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网上审批范文1
网上审批监察系统是监察机关运用系统对行政审批过程进行实时纠错绩效、评估信息服务，对行政审批项目的受理、承办、批准、办结和告知等环节进行网上操持，实现全程监督的应用系统。
㈠推行网上审批可以改善发展环境，提升我市对外形象。当前行政审批制度存在审批项目设置较多、环节繁琐、时间偏长、部门之间有时不协调等诸多问题和弊端，影响了市经济的发展。建设网上审批系统,将传统的政务审批改造为电子审批政务,可更高效地发挥政府公共服务职能，方便公众办事，改善我市的投资环境，提升我市对外形象。
㈡推行网上审批可加强对行政审批的监督，从源头上预防腐败。保守的行政审批为权力“寻租”提供了机会，成为一个需要清除的腐败源。建设网上审批系统，能够加强对行政审批全过程的监督，有效约束审批权力，杜绝暗箱操作，从源头上预防腐败，建设廉洁政府。
㈢推行网上审批可以推进政府管理创新,推动政府自身建设。建设网上审批系统有利于形成一个行为规范、运转协调、公平透明、廉洁高效的虚拟”政府，对促进政府机构自身改革和建设、增强政府行政管理能力、提高行政运行效率、改进公共服务水平等，都具有重要意义。
二、建设目标
㈠总体目标：年底前，实现市第三轮行政审批制度改革所保留的各项审批、审核、核准、备案及内部事务等行政审批事项的网上在线料理和监督，共计47个部门248项，其中行政许可项目191项，政府部门内部管理事项57项
㈡具体目标：建设市政府网上审批电子监察统一大平台，涵盖市政府各部门审批业务。主要内容：
1建设网上公共服务平台。政府门户网站“行政审批网上服务平台”运行在互联网上为公众提供行政审批服务的窗口，实现公众与政府交互对话的一站式服务门户。网上公共服务平台的主要用户是进行审批申报的公众用户。
2建设网上审批业务平台。网上审批业务平台运行于政务网内网，为政府公务人员提供处置行政审批业务工作平台，实现审批业务的信息共享、任务调度、协作交互、管理监控等业务功能。网上审批业务平台的主要用户是进行审批操持的政府公务人员。
3建设电子监察平台。具有实时监控（流程监督和过程跟踪）预警纠错（审批督办）绩效评估、统计分析、投诉举报、信息服务等功能。电子监察系统可对不同部门、同一部门不同时间段的行政许可实施情况和行政效能情况进行横向、纵向比较和综合评价。
4建设系统管理平台。系统管理平台运行于政务网内网，实现对人员组织、角色权限、网上审批业务流程及其他相关系统控制参数进行定义和管理。系统管理平台的主要用户是负责审批系统管理和维护的系统管理人员。
三、建设方法
整个网上审批电子监察系统建设，分四阶段进行：
第一阶段主要任务是依照工作方案安排，组织有关人员前往国内部分网上审批电子监察系统建设工作效果比较好的地区观赏学习和考察，借鉴先进经验，做好各项前期准备工作
第二阶段完成系统软件的开发、测试、试运行及硬件配置，选择10个左右的行政审批事项作为试点，实现网上在线办理。
第三阶段实现第一批20个政府部门80个左右的行政许可项目和20个左右内部管理事项的网上在线办理。
第四阶段实现第二批27个政府部门101个左右的行政许可项目和37个左右内部管理事项的网上在线办理及整个网上审批电子监察系统项目的测试、试运行、验收。
四、工作要求
㈠加强组织领导。为保证系统建设的顺利进行，成立网上审批电子监察领导小组，市委副书记、市长任组长，市委常委、常务副市长和市委常委、副市长任副组长，具有行政许可和内部管理行政审批职能的各部门主要负责人为成员；领导小组下设办公室，市委常委、副市长兼办公室主任，市监察局、市信息化工作办公室、市政府法制办、市编委办、市行政服务管理委等部门主要负责人任办公室副主任；办公室下设综合协调组、软件开发组、审批项目流程梳理组，分别由市监察局、市信息化工作办公室、市政府法制办主要负责人兼组长，具体负责网上审批电子监察系统建设的实施。各行政审批职能部门应成立以部门主要负责人为组长的网上审批工作组，做好本部门行政审批事项网上操持的实施工作。
㈡提高思想认识。各行政审批职能部门要充分认识建设网上审批电子监察系统的重要性，将其列入重要的议事日程，主要领导亲自抓，明确分管领导具体抓，并安排专职工作人员，配合做好相关工作。各行政审批职能部门要制定好实施计划，按方法分阶段扎实推进。目前尚未接入市政务信息网和未建设本部门政务门户网站的有关单位，要尽快按要求做好“入网建站”工作，确保网上审批电子监察系统的顺利实施。
网上审批范文2
一、在审批过程中明确审批事项、加强审批监管，清理审批事项。严格按照省交通厅业务全部录入《省交通运政系统》规定的网上审批程序和流程，对国家已经废止的项目坚决清除；对依法可以保留的审批项目，最大限度地规范细化标准，严格限制自由裁量权；对认定适用的审批项目，逐项予以编码，实行审批项目“编制化”动态管理。目前，梳理、审查工作已完成，已通过省交通厅的审核。
