一步推导得出来的。不同研究领域的学者相继提出了多种RNAi机制的模型，这些模型大致都将RNAi分为两个阶段：起始阶段和效应阶段。
起始阶段包括：①dsRNA的导入：包括由外源导入或由转基因、转座子、病毒感染等各种方式引入的dsRNA;②dsRNA在细胞内被一种命名为Dicer的酶切割成21~23 nt长的小分子干扰RN断（short interfering RNA, siRNA）。
效应阶段包括：①在siRNA反义链指导下，双链siRNA与一个不同于DICER的RNA酶结合形成沉默复合物RISC。②siRNA双链解旋，正义链被释放出来，RISC被激活。③活化的RISC通过碱基配对识别互补的靶mRNA，siRNA反义链与mRNA复合体中换位，并在距siRNA的3'末端12 nt处切割靶mRNA，从而实现了对mRNA的降解。降解位点多为尿嘧啶。
某些学者认为RNAi过程中还具有自身循环放大机制，并将其归为模型的第三阶段――循环放大阶段，其机制大致如下：
在效应阶段，活化的RISC结合mRNA后，内切核酸酶将mRNA切割成12~23 nt的片段，特异性地抑制了靶基因的表达。同时，释放出来的siRNA可以作为一种特殊引导物，在RNA依赖的RNA聚合物（RdRP）作用下，以靶mRNA为模板合成新的dsRNA，后者又被降解为新的siRNA，进入上述循环，呈放大效应。此过程又称为随机降解性多聚酶链式反应（PCR）[2]。
1.2翻译水平的RNAi机制[1]
翻译水平上的RNAi是抑制相应mRNA的翻译，使相应的蛋白质表达受阻，其中起重要作用的是stRNA (small temporal RNA)，它是由长度约70 nt的RNA形成的茎环样前体，经Dicer酶作用后形成长约21～23 nt的dsRNA， 通过RISC结合在相应mRNA的3'末端非翻译区上,进而阻断mRNA的翻译。
1.3转录水平上的RNAi机制[1]
该机制是通过siRNA与互补的DNA直接发生作用，激发同源DNA甲基化的加强，使目的基因转录受限，表达关闭，进而加强了基因沉默。有报道dsRNA可诱导组蛋白H3及相应DNA区域甲基化。如果甲基化出现在启动子区域,则转录就不能进行,如甲基化出现在编码区,则转录进行,但在转录后水平上沉默。
1.4 非特异效应
许多研究表明，当向哺乳动物转染大于30 nt的长双链RNA（dsRNA）时，由于dsRNA激活双链RNA依赖的蛋白激酶（dsRNA dependent protein kinase, PKR）途径[3]，使EIF-2α因子磷酸化，进而非特异性地抑制翻译，从而使细胞内发生全面的细胞沉默。
1.5 RNAi过程所涉及的主要因子
siRNA：是RNAi作用赖以发生的重要中间效应分子。它是长约21~23 nt的双链RNA小分子，与靶mRNA序列具有同源性。此外，siRNA每条单链 的3'末端均有2~3个非配对的碱基[4]。
Dicer酶：Dicer酶（在果蝇中发现）是一种RNaseⅢ家族中的一种识别dsRNA的酶，据报道其结构含有1个PAZ结构域，1个氨基螺旋酶结构域，2个RNaseⅢ模体及2个dsRNA结构域。在dsRNA导入后，Dicer酶以ATP依赖的、持续方式连续切割dsRNA。在对dsRNA进行切割时，Dicer以二聚体形式参与，每个二聚体包括4个活性中心，在降解RNA时其中的2个要失活,从而使降解过程每隔一定间隔进行,这个间隔正好为22个核苷酸,即每隔22个核苷酸Dicer酶将dsRNA降解一次。而Dicer酶结构上的微小改变将会引起间隔的改变,所以不同的物种产生的siRNA长度也略有不同[1]。
RdRP：许多实验证明，RdRP是RNAi所必需的。RdRP目前仅知其主要是在单链siRNA指导下扩增RNA而加速RNA的过程。由于RdRP的存在，使RNAi能在低浓度下高效快速地进行。
ATP[5]：ATP在siRNA介导中起重要作用，dsRNA被降解为siRNA的过程需要ATP；siRNA解旋，反义链与RISC前体结合形成RISC的过程也依赖ATP。研究还发现，RNAi过程中外源性ATP不能起促进作用。
2 RNAi的特征
高稳定性：以3'末端突出的TT碱基的dsRNA尤为稳定，无需象反义核酸那样进行进行广泛的化学修饰以提高半衰期[6]。
高效率：在低于反义核酸几个数量级的浓度下，就能使目标基因的表达降到极低水平甚至完全抑制，从而产生缺失突变体表型[7]。
高特异性：siRNA除正义链3'末端突出的2个碱基在序列识别中不起主要作用外，其他单个碱基的改变均可能使RNAi效应大大减弱。而针对同源基因共有序列的RNAi则导致同源基因共同失活[5]。
