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免疫组化染色范文1
【摘要】脑组织石蜡切片的染色结果，易出现切片染色不清楚，脱片、假阳性，假阴性出现。免疫组化这些结果的出现，与组织固定，抗原修复，内源性过氧化物酶活性的灭活，抗体质量，显色试剂质量，苏木素质量，时间上的把握及技术人员熟练程度有关，得出了免疫组化的过程的很多细节及各个步骤的主要的注意事项，提高脑组织切片的免疫组化染色操作技术。
【关键词】脑组织；石蜡切片；免疫组化；染色
随着免疫组化技术广泛应用于科学和医学各个领域的研究和诊断中，免疫组化的技术已经成为一种基本的检测技术，如何提高免疫组化的技术，特别是脑组织切片在免疫组化中的检测，是每一个科研人员在检测中最关心的问题，现将近几个月大鼠脑组织切片的免疫组化技术的一些体会和细节概况如下：
1 脑组织固定体会
用4%的多聚甲醛固定，固定之前要保持脑组织的平整和完整，不能被挤压，以免影响细胞的形态，影响电镜下观察。
2 脑组织防脱片的处理
（1）传统的防脱片的处理方法有延长烤片的时间、提高烤片的温度和重新脱水［2］。免疫组化前，切片在58-60℃的恒温箱中烤2-24 h［1］，在脱蜡和脱水过程中，把切片稍晾干后再行下一步的免疫组化过程。但不能进行高温烤片，在干燥的条件下加热切片可以加速组织中抗原的氧化而破坏组织中的抗原［2］。
（2）玻片进行化学试剂处理玻片为充分洗净干燥的磨砂防脱载玻片。可以选用免疫组织化学染色中常用防脱片剂即多聚-L-赖氨酸(Poly-LLysine)对载玻片进行处理，处理后载玻片不易脱片。
3 抗原修复
（1）少数抗体可以选择酶消化法.如原位末端标记法（TUNEL）试剂盒中以蛋白酶K为消化酶，在这过程中，注意蛋白酶K的浓度不能过高，过程中不能超过10 min，以免修复太过出现假阴性，且BPS洗涤要彻底。
（2）热修复注意事项。
高压加柠檬酸盐(pH6. 0)缓冲液修复，时间为5分钟，冷却后连续修复2次。水浴锅修复时水温为95℃，修复时间为15～60 min。须等缓冲液冷却至室温,才能把切片取出，取切片时防烫伤。
4内源性过氧化物酶活性的灭活
3%H2O2孵育时间一般8～10 min，时间过长易造成结果假阴性的出现。用BPS充分冲洗三次每次3 min，注意保证BPS的PH值在7.2～7.6。
5 滴加抗体和孵育时间
（1）试剂储存时间过长会影响抗体的有效价,所以试验前检查试剂是否在有效期内,并及时调整储存。一般抗体储存在-20℃的冰箱内，一抗是即配即用，根据说明书上一抗的浓度比例做预示实验，一般是1:50,1:100,1:150，1:200进行对比，然后按最佳效果的比例进行正式试验。
（2）滴加一抗二抗时,须用滤纸将切片周围和多余的BPS液体拭净,以防残留液体稀释工作液,出现不必要的假阴性。为了避免试验的误差，降低试剂的耗损，先离心积液再取用抗体，移液需精准。滴加抗体时须悬空滴加，不能触到脑组织，以免造成脑组织损伤。工作液须完全覆盖住脑组织，如若液体分布不均匀，可轻微晃动玻片或用移液枪头的外侧面但不接触脑组织撑开液面。
（3）不同的试剂的抗体孵育时间不同。在37℃恒温箱中孵育时，一抗的孵育的时间一般是2.5h，二抗为30min，二抗的时间随一抗的延长而延长。湿盒孵育可以在4℃冰箱过夜,孵育出的切片阳性率高。
6设置阳性对照片和阴性对照片
阴性对照和阳性对照需同时进行，但阴性对照组须与阳性对照组在操作上，所有步骤都应独立，独自漂洗，独自孵育，防止受抗体污染而出现阳性结果。
7显色试剂配制和时间
DAB显色剂应现用现配,注意颜色是否正常，新鲜配制的显色液为淡棕色，颜色过深，则不用。显色不宜超过10 min,一般是2-3min，否则易出现背景深染，或先在低倍镜下观察显色的程度，控制显色的程度，染色充分后立即终止。
8复染注意事项
（1）注意苏木素配置的时间，是长期还是短期的，观察其色泽，气味，注意苏木素配置的方法不同，其效用也不同，不全是存储越久，染色的质量越好。
（2）苏木素复染需2min,复染只需苏木素浅淡的染色,若过深的苏木素染色有可能覆盖已有的阳性染色。500ml苏木素染液染800-1000张玻片后需更新换液，保证染色质量［3］。每次染色之前应将染液通过滤纸过滤，保持染液干净，防苏木素中的过氧化物沉淀在玻片上影响美观。
（3）封片时宜湿封，防切片细胞龟裂，收缩或黑色结晶样小点，滴树胶不能过稠或稀，稠了会使树胶外溢，易粘在切片上影响美观，稀了封片产生气泡，这些均不利于镜下观察。
