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岁岁又重阳范文1
[关键词] 骨髓间充质干细胞 分化 视网膜色素上皮细胞 共培养
视网膜色素上皮（Retinal Pigment Epithelium，RPE）细胞组织学上来源于神经外胚层，具有重要的生理功能，但是视网膜色素上皮细胞无再生能力，因而，当其功能障碍时会导致严重的遗传性、变性性视网膜病变，如视网膜色素变性等，目前通过药物和手术均不能阻止其进展、恶化。通过视网膜干细胞途径达到视网膜再生是一条希望之路，但是哺乳类动物视网膜干细胞成年后则很少具有活性，因此，外源性视网膜细胞移植可能是一个有希望的途径。
可直接应用于移植的视网膜干细胞非常有限，组织工程学的兴起为外源性视网膜干细胞的产生带来了新的希望，骨髓间充质干细胞（BMSCs）是至今研究最值得关注的成体干细胞，骨髓间充质干细胞是来源于中胚层的多能成体干细胞，大量的实验证实体外不同的微环境对BMSCs具有不同的诱导分化效果。BMSCs不仅能向中胚层的成骨细胞等分化，而且能跨胚层分化，如向内胚层的肝细胞样细胞以及外胚层的神经干细胞样细胞等分化。本实验探索诱导BMSCs向视网膜色素上皮细胞定向分化的微环境,现将研究结果报告如下。
1 材料与方法
1.1 材料
DMEM-LG培养基、胰蛋白酶、胎牛血清（Hyclone, USA）；bFGF、EGF、BDNF、PEDF(Peprotech,USA)； Taurine（Sigma,USA）；淋巴细胞分离液（天津市灏洋生物制品科技有限责任公司）；小鼠抗人巢蛋白单克隆抗体、小鼠抗人角蛋白8＆18单克隆抗体、小鼠抗人RPE65单克隆抗体（NeoMarkers，USA）；流式细胞术试剂小鼠抗人单抗CD34-FITC+小鼠抗人CD90-PE，小鼠抗人单抗CD34-FITC+小鼠抗人CD44-PE（Beckman-Coulter，USA）, RT-PCR试剂盒（Fermentas，USA），transwell双层共培养系统（Corning，USA）。
1.2 方法
1.2.1骨髓的采集、BMSCs 的分离与培养
骨髓取自健康成年捐赠者，实验符合国务院1994年颁布的《医疗机构管理条例》第33条原则。抽取骨髓约5mL，将骨髓用PBS稀释后以1000rpm离心5min，洗涤2次，将下层血浆用等量DMEM-LG培养基重悬后采用淋巴细胞分离液（相对密度为1.077kg/L）密度梯度离心分离，轻轻吸取白色雾状单核细胞层，置于离心管中再次用PBS洗涤2遍，用含10%FBS的DMEM-LG培养基吹打分散后调整细胞密度为1×106/mL接种于25cm2塑料培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。72h后予以首次换液，以后每3d换液1次。
1.2.2 BMSCs的形态学观察与细胞表面抗原的流式细胞仪检测倒置相差显微镜下观察原代及传代细胞形态学变化及增殖情况，并拍照记录。按照谢茂松等[1]对骨髓间充质干细胞的流式细胞术鉴定方法步骤进行，第3代人BMSCs 90%融合时用胰蛋白酶消化，用流式细胞仪检测BMSCs CD34（造血干细胞表面抗原），CD44（基质细胞表面抗原）及CD90（干细胞表面抗原）的表达情况。
1.2.3 RPE细胞的采集、分离与培养
RPE细胞取自福建医科大学附属第一医院眼科角膜移植术后的供体眼球，具体操作方法按照徐国兴等[2]提出的步骤进行，无菌条件下行眼杯消化法消化RPE层，将消化液中和后离心，用含15%胎牛血清的DMEM/F12培养基重悬接种于培养瓶中，置于37℃、5%CO2培养箱中培养。72小时后开始首次半量换液，以后每3天换液一次，当细胞贴壁密度达80%时消化传代。
1.2.4 RPE细胞的免疫细胞化学检测鉴定
RPE65蛋白检测：收集细胞爬片进行RPE65蛋白的免疫细胞化学检测：PBS洗涤，4%多聚甲醛固定，5%正常羊血清封闭，加入小鼠抗人RPE65蛋白单克隆抗体（稀释度为1：100），4℃过夜，滴加聚合物辅助剂及生物素化山羊抗小鼠IgG， DAB显色及苏木素复染，自来水洗涤后干燥，树脂封片，显微镜下观察，拍照。
1.2.5诱导分化
实验分两组：诱导组和对照组。诱导组分两阶段诱导：首先向神经前体细胞诱导分化，再进一步与RPE细胞共培养向RPE细胞专向诱导分化。取第3代人BMSCs按 5×104/mL密度接种六孔板中，培养基为含10% FBS的DMEM-LG，每个六孔板中预先放盖玻片进行爬片，24h后将培养基更换为含20ng/mLbFGF、20ng/mLEGF及 20ng/mLBDNF进行第一阶段诱导，在因子诱导的2d开始进行巢蛋白的检测，检测到巢蛋白表达率最高时进行第二阶段诱导，采用transwell双层非接触共培养体系，将第一阶段诱导的BMSCs接种于transwell下层并爬片，取第三代RPE细胞接种于transwell上层，进行共培养诱导并观察细胞形态变化，对照组采用含10% FBS的DMEM-LG培养基培养，不加任何干预。
第二阶段向RPE样细胞方向诱导后角蛋白及RPE65蛋白表达的免疫细胞化学检测,角蛋白8＆18及RPE65蛋白抗体稀释度均为1:100。
1.2.6共培养诱导前及共培养2w后采用RT-PCR方法检测角蛋白及RPE65蛋白表达情况
第二阶段诱导前和诱导2w后，收集细胞，Trizol裂解细胞提总RNA，取1μlRNA在逆转录酶作用下合成cDNA，然后以此cDNA为模板，以角蛋白引物序列：上游5'-GAGGCATCCAGAACGAGAAGG-3'下游5'-CGGGCATTG
TCCACAGTATTTG-3'（扩增片段长223bp），RPE65蛋白引物序列:上游：5'-TTCAACCTCTTCCATCACATCAAC-3'下游：5'-GATTCAAGCCAAGTCCATACGC-3'（扩增片段长397bp），内对照β-肌动蛋白（β-Actin）引物序列：上游：5'-AAAGACCTGTACGCCAACACAG-3'下游：5'-TTTTAGG
ATGGCAAGGGACTTC-3'（扩增片段长度：556bp）（由南京金斯瑞生物公司设计并合成）扩增。产物经1.0%琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像系统拍照。
2 结果
2.1 BMSC形态及鉴定结果
原代培养48h有部分细胞贴壁，少数形态呈杆状，4~6d细胞呈杆状或梭形，形成多个不同大小的细胞集落，7~10d呈放射状向外扩展，细胞呈梭形，并逐渐融合成漩涡状单层细胞。传代后细胞分布均匀，形态一致，长梭形，呈成纤维细胞样形态（见图1）。
图1 原代培养BMSCs第10天（×100）