高传递性：RNAi抑制基因表达的效应可以穿过细胞界限，在不同细胞间长距离传递和维持，在某些生物中RNAi还可以传递到后代中去。
3 RNAi应用过程需要解决的几个问题
避免非特异性效应：前述已阐明，在哺乳动物中，当大于30 nt的dsRNA被导入时，可激活PKR途径而导致非特异性抑制。这就要求在设计dsRNA时必须考虑该dsRNA导入时能否避免非特异性效应的出现。多数实验表明，以21~23 nt为最佳选择。
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干涉dsRN段的获取和导入：在实际应用中，siRNA的长度、结构、组成及其触发的效果基因、种属、序列、细胞类型、甚至实验体系的不同而有变异。目前，siRNA的获取大多数仍旧是生化合成，其设计仍处于试验阶段，能否成功地设计出合理实用的siRNA对其能否广泛应用起决定性作用。对RNAi效应的调控：目前对RNAi的研究还限于以双链干涉片段抑制特定基因的表达，对其调控的干涉较少。但大量的研究表明，dsRN段的大小、潜在靶位、活性片段浓度等都是RNAi有效性发挥的影响因素。Yang等还证实RNAi现象可被过剩的不相关的dsRNA竞争性抑制，深入的研究表明，甚至过剩的正义链与反义链也可竞争性抑制RNAi效应。
4 RNAi的应用及前景
4.1遗传学研究的应用
4.1.1 稳定转座子RNAi缺陷可引起内源性转座子的移动。转座子的重要特征之一是具有反向重复序列，生物体通过此序列可以产生dsRNA发夹，启动PTGS效应，所以抑制转座子的移动有利于遗传稳定，防止遗传损害。因此人们认为RNAi的一个自然功能就是转座子沉默[8]。
4.1.2 基因功能分析人类基因组计划中的基因测序已经完成，人类将进入后基因组时代。其主要任务是确定基因的功能，因此迫切需要建立有效、经济的分析基因的技术。
尽管目前对RNAi机制并未完全弄清，但其高效、特异阻断基因的表达已在某些研究中开展。RNAi克服了传统基因功能分析技术要求高，过程繁等缺点，已吸引了越来越多学者的重视。可以预见，RNAi将成为新一代基因组功能研究的有力工具。
4.2 临床应用
4.2.1 抗病毒David等认为在动物中RNAi代表一种古老的抗病毒反应，与植物的PTGS（转录后的基因沉默）一样可抵抗病毒的感染，目前这一观点已被普遍认可。
目前，利用体外培养人类细胞研究抗病毒感染，主要限于单链 RNA病毒，包括人类免疫缺陷病毒、流感病毒、丙型肝炎病毒和脊髓灰质炎病毒等。Novina[9]等用针对CD4的siRNA转染Magi-CCR5细胞，产生了对CD4受体表达特异性抑制达75%，Northern杂交发现CD4分子的mRNA明显降低了8倍，从而阻断了HIV-1病毒细胞。Kapadie等[10]用针对HCV的siRNA与表达HCV的质粒共转染人的肝癌细胞株Huh-7细胞，2 d后，Northern杂交检测显示：HCV的RNA含量下降，证明了HCV特异的siRNA抑制了病毒的复制[9]。
RNAi在针对其他病毒，如呼吸道合胞病毒、SARS病毒、脊髓灰质炎病毒，猪瘟病毒等均显示出抑制病毒复制的作用。最近有文献报道RNAi在研制抗SARS药物中显示出特殊的作用。
从当前的这些研究结果可以看出，siRNA通过序列特异性干扰作用，能封闭病毒基因在体内的复制，RNAi成为控制病毒在细胞内复制的重要工具，为病毒治疗提供了新的思路。
4.2.2 抗肿瘤利用RNAi的高效率和高度特异性，我们可以设计特异siRNA分子，沉默目标基因，而正常基因不受影响。这是用RNAi抗肿瘤的基本思路。从现阶段研究的进展看来，RNAi有望成为新一代研究抗肿瘤的重要工具，发挥重要作用。
肿瘤是多因素、多基因的疾病，单个癌基因的抑制难以达到治疗效果，用基因敲除等方法进行治疗研究就造成了时间和经费的浪费。RNAi技术可同时抑制多个基因，且抑制效果互不干扰，并且RNAi识别可以精确到单个核苷酸，对由野生型突变形成的癌基因，如ras、p53等，能产生准确有效的封闭效果，而野生型不受影响[11]。Wilda等针对bcr/abl基因融合位点设计了一段21 nt长的dsRNA分子，特异性沉默了该融合基因，并使表达该融合基因的细胞凋亡，而对不表达该基因的肿瘤无任何作用。最近，Linsl等把针对bcl2基因的mRNA-cDNA杂交体转染到人前列腺癌lncap细胞中，产生了长时期的阻抑bcl2表达效应，这一效应与体外培养的前列腺癌细胞中的RNAi非常相似。
5 结语