二、加大业务进驻。2012年8月设立了区行政服务大厅。交通运输局行政服务科正式迁至行政服务中心，所有维修业户的经营许可的审批年审、驾培和租赁业务经营许可的审批和年审、营运车辆业户经营许可的审批、营运证件的办理、年度审验、车辆定期维护签章及超期处罚等等业务实现了“一站式”服务。还在外网、电子显示屏、触摸屏增添了新内容，印制了窗口服务指南、便民联系卡，建立了固定的公开栏和网上公开栏目；办件过程中，对审批程序、收费标准进行了严格设定和公示，通过承诺件办件通知书，实现了审批项目在办理前、办理中和办理后的公开公平公正。
三、严格督查管理，树立严谨作风。修订完善制度，强化廉政意识，强化规范运作，开展创先争优。能热心、热情地接待每一名服务对象，做到来有迎声、问有答声、走有送声，着力塑造四个形象，即：和谐可亲的形象、务实高效的形象、规范行政的形象、勇争一流的形象。在办件中做到主动热情、耐心周到、解释全面、百问不厌，让所有客户高兴而来、满意而归；在服务对象提出意见、建议和批评时，始终保持欢迎、谦虚、诚恳的态度，耐心听讲，不争辩，做到有则改之、无则加勉；当服务对象出现误解、出言不逊时，不争吵、不斗气，及时做好政策的宣传解释工作，始终保持文明窗口的良好形象。
网上审批范文3
关键词：电子政务； 流程建模； 模型验证； PI演算； 进程
0引言
近年来，世界各国在提倡和推进信息化战略中都把电子政务作为首要任务。推进政府部门办公自动化、网络化、电子化已是大势所趋。国内各级政府都在大力推进信息化建设。政府的组织形态也正由职能型向服务型转变[1]；政府的行政业务正由传统的方式向信息化方向转变。中国政府的电子政务经过前期的投资建设已经具备了一定的硬件设施和软件环境。但是政府各部门之间联合审批事项数据始终不能共享，这使得数据共享和协同工作成为我国电子政务发展过程中要解决的关键问题。行政许可法的颁布给基于业务流程为核心驱动的跨部门联合行政审批带来了挑战和契机，跨组织、跨部门、跨区域的网上关联审批成为了目前研究的热点和难点。
网上并联审批是应用Web技术，把分布在不同部门、不同区域的已有、将有的政府信息资源迅速整合成为一种没有（或很少有）时间和空间的制约，以信息通信手段实现政府跨部门协作和统一审批的信息系统。要实施网上并联审批系统第一步工作是根据应用要求设计业务流程，也称为流程建模。要完成网上并联审批的电子化和网络化，准确地构建电子政府的业务模型是十分关键的一步。流程建模合理与否决定政务项目的成败。
前期用于政府业务建模的技术有工作流图、UML[2]、Petri网、BPMS等。UML是面向对象开发中的一种通用而又统一的图形化模型语言。UML建模形式简单易懂，但缺乏形式化语义基础，模型检测性差。工作流技术(workflow)早期主要用于描述工业及办公自动化，对工作过程约束条性太强，灵活性较差，较适用于一些相关规范、稳定不变的业务流程。即使工作流管理联盟全新定义了工作流[3，4]，但是大规模过程操作中隐含着错误[5]。Petri 网技术具于丰富的语义定义、坚实的数学理论和直观的图形化界面，是目前构建工作流模型较为理想的建模方法[6，7]。但对于复杂系统的流程模型描述有一定的局限性[8]。BPM[9，10]被Smith、Fingar称为业务流程管理的第三次浪潮。它是一种以规范化的构造端到端，以持续提高组织业务绩效为目的的卓越业务流程管理方法。BPM的关键是将业务流程计算机模型化、标准化，将业务流程与业务应用相分离。BPM的技术实现被称为业务流程管理系统(BPMS)。BPMS[11]的技术基础是工作流管理系统(WfMS)、企业应用集成(EAI)、电子商务等。BPMS的理论基础是进程代数PI演算[12~15]。PI演算比传统工作流模型更加灵活、理论性更强，能描述复杂系统，支持结构变化的动态系统，提供安全控制，支持信息的异步并发性，将计算机的计算和通信两种基本功能进行统一，从而能协调分布式业务流程。
本文首次引入进程代数PI演算理论到电子政务建模中，对复杂的、动态变化的、并发运行的网上并联审批系统进行了形式化建模，并对所建模型的合理性、可行性进行了分析验证；确保了模型的正确性，避免了模型实施过程发现错误的修改周期长、代价大等缺陷，确保了政府部门项目的成功率，极大地降低了政府项目投资风险。
用死锁检验命令deadlocks检验流程P是否有死锁。结果是没有死锁。用交互模拟step命令运行流程P。结果是流程P的每一步运行过程，如申办人与工商系统的通道是什么及通道上的信息是什么等。这有利于分析、检查整个流程的每一步交互是否按设计过程在运行，等等。
在应用PI演算理论对网上并联审批业务流程所建模型验证及推理过程、跟踪分析、检验业务流程中，发现了描述过程中不合理部分，修正后使模型更具有合理性、实用性，确保了项目的可行性，从而避免了模型实施后错误修改周期长、代价大等缺陷，极大地降低了政府项目投资风险，提高了项目的成功率。
4结束语
政府网上并联审批业务流程系统是电子政务研究的热点方向。本文首次把PI演算理论引入到电子政府中来，为政府业务系统长远建设发展作了初步的探索。PI演算对政府网上并联审批业务流程的信息交互进行了精确的抽象描述，并对整个业务流程进行了验证，政府投资的风险大大降低了。它为政府跨部门、跨区域信息交互提供了新的思路和方法。