免疫组化的过程，看上是一个简单的过程，在这个过程中，每一个过程都是都是很重要的步骤，一步不慎，皆会影响到实验的结果。因此需要操作者每一步都要做到细致规范，熟练免疫组化的每一个步骤，每一个过程中的不同的方法及效果，通过反复的比较对照掌握免疫组化的过程中的方法和时间的把握，且按上面步骤注意操作后，能做出背景清晰，不脱片，易于镜下观察的脑组织切片。
文献摘要
［1］张惠球,刘奕生.免疫组织化学染色质量的影响因素［J］中国误诊学杂志,2006,6(3),571-572.
［2］王小亚,杨清海. 免疫组织化学标准化(一) ［J］. 诊断病理学杂志, 2001 (1) : 801.
免疫组化染色范文2
[关键词] BrdU；免疫组织化学染色；胰酶抑制剂；牛血清白蛋白；漂片法
[中图分类号] R392-33 [文献标识码] A [文章编号] 1673-7210（2012）02（b）-0016-03
Improvement in technique of BrdU immunohistochemical staining by bleach section
GUO Jingjing1 SHAN Lidong2 WU Gang3
1.Department of General Surgery, Huashan Hospital Baoshan Branch of Fudan University, Shanghai 200431, China;
2.Department of Neurobiology and Medical Psychology, School of Preclinical Medicine and Biological Sciences,Medical School of Suzhou University, Jiangsu Province, Suzhou 215123, China;3.Department of General Surgery, Huashan Hospital Affiliated to Fudan University, Shanghai 200040, China
[Abstract] Objective To reduce the tissue slice breakage, explore the technique of 5-bromo-2-deoxyuridine (BrdU) immunohistochemical staining by blocking buffer in bleach section. Methods BrdU, which was detected by ABC immunohistochemistry on bleach section of brain slides, was used to incorporate the new born cells which were promoted proliferation by motor-driven wheel running. The different blocking effects of Goat serum, trypsin inhibitor and bovine serum albumin were compared in the process of immunohistochemistry. Results In the group of motor-driven wheel running in the dentate gyrus of the hippocampus in rats, the number of BrdU-positive cells was more than the control group. The breaking rate of slides was reduced obviously, especially in the groups with bovine serum albumin and trypsin inhibitor, after being added different blocking reagents. But cells in trypsin inhibitor group were appeared without specific staining. Conclusion Bovine serum albumin is preferable blocking buffer.