RNAi的发现改变了人们对细胞基因调控的传统思路，提供了特异性阻断基因表达的新工具和评价基因功能的新策略，为人类基因功能研究和疾病基因治疗开辟了一条革命性的新领域。尽管其机制仍未完全弄清，但RNAi技术在病毒、肿瘤等尚未根治的疾病提供了新的治疗方案，并带来根治的希望。目前RNAi在各方面的研究已经日新月异，可以相信，不久的将来，将会出现基于RNAi的基因治疗药物，RNAi技术也将成为未来生命研究的重要工具。
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(收稿日期:2007-08-23)
基因治疗的基本策略范文4
[关键词] 地中海贫血；孕期；预防与治疗
[中图分类号] R556.6[文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2009）01（b）-030－03
The study of mediterranean anemia for screening methods and prevetion and treatment during pregnance
WANG Zhi-hui
(The MCH Hospital of Haizhu District, Guangzhou City, Guangdong Province， Guangzhou510000, China)
[Abstract] Objective: To evaluate the value of the screening methods and the preventions and treatment of mediterranean anemia in pregnant women. Methods: Choosing 700 out-patients from 2005 to 2007 who participated in examination before delivery. Then divided them into three groups refering to the level of Hb. After being given vitamins and folic acid and regulated the food patients take. Checked the biochemiacal exams after 3 weeks. Results: The MCV and MCH in mediterranean anemia group(MA) were significant lower than controlled group and non-MA group (P
[Key words] Mediterranean anemia; Pregnant period; Prevention and treatment
地中海贫血(mediterranean anemia)是一组遗传性溶血性贫血，其共同特点是由于珠蛋白基因的缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，导致血红蛋白的组成成分改变[1]。地中海贫血不仅是一种发病率较高的血液系统疾病，而且全球约18亿人为无明显症状的携带者，每年出生100万缺陷患儿，在我国，地中海贫血的高发区位于南方各省份。地中海贫血与妊高征、流产、畸胎及死胎的发生有相关关系，严重影响了优生优育，因此早期预防，及时进行临床干预是非常有必要的[2]。本研究提选择2005年1月～2007年1月在我院妇产科门诊进行常规定期产前检查，首次产前筛查，确诊为地中海贫血的患者病历共700例，进行为期2周的临床干预，现报道如下：
1资料与方法
1.1一般资料
选取2005年1月～2007年1月在我院妇产科门诊进行常规定期产前检查、孕28周前在本院常规产检并住院分娩病例共700例。依据首次产前检查时血常规及血红蛋白结果分为3组：Hb>100 g/L及血红蛋白电泳正常者185例作为对照组；Hb
其中，地贫组240例均嘱男方查血细胞分析及血红蛋白电泳，如双方为同型地贫，则需基因诊断，孕妇α地贫组164例，其中，男方同型4例地贫，2例同为（4，2）型缺失杂合子，（－－/aa），2例同为1基因缺失杂合子，即标准型α地贫。均孕24、28周彩超排除巴氏水肿胎。孕妇β地贫组76例，β及α地贫组2例，男方均无同型地贫，可以排除胎儿重度地贫，不需进一步检查胎儿脐带血。
1.2检测方法
1.2.1血细胞分析用SystemKX-21自动血细胞分析仪(日本产)检测血常规，包括红细胞计数(RBC)、血红蛋白浓度(Hb)、红细胞平均容积(MCV)、红细胞平均血红蛋白量(MCH)、红细胞平均血红蛋白浓度(MCHC)等15项。