下一步工作中，以PI演算为理论基础开发业务流程图形化管理软件，将实现图形化描述与进程代数验证自动双向转换。应用PI演算等互模、强互模、弱互模、观察互模等理论，近一步分析及优化业务流程，从而推动电子政务的发展。
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网上审批范文4
关键词：电子政务；网上交互审批；异构数据转换；工作流控制
中图分类号：TP302文献标识码：A文章编号：1009-3044(2012) 05-1078-04
The Design and Implementation of Online Interact Approval System in E-government
QIAN Fang
(Huaian College of Information Technology, Huaian 223003, China)
Abstract: Online Interactive Approval System in E-government was designed and implemented using the Technique of information inter? action of heterogeneous data sources and workflow technology. XML is applied in this system to accomplish the data unification and stan? dardization. The Web Service and message delivery technology are used to exchange data in the isomerization application systems. With the workflow engine, a centralized dispatch and control can be done. By analyzing some inner relations in the approval process, the approv? al flow control can be achieved within the approval center and each department system using the flow control mechanism. The flow con? trol can also be achieved within the unified approval platform.
Key words: E-government; online interactive approval; interaction of heterogeneous data; workflow control
随着信息技术、网络技术的发展，电子政务对传统办公方式和政务处理提出了新的思路。政府各部门间以及政府与社会各界之间可经由各种电子化渠道进行相互沟通，并可以依据市民的需求，提供跨地域的全天候的各种形式的服务。为了实现政务公开、简化审批手续、提高办事效率，本文利用异构数据交换技术和工作流技术，设计和实现了一个电子政务平台中的网上交互审批系统。此系统不仅能够使部门的审批流程更加便捷，同时还能实现多部门的协同审批。
1关键技术
1.1异构信息的交换方式
网上交互审批系统的很多业务需要多部门的协同作业，需要在多部门之间交换数据信息。由于历史原因，各个单位采用了不同的操作系统(Windows、UNIX、Solaris等)，数据库也不尽相同，如有Oracle、SQL Server、Sybase等，硬件平台呈现大型机、小型机、微机等并存。同时他们对一些数据文件的存放格式也不一样，如对空间数据的存放就含有矢量、栅格等格式。全市各个部门、单位之间成了由若干地理上分布、管理上自治、模式上异构的多种不同数据库和超文档资源组成的异构资源体。
本课题的电子政务平台将采用JAVA、EJB、SERVLET、JSP等技术实现跨平台操作，利用XML技术实现数据格式的统一和标准化，利用Web Service技术和消息传递实现跨平台异构系统的信息交换。本课题利用XML技术来实现数据格式的统一和标准化，模型采用以下四层结构模式：
表示层：采用Web浏览器作为用户交互界面,接受用户的信息请求并返回请求结果。
WWW服务器：实现信息的、交互和处理的功能。
信息处理层：它是整个平台体系结构的核心。信息处理层对外部信息分为两个层次进行处理，即中心机房和分机房。中心机房实现用户的身份、权限认证；根据元数据字典对外部请求信息进行分解，定位请求信息分别对应于各个分机房的具体物理位置。分机房可以是某个局，也可以是由若干个比较小部门组成，它将从中心机房传过来的信息转换成XML文档，通过XML转换器实现XML文档与数据库之间的交互，分机房中不同的XML文档也可以互相传递信息，各分中心的XML文档可以通过XML合成器合成为一个XML文档，从而实现各个局数据库系统之间异构文件、数据信息的交互和共享。XML文档经过语法分析、处理、协同XSL，通过 Web服务器，便把结果信息返回给客户。在整个信息处理过程中，利用XML转换器来实现异构信息的交互和共享为信息处理层最为核心的部分。