第3代人BMSCs表面抗原检测显示CD90表达阳性率CD90+/CD34-：96.3%，CD44表达阳性率CD44+/CD34-：94.2%，表明所获得的细胞绝大部分为BMSCs。
2.2 RPE细胞鉴定：RPE65蛋白免疫细胞化学检测结果
第三代RPE细胞呈梭形，融合时可呈多边形，镜下可见胞浆内少量色素颗粒，随着传代的延续色素颗粒逐渐减少。
图2 第三代RPE细胞融合（×100）
图3 免疫细胞化学检测RPE细胞的RPE65蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）
2.3 诱导第一阶段诱导的BMSCs巢蛋白免疫细胞化学检测结果
诱导第3d开始能检测到巢蛋白表达，第12d阳性表达率达到最高，达（86.9±2.6)%。
图4 免疫细胞化学检测诱导BMSCs巢蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）
2.4 诱导第一、二阶段后细胞角蛋白及RPE65蛋白的免疫细胞化学检测结果
第一阶段诱导后可检测到角蛋白表达，但未见RPE65蛋白表达；第二阶段诱导后检测到角蛋白阳性率为（60.8±3.1)%，RPE65蛋白表达阳性率为（25.7±3.8)%；
图5 免疫细胞化学检测诱导BMSCs角蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）
图6 免疫细胞化学检测诱导BMSCs后RPE65蛋白表达情况（免疫细胞化学二步法，DAB染色，苏木素复染，×100）
2.5 诱导第一、二阶段角蛋白及RPE65蛋白的RT-PCR检测结果
实验组第一阶段诱导后RT-PCR检测角蛋白及RPE65蛋白，发现有角蛋白表达，未见明显RPE65蛋白表达；实验组第二阶段诱导后发现角蛋白及RPE65蛋白均有表达；对照组未见角蛋白及RPE65蛋白表达。
图7 两阶段诱导角蛋白的RT-PCR 结果
图8 两阶段诱导RPE65蛋白的RT-PCR 结果
3 讨论
本实验采用分阶段诱导BMSCs向神经外胚层来源的视网膜色素上皮细胞方向分化。干细胞在体内分化与微环境密切相关，不同的发育阶段干细胞所处的微环境不同将会影响干细胞发生不同的分化，干细胞进入新的微环境后,对新的微环境的调节信号做出反应，分化成与新的生长环境相适应的细胞。我们采用分阶段诱导是在细胞分化的不同阶段提供合适的微环境以期向特定细胞分化。第一阶段采用神经细胞生长分化所必须的生长因子诱导BMSCs向神经前体细胞分化，第二阶段将分化成的神经前体细胞与RPE细胞供培养，利用RPE细胞所分泌的相关物质来提供一个微环境，促使诱导的神经前体细胞向RPE样细胞分化。
有实验证实骨髓间充质细胞表面存在PDGF、FGF和EGF受体等。本实验首先使用bFGF、EGF及BDNF 三种因子进行诱导BMSCs向神经前体细胞诱导分化。这些因子具有以下的生物学功能：bFGF具有促有丝分裂功能，在神经元发生、分化和功能方面起着重要作用，在体外bFGF能提高视网膜表达视蛋白的水平，体内有神经视网膜保护作用。BDNF能延缓神经元的变性和自然死亡，对神经元的存活和生长具有重要作用，有很强的刺激和促进神经细胞生长、分化的功能；不仅能保护神经元的功能，而且能促进光损伤的视网膜修复；BDNF能明显促进光感受器细胞生存；在发育中的RPE细胞中有BDNF表达。大量实验证实EGF存在于视网膜，可能与胚胎发育期和生后的光感受器细胞的诱导分化有关，它是视网膜神经元有效的分化因子。
RPE细胞能分泌多种生长因子,这些因子是维持视网膜完整结构所必须的，RPE维持光感受器细胞的存活，RPE能分泌FGF（FGF-1, FGF-2, FGF-5），IGF-1,PEDF等。PEDF有神经保护和为抗血管生成功能，提供环境保护，健康眼RPE能分泌PEDF维持视网膜和脉络膜结构，并支持光感受器细胞和神经视网膜细胞的生长[3]。RPE细胞已知的能分泌以上多种因子，还有分泌一些其他未知的营养成分，这些对于RPE细胞的生长是必需的，因此本实验将诱导分化后的神经前体细胞再与RPE细胞共培养，利用RPE细胞分泌的各种因子为神经前体细胞提供一个微环境，以促进其向RPE样细胞方向分化。
本实验采用细胞角蛋白8＆18(CK8＆18)与RPE65蛋白鉴定诱导分化后的细胞。细胞角蛋白是细胞骨架蛋白的一种，见于所有的上皮细胞，细胞角蛋白包括多个亚型，不同的上皮细胞表达不同亚型的细胞角蛋白。RPE细胞表达分子量为45KD的CK18和分子量52KD的CK8。而在视网膜组织，RPE细胞是视网膜中的上皮细胞，其它非上皮细胞不表达细胞角蛋白表面标志。RPE65 基因定位于1p31,编码视网膜色素上皮特异蛋白, RPE65蛋白是RPE细胞特异性蛋白，故而在该组织中表明就是RPE细胞。本实验第一阶段检测角蛋白即有表达，但未见RPE65蛋白表达；第二阶段诱导分化后检测细胞的角蛋白8＆18与RPE65蛋白，均有表达，表明所诱导的部分细胞具有合成角蛋白8＆18与RPE65蛋白的特征。
本实验结果显示在适当的微环境下可以诱导BMSCs分化为表达角蛋白及RPE65蛋白的细胞，但体外的诱导与体内的微环境有着很大的差别，体外诱导分化的细胞是否具有RPE细胞的生理功能如吞噬功能，有序排列，形成紧密连接等仍不明确，这些问题均需要更加深入的研究。
参考文献:
[1] 谢茂松,徐国兴,李琼等.大鼠骨髓间充质干细胞分离培养方法的比较[J].国际眼科杂志,2007,7（5）:1285-1287.
岁岁又重阳范文2
【摘要】
目的 观察丹酚酸B(SalB)干预体外诱导骨髓间充质干细胞(MSCs)分化为心肌样细胞的作用及其机制。方法分离培养及鉴定大鼠MSCs，对其进行分组诱导:SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-氮胞苷组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L与10 μmol/L)，诱导24 h后继续培养4周，观察其形态学变化，免疫细胞化学法鉴定心肌特异性肌钙蛋白T (cTnT)的表达， 实时荧光定量RT-PCR法检测心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达。结果诱导后的MSCs体积增大，增殖减慢，并出现肌管样结构；免疫细胞化学结果显示诱导后的MSCs表达心肌特异性蛋白cTnT，与5-aza组相比，SalB组cTnT表达较低，SalB联合5-aza组cTnT表达升高；实时荧光定量RT-PCR结果显示各组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5-aza组诱导后的MSCs的心肌早期分化基因表达明显高于其他两组。结论SalB可在体外诱导大鼠MSCs定向分化为心肌样细胞，其与5-aza联合诱导可明显提高MSCs向心肌细胞分化的能力。