1.2.2血红蛋白电泳美国Helena公司的SPLFECOMBO血红蛋白电泳仪，做HbA2定量测定，异常Hb测定、HbF定量测定及不稳定Hb检查。血红蛋白电泳筛查指标：HbA2正常范围为2.5%～3.5%，HbF正常范围为0.5%～2%。
1.2.3基因诊断对筛查阳性的α地贫和β地贫携带者采用地贫诊断基因芯片(Thala Chip)进行地中海贫血的检测，由深圳亚能生物技术公司提供基芯片及技术支持。Thala Chip有24个探针，可同时检测－－SEA、－α3.7、－α4.2 3种常见缺失型α珠蛋白基因和21种β珠蛋白基因的突变。用常规方法提取患者DNA，通过PCR技术和PCR结合反向点杂交（RDB）技术扩增α珠蛋白基因或β珠蛋白基因含突变点DN段，琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物。根据DNA标记反应和双链杂交反应的特异性，针对野生型及不同突变型设计特异性杂交探针，然后用特异性荧光染料标记PCR产物。将标记产物和杂交液混合，与玻片上的探针进行杂交，洗涤后用荧光扫描仪扫描玻片，根据杂交结果显示探针的位置及荧光类型判断野生型或不同的突变位点。本研究采用基因诊断确诊为轻型地中海贫血者为地贫组。
1.3临床处理
地贫组孕28周及孕32周予补充叶酸、维生素E、复合维生素B，各2周，并指导孕妇均衡饮食。孕足月入院待产时复查血常规RBC、Hb、MCV、MCH。
1.4统计学分析
将收集到的数据输入计算机建立EXCEL数据库，用SPSS 13.0统计软件进行数据整理和分析。统计方法采用秩和检验和χ2检验。P
2结果
依据首次产前检查时血常规及血红蛋白结果分为3组，孕妇的血细胞分析结果见表1。
表1 各组孕妇的血细胞分析结果比较
表中除对照组和非地贫组的MCH外，各参数在各组间差异均有显著性差异(P
在给予孕28周及孕32周的地贫组予补充叶酸、维生素E、复合维生素B，各2周，并指导孕妇均衡饮食，两周之后再次复查血常规RBC、Hb、MCV、MCH结果见表2。
表2 地贫组予补充叶酸、维生素E、复合维生素B后
与先前的血常规比较
由表2可见，在给予叶酸、维生素E、复合维生素B后，28周及孕32周的地贫组孕在血常规RBC、Hb、MCV、MCH与初检时有统计学差异(P
3讨论
3.1地中海贫血的概况
地中海贫血(mediterranean anemia)也称海洋性贫血（Thalassemia）、珠蛋白合成障碍性贫血、库勒（Cooley）贫血。1925年Thomas Cooley和Pear Lee首次描述这种发生在意大利儿童的遗传性、溶血性贫血病，按受累基因、血红蛋白链位置分为α、β、γ和δ等4种类型，其中以β和α地中海贫血较为常见，广泛发生于热带和亚热带国家，我国以长江以南发病率高，无明显症状的携带者超过人群的20%[3]。
地中海贫血是一组常染色体不完全显性遗传性慢性溶血性疾病，是因珠蛋白基因缺陷使血红蛋白中的珠蛋白肽链有一种或几种合成减少或不能合成，引起血红蛋白的组成成份发生改变而导致的溶血性疾病。
重型地贫胎儿基本不能妊娠至足月，大多在妊娠28～34周胎死宫内、死产或出生后不久夭折，不能长大成人，故临床上成年地贫患者均为轻型，轻型地中海贫血常无临床症状，其外周血中RBC和Hb也可以是正常的[4]。目前，临床上筛查轻型地中海贫血的方法主要有血红蛋白电泳、红细胞脆性检测等。近些年来文献报道轻型地贫患者外周血中RBC、MCV、MCH等血细胞参数发生明显变化，而且有诊断意义[5]。随着临床检验技术的提高，基因诊断的出现很大程度提高了地贫诊断的准确性。
3.2地中海贫血的预防
自20世纪70年代后期以来，在欧洲、中东和地中海的一些地区开展了高危人群地贫的前瞻性筛查，对象主要为育龄妇女及其配偶。Cao等[6]在地中海地区进行了近20年的地贫遗传预防计划，已经取得显著的效果。Hsia等[7]在夏威夷实施了控制地贫计划，包括对高危人群进行筛查、教育公众重视地贫的预防方法、采用最优的筛查策略等。在我国南方，地贫是发病率高、影响较大的疾病之一。如广东的地贫检出率为1.08%～1.16%，广西和海南更高。地贫的预防最关键要从婚检着手。
3.3地中海贫血的治疗
目前地中海贫血还没有很高效的治疗方法，在临床上常用的方法可以分为两大类：药物治疗和基因矫正。药物治疗包括早期的5-氮胞苷、羟基脲和丁酸盐类药物。基因矫正包括补偿策略的珠蛋白基因治疗以及造血干细胞移植治疗。
本研究在临床确诊的基础上，结合患者的初诊的血常规和血红蛋白分析，在孕期通过补充叶酸、维生素E、复合维生素B，各2周。叶酸、维生素E、复合维生素B是骨髓造血与修复所必需的物质，同时指导孕妇均衡饮食，摄入机体必需的微量元素与营养。通过以上的临床干预临床症状得到改善，并且也为优生优育奠定了基础。