数据库层：分布有全市各个局的数据库系统，实现数据库访问的物理操作。
图1基于XML的异构信息交换模型结构
1.2工作流控制
行政审批工作其本质就是流程化的事务处理，因此借助工作流引擎实现集中的调度和控制是顺理成章的。工作流引擎提供了强大的功能，支持通过数据的变化而自动触发流程，可对外提供流程中间环节的各项相关数据。网上交互审批系统将从具体的审批业务流程出发，分析审批业务中的部门、操作、数据及其之间的关系，结合目前审批中心的业务情况和信息化建设情况，利用符合BPEL的流控制机制来实现审批中心系统内部或部门系统内部的审批流程控制，同时实现全市统一审批平台范围内的大流程控制。
网上交互审批系统的核心是流程化的事务处理，针对目前的审批大厅与审批业务部门实际的系统情况，将采用两级工作流引擎来事项流程调度。网上交互审批系统借助工作流引擎来实现集中的调度和控制。工作流引擎提供了强大的功能，支持通过数据的变化而自动触发流程，可对外提供流程中间环节的各项相关数据，如处理状态、时间、处理人、审批意见等。
网上交互审批系统采用两级工作流引擎实现一体化的流程控制，如图2所示。
图2网上交换审批系统的两级工作流定义及流程控制
2网上交互审批系统的设计与实现
网上审批服务系统应与行政审批服务中心和办理审批单位建立协同办理机制，支持联合审批。系统的总体功能层次结构如图3所示。
网上审批服务系统大致分为四个层次，分别为表现层、综合应用层、业务协同与信息交互层、部门应用层。实现审批业务的后台维护、审批业务的网上查询与提交、审批业务处理、网上报表、问卷调查管理以及自动回复等功能。
表现层、综合应用层、业务协同与信息交互层等三个层次分别对应统一交互界面、审批业务平台和审批支撑平台，部门应用层为各部门内部的审批应用系统，包括垂直单位（如工商局、国税局、地税局等）的审批系统。安全管理与系统管理则贯穿各个环节。
图3网上交互审批系统功能层次结构图
2.1统一交互界面
统一交互界面是审批申请者与一体化行政审批系统交互的通道，审批申请者可以查看审批事项与审批流程、提交审批申请和材料、获取审批结果反馈、提出建议或投诉等。统一交互平台包括政府网站、行政审批服务中心、呼叫中心和触摸屏等方式，方便企业和公众的使用。
总体功能如下：政务信息；有关政策法规信息；审批业务信息；办理指南与流程说明；各种登记表格的下载；审批事项的网上申报和预审；审批状态与结果网上查询；用户意见箱；用户投诉、评议等功能。
门户网站与各部门网站均能实现链接，由两级网站分工完成各项功能。在网上审批外部系统预审完毕的审批事项信息，通过信息交换，进入网上审批内部系统数据库。网上交互系统包括网上申报、申报、网上办件查询、交流通道、办事指南与咨询、用户注册与认证等模块。
2.2行政审批业务平台
审批业务平台的主要用户是进行审批办理的政府公务人员。网上审批业务平台运行于政府专网上，为政府公务人员提供处理行政审批业务的工作平台，实现审批业务的信息共享、任务调度、协作交互、管理监控等业务功能。该平台包括审批中心业务系统、审批效能监控、网上报表、信息与反馈、网上交互管理系统等部分。
总体功能包括：
行政审批中心的审批业务受理。
在审批中心业务系统上完成相关审批业务，并由审批中心流程控制实现各部门多个审批岗位的审批流转控制。
提供对各种审批事项统一的审批效能在线监督功能。
利用信息与反馈模块实现审批结果的多种方式反馈，包括政府网站、短信回复、邮件通知、呼叫中心反馈等。
对网上查询、用户投诉、网上评议、调查问卷等进行后台管理。
提供审批中心业务系统与银行联网接口，支持交费功能。
提供纸介质材料与电子材料的管理功能，实现实物登记管理。提供统一系统管理和安全认证接口，实现用户管理与权限控制。
2.3审批支撑平台
基于电子政务系统应用支撑平台，构建网上交互审批系统的审批支撑平台，包括审批中心数据库、工作流引擎、审批信息交换、审批系统业务封装等功能。
提供工作流引擎，实现审批流程调度与控制，实现审批中心各成员单位间的流转控制（大流程）。利用工作流引擎和信息交换平台实现审批中心系统与各部门内部审批系统之间的信息交换与流程集成，利用两级工作流机制实现一体化的流程管理。
提供与各部门内部审批系统及垂直单位系统的统一信息交换通道与转换接口。实现部门审批系统封装，支持标准化、规范化的数据交换。
利用信息交换平台实现审批中心业务系统与各部门系统间的审批信息和数据交换。在中心数据库中统一存放各种审批事项的有关信息。
2.4各部门内部审批系统