[Key words] BrdU; Immunohistochemical staining; Trypsin inhibitor; Bovine serum albumin; Bleach section
5-溴-2-脱氧尿嘧啶核苷（5-bromo-2-deoxyuridine, BrdU）是胸腺嘧啶核苷的类似物，在细胞周期的S期掺入到增殖或分裂细胞的核内，只要细胞不消亡，BrdU 将永久地存留在胞核DNA 中，且在体或离体都能通过免疫组织化学的方法检测到，可用于标记BrdU暴露期间进行DNA合成的细胞[1]。故BrdU阳性细胞可被看作是具有增殖活性的细胞。
1 材料与方法
1.1 材料
动物：SD大鼠，雌雄不拘，体重220~230 g，苏州大学实验动物中心提供。试剂：BrdU（ Roche Diagnostic Co.）。
1.2 分组
踏转轮运动对成年大鼠海马齿状回细胞增殖的影响。实验分两组，①踏转轮运动组：转轮速度为10 m/min，每天训练2次（09:00，15:00），每次训练30 min，连续6 d；②对照组：动物置于转轮中，速度为0。放置次数与时间同运动组。在染色过程中每一组又分为三个亚组，分别为加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组。
1.3 BrdU标记
踏转轮运动的第4天开始给药，于每次运动前1 h腹腔注射BrdU（50 mg/kg，美国ROCHE公司），2次/d，连续3 d。末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，进行BrdU染色。
1.4 BrdU免疫组织化学
切片经2 mol/L HCl（室温30 min）变性， 用0.01 mol/L PBS 充分漂洗后转入0.1%胰酶中（37℃ 15 min）消化后，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），分别加入羊血清组、胰酶抑制剂组和牛血清白蛋白组，室温下30 min, 然后加入小鼠抗BrdU单克隆抗体（1∶200，Biosource）室温孵育16 h，0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），转入羊抗小鼠二抗（1∶200，Vector）室温孵育2 h，再用0.01 mol/L PBS漂洗（5 min×3次），移入亲和素生物素试剂（avidin-biotin complex，ABC，1∶200）室温孵育2 h，最后用含0.03% H2O2的0.05% DAB显色3~5 min， 0.01 mol/L PBS终止显色。常规脱水、透明、封片。镜检BrdU阳性细胞计数。
1.5 统计学方法
随机选取每只大鼠位置相同的5张不连续切片，光学显微镜下（×200）计数每张切片双侧海马齿状回颗粒细胞层（granular cell layer，GCL）免疫反应阳性细胞数。阳性细胞的均数作为统计数据，以均数±标准差（x±s）表示。用SPSS 10.0软件作方差分析（one-way ANOVA）检测组间差异性。
2 结果
2.1 踏转轮运动对成年大鼠齿状回细胞增殖的作用
经过6 d的踏转轮运动训练后，各组BrdU阳性细胞见图1。免疫组织化学结果显示，海马齿状回BrdU阳性细胞数，对照组为（22.55±1.91）个/切片，踏转轮组为（57.89±1.90）个/切片，两组相比差异有高度统计学意义（P < 0.001）。由此可见，踏转轮运动可增加BrdU阳性细胞，促进齿状回细胞增殖。
a、a′为对照组， b、b′ 为踏转轮组。a、b分别是a′、b′的高倍视野
图1 踏转轮运动6 d后海马齿状回BrdU阳性细胞数
2.2 不同的封闭液对组织片染色效果的影响
末次给药后24 h处死动物，从前囟后3.3~5.1 mm作连续冰冻切片，将切片随机分成三组。在染色过程中，这三组分别加入羊血清、胰酶抑制剂和牛血清白蛋白作为封闭液和终止胰酶作用的抑制剂。各组BrdU阳性细胞如图2所示。免疫组织化学结果显示，三种方法均能使BrdU着色，但各组的本底颜色和非特异性着色程度不同：羊血清组中虽然阳性细胞与非特异性着色细胞有明显区别，但非特异性着色细胞显色度较深，且遍布整个视野。胰酶抑制剂组阳性细胞与非特异性着色细胞也有明显差异，而且非特异性着色细胞显色度较浅，整个本底相对较为干净、清爽。牛血清白蛋白组几乎见不到非特异性着色细胞，本底颜色非常淡。