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基因治疗的基本策略范文5
[关键词] 冠状动脉；支架；再狭窄；研究进展
[中图分类号] R541.4 [文献标识码] A [文章编号] 1674-4721（2013）08（b）-0029-03
冠状动脉支架置入术自20世纪80年代应用于临床以来，得到了迅猛的发展，并已经成为心肌血运重建的主要手段，但支架置入术后仍有10%～50%[1]的患者发生支架内再狭窄（in-stent restenosis，ISR），以术后3～6个月为高峰期，6个月后的发生率明显降低，这严重影响了支架置入术的疗效和患者的长期预后。因此，解决支架内再狭窄是当今冠心病介入治疗领域的难点与重点之一[2]。
ISR是指支架置入术后6～9个月冠状动脉造影发现其管腔净丢失率≥50%。Mehran等[3]利用血管内超声显像技术（intravascular ultrasound，IVUS），将ISR分为4型，Ⅰ型：局限病变型，位于支架内或支架边缘，病变长度10 mm，但不超过支架的边缘；Ⅲ型：增生型，病变长度>10 mm并超过支架的边缘；Ⅳ型：完全闭塞型，造影剂不能通过。
1 ISR的病理学
支架置入所致的急性血管损伤程度决定新生内膜增生的程度。研究表明[4]，由于支架置入使病变血管扩张而引起血管内皮的损伤，血管弹性层的破坏进而延伸到动脉外膜，血管的损伤导致血管平滑肌细胞（vascular smooth muscle cells，VSMC）向损伤部位迁移增殖以及血栓的形成，从而引起ISR。而IVUS研究表明，ISR则完全是新生内膜的结果[5-7]，而新生内膜主要是由增殖的VSMC和细胞外基质组成[8]。血管壁重构在时间上分两个阶段，其作用也是双向性的：早期是适应性重构，大约距支架置入1～2个月，此时内膜组织增生并不压迫支架改变其内径且能在一定程度上减轻支架置入后管腔横截面积的丢失；晚期主要发生在支架置入6个月以后，血管壁重构的程度与血管损伤轻重相关，会加重血管壁的硬化并引起ISR。
ISR的形成可分为以下几个过程[9]：①支架置入后，血小板在支架表面的聚集和激活导致血栓的形成；②接下来的几天到数周，大量白细胞聚集在血管损伤部位并分泌细胞因子对治愈的组织产生影响；③炎症反应阶段，可能持续几个月，在这个过程中血管壁将重新组织，VSMC发生增殖反应，导致新生内膜大量增生从而引起ISR。
2 ISR的机制
ISR的发生机制尚未完全阐明，一般认为由多因素参与。目前多数学者认为，ISR是一个损伤反应后新生内膜增殖与血管重构的过程，其中血管内皮细胞的损伤及炎症反应是ISR的启动因素，VSMC的过度增殖与迁移，血管新生内膜的过度增生是其形成的中心环节[10]，并且血栓形成也起一定的作用。
2.1 血小板激活血栓形成
无论是球囊预扩张还是支架置入，都可能造成动脉粥样硬化斑块与正常组织连接部位的破裂，并可深达中层，使内皮组织暴露并造成抗凝因子的释放，如一氧化氮、前列腺素等，激活血小板并形成血栓，5～7 d附壁血栓达到高峰。研究表明，支架置入后最有可能刺激血栓形成的是组织因子的暴露[11]，血小板活化后可释放诸如血小板源性生长因子（platelet-derived growth factor，PDGF）等，刺激中层VSMC的迁移和增殖，导致一系列血管损伤后的修复反应，引起血管狭窄。
2.2 炎症反应
Kornowski等[4]观察到血管损伤程度和炎症反应程度明显相关，炎症反应程度又与新生内膜增生程度明显相关。球囊扩张和支架置入损伤血管内膜，并且支架作为异物必定会引起机体的免疫应答，特别是支架损伤血管中膜层后[12]，循环中的炎性细胞如T淋巴细胞、单核巨噬细胞，迁移并黏附于损伤部位，引起冠状动脉炎症。而且支架置入后持久牵拉血管，可导致血管中层持久的慢性炎症反应，刺激内膜增生[13]。实际上炎症细胞尤其是巨噬细胞在ISR的各个阶段都能观察到。炎症可能是ISR发生的重要机制[14]。
2.3 血管内膜增生与血管重构
目前公认的ISR主要原因是置入支架局部的内膜过度增生[15]，一直认为内膜剥脱、中膜损伤后平滑肌细胞过度增殖、迁移，是ISR病理改变的主要环节，故平滑肌细胞是增生内膜的主要成分。对支架而言，内膜增生分布于其全长，程度基本均等，仅在支架中心部位稍明显，但未达到统计学差异。支架置入后的内膜增生并不只限于支架内表面，在支架外表面和血管壁支架也可有内膜组织的增生，并且可以影响支架置入部位血管壁重构的过程。ISR形成的晚期主要是由血管壁中层大量纤维组织增生引起的血管重构。血管重构包括负性重构和正性重构，ISR是由负性重构引起的。