除了统一的行政审批平台之外，还包括各个独立办公部门局域网上的专用审批系统。这些系统有些已经建立了，有的还需要建立，应结合具体情况通过全市政务专网纳入网上交互审批系统中来。对于已经建立独立审批系统的部门，在构建跨部门审批系统时通过信息交换平台和在其一方设置交换前置机实现互联互通信息。对于尚未建立独立审批系统的部门，应结合具体审批事项或集中建立或基于通用审批系统单独构造其内部的审批系统。
3总结
本课题对网上交互审批系统进行实施，并加以测试，确保系统符合设计要求。本文对系统的审批业务流程及异构信息交换方式进行了详细的分析，这对电子政务建设中重复建设的问题有借鉴作用。相信以后的电子政务平台可以将系统的功能模块抽象提取，形成通用的政务系统平台，并且使行政审批系统能够与其它电子政务系统更加无缝整合。
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网上审批范文5
摘要
目的研究高糖诱导人肾近曲小管上皮细胞凋亡及其调控机制。方法以人肾近曲小管上皮细胞株HK2为研究对象，随机分为对照组、高糖组、甘露醇组。MTT、流式细胞术观察细胞的增殖和凋亡状况；ELISA法检测细胞内Caspase的活性；Westernblot法分析B淋巴细胞瘤2（Bcl2）及Caspase家族蛋白的表达变化。结果与对照组比较，高糖组能抑制HK2细胞的体外增殖，下调抑制凋亡作用的蛋白Bcl2表达，上调促凋亡作用的蛋白Bax、Bak表达（P＜005）；流式细胞术显示HK2细胞周期有明显的变化，且随葡萄糖浓度的升高中期凋亡和末期凋亡所占的比例明显上升（P＜001），并且Caspase酶原降解及活性表达也呈上升趋势（P＜001）。结论高糖能抑制HK2细胞体外增殖并诱导其凋亡，其机制可能是通过Bcl2及Caspase家族调控HK2细胞的凋亡。
关键词
高糖；HK2；凋亡；表达
细胞凋亡是生理性过程，不同于细胞坏死；凋亡细胞能产生吞噬和清除碎片的凋亡小体，避免周围环境中细胞损害，维持内环境稳定［1］。糖尿病肾病（diabeticnephropathy，DN）发病机制复杂，DN早期，肾脏通过细胞凋亡等应急反应来清除过度增殖的内皮细胞，维持内环境稳定；DN晚期，随着肾功能障碍，内环境稳态破坏，细胞凋亡过度，致使肾损害也加剧［2－3］。了解和干预肾小管内皮细胞凋亡有助于延缓DN进展。该研究采用体外培养人肾近曲小管上皮细胞株HK2细胞，分析高糖坏境下HK2细胞的增殖和凋亡状况、B淋巴细胞瘤2（Bcelllymphoma2，Bcl2）及Caspase家族蛋白表达的变化，并进一步探讨这些作用可能的分子调控机制。
1材料与方法
1．1材料低糖（55mmol／L）DMEM（美国Gibico公司）；Dglucose、医用甘露醇（北京国药集团公司）；Gibco原装小牛血清（北京索莱宝科技有限公司）；HK2由中国科学技术大学生命科学院赠送，液氮保存；AnnexinVFITC（安徽碧云天生物试剂公司）；一抗actin、Caspase3、Caspase9、Bcl2、Bax、Bak、Caspase7（美国SantaCruz公司）；MTT（美国Sigma公司）；二抗（美国Pierce公司）。
1．2方法
1．2．1细胞培养和分组液氮取出HK2细胞，37℃水浴解冻，迅速接种于含10％小牛血清低糖DMEM（葡萄糖浓度55mmol／L），37℃、5％CO2饱和湿度的细胞培养箱中。胰酶消化传代，备用。分组：对照组（葡萄糖浓度为55mmol／L）、高糖组（葡萄糖浓度分别为25、40mmol／L）和甘露醇组（葡萄糖浓度55mmol／L＋甘露醇浓度分别为195、345mmol／L）。
1．2．2MTT法检测细胞增殖取生长旺盛的HK2细胞，胰酶消化，按121分组，MTT实验严格按照前期报道［4］操作，实验重复3次。
1．2．3AnnexinVFITC分析细胞凋亡取对数期生长的HK2细胞，胰酶消化传代，制成细胞悬液，取合适的量平均接种于6孔板，次日按121分组，37℃刺激48h，各组胰酶消化制成约1×106个／ml细胞悬液。400μlAnnexinV结合液重悬，加入5μlAnnexinVFITC染色液，2～8℃避光孵育15min。4℃冷冻离心5min（10000r／min），去除上清液，再用400μlAnnexinV结合液重悬，10μl／孔PI染色液，震动器轻轻混匀；锡箔纸包裹置冰上孵育5min，然后上机检测。
1．2．4Caspase蛋白酶原活性检测原理：依据ELISA抗原抗体结合的原理，细胞内活性的Caspase7、Caspase3、Caspase9能在体外与相应的酶结合，催化底物显色反应，通过吸光度（opticaldensity，OD）值OD405来间接反应Caspase7、Caspase3、Caspase9的活性。取对数期生长的HK2细胞，按123步骤操作，分组后置于培养箱连续刺激2d，胰酶消化，冷冻离心5min（10000r／min），按照ELISA法操作，依次加入酶、底物、酶标仪检测，实验重复3次。