【关键词】 丹酚酸B； 骨髓间充质干细胞； 体外诱导； 免疫细胞化学； 实时荧光定量RT-PCR
骨髓间充质干细胞(MSCs)系自体来源，取材容易，扩增能力强，是一种体内外均有极强的分化潜能的干细胞［1］。1995年，Wakitanis等［2］发现体外分离培养的大鼠MSCs体外可被5-aza诱导分化为心肌样细胞。但5-aza作为抗肿瘤药物具有一定的毒副作用，故寻找安全、有效的诱导剂应是目前的重要课题。我们前期的研究结果表明SalB可以减小心肌梗塞的面积［3］，并能有效地促进梗塞灶内成纤维细胞的增生，加速心脏的修复过程。那么，它对有心肌分化潜能的MSCs起什么作用呢？为进一步研究其机制，我们进行了中药单体丹酚酸B(SalB)体外诱导MSCs分化为心肌样细胞的研究。现将研究结果报道如下。
1 器材
1.1 动物
（200±20）g体重的Wistar雄性大鼠，购于中国医学科学院放射医学研究所实验动物中心，动物许可证号：scxk2005-0001。
1.2 试剂与仪器
L-DMEM培养液、1∶250胰蛋白酶、EDTA、双抗，Gibco公司；胎牛血清（fetal bovine serum， FBS），Hyclone公司；D-Hanks缓冲液； percoll淋巴细胞分离液，Pharmacia公司；CD44兔多克隆抗体〔Rabbit Anti-CD44(HCAM)〕、CD34兔多克隆抗体（Rabbit Anti-CD34）、即用型SABC免疫组化染色试剂盒，DAB显色试剂盒、PBS缓冲液，武汉博士德生物工程有限公司；小鼠抗大鼠单克隆抗体Troponin T， Cardiac Isoform Ab-3(Clone CT-3)，美国Lab vision公司；即用型SP免疫组化染色试剂盒(cat.no.MSP859143)，天津灏洋生物制品科技有限责任公司；TaqMan Reverse Transcription Reagents、SYBR Green PCR Master Mix reagent kits试剂盒(Applied Biosystems)、Trizol总RNA提取试剂，天津润泰科技发展有限公司；5％CO2恒温培养箱（model TC2323 CO2 incubator）；倒置相差显微镜（XD-101 98010）；SW-CJ-2FD型单人双面净化工作台；离心机（LDZ5-2）；UV-530紫外分光光度计(上海生物仪器厂)；PCR仪(美国HYBAID)；ABI7300实时定量PCR仪。
1.3 药品
5-aza，Sigma公司；丹酚酸B，天津天士力制药股份有限公司。
2 方法
2.1 MSCs的分离培养
将大鼠脱颈处死，无菌条件下取双侧股骨、胫骨，适量D-Hank's液冲洗骨髓，100目筛网过滤，将密度为1.073g/ml的Percoll预先置于试管的底部，然后按照1∶1的比例沿管壁缓慢滴加骨髓悬液，离心（1 800 r/min，20 min），收获位于界面层灰白色的单个核细胞，用L-DMEM离心洗涤2次（800 r/min，5 min）后接种于完全培养液（含10%胎牛血清、100 mg/L青霉素、100 mg/L链霉素的L-DMEM培养液），置于37℃、5%CO2饱和湿度的培养箱中继续培养，24 h后首次换液，以后每3 d更换1次培养液，2周后细胞长满瓶底。
2.2 MSCs的传代及纯化
待原代MSCs长满瓶底时，用1∶1配比的0.25%胰蛋白酶和0.02%的EDTA对细胞进行消化2～3 min，以完全培养液中止消化并反复吹打贴壁细胞，制成单细胞悬液，按1∶3进行传代培养，直至贴壁细胞彼此融合铺满瓶底时，重复上述操作，反复传至第9代。
2.3 MSCs的鉴定
选用生长状况良好的第9代 MSCs，用免疫细胞化学方法检测细胞表面抗原CD44和CD34。将第9代的大鼠MSCs培养于6孔板，孔板内预置无菌盖玻片，周后，细胞80%长满瓶底，用95%乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS彻底清洗。滴加5%BSA封闭液，室温孵育20 min，甩去多余液体，不洗。滴加以1∶100浓度稀释的一抗（兔IgG）4℃过夜。余按SABC免疫组化试剂盒操作说明进行。苏木素轻度复染、脱水、透明、封片。
2.4 MSCs的诱导分化
将第9代MSCs接种于预先置有盖玻片的6孔板中，培养2 d，将完全培养液换为无血清培养液，24h后进行分组诱导：SalB组(终浓度为250 μg/L)、5-aza组(终浓度为10 μmol/L)、SalB联合5-aza组(终浓度分别为250 μg/L，10 μmol/L)，并设空白对照组，仅用基本培养液(L-DMEM)诱导。诱导剂作用24 h后，更换完全培养液继续培养，每3 d换液1次，共4周。
2.5 免疫细胞化学鉴定心肌特异性蛋白cTnT
取诱导后4周的细胞，用95％乙醇（加少量冰醋酸）固定15 min，PBS彻底清洗。用羊血清封闭，滴加cTnT(1∶50)，阴性对照用PBS代替一抗cTnT，4℃冰箱过夜。其余步骤按超敏S-P试剂盒操作程序进行，最后苏木素复染，梯度酒精脱水，中性树脂封固。显微镜下观察，胞质中有棕黄色颗粒的细胞为阳性细胞。每组选取染色较好的8张玻片，在显微镜下每张玻片取5个视野，由数码摄像机摄入，用Image Pro Plus6.0图像分析软件对结果进行分析。
2.6 实时荧光定量RT-PCR检测
心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达 取诱导后4周的细胞，按以下步骤进行操作：(1)RNA提取与cDNA的合成:取诱导后4周的细胞，采用Trizol一步法提取总RNA，按照试剂盒说明进行反转录，反转录条件为：25℃10，48℃30，95℃5 min。(2)实时PCR法检测心肌早期基因NKX2.5，GATA-4，Desmin和a-actin的相对表达量：从NCBI基因库查找、验证后，确定各目的基因和管家基因的引物序列，由北京赛百胜基因有限公司合成，引物序列见表1。根据试剂盒说明进行扩增，扩增条件为95℃，10 min；95℃，15sec60℃，1 min，40循环。（3）所得CT值经转换后以2-ΔΔCT相对定量法获得每个样本各目的基因相对表达量的数值。表1 各目的基因及内参照基因引物序列（略）
2.7 统计学方法
结果用±s表示。应用SPSS 11.5统计软件采用单因素方差分析进行组间比较，以P＜0.05为具有统计差异。
3 结果
3.1 MSCs的形态特征