3 ISR的影响因素
3.1 年龄
年龄每增加10岁，发生ISR的相对危险度增加1.14，而据Kasaoko等[16]报道年龄每增加10岁，受损血管处发生狭窄的相对危险性增加14%～19%。
3.2生活方式
吸烟是冠状动脉粥样硬化的危险因子，参与并加速了动脉粥样硬化的发生及发展。Sahara等[17]的研究发现，吸烟者发生局灶性冠状动脉ISR和弥漫性ISR的比率高达76%～85%，但新的研究却显示，吸烟与ISR关系不大[18]。Niroomand等[19]研究表明，每周饮酒≥50 g的患者较每周饮酒
3.3代谢因素
胰岛素依赖型糖尿病是支架置入术后ISR发生的独立危险因素[16，20]，这可能是由于胰岛素抵抗致内皮功能不全并导致平滑肌细胞增殖，造成冠状动脉内膜增生，导致ISR的发生。有报道称，高尿酸血症亦与ISR有关[21]
3.4冠状动脉病变相关因素
国内陈韵岱等[22]认为，左前降支、开口病变是预测ISR的危险因素。冠状动脉ISR发生率与原血管病变长度、大小呈正相关[18，23]，可以将10 mm病变长度作为ISR的一个高危界限。同时在小血管（血管直径
3.5置入支架相关因素
一次置入多个支架是ISR的显著危险因素[24]，30 mm的长病变[22]，以及因ISR而在此再次置入支架者，其ISR发生率很高。
3.6 与介入操作相关的因素
①术者对支架及支架长度的选择；②经球囊高压扩张，但置入支架的对称性不好；③冠状动脉旁路移植手术后在移植桥血管内置入支架；④置入支架时无IVUS指导；⑤两次介入的操作时间间隔≤90 d。
4 ISR的防治对策
对于ISR，除了改变不良生活习惯、加强口服药物治疗，临床上也出现了一些新的技术用于ISR的预防和治疗，诸如切割球囊、定向冠状动脉斑块旋切术、基因治疗及放射治疗等。
4.1尽可能减少ISR的危险因素
冠状动脉病变患者的临床特点及病变的临床特征是无法改变的，临床医生应尽量严格掌握手术适应证并根据病变选择合适的支架，术中尽量减少血管内膜的损伤。
4.2 口服药物治疗
血管紧张素受体拮抗剂具有保护内皮功能，抑制平滑肌细胞增生和向内膜迁移，阻止新生内膜增生，从而延缓和抑制ISR的血管壁增厚，改善损伤反应的形成。他汀类药物除降脂作用外，还有抗炎、抗增殖、抗氧化应激、抑制新生血管形成等多重作用，保护受损血管内皮细胞，干预ISR的多个环节，是可以用于降低ISR的发生率[25]。另有小规模的动物实验和临床研究证实口服雷帕霉素可以降低冠状动脉金属裸支架置入后的再狭窄率[26]，但尚未得到大规模临床实验的证实。
4.3 药物涂层支架
药物涂层支架（drug eluting stent，DES）是将抗血栓和抗增殖药物包被于冠状动脉支架上，置入冠状动脉后药物在局部以“洗脱”方式缓慢释放，既增加局部药物浓度，又减少全身不良反应，从而降低再狭窄率[27]。①抗血栓药物以肝素膜为代表，主要作用是降低血栓的发生，据报道可使支架置入后ISR降到12%～22%[28]；②抗增殖药物以雷帕霉素和紫杉醇为代表，雷帕霉素抑制细胞从G1期向S期过渡，而紫杉醇可使细胞发育受阻于M期，均可以一直VSMC的增殖，减少再狭窄的发生。大规模临床实验证实此两种药物涂层支架均可明显降低支架置入后ISR。
4.4 内皮细胞种植
内皮细胞种植能在较短的时间内使受损的血管壁重新内皮化，迅速恢复内皮细胞的完整性及其生物学功能，维护了血管局部的正常生理环境，能够减少急性、亚急性血栓形成和再狭窄的发生。
4.5 基因治疗
基因治疗被认为是防止ISR较理想的方法，主要是把带有细胞毒性基因、细胞稳定基因、抗迁移基因的支架置入病变处，可抑制VSMC增殖和迁移并促进内皮细胞增生及血栓溶解。用于防止ISR的基因主要分为5类[28]：①抗血栓形成的基因；②血管活性物质的基因；③生长因子的基因；④癌基因与抑癌基因；⑤细胞周期调节基因。
4.6 切割球囊
切割球囊被证明能有效防治ISR，临床应用有效而安全。Chen等[29]根据IVUS检查发现切割球囊主要机制是显著减少斑块面积但对血管面积无明显增加，这提示它对血管的损伤小，是其降低ISR的主要机制。
4.7 冠状动脉内放射治疗
冠状动脉内放射治疗（intracoronary radiation therapy，ICRT）由导管介导，将β射线源或γ射线输送到靶血管，借助电离辐射的作用来干预血管成形术后的病理生理反应，降低ISR。主要作用机制是抑制VSMC的迁移，诱导平滑肌细胞出现G1期阻滞，进而抑制其增殖，从而减少内膜增生。
4.8 斑块消融治疗