除了本底颜色和非特异着色的观察外，笔者还重点观察了组织切片的破损情况。实验结果显示：牛血清白蛋白和胰酶抑制剂组无切片破损，而羊血清组有少部分脑片破损。细胞计数显示：羊血清组为（23.22±2.38）个/切片，胰酶抑制剂组为（22.54±2.12）个/切片，牛血清白蛋白组为（23.14±3.12）个/切片，各组间差异无统计学意义（P > 0.05）。
3 讨论
自从20世纪末神经干细胞发现以来，其目前已经成为神经科学研究的热点之一。而研究在体或移植后的神经干细胞的增殖、迁移、分化中常用的标记新生细胞的方法有BrdU、3H、Ki-67、 PCNA（proliferating cell nuclear antige）[2-3]，前两者在细胞增殖时整合入细胞以后，即使在细胞静止期仍能表达；后两者是细胞增殖过程中表达的内源性蛋白，当细胞处于静止期时，它们并不表达。因此，BrdU和3H是常用的追踪细胞的标记物，而BrdU的检测又较3H更为方便、简单，所以BrdU是最为常用的标记细胞增殖的标记物。
丰富环境对神经发生有影响，而在各种环境因素中，运动对其影响较为显著[4-5]。本课题的前期研究建立了踏转轮运动的模型[6]，并发现运动对神经发生的作用具有强度依赖性，这早于国内外的相关报道[7-8] 。故本课题选用运动作为促进细胞增殖的方法，观察了不同的染色方法对切片及结果的影响。
组织切片BrdU染色时，常用的方法有贴片法和漂片法。漂片法与贴片法相比有一定的优点：前者能使抗体从两侧渗透，更有利于抗体与抗原充分反应，相应的在洗片时，也能使未结合的抗体充分漂洗干净；漂片法比贴片法所使用的抗体数量少，而且必要时抗体还可以回收，重复利用。标本量大时，漂片法比贴片法更省时、省力。但是，用漂片法进行BrdU染色时，由于在加入抗体前要用盐酸和胰酶对脑片进行预处理，经过处理（尤其是胰酶处理）后，进行染色的脑片极易破损，从而导致整个染色过程无法正常完成，或最终所得到的脑片极少。因此，在本实验中针对胰酶的消化作用，笔者分别选用了与二抗同源的羊血清、牛血清的主要成分白蛋白（牛血清白蛋白）及胰酶抑制剂来抑制（或终止）胰酶的消化作用。
羊血清是免疫组织化学中常用的封闭液，但是，在本实验中并未取得预期的成果，虽然羊血清能终止胰酶的消化作用，但并未能有效地封闭非特异性染色。其原因目前仍不清楚，有待进一步研究。胰酶抑制剂（取自火鸡蛋清）组和牛血清白蛋白组非特异性染色较少，尤其是牛血清白蛋白组。其原因可能是二者的成分单一，纯度较高。
[参考文献]
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[4] Praag van H，Kempermann G，Gage FH. Running increases cell proliferation and neurogenesis in themouse dentate gyrus[J]. Nat Neurosci，1999，2（3）：266-270.
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免疫组化染色范文3
【关键词】病理技术；无醛固定液；甲醛固定液
doi：10.3969/j.issn.1004-7484（s）.2014.05.060文章编号：1004-7484（2014）-05-2453-02在病理诊断中传统应用较多的是甲醛固定液，但是甲醛固定液的毒性较大，对人体危害严重。无醛固定液是近年来病理诊断中逐渐应用的新型固定液，其免疫组化染色效果较好，且能保证组织细胞的完整性，是病理诊断中较为理想的固定液。为了探讨无醛固定液在病理技术中的应用价值，本文选择我院临床送检的61例组织标本，分别用甲醛固定液和无醛固定液固定后，对免疫组化染色效果进行对比，报告如下：
1资料和方法
1.1一般资料选择我院2009年――2012年临床送检的组织活体标本61例进行研究，其中11例结肠癌组织，9肺癌组织，13例乳腺癌组织，12例淋巴癌组织，10例卵巢癌组织，6例前列腺癌组织。
1.2方法
1.2.1试剂每种组织分别取2块，组织大小为2×1×0.2cm，将每种组织分别纳入两组中，采用甲醛固定液和GS无醛固定液固定组织。试剂：GS无醛固定液、脱水液、浸蜡液、无苯透明液全部由（哈尔滨格林标本技术开发有效公司）提供。甲醛、二甲苯试剂则由（北京益利精细化学品有限公司）提供。另外，在试验中所需的RPR、HER-2、CAl99、LCA、CD20、CD45RO、EGFR、CK、p53、CAl25等即用型单克隆抗体由（福州迈新生物技术开发有限公司）提供。