1．2．5Westernblot法检测提取总蛋白：按121分组批量培养，刺激48h后，弃去原液并用PBS洗去残留液体，置冰上，每瓶加裂解液150μl充分裂解，细胞刮子收集细胞，低温冷冻离心5min（10000r／min），上清液置于－80℃备用，BCA测定蛋白浓度，每组加入浓缩蛋白上样缓冲液，水浴煮沸，分装备用，置于－20℃保存。配制125％SDSPAGE，微量加样针上样，先用40～50V电泳浓缩胶，100V电泳分离胶，100mA冰浴转膜，伊利脱脂牛奶封闭，PBS洗膜，置于一抗为Bcl2（1∶400），Caspase7（1∶1000），Bak（1∶1000），Bax（1∶300），Caspase3（1∶2000），Caspase9（1∶800），actin（1∶1000），4℃过夜。相应二抗分别为山羊抗小鼠（1∶1500），山羊抗鼠（1∶1500），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗鼠（1∶1000），山羊抗兔（1∶1000），山羊抗小鼠（1∶4000），37℃孵育2h，PBS洗膜3次，暗室内胶片显影、定影，重复实验3次。结果进行统计学分析。Westernblot条带的灰度值用ImagePro45分析软件测定。
1．3统计学处理采用SPSS190软件进行统计学单因素方差分析，数据用珋x±s表示。组间计量资料用方差分析。
2结果
2．1高糖对HK2细胞的体外增殖的影响MTT结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，显示差异有统计学意义（F＝11204，P＜001）。组间两两比较显示，与对照组比较，高糖组（25、40mmol／L）的OD值依次降低，且糖浓度为40mmol／L抑制率达266％（P＜005，P＜001）；而甘露醇组与对照组比较，差异无统计学意义，表明体外高糖能抑制HK2细胞的体外增殖，与高晶体渗透压无关。见表1。
2．2高糖对HK2细胞凋亡的影响结果采用单因素方差分析进行主体间效应检测，差异有统计学意义（F＝8254，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组（99％）比较，高糖组（图1B、1C）中期凋亡与末期凋亡所占的比例明显升高，并且末期凋亡所占的比例随着葡萄糖浓度的升高而升高；从图1D、1E中可以观察到甘露醇对细胞的凋亡影响不明显。提示高糖能诱导HK2细胞凋亡，与高晶体渗透压无关。见图1、表2。
2．3高糖对Caspase蛋白酶原活性的影响单因素方差分析显示高糖能够增强Caspase7、Caspase3、Caspase9活性（F＝7143、5581、7432，P＜001）。组间两两比较显示：与对照组比较，高糖组Caspase7、Caspase3、Caspase9活性呈上升趋势，但甘露醇组活性没有明显变化。见图2。
2．4高糖对Bcl2及Caspase蛋白酶原家族蛋白表达的影响单因素方差分析显示高糖上调Bak、bax、cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达（F＝2741、4754、3722、41772547，P＜001）；下调Bcl2蛋白表达（F＝3314）。组间两两比较显示：与对照组比较，Bcl2家族Bcl2蛋白表达量有所下降，Bak、Bax蛋白表达量显著上升，且Bax／Bcl2的比值也呈上升趋势。另外剪切后的Caspase蛋白酶原家族cleavedCaspase9、cleavedCaspase3、cleavedCaspase7蛋白表达明显增加，见图3。
3讨论
DN是糖尿病重要并发症之一，其基本病理特征主要表现为肾小球细胞外基质聚集与降解紊乱，导致肾小球病态增生、基底膜增厚和动脉硬化等，这些改变严重影响肾小管的营养供应，诱发上皮细胞程序性凋亡，从而导致肾间质纤维化［5］。国外相关报道［6］证实终末期肾病肾小球损伤多数从肾小球上皮细胞（足细胞）损伤开始；在糖尿病的早期，长期处于高糖环境下的细胞微环境发生改变，导致肾小球超过滤、诱发氧化应激、糖化终产物堆积、蛋白激酶C的激活、多元醇化、转化生长因子的过表达和炎症等，这些因素致使肾小管基底膜增厚，养分供应受阻，引起肾小管上皮细胞萎缩，导致肾衰竭。因此干预肾小管上皮细胞凋亡，维持上皮细胞活性，能有效的减缓肾脏的衰竭［5］。体内长期高血糖容易导致上皮、内皮细胞损伤和功能障碍，从而诱发多种疾病，如2型糖尿病等；因此，控制血糖，并通过调节细胞增殖和凋亡修复损伤的细胞有重要的临床意义［7－8］。本研究模拟体内高糖环境，选取稳定性较好的人肾近曲小管上皮细胞株HK2进行体外培养。作为维持近曲小管功能的上皮细胞，HK2细胞的功能障碍在DN的发生发展中扮演着重要角色。实验表明高糖刺激48h后HK2细胞的增殖抑制，且出现细胞凋亡现象。
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[关键词] 游离脂肪酸;近端肾小管上皮细胞;一氧化氮;凋亡;caspase-3
[中图分类号] R329.2+5[文献标识码] A[文章编号] 1673-9701(2010)12-06-03