斑块消融技术可以清除支架置入术后的残余斑块及新生内膜组织，在理论上是有效的，但都是与单纯PTCA相比较的结果，并没有与支架置入术后进行对照。目前应用较多的有定向冠状动脉斑块切除术（directional coronary atherectomy，DCA）、冠状动脉斑块旋磨术（rotablata）、冠状动脉内激光成形术（excimer laser coronary angioplasty，ELCA）等。
4.9 超声治疗
已有实验证实，超声可抑制平滑肌细胞的黏附、迁移和增生，从而干预损伤血管修复过程，防止平滑肌细胞的过度增生[30]。但其对ISR的防治作用，仍有待于进一步研究。
4.10 再次支架置入
支架内支架可以得到良好的影像学结果，是一种安全有效的治疗ISR策略，其远期疗效也令人满意[31]。
5 小结
综上所述，ISR是一个十分复杂的问题，近年来随着对ISR发生机制的深入研究，各种针对其发病机制的防治措施不断发展。DES的出现曾一度使冠状动脉介入治疗领域看到了消除ISR的希望，但近年来随着DES的广泛应用，特别是在左主干、分叉病变及小血管的应用，发现其ISR也在逐渐增高。目前，在患者规律口服药物治疗、术中尽量减少ISR的危险因素的同时，一旦发生ISR，应用何种治疗方法最有效且长期疗效如何，仍需要大规模的临床实验提供循证医学证据。相信，随着新药物的临床应用、新技术的不断进步以及新一代支架的问世，ISR这个困扰冠状动脉介入治疗领域的难题终将被攻克。
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基因治疗的基本策略范文6
提要 寻找与高血压以及血压调节有关的基因，已成为当前心血管领域的研究焦点之一，一些属于单基因遗传病的继发性高血压的致病基因已被识别。原发性高血压是一种多基因遗传病，其发病系遗传与环境因素共同作用的结果，这为高血压易感基因研究带来很大困难。迄今大多用候选基因法进行高血压相关基因研究。在人和动物模型的研究中，有关高血压候选基因多态性的报道已有四十多种，但各家结果不一致。近年来用微卫星标记进行全基因组扫描和连锁分析，它已成功地用于多基因病相关基因的定位克隆研究。应用该技术对原发性高血压易感基因的定位研究正在进行中。
Gene studies in hypertension:State-of-art
Abstract The search for genes influencing blood pressure or hypertension has become one of the focal point of cardiovascular research. A few disease genes causing secondly hypertension，as a result of a single gene defect， have been identified. However，essential hypertension is a polygenic disease and both genetic and environmental factors play important roles in its development. This fact makes the identification of its susceptibility genes more difficult. So far most studies to reveal the genes related to essential hypertension have employed a candidate gene approach.Using this strategy，the associations between polymorphisms of over forty genes with essential hypertension have been reported in human or in animal models.However，the results are not consistent .Recently，a genome－wide scan and linkage analysis using microsatellite markers becomes a useful approach in the positional cloning of genes in polygenic diseases.Its application for mapping susceptibility genes of hypertension is ongoing.