1.2.2固定方法①GS无醛固定液固定方法：无醛固定液Ⅰ和无醛固定液Ⅱ分别固定1h和3h，之后用脱水液脱水1h，无苯透明液透明1.5h，浸蜡液1.5h，石蜡包埋，常规切片，切片厚度为5μm。②甲醛固定：采用4%的甲醛液将组织分别固定2h，之后用80%的乙醇脱水1h，无水乙醇脱水1h，二甲苯透明1.5h，浸蜡液1h，石蜡包埋后常规切片，厚度为5μm。
1.2.3免疫组化染色将两种固定液固定的切片各取一张，切片先进行脱蜡，然后用3%的H2O2室温孵育10min，用蒸馏水洗3次，每次3min，用高压锅修复，温度为140℃，时间为2.5min，之后PBS洗3次，每次5min，加抗工作液1滴，在37℃下孵育2h，再次PBS洗3次，每次5min，加入Max VisionTM试剂，37℃下孵育30min，再次PBS洗3次，DAB显色，用蒸馏水冲洗，苏木精复染核1min后，分化返蓝，乙醇脱水，二甲苯透明，用中性树胶封固。根据组织标本进行免疫组化染色。对同一种组织采用不同固定液固定方法得到切片的免疫组化染色效果进行对比。
2结果
经对比，采用传统甲醛固定液固定的一组，液面较浑浊，且组织上浮，而采用GS无醛固定液固定的一组，液面清亮，组织沉底，且变硬、变白，具有较好的连续性；免疫组化染色效果显示，无醛固定液的标本组织细胞抗原性保存较好，背景清晰，且阳性结果定位较准确。
3讨论
在病理诊断中免疫组化染色是非常重要的工具，当前大部分的病理诊断均需要通过免疫组化染色。在以往免疫组化染色过程中，结果不稳定情况经常出现，近年来随着免疫试剂质量的提高和免疫组化染色操作自动化的发展，该状况有了一定改善，但是结果不稳定情况依然存在。对免疫组化染色结果稳定性产生影响的重要方面就是组织的固定质量，该步骤是实验室检测中的最初的一步，也是最关键的一步，通过对病理切片制作质量的影响来影响免疫组化的结果，固定液是该操作中必不可少的，而固定液的质量和性质对切片质量产生影响[1]。
在以往病理组织切片制作过程中应用较多的是甲醛固定液，除了具有较高的毒性之外，它具有较强的渗透性，组织收缩小，固定均匀，廉价以及保存组织结构好的优点，因此在病理诊断中应用较多，但是甲醛固定液也存在较大的缺点：首先其挥发性较强，保存要求高，具有强烈的腐蚀性和刺激性，释放到空气中对环境的污染严重，根据相关的医学研究，人体直接接触甲醛可能会引发湿疹、过敏和皮炎，另外众所周知，甲醛具有致癌性，人长期生活在甲醛环境中，则罹患各种癌症和呼吸道疾病的可能性增高；甲醛的存放要求高，当存放时间够长，则会产生白色沉淀，在标本制作中应用会影响固定效果；甲醛氧化活性较高，容易氧化为甲酸，导致整个溶液呈酸性，固定后标本也变为酸性，在细胞核染色时，对其效果产生影响，同时在固定肝、脾等的陈旧组织时，甲醛容易形成甲醛色素，与含铁血黄色混合，直接影响到病理诊断效果；甲醛固定液用完之后的处理难度较大，需要特殊处理，废液不能直接从下水管道排出，处理成本较高[2]。
鉴于甲醛固定液存在的缺陷，在医学研究中，研究人员在不断寻找甲醛固定液的替代品，我国研究人员经过长期的研究，研制出了GS无醛固定液，该固定液最明显的特点就是环保，除了无色、无刺激性、低挥发性、对环境危害较小之外，还具有如下优点：具有较强的渗透性，有效缩短了切片制作中脱水时间；具有较好的固定、脱水、脱脂、硬化等作用，减少了组织在制作中出现收缩、空泡、核固缩等；除了能保护组织形态学结构之外，还能保证细胞膜的完整性；用无醛固定液制作的标本易于分离，能有效清除脂肪组织，无需过多的清洁；减少了组织中抗原和核酸被破坏；能较为完整的保存RNA和DNA，可清除显示细胞的内部结构，便于进行标本精细化研究；无醛固定液的处理较为简单，以乙醇废液处理方法相似[3]。
在本组研究中，同一标本采用无醛固定液和甲醛固定液，在相同的免疫组化条件下，在免疫组化染色效果中两者基本一致，在部分切片中，无醛固定液组的免疫组化染色效果要优于甲醛固定液组。另外在部分研究中对甲醛固定液和无醛固定液的固定时间进行了研究，当固定时间在30d以内，甲醛固定液与无醛固定液的免疫组化染色效果无差异（p>0.05），但是当固定时间超过60d后，相比于甲醛固定液组，无醛固定液组的免疫组化阳性结果呈现较大的优势（p0.05），说明了无醛固定液固定时间在120d内不会对免疫组化染色效果产生影响，而甲醛固定液则只在60d内不会对免疫组化染色效果产生影响。
综上所述，无醛固定液的免疫组化染色效果与甲醛固定液基本一致，在某些组织中还优于甲醛固定液，同时固定有效时间要长于甲醛固定液，因此在病理检查中可用无醛固定液代替甲醛固定液。
参考文献
[1]潘黎明.环保型无醛固定液与甲醛固定液对免疫组化染色的效果比较[J].现代实用医学，2013，25（5）：583.