Free Fatty Acid-induced Apoptosis of Renal Tubular Epithelial Cells:An Experimental Study
LI Yuan1LIU Xiaoling2LI Rongshan2BAI Bo2HAN Le1
1. Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China;2. The Second Affiliated Hospital of Shanxi Medical University,Taiyuan 030001,China
[Abstract] Objective To observe the effect and mechanism of free fatty acid(FFAs)on apoptosis of proximal renal tubular epithelial cells. Methods Rat renal tubular epithelial cells(NRK-52E) were cultured with DMEM-F12 at different concentrations of palmitic acid(0,125,250 and 500μM)at 24h and 48h,respectively. The percentage of apoptotic cells was assessed by Tunel and Nitrate reduction test was used to measure NO content of the medium. Caspase-3 expression was detected by immunocytochemistry method at 48h. Results As the palmitic acid concentration increased and the reactive time prolonged,the apoptosis rate of NRK-52E cells was gradually increased, at 24 h the apoptosis rates of the three palmitic acid groups at the concentrations of palmitic acid from low to high were(9.7±1.9)%, (14.2±4.5)% and (23.4±5.3)%, at 48h(16.2±3.7)%,(24.8±4.4)%,(35.4±5.7)% and they were significantly different from the apoptosis rate of the control group(P
[Key words] Free fatty acid;Proximal renal tubular epithelial cells;NO;Apoptosis;Caspase-3
糖尿病肾病(diabetic nephropathy,DN)是高发的糖尿病慢性并发症,糖尿病终末期肾病占到所有终末期肾病的30%以上,细胞凋亡在肾脏疾病的发生、发展过程中发挥着极其重要的作用。2型糖尿病常伴血脂代谢紊乱,血清游离脂肪酸浓度随着血糖的异常发生改变,伴随空腹血糖水平的升高而升高[1]。FFA异常增多可诱导多种细胞凋亡,本实验正是观察不同浓度的软脂酸对大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)凋亡及凋亡信号蛋白caspase-3的影响,探讨FFAs导致肾小管上皮细胞凋亡的机制。
1材料和方法
1.1材料
大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)由中山大学余学清教授惠赠,软脂酸、EMDE-F12培养基购于Gibco公司,新生胎牛血清购于杭州四季青生物公司;去脂牛血清白蛋白(d-BSA);NO检测试剂盒购自南京建成公司,凋亡试剂盒、DAB显色剂、caspase-3多克隆抗体(浓度为1∶150)及生物素化羊抗兔IgG及均购自博士德公司。
1.2方法
1.2.1细胞培养采用含10%胎牛血清的DMEM-F12为NRK-52E细胞的培养液,在含5%CO2浓度37℃恒温培养箱内孵育,细胞传至第四代处于生长对数期时进行下述实验,每个实验重复3次。
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1.2.2分组方法实验共设立五组(1)软脂酸干预组设三组:以去脂牛血清白蛋白(d-BSA)为溶解软脂酸的载体,以加入培养液中软脂酸浓度的不同分为125μmol/L、250μmol/L、500μmol/L,(各组载体d-BSA含量为0.125%、0.25%、0.5%);(2)对照组设两组:①正常培养液组②0.5%d-BSA+正常培养液组。