刚分离接种的MSCs镜下呈圆形，大小不一，数目较多，24 h内贴壁完成，但仍有较多的圆形细胞悬浮于培养液中，2～3 d后细胞呈梭形，体积较悬浮的圆形细胞大，大小较均一，核浆分界清楚，折光性强。8～9 d形成多个克隆，细胞排列有一定方向性，多成“漩涡状”或“网状”生长。传代细胞保持原代细胞的形态特征，24 h内完全贴壁，呈梭形，增殖迅速，5～7 d即铺满培养瓶底部，发生接触抑制不再生长，需及时传代。在整个培养过程中，通过换液可去除不贴壁的红细胞，通过传代可去除贴壁比较牢固的巨噬细胞、单核细胞等，随着传代，细胞得到纯化。
3.2 MSCs表面抗原的鉴定
镜下可见阳性细胞胞浆内含棕黄色、颗粒状物质。永生化的MSCs免疫组化染色CD44表达阳性，不表达CD34。
3.3 MSCs诱导后的形态变化
阴性对照组细胞在诱导1周后基本长满培养瓶底，而各诱导组细胞死亡较多。2周后，阴性对照组的细胞因生长抑制开始死亡，细胞重叠生长，状态不佳；诱导组细胞仍有少量死亡，但部分细胞体积开始变大，形态呈梭形、长方形、不规则形；3周后，阴性对照组的细胞大片死亡，镜下形态不清；各诱导组细胞呈梭形、长方形的细胞数量相对增多，细胞增殖能力减弱，数量较诱导前减少，个别胞浆中可见明显颗粒状物质，部分视野可见肌管样结构；第4周，阴性对照组的细胞形态模糊；各诱导组细胞形态均一，细胞间发生融合，排列具有方向性，更多视野可以观察到明显的肌管样结构，以SalB联合5-aza组最为明显。
3.4 诱导后MSCs的免疫细胞化学鉴定
未诱导的MSCs空白对照组未发现cTnT阳性细胞， SalB，5-aza，SalB联合5-aza诱导的各组中cTnT免疫细胞化学染色均可见阳性细胞，与5-aza相比，SalB联合5-aza组的cTnT表达明显增加，阳性表达率为28.21%，单纯SalB组的阳性表达率较低。结果见表2。
3.5 实时荧光定量RT-PCR检测
心肌早期基因NKX2.5、GATA-4、Desmin和a-actin mRNA的表达结果显示，各组均表达心肌分化早期基因，SalB联合5-aza组诱导后的MSCs心肌早期分化基因表达明显高于其他两组（见表3）。诱导后各基因的溶解曲线和扩增曲线见图1～10。表2 各诱导组MSCs的cTnT阳性表达率比较(略) 表3 3组NKx2.5，GATA-4，Desmin，a-actin mRNA相对表达量的比较(略)
4 讨论
随着MSCs分离、培养和纯化技术的不断发展和成熟，越来越多的研究者关注于诱导其定向分化为所需的细胞，其中处于心脏细胞与组织再生工程领域的人们正热衷于诱导其向心肌细胞分化的研究。Liu等［4］实验表明，原代和第1代的MSCs用不同浓度的5－aza单次或多次诱导后均未出现心肌样细胞，证明未永生化的MSCs在体外是不能分化为心肌细胞的。骨髓间充质干细胞经连续传代4个月以后得到永生型细胞(immortalized cells)，即纯化的间质干细胞［5］。未分化的永生化MSCs对诱导成功很关键。因此，本课题组选用了第9代的MSCs。
5-aza是研究最多的干细胞分化体外诱导剂，也是目前较公认的可以诱导MSCs分化为心肌细胞的药物。5－aza是一种胞苷类似物，能引起DNA中某些胞嘧啶去甲基化，而DNA的甲基化与基因表达密切相关。所谓甲基化是指细胞通过一个甲基集团与CPG二核苷酸的胞嘧啶环的5'-末端共价结合以修复基因，一般近70%的CPG残基被甲基化，甲基化的结果是这些基因不被表达，而那些非甲基化的基因表达。在胚胎发育早期，特异性基因选择性的去甲基化使细胞向不同方向分化［6］。我们的实验验证了5-aza可以诱导永生化的MSCs向心肌细胞分化。
肌钙蛋白（Tn）包含了3种成分：肌钙蛋白C(TnC)、肌钙蛋白I(TnI)和肌钙蛋白T(TnT)。他们在横纹肌和心肌的收缩调节中起重要作用。肌钙蛋白T(cTnT)是肌钙蛋白的原肌球蛋白的粘合亚型，与肌动球蛋白上的决定ATP酶活性的Ca2+的敏感性有关。存在于快慢骨骼肌及心肌亚型中。cTnT在心肌与骨骼肌上的氨基酸序列是不同的，两者在结构上和免疫方面也有很大的区别，其抗血清的交叉反应率只有1%～2%，不易受骨骼肌的影响，是鉴定心肌细胞的比较特异性的蛋白。因此，本实验选其作为鉴定MSCs向心肌细胞分化的重要检测指标。结果显示除阴性对照组外，各组均表达cTnT。为探讨确切机制我们从基因水平做了进一步的实验。研究认为，分化信号提供给MSCs后，引起调控MSCs分化的关键基因表达改变，决定了干细胞的定向分化方向［7，8］。目前已发现的与心脏发育相关的基因有很多，我们选择的是目前比较公认和研究较多的心肌早期分化基因Nkx2.5、GATA-4、Desmin和a-actin。NKX2.5、GATA-4是对心脏早期发育具有至关重要作用的转录因子［9，10］。Nkx2.5基因在心脏异表达，在胚胎、胎儿心肌细胞中保持一定的表达水平，是心脏前体细胞分化的最早期标志之一。GATA-4作为GATA转录因子家族成员，具有两个锌指结构域，在心脏异性表达，最初表达于原始心肌中层，然后在血管和心脏内膜及肌层中表达，它除了直接参与调节心肌细胞结构基因和相关调控基因的表达外，还可与几种心肌基因调控区的DNA结合，参与心肌细胞的分化过程。NKX2.5、GATA-4在心肌细胞发育的早期即出现表达，两者单独或协同作用可促进正常心肌细胞的特化、分化和成熟。Desmin和α-actin都是细胞的骨架蛋白。Desmin作为心肌细胞分化的一种早期的标志已经得到公认，是最早表达于未分化的肌母细胞中的肌源性蛋白［11］，在肌源性细胞的发育、成熟过程中起重要作用，能够维持肌纤维形态、连接细胞核与细胞膜而使肌小节之间发生信号联系。α-actin为肌动蛋白的一种亚型，是骨骼肌和心肌的特异性具有收缩功能的细胞骨架蛋白，为胎儿或新生儿心室肌的主要成分。因此Desmin和α-actin的表达阳性说明MSCs发生了肌源性分化。心肌细胞的发育是一个连续的过程，其中涉及多种基因的参与和调控，这些基因的表达及它们之间的相互作用在心肌发育过程中至关重要。据报道［12］，SalB能改善心肌梗塞大鼠的心脏功能，并能使心肌基因表达谱发生改变。本研究从体外初步探讨了SalB诱导MSCs分化为心肌样细胞的机理，从实验结果我们认为SalB诱导MSCs向心肌细胞分化的可能机制一方面是由于SalB作用于MSCs后分泌某些有利于心肌细胞生长的因子，从而影响了其向心肌细胞分化的相关基因及蛋白的表达；另一方面可能是由于其上调了心肌分化相关基因的表达。但是SalB诱导MSCs的心肌分化率较低，若要用于临床治疗，尚需更进一步的研究与实践。同时，我们的研究结果显示SalB联合5-aza可以提高心肌分化率，那么，其能否减少5-aza作用所带来的负面影响呢？这仍需要进一步的实验研究。
参考文献
［1］Whitelaw ML，McGuine J.Heat shock protein hsp90 regulates dioxin receptor functionin vivo［J］.Proc Natl Acad Sci USA，1995，92(10): 4437.