Key words essential hypertension;gene;candidate gene approach;genome－wide scan
和平利用原子能、登月和人类基因组计划（HGP）是本世纪最重要的三大科技成就。1990年启动的美国HGP的研究目标是在2005年最终阐明人类基因组DNA的全序列、发现所有人类基因、完成它们在染色体上的定位。目前人类基因组遗传图和物理图已经完成，大规模测序技术和生物信息学获得迅速发展，提前达到HGP研究目标已成定局。在“结构基因组学”获得巨大进展的推动下，一个以破译基因功能信息为目标的“功能基因组学”已应运而生。为应对激烈的国际竞争和日新月异的科技进步，我国科学家率先提出了“疾病基因组学”这一新概念，从而确立了我国人类基因组研究的重点和特色。在“863”计划等相关项目的研究基础上，集合了国内一批一流研究单位，一项以创立“疾病基因组学”理论和技术体系为目标和“国家重点基础研究发展规划”研究项目，已于今年初正式启动，这标志着我国疾病基因研究已经跨入积极参与大规模国际竞争的时代。
1 继发性高血压基因研究现状与展望
在高血压基因研究方面，迄今已有10多种属于单基因遗传病性质的继发性高血压的致病基因已被定位或克隆。它们是：与肾上腺皮质激素代谢有关的基因：如醛固酮合成酶基因与11β羟化酶基因形成嵌合基因，导致糖皮质激素可抑制性醛固酮增多症；与离子转运有关的基因：如已查明Liddle综合征系上皮细胞钠通道β.γ亚单位突变所致；一些因儿茶酚胺产生过量导致高血压的常染色体显性遗传疾病，它们的致病基因已被识别。此外，某此类型的多囊肾致病基因也已被定位。需要指出单基因性质的高血压基因研究
并未结束，可能还有一些尚未认识的新病种有待发掘，如在土耳其发现一种以严重高血压伴短指畸形为特征的常染色体显性遗传病，新近其基因已被定位。此外，阐明致病基因在高血压发病中的分子生物学和病理生理机制、探索基因治疗等方面有待进一步研究。
2 原发性高血压基因研究现状与展望
单基因病致病基因的识别，犹如池塘中的鱼已钓一个少一个；而多基因病易感基因却似深海中的鱼，若隐若现、深不可测。当前疾病基因的研究重点从单基因病转向多基因病已成趋势，但难度也越来越大。原发性高血压（EHT）是一多基因遗传病，其发病率高、危害性大、家系样本收集相对比较容易，因此已成为当前多基因病研究的重点和热点之一。
EHT发病是遗传因素与环境因素共同作用的结果，一般认为，人群中血压变异的30％～60％是由遗传因素决定的。遗传因素赋予个体对于EHT的易感程度，因此与EHT发病相关的基因称为易感基因而不是致病基因。
自90年代起识别EHT相关基因的研究开展得十分活跃，目前最常用的方法为候选基因法，其基本策略和步骤为：以参与血压调节机制的蛋白为对象，确定候选基因；进行遗传连锁分析，确定该候选基因座位与高血压是否连锁；筛查该候选基因的各种突变体；基因多态性与高血压间的关联研究，以确定该基因突变体是否与EHT相关。相关基因识别后到最终确定为EHT易感基因还有很多工作要做。
在已研究过的所有EHT候选基因中，以血管紧张素原（AGT）基因的研究最为深入。多数报道指出AGT基因与EHT相连锁，不少研究发现AGT基因的M235T变异体（即基因突变导致AGT第235号氨基酸由甲硫氨酸转变为苏氨酸）与高血压相关联，235T纯合个体的血浆AGT水平显著高于235M纯合个体。但也有一些研究无法证实AGT基因M235T多态性与高血压有关。血管紧张素转化酶（ACE）基因存在插入型（Insertion，I）或缺失型（Deletion，D）多态性。目前一般认为ACE基因这一多态性与高血压关系不大，但似与心、脑、肾等靶器官损害有关。尽管荟萃分析结果支持这一观点，但ACE基因的DD基因型是否为心脑血管病的危险因子，需待前瞻性研究加以证实。一组意大利学者对α－adducin基因与高血压关系进行过系列研究，提出α－adducin基因突变是盐敏感性高血压的遗传基础之一，从而引起广泛重视，但目前多数报道不能证实这一结果。目前已经研究过的EHT候选基因不下四、五十个，不能一一介绍。但迄今为止用这一方法未能肯定哪个基因与EHT相关。尽管如此EHT候选基因对象仍在扩大，对于已研究过的候选基因寻找新的变异体，并探索它们与EHT间的关系还将继续。另一方面，候选基因多态性的民族和地区差异的研究，尤其对于基因多态性分型用于指导临床的可能性探讨正越来越受到重视。
近年来应用微卫星引物进行基因组扫描的技术已经成熟，多色荧光标记的微卫星DNA引物已经商品化。用300多对覆盖整个基因组的微卫星引物，选择大样本的EHT家系或同胞对进行连锁分析，有可能将EHT相关基因位点定位到某一染色体区域内，分辨率可达10cM。进一步用区域内DNA多态标记进行精细定位，如能将范围缩小到1cM以内，便可直接大规模DNA测序，分离并克隆出EHT相关基因。全基因组扫描的应用，在个别多基因遗传病基因定位中已有成功报道。目前国内外一些实验室正采用此技术进行EHT相关基因的染色体定位研究，但迄今尚未见正式报道。
患者对药物的反应、药物副作用以及药物在体内的代谢，都存在明显的个体差异，这种差异都有一定的遗传背景。如能在基因水平上阐明有关机制，将有可能通过检测某个或某一组基因的多态性，预测药物疗效、减轻甚至避免副作用。“药物基因组学”的出现为实现高血压个体化治疗带来了希望。