1.2.3硝酸还原酶法分别测定NO常规消化、收集NRK-52E细胞,按每孔1×105接种于6孔培养板内,置37℃、5%CO2培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞,加入不同浓度软脂酸继续培养,在0h、24h、48h时收集细胞培养液各100μL,-20℃储存用硝酸还原酶法测定各组NO含量。
1.2.4原位末端标记(TUNEL法)检测细胞凋亡水平按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,分别在24h、48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,按照tunel凋亡检测说明书操作。再用苏木素轻度复染正常细胞,凋亡的细胞胞质浓缩、胞核固缩呈黄色,正常细胞形态正常胞核呈蓝色。从而可以在显微镜下观察到着色的凋亡细胞。在400倍倒置显微镜下计数,凋亡率=凋亡细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。
1.2.5免疫细胞化学法检测caspase-3按每孔1×105接种于放有盖玻片的6孔培养板内,置37℃、5%CO2孵箱细胞爬片培养24h,换无血清培养液培养24h同步化细胞后,加入不同浓度软脂酸继续培养,在48h进行实验:先用PBS洗涤2次,加入4%多聚甲醛室温下固定30min,PBS洗2次,蒸馏水洗3次,3%H2O2处理5min,蒸馏水洗3次,5%BSA封闭20min,甩去不洗加一抗4℃湿盒过夜,PBS洗3次,加二抗(生物素化羊抗兔IgG)37℃反应20min,PBS洗3次,加SABC37℃反应20min,PBS洗4次,DAB显色10~20min,苏木素轻度复染,蒸馏水洗。风干、封片。400倍倒置显微镜观察:细胞胞质成棕黄色者为阳性细胞。caspase-3表达率=阳性细胞数/400倍视野中细胞总数×100%,每张片随机取9个视野,每个实验组观察5张片。
2统计学处理
采用SPSS13.0统计软件,实验数据以均数±标准差(χ±s)表示,多个样本均数间两两比较采用单因素方差分析和q检验,两样本均数间比较行t检验。
3结果
3.1一氧化氮测定
见表1。表1显示,正常培养液组和d-BSA组培养液中NO浓度无明显升高,各软脂酸处理组在第24小时、48小时NO均明显增高,其中各软脂酸处理组与0h组相比,在第48小时表现出显著统计学差异(P
3.2TUNEL原位凋亡检测
见表2。表2显示,NRK-52E细胞在正常培养液组、d-BSA组培养,在24h、48h两个时段都有少量凋亡细胞,两对照组之间无统计学差异(P>0.05)。各软脂酸处理组细胞凋亡率明显增高,与正常培养液组和d-BSA组比较,差异均有统计学意义(P
3.3细胞免疫化学法检测
见图1。图1显示,NRK-52E细胞在正常培养液组、d-BSA组培养,48h都有少量细胞caspase-3表达,两对照组之间无统计学差异(P>0.05)。各软脂酸处理组细胞caspase-3表达率明显增高,且具有浓度依赖趋势,和48h时的细胞凋亡率基本一致,与正常培养液组和d-BSA组比较,差异均有统计学意义(P
4讨论
随着现代生活水平的提高、生活方式的改变,肥胖、高血压、高血脂、高血糖为特征的代谢综合征患病率逐年上升。脂质代谢的异常存在于上述各类疾病中[2],但以往对血脂的研究重点主要集中在心血管的损伤作用上,近年有学者报道,蛋白尿的肾毒性可能是由结合在蛋白上的脂质介导,其中游离脂肪酸(FFAs)起重要的作用[3,4]。游离脂肪酸(free fatty acids,FFAs)是指非酯化的脂肪酸(nonesterified fatty acid,NFFA),是脂肪代谢的中间产物,在血中与白蛋白结合运输,可随尿白蛋白经过肾小管,为FFAs导致肾小管细胞损害提供了基础。正常肾小管上皮细胞具有旺盛的代谢活性和修复能力,并能分泌多种细胞因子,在病理状态下,也容易发生结构、功能的损伤。莫湛宇等人发现,FFAs有促进肾小管表型转化肾小管间质纤维的作用[5]。FFA的长期作用还可诱导多种细胞凋亡,包括胰岛β细胞、血管内皮细胞、卵巢颗粒细胞[6]和Leydig细胞[7]等。
我们采用体外干预的方法,以白蛋白为载体用含不同浓度软脂酸的培养液培养大鼠近端肾小管上皮细胞(NRK-52E)发现在软脂酸浓度增高和干预时间的延长时,细胞凋亡率增加,在48h测得各软脂酸干预组细胞中caspase-3阳性表达率与细胞凋亡率基本一致,而凋亡率增高组培养液中NRK-52E细胞NO的分泌量也显著增加。而d-BSA组和正常培养液组相比在对NRK-52E细胞的凋亡作用上没有差别,排除了作为FFA载体的小剂量白蛋白(
综上所述,游离脂肪酸对肾小管上皮细胞脂性凋亡作用与其自身在FFAs作用下产生大量NO有关,caspase-3作为重要的效应因子在肾小管上皮细胞凋亡过程中起重要作用。
[参考文献]
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