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岁岁又重阳范文3
送你一棵幸运草，愿你好事连连有；敬你一杯健康酒，愿你快乐又长寿；送你一条短息语，祝你重阳节日乐！
三三令节春时松更高，九九芳辰重阳鹤添寿，愿秋风捎去我的思念和祝福，祝你越活越精神，越活越年轻！
秋高气爽，人寿花香；彩云追月，盛世和祥。登高临望，有把酒临风之概；菊酿成杯，有对月相贺之意。春光即逝，莫引秋殇，今是重阳，来曰且追。
九月初九是重阳，一见倾心结姻缘，相持相伴到白头，老来登高忆满头。短信祝福呈吉祥，问候关怀暖心窝，愿你重阳心欢喜，健康快乐到永久。
松柏不残四季翠，山村难老百岁人三三令节春时松更高，九九芳辰重阳鹤添寿，愿秋风捎去我的思念和祝福，祝你越活越精神，越活越年轻！
岁岁重阳，今又重阳；声声祝福，莫要彷徨；丝丝挂念，记在心上；条条短信，胜似阳光；问问友人，是否安康？重阳节快乐！
岁岁重阳，今又重阳，傲霜满地香；久久思量，久久难忘，九九重阳胜春光；美酒一杯，秋雁两行，福泽深厚又绵长。祝重阳快乐，永远健康！
九月初九上酒楼，酒醉醉酒忘忧愁，久久凝思九九日，九九重阳想舅舅，纠结思念家中舅，久久未见离家久，带酒一瓶送舅舅，祝福永久在心中。
天高云淡香，遍插茱萸在厅堂。游子千里归故乡，美酒一杯敬尊长。养育之恩不敢忘，祝愿福寿安康万年长。重阳节到了。祝天下所有老人健康长寿！
我愿化作一片云，随你漂流到天涯海角，我愿变成一首歌，寂寞时在你耳边响起，我用真心编写最美的祝福，在这重阳佳节里送给最爱的你。
生命的火焰在跳动，寒冬也冷却不了；生命的色彩在描绘，黑夜也掩盖不了；生命的精彩在延续，时光也终止不了！重阳节，真诚祝愿您健康快乐，永远年轻！
岁岁又重阳范文4
《采桑子 重阳》最早作为《词六首》之一正式发表于1962年5月号《人民文学》，当时标题为《采桑子》。1963年12月人民文学出版社出版的《诗词》收入此词，标题改为《采桑子 重阳》。
据有些资料披露，这首词正式发表前有一稿。两稿对照如下：
【修改稿】
人生易老天难老，
岁岁重阳。
今又重阳，
战地黄花分外香。
一年一度秋风劲，
不似春光。
胜似春光，
寥廓江天万里霜。
【原稿】
一年一度秋风劲，
不似春光。
胜似春光。
寥廓江天万里霜。
人生易老天无老，
岁岁重阳。
今又重阳，
但看黄花不用伤。
（见龚国基著《与诗》210页）
【妙处可言】
《采桑子 重阳》的定稿与未定稿相比，除了上下阕颠倒以外，还有两处较大的修改：一是“人生易老天无老”改为“人生易老天难老”；二是“但看黄花不用伤”改为“战地黄花分外香”。从这几处的修改，可以看出炼字的功夫。
1.上下阕颠倒后，意境和结构大不相同。开头用一个深刻的哲理句奇峰突起：“人生易老天难老”；紧接着扣题，虽然“岁岁重阳”，但是今天的重阳可不同了，是在战地，感受分外深切。这样思绪由黄花到秋风，最后飞到万里寥廓江天。全词由无边到眼前，再由春光到无边，结构上曲折起伏，又完整绵密。
2.“人生易老天无老”改为“人生易老天难老”，改动一字，但是思考顿深。“天无老”是肤浅的直觉，“天难老”反映了对宇宙空间无边无际、时间无始无终的深刻认识。“人生易老”与“天难老”之间，又包含了对有限与无限的辩证认识（若干个有限组成无限，而又永远到不了无限）。
3.“但看黄花不用伤”改为“战地黄花分外香”。“不用伤”是有伤而不伤的自我解脱，“分外香”是用心去感受从未有人感受过的境界。很多分析都去联系当时的处境和心情，其实用不着；这两个句子一比较，高下立现。
其实，诗词中的“炼字”根本目的还是为了“炼意”，也就是为了更好地表现诗词的意境。“炼字”必须以“炼意”为前提才有价值。“字”是出墙红杏，“意”是满园春色。因此无句无篇也就说不上炼字。只有篇中炼句，句中炼字，切合题旨，切合情景，做到语意两工，这样炼出来的字才能真正灵光四射。《采桑子 重阳》在未定稿的基础上作了几处改动后，单独看改动之处，可能觉不出有多好，可是如果把改动之处放到整首词中来看，再联系当时的写作背景仔细品味，词篇的字里行间洋溢着的革命乐观主义精神就感人至深了。
【牛刀小试】
遇 见
孔屹桧
风屏息在天边
树叶却哗啦啦地
跌落一片
如绿衣蝴蝶
缱绻缠绵
你低眸
我仰望
脱口而出的讶异
如蜻蜓点水般的
涟漪荡漾
须臾
淡然的笑意
绽放在你眉间
伸出手
清风将你掌心的温度
绵延至我心尖
胜过许多的诺言
【指导教师：张兴武】
岁岁又重阳范文5
愿我的祝福迈过千山万水，愿我的祝福走过千家万户，愿我的祝福携着千福万福，伴着九九重阳的欢聚，来到你的身边，祝你节日快乐，幸福安康!和大家分享重阳节祝福语录精选材料，提供参考，欢迎你的参阅。
语录一
1.秋风吹过的蓝天，格外明艳，仿佛心底的那份思念;秋水映衬的白云，卓尔不群，恰如祝福的那颗真心;重阳发来的信息，全心全意，代表想你的心地。
2.让南山上的空气帮你润肺，让解放碑的轻轨载你腾飞，让瓷器口的鸡杂给你美味，让太白酒的清香把你迷醉，也让我的祝福带给你实惠：重阳节快乐!
3.你如果现在是一个人，我祝你重阳节快乐;如果两个人，那也重阳节快乐;如果一伙人，请告诉我你们在什么地方。
4.今日重阳节，共饮酒，吃口重阳糕，顺便诉问候，首先祝你重阳佳节好，愿你生活如重阳一直逢双九，幸福永远九九(久久)!
5.九月初九是重阳，孤身在外想念爹娘。举杯遥祝二老安康，愿你们身体健康老当益壮，心情舒畅神清气爽，康乐人生如意吉祥，欢乐多多幸福绵长!
6.双九重阳佳节到，短信祝福来问好：相逢总是很奇妙，生活无忧无烦恼，工作压力瞬间消，伤心失落全跑掉，锻炼身体多散步，愿你重阳更美好!
7.沧海一粟，九九回归;天涯浪子，黯然伤神;亲朋满座，只差一人;快马一鞭，欢喜满心;终踏乡路，静听乡音;疾见亲友，顿感温馨!
8.重阳节，祝你一重喜悦，两重欢笑，三重友谊，四重真情，融成十重光芒温暖你心窝，祝你重阳节幸福快乐!
9.每逢佳节，重阳在列，片插茱萸，登高望远，举杯怀远，唯思尔等，愿君婵娟，共思美好，祝你重阳节快乐!
10.九九重阳齐欢笑，真诚祝福少不了，全家欢聚真热闹，我在这里问声好，愿你事事都如意，一家老少乐淘淘!
11.月落乌啼满天霜，枫叶轻舞到重阳。东篱把酒黄，悠闲送到你身旁。无尽思念心中藏，有情岁月暖心房。声声祝福情意长，愿你幸福人安康。
12.重阳将至，送你跑车价格太贵，送你美酒怕你喝醉，送你玫瑰怕你误会，给你介绍情人又怕你犯罪，只好发条短信，让你陶醉!重阳节快乐
13.寒雁一向南飞远，游人几度丛。九月九日望遥空，秋水秋天生夕风。现在正是争艳的季节，愿你的心情也和那样清爽、淡雅!重阳快乐!
14.九九重阳节，愿久久的幸福在你生活中重复，久久的成功在你事业中重复，久久的友情在你我之间重复。重阳节快乐!
15.借此佳节之际我感谢你，你的笑颜似绚烂的阳光照亮了我的国际，你给予我的安慰和鼓舞撑持我度过全部艰苦。祝你重阳节高兴! 九九重阳，欢笑聚堂，祝您重阳节：亲朋好友相聚来，喜上眉梢笑花开，长慈幼孝夫妻爱，好时好事好运来!
16.吃着重阳糕，饮着酒，插朵茱萸花，牵着爱人手，散步到永久，重阳节到了，愿你幸福平安，快乐一生。
17.重阳节到了!在这个丰收的季节里，祝愿你：事业丰收，薪水丰收，爱情丰收，欢乐永相随!
18.九月，枫笑红了脸，菊笑开了花，您笑弯了腰。九月，你踩着坚定的步子，一步步攀登着石阶，迈向成功，迈向新的生活。送您一块重阳糕，愿您重阳步步高!
19.重阳节，送你一杯九月九的酒，熏香你的生活;送你一丝思念，让你学会心系祖先;送你一束鲜花，甜蜜你的爱情;送你一缕轻烟，让你每天轻松欢乐。
20.重阳节就要到了，送一支山茱萸，愿你永远愉快;送一块重阳糕，愿你永远高兴;送一杯酒，愿你幸福久久。祝福您身体健康，老当益壮!
21.九月九日宴重阳，亲友齐聚登高望，祈福避灾无疾病，幸福如意身健康。天高云淡香，遍插茱萸迎吉祥，好运围绕财神伴，阖家欢乐业兴旺!
22.重阳时节日照少，情绪不畅易衰老，沟通交流解心结，平静心态保健康，避寒而卧睡无恙，饮食平衡养胃肠，无事之秋开心过，愿你顺意心舒畅。
23.九九重阳节，你我难聚首，思乡的人儿眼泪流，条条的短信诉真情，愿你心儿莫忧愁，朋友一直将你放心上，再到重阳日，你我定能共饮酒!
24.重阳节到了，祝愿你登上高峰把幸福采下来，把烦恼丢下去;让骄阳把事业照得红红火火，让秋风把忧愁吹得干干净净!
25.工作需要多点激情，生活需要多点快乐，爱情需要多点甜蜜，友情需要多点联系，假日需要多点休息。享受生活，欢度重阳，朋友记得常联系!
26.一到九九重阳，二九归一心愿，三神大喜同乐，四季唯一佳节，五合六聚欢聚，七大八小祝愿，九九归一祝福，重阳快乐无比!
27.九月九是重阳，烈酒香醇菊飘香;九九相碰在重阳，万丈光芒耀吉祥;九九相约在重阳，好运双双齐送上;九九归真在重阳，步步登高人安康;祝重阳喜洋洋!
28.一杯酒带来我最真的问候，希望远方的你能够开心健康。一句简单的问候代表我最真心的祝福，希望你事事如意。重阳节快乐!
29.当秋风吹起的时候，远方的你让人分外牵挂，当枫叶飘落的时候，天各一方的我们彼此关怀，在重阳节的日子里送出我的祝福，希望你身体健康。
30.一年一度重阳，祝福大不一样，生活喜气阳阳，职场阳阳得意，爱情沐浴阳光欢笑阳溢，幸福总在身边徜阳不会扬长而去。收下祝福吧!重阳节快乐!
语录二
1、愉快掺杂在空气中，祝福飘落在树梢上。向你招手是温馨的重阳，你的笑声是节日的激情。我愿化作幸福、给你带来幸福，化作健康，给你带来健康。重阳快乐
2、秋天来了，丰收的时候还会远吗?重阳来了，团聚的日子还会远吗?愿我的朋友笑容灿烂，每天都有一个好心情。抛开烦恼，时刻都能开开心心。
3、用彩云编织缱绻的梦境，收集心中每一份感动，许下星空每一个祝愿，记载心头每一丝企盼，交织成一首幸福美丽的乐章，在这重阳佳节伴随你!
4、今日重阳九月九，如意吉祥酿美酒。一杯送你钱满箱，二杯送你好前程，三杯送你彩票梦，四杯送你永平安，五杯尽饮鸿福来，国太平安度余生。节日快乐!
5、重阳佳节，祝福送至，秋菊飘香，问候传递。我用彩云编织幸福的梦境，收集重阳里每一份感动，用短信将幸福为你送去。祝你重阳节快乐，精彩生活每一天。
6、暴雨浇不灭青春的火焰，困难压不垮坚挺的人心，荆刺止不住登高的愿望。借秋风传送我的问候，托大山保存的我的祝福，真心地祝愿你重阳快乐。
7、工作需要多点激情，生活需要多点快乐，爱情需要多点甜蜜，友情需要多点联系，假日需要多点休息。享受生活，欢度重阳，朋友记得常联系!
8、愿你工资加薪如涨潮，生意兴隆买卖好，爱情路上遇月老，友谊之树不会老，一天更比一天好，家中啥都不缺少，开开心心活到老，重阳节快乐。
9、转眼重阳到，金风送爽俏，又逢重阳去登高，茱萸遍插秋风抱，送你祝福短信妙，重阳久久幸福居高，容颜不老，开心最紧要!
10、思念，高远了青山，倾诉了山泉;期盼，遍地了茱萸，浓香了秋艳;祝福，汇集了久久，凝聚在心间，祝你：重阳节日，全家美满，幸福平安。
11、为答谢各位亲友对本人的支持，特在此佳节举行大派送活动，凡在本人心中具有一定地位的朋友将获得价值一毛的短信一条。祝：重阳节快乐!
12、重对董说：虽然戴的是草帽，也是公司的头啊。阳对日说：听话才有靠山。老对考说：我坐你站，因为我是面试官。我对你说：重阳到了，祝你快乐!
13、秋菊酿出重阳酒，喝出开心没烦恼。五谷做成重阳糕，吃出健康平安到。秋风谱出重阳曲，听出幸福和美妙。艳阳搭建重阳屋，住出温馨好情调。重阳节快乐!
14、九九重阳登高塔，高瞻远瞩赏。开阔眼界祁幸福，期盼亲朋皆平安。胸佩茱萸送瘟神，门插迎吉祥。全家共饮酒，欢聚一堂度重阳。重阳节快乐!
15、欢聚一堂，痛饮酒，多吃重阳糕。让我们的重阳节，步步高升吉祥顺利，健康养生到永远。祝你重阳节快乐!
16、出游赏景、登高远眺、观赏、饮酒、吃重阳糕;朋友，重阳佳节到了，愿你和你的家人健健康康，长长久久。
17、本想亲自到你身边给你送点祝福，但因物价上涨、囊中羞涩、路费难凑，实在无奈，发条短信，内容很少，但祝福很满。祝你重阳节开心快乐!
18、九九重阳节，传你九阳真经：天气多变，记得加衣;少些惆怅，多点喜气;秋高气爽，悠然赏菊;亲朋好友，时常联系。记住要诀，你会天下无敌!
19、七夕节许爱情愿最灵，重阳节许长寿愿最灵，财神日许发财愿最灵。正月十五财神日，心中许个发财愿再加我给你祝愿，愿望一定能实现。祝：今年大发!
20、但得夕阳无限好，哪须惆怅近黄昏，我蒸上九重的粟糕，备好香醇的菊酒，只待与你分享。愿你在这秋风徐徐的重阳里快乐永久!美好永久!
21、悬茱萸，福满堂，九九重阳好运到;赏秋菊，品香茶，惬意无忧乐逍遥;踱步出，有山水，登高远眺心情妙。九九重阳，愿你开心久久，幸福久久!
22、九九重阳节，悠悠思乡情，金秋佳节，菊蓉笑绽，关爱老人，思念亲情，好友陪伴，思高登顶。祝亲爱的朋友身体健康，心想事成，重阳节快乐!
23、斟一杯菊酒，愿你健康长寿;插一棵茱萸，愿你吉祥如意;尝一块花糕，愿你步步登高。九九重阳节，祝你幸福快乐。
24、九九重阳快乐!此短信饱含我的深情款款、含情脉脉，既活泼俏皮，又幽默喜气。收到的快乐一生，储存的幸福永远，收藏的好运连连，转发的年年大发!
25、九九重阳，飘香，山高水长祝爹娘，常安康。糕点黄黄，甜蜜心上，秋收秋获好时光，财满仓。送一则短信，含万般衷肠。祝你合家幸福，开心荡漾。
26、1个，2个，。97个，98个!我的祝福翻了98个跟头，终于来到了你的面前，唷，还差一个!好，再翻!99个跟头，祝九九重阳快乐，快乐久久!
27、盼望着，盼望着，九月九要来了，重阳节要到了;你的手机要响了，我的祝福要发了;你的脸儿要笑了，我的心意要表了：重阳节快乐了!
28、四川人重阳节指南：去青城登高望远，去峨眉烧香拜佛，去宜宾喝五粮液，去成都感受地铁，再到春熙路看美女，最后回家搓麻将。哎呀!生活硬是不摆老!
29、独在异乡为异客，每逢佳节倍思亲，遥知兄弟登高处，遍插茱萸少一人!祝福远方求学的学子以及打工的朋友们重阳节快乐!
30、又逢九九重阳，又到金秋送爽，又逢长假添吉祥，又可与友登高聚首诉衷肠，又是重阳快乐回味久悠长，又见笑面如花你最靓，快乐就在九九重阳!
31、双九重阳日，举杯共消愁，人生多波折，多亏朋友助，借着今天佳节日，祝福话语说出口，愿你年年岁岁有今朝，时时刻刻无忧愁!
32、愿你薪水多赚，奖金满满;快乐天天，幸福年年!祝我们这些表面风光内心彷徨;容颜未老，心已沧桑;成就难有，郁闷经常;比蚂蚁忙;比岳飞更忠良的兄弟姐妹们，重阳节快乐!
33、九月九重阳节，想约你一起来过节，但一采就碎，菊酒一喝就醉，外出旅游太贵，登高远眺太累，不如发条短信经济又实惠，祝你重阳过得轻松愉快!
34、做人要做李莫愁，刮风下雨不用愁;做事要像张无忌，牛鬼蛇神都无惧;工作要像王重阳，全真七子帮我忙;生活要像韦小宝，开心无忧没烦恼!
35、春花灿烂，孕育了秋实;秋菊飘香，润含了顺利;茱萸遍地，预示了安逸;重阳登高，祝你如意，送上大礼：愿你重阳节合家幸福，健康甜蜜。
36、秋景妖娆百媚生，秋菊怒放迎重阳;茱萸在手福满屋，身轻体健福寿长;登高远眺精神爽，忘忧忘烦心情好;祝你重阳交好运，步步如意走鸿途!
37、重阳节将至，我把祝福送;送枝茱萸叶，灾祸无处躲;斟杯酒，幸福很长久;赠块重阳糕，事业步步高;邀你登高峰，增福又添寿。祝你重阳节快乐，幸福快乐又安康!
38、重阳节登高，我登上天庭，用酒贿赂了全能的上帝，借他的手机给你发短信，因为收到上帝祝福的人定会健康久久，长寿久久，快乐久久，幸福久久!
39、有很多的事情难以忘怀，有很多的朋友梦萦魂牵。总有相汇相聚的时候，总有在一起载歌载舞的时日。朋友重阳节到了，愿你平安吉祥，年年如意，喜乐开怀!
40、九月九日，在这个思念泛滥的日子里，我想把全世界的祝福都送给你，我对你的思念，你懂得，所以我只想说：朋友，身体健康，万事如意!
41、花总是会谢的，人总是会老的，重阳节年年都要来的，老人节早晚都要过的。无需在意岁月的更迭，祝你拥有一个美好，快乐的节日。重阳节快乐。
42、重阳佳节，丰收时节，漫山红叶绽放你的笑颜，遍地稻香笼罩我的祝愿，祝愿你：事业大丰收，爱情大丰收，生活大丰收，快乐大丰收，事事大丰收!
43、是您将我培育，教我做人的道理;是您将我指引，让你给我不至于在花花世界里迷失自己;父爱如山，永记于心，我亲爱的父亲，重阳节快乐。
44、岁岁重阳，今又重阳，九九相逢祥瑞降。不似春光，胜似春光，秋高气爽喜洋洋。金菊飘香，归雁成行，健康喜乐福绵长。重阳节，祝你幸福安康!
45、原本有心花不开，偶尔有人来相伴，悔时心中已有泪，吞下口去悄无悄，来者耳边轻轻诉，缺字少左心相印，东风去掉一二点。每句猜一字：愿你每天都快乐!
46、九月九，捧来美酒，回忆涌上心头!久未见，思念浓厚，问候不常有!朋友之情当天长地久，朋友之谊当放心头。送来祝福：仕途高涨，工作顺利!
47、岁岁重阳，今又重阳。秋风凄冷霜叶黄，年月如水细细淌。在故乡，望远方，兄弟别忘添衣裳。勤努力，勇敢闯，自信人生二百年。
48、数、数、数，数到九月九，重阳节日又来到，发条短信祝福你，愿你平安幸福，身体健康，事事顺心，重阳快乐!
49、重阳赏菊饮菊酒，祛灾祈福吉祥久。九九佳节蟹黄肥，樽前品蟹日日美。吃过糍粑柿子甜，出游登高身体健。佳节遥寄我思念，贴好秋膘享冬天!重阳快乐!
50、愿我的祝福迈过千山万水，愿我的祝福走过千家万户，愿我的祝福携着千福万福，伴着九九重阳的欢聚，来到你的身边，祝你节日快乐，幸福安康!
语录三
1、重阳佳节，大吉大利，岁岁重阳，六六大顺，重阳之夜，七星高照，喝酒赏夜，十全九美，金秋十月，喜气浓浓，祝天下有情人：幸福美满，岁岁重逢!
2、九九重阳节，送给你双重的快乐，双重的健康，双重的如意，双重的温情，双重的祝福：祝好事成双相伴，甜蜜重重包围!
3、重阳的到来，久久的期盼;九九的快乐;久久的思念;九九的幸福，久久的等待;九九的祝福，久久的珍藏;九九，喜事乐事好事伴你久久。
4、通往希望的山上，我不断向上攀登，不管前方的路途多么崎岖，那是我不变的方向，只为登上山顶，为你祝福，为你祈祷，重阳登高，祝你幸福快乐长相伴!
5、重阳送美酒，让好运伴你走。重阳送，让你美貌如花。重阳送茱萸，朋友常相聚。重阳送祝福，幸福到永久。
6、如果我能化作一缕的阳光，我会为你把梦照亮，如果我能变作一团火焰，我会为你驱散早秋的寒意，今天是重阳节，为你送去一份发自内心的祝福。
7、酒是友情长青酒，久是天长又地久，九是五六的九。九九重阳至，送你友情长青酒，愿你我友谊天长地久，祝你五谷丰登六六大顺八发快乐九九!
8、夕阳无限美，黄昏也娇媚，纵使光线暗，明日可重来;年年节日多，今次大不同，人人登高忙，节节盼高升;小小短信到，细细润心田，道声重阳节快乐，生活好滋味!
9、菊飘香，插茱萸，欢欢喜喜过重阳，登登高，望望远，释放快乐无烦恼，斟满酒，敬敬老，父母安康永不老，表思念，送祝福，愿你幸福永相伴，重阳节愿你开心无限!
10、年年岁岁九月九，两九相重又重阳;金秋九月天气爽，心旷神怡喜登高;秋粮丰收重阳糕，寓意吉祥步步高;盛世华诞祖国兴，尊老敬老新风气。祝您重阳节快乐!
11、九九八十一，好运全部送给你。不管三七二十一，幸福将会纠缠你。重阳节到来之际，为你奉上真诚的祝福，愿你登上人生的最高峰，事事都成功!
12、九九重阳，九九祝福，九九快乐，九九成功，九九好运，九九平安，九九发财，九九健康，九九幸福。九个九九，思念九九，情意九九。
13、理想幻想梦想心想事成;家事公事心事事事顺心;财路官路人生路路路畅通;晴天雨天天天开心，友情亲情爱情情情似海;中秋国庆重阳节节节快乐!
14、松柏不残四季翠，山村难老百岁人，三三令节春时松，更高九九芳辰重阳鹤添寿，愿秋风捎去我的思念和祝福，祝你越活越精神，越活越年轻!
15、送你九九重阳节开心秘方：工作放一放，心事搁一搁，烦恼抛一抛，身体歇一歇，心情酿一酿，开心笑一笑，牙齿露一露，快乐好心情。祝天天开心!
16、姐拥有一座快乐别墅，两幢好运公寓，三辆成功豪车，四季健康时光，爱姐追姐的人多了。但姐就看中了你，非你不嫁。记住了，我叫重阳“姐”。
17、重阳节，敬老时，不管你年龄有多大，请保持灿烂的笑容平和的心态，把有限的生命融入到无限的快乐中去，就能青春永驻，幸福长享。重阳快乐!
18、一言九鼎送秋风，秋景，秋实，秋叶，三言两语送秋梦，秋波，秋雨，秋水宜人，秋意浓，九九归一九月九，重阳佳节幸福天长地久。
19、浓情九月九，思念挂心间，一片孝心，一份关爱，一份诚挚，一份祝福，将真挚的情感表达，祝福天下所有的老年人重阳节快乐!
20、9月9，请你品好酒：千年陈酿女儿红，喝了气色红润，身体好，百年佳酿茅台酒，喝了一醉解千愁，人间难有几回有!祝你重阳快乐!
21、九九八十一，重阳来做题，九份成功甘露水，九份快乐甘露水，八十一份幸福浆，加上你这个储藏瓶，百分人生终归你。
22、重阳送九“久”：友情历久弥坚，爱情天长地久，事业久炼成钢，生活长治久安，人气久负盛名，成功由来已久，健康经久不息，好运旷日持久，快乐长长久久。
23、无论天涯海角，总有一条牵挂的线，始终围绕在你身边，逢年过节就出现在你眼前，重阳节到了，祝愿我的朋友幸福健康，平安快乐，心想事成，万事如意!
24、我的祝福跋山涉水，餐风饮露，降妖伏魔，一路西行，历经九九八十一难，终于成功抵达你的手机，赶在九九重阳佳节之前，对你说一声：节日快乐!
25、登高远眺，层云朵朵，晚霞夕照，余晖勾勒出人间的美好;九九重阳，茱萸遍插，酒香，美酒荡漾着生活的芬芳;值此佳节，真诚祝愿，愿你快乐永远!
26、岁岁重阳，今又重阳!去年黄花亮，今年黄花黄!只等登高望远，家乡的人还好!愿秋风带去祝福，带去问候，祝福家乡的人身体康健，问候远方的人儿幸福长久!
27、九九重阳节日到，我的短信首先到，登高望远先敬老，赏菊插萸忆欢笑，一叶一信总关情，好运笼罩乐逍遥。祝重阳节鸿运总围绕，幸福无限延。
28、重阳佳节，一心一意想着你，对你的思念，久久不能忘记。两心相映不分离，三生有幸爱上你，祝你福寿无疆，越活越精神，越活越年轻，越活越健康!
29、欢送国庆，朝阳无限好，大江向东流，万家欢乐遍神州;喜迎重阳，风凰栖梧头，花开满枝稠，人寿年丰身无忧。双节同庆，祝君好事成双，幸福又吉祥!
30、九月九的重阳—友谊情深;美酒—芳香宜人;艳阳—普照大地;韭菜—味美可口。好一个九月九，朋友!今天我将永久地祝福你重阳节快乐。
31、九九重阳到，祝福跑不了，送一缕秋风给你，愿它拂去你所有的不如意;送一杯茶给你，愿它冲走你所有火气;送一枝茱萸给你，愿它带走你所有的霉气;送一条短信给你，愿它带给你欢喜!
32、一阵秋风捎去一片牵挂，一场秋雨带去一份温馨，一缕阳光送去一份暖意，一群大雁载去一腔思念。九月初九重阳佳节来临，祝愿朋友开心久久，健康久久，甜蜜久久，幸福久久。
33、九九艳阳天，登高赏。茱萸插发间，驱邪求平安。挥酒祭天地，祈福在人间。席地饮美酒，快乐天天伴。重阳节愿朋友，全家平安吉祥!事业大展辉煌!
34、家有一老，如获至宝∶似绿草，风吹不倒。锻炼长跑，动作灵巧。丢开烦恼，困惑不扰。重阳节好，福气来找。您可千万别怪我胆子不小，欢心来讨。
35、重阳怎么乐呵，有人花钱吃喝，有人花钱点歌，有人花钱美容，有人花钱按摩，今天我自个儿花钱，发条信息陪你唠嗑，送你一点秋波：祝你重阳快乐!
36、重阳节送您限量版重阳糕，祝您心情好开心程度高，工作顺办事效率高，薪水涨升级职位高，身体棒生活质量高，朋友多人气指数高，福气到运气与天齐高!
37、在艳阳高照的日子中，我们迎来了盼望已久的节日，与家人团聚，享受着快乐的洗礼，记得笑容多一点，重阳节快乐。
38、重阳节：我国古代以“六”为阴数，九”为阳数，九月九日正好是两个阳数相重，所以叫重阳”，也叫“重九”，你知道吗?重阳节快乐。
39、重阳到，买辆奔驰送你，太贵!请你出国旅游，浪费!约你海吃一顿，伤胃!送你一支玫瑰，误会!给你一个热吻，不对!只好短信祝福你，实惠!
40、生命之春，如春草般蓬勃。生命之夏，如夏花般灿烂。生命之秋，如秋枫般静美。九九重阳，时值霜天季节，你却格外神采奕奕。祝您老节日快乐，健康长寿!
41、一帆风顺，双喜临门，三羊开泰，四季发财，五谷丰登，六六大顺，七星高照，八发，九九重阳祝你十全十美!
42、重阳节：老人养生，红糖少不了。老人对各种微量元素和维生素的摄入逐渐减少，而红糖含有较多维生素和矿物质，老人在吃糖时，应多选择红糖，可维持正常代谢功能，延缓衰老。
43、据考证，史上第一个淘宝店主是一位诗人，名叫王维。证据就是他在重阳节给买主写的一句慰问诗：“每逢佳节倍思，亲!”亲，重阳节快乐哦!
44、重阳去登高，我送祝福到，祝你工资翻倍涨的高，祝你事业发达飞的高，祝你身体健壮跳的高，祝你万事如意笑声高，祝你生活幸福步步高。
45、送你清风让你心旷神怡，送你细雨洗去你疲惫的汗迹，让蓝天作封白云作信，让流星作我的特快专递，送你彩虹通向梦想之旅，祝你重阳节快乐!
46、一九二九快乐无忧，三九四九健康逗留，五九六九幸福不走，七九甜蜜无愁，九九重阳团聚久久，十分祝福祝你无愁，快乐永远长长久久!
47、九九久久，重阳节送给你双重的祝福：祝你麻将常胡九;祝你活到九百九十九;祝你的福气财运长长久久;祝你的幸福天长地久。再送你一瓶吉祥美酒，痛饮。
48、今天你是世上最幸运的人，恭喜你收到我的这条短信，虽然你也许还没有满一百岁，但我会提前祝你长命百岁，万寿无疆，九九重阳，久久健康!
49、清秋日，重阳节，祝福短信不能缺，先向老人致问候，祝双亲身体健康，神清气爽;再祝合家欢乐，共度佳节;三祝工作顺利，发达事业，最后来句总结：重阳节快乐!
岁岁又重阳范文6
2、金秋送爽，丹桂飘香，重阳又至，问候送上。品浓酒之香，念远方老友，送真心祝福，愿你年年岁岁，无忧无愁!
3、生活是座迷宫，爱是一个谜题，从容游迷宫，开心解谜题。景好不如人美，相遇不如神交，九九重阳节，祝你乐逍遥!
4、您生命的秋天，是枫叶一般的色彩，不是春光胜似春光，时值霜天季节，却格外显得神采奕奕。祝您老重阳节快乐，健康长寿!
5、与你相遇在秋高气爽的重阳，想你在初冬漫漫的圣诞，吻你在青草已绿的春天，只想轻轻的问你——重阳给我一次美好的约会，好吗?
6、敬老鼓琴仙度曲，爱老种杏客传书。重阳节快乐!
7、重阳及门第，碧月护富翁!无限秋光好，我请你去赏菊，好吗?
8、重阳节到了!在这个快乐的节日里!祝愿你：事业丰收，薪水丰收，爱情丰收，欢乐永相随!
9、九月九，佩茱萸，食蓬饵，饮酒菊，登高山，心神怡，送鸿运，福相依!祝愿重阳快乐，万事如意!