免疫组化染色范文4
【关键词】:小鼠组织;免疫组化技术
【中图分类号】R392.33【文献标识码】A【文章编号】1007-8517(2010)06-034-1
医学研究和科研领域经常会应用动物模型来进行研究,以此来探索人类疾病的模拟反应。在过去一个世纪的研究中,小鼠已经成为建立人类疾病的动物模型的最佳实验材料。当科研人员应用小鼠做为研究对象时,往往采用免疫组织化学的方法对小鼠组织进行鉴定和分析。但是由于免疫组化操作的影响因素诸多,免疫组化效果不稳定等因素常常困扰着免疫组化操作者。本文就以上相关问题进行了简单的总结和分析。
1小鼠组织的应用
小鼠经常被用作动物模型进行科学研究,因为现在小鼠的基因改造技术越来越成熟,并且它的生理生化及发育过程类似于人类,基因组也和人类有90%同源,所以小鼠模型可以基本上真实模拟人类的功能活动和反应;小鼠作为遗传学研究材料的另一优势还在于其基因组计划已基本完成[1]。基因组序列的大量信息为研究基因功能及其表达调控、胚胎发育和人类疾病的分子机制提供了条件基础和技术手段。
2免疫组化的原理及优点
免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术,能将形态、代谢和功能密切结合起来。简单地说,用已知的抗原或者抗体去检测待检组织中的抗原或抗体,其结合后经一系列方法的处理,出现呈色反应,这样在光镜下就可以确定组织的来源属性和部位。免疫组化技术还有着以下的优点。(1)特异性强,抗原抗体的结合具有高度特异性;(2)敏感性高。由于ABC发或SP法的出现时抗原抗体的结合更敏感;(3)定位准确,免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位。
3实验中存在的问题及注意事项
3.1组织的预处理
因为小鼠模型都十分珍贵,所以我们在试验中应尽量减少失败的几率。首先,小鼠组织的剥离要迅速,固定要及时,否则很多组织比如脑组织很容易被破坏。其次,固定时间要适当。固定时间以常温下6-12小时为宜。过度固定可能导致组织抗原的损失,影响实验效果[2,3]。最后,组织的脱水时间要适当。拿裸鼠为例,因为其组织比较柔嫩,所以脱水时应该从低浓度乙醇开始,比如50%乙醇梯度开始,并且适当缩短脱水,透明的时间,防止小鼠组织变形,变脆变硬,影响后面的切片和形态观察。
3.2免疫组化实验步骤
免疫组织化学技术是多步骤、多因素决定的实验方法,任何一个环节稍有不慎,都直接影响免疫组化的结果。下面从以下几个方面进行阐述:(1)抗原修复。由于小鼠组织在福尔马林或其他固定液中会引起蛋白内或蛋白间亚甲基桥的桥连,导致许多抗原簇被封闭。所以,需要先进行抗原修复或暴露。试验中应该根据具体组织和抗体选择最佳的修复方法。(2)减少或消除非特异染色。一般小鼠组织中免疫组化的非特异染色较深,常常干扰实验结果的观察。我们应该从以下方面尽量避免:①抗体浓度要适合。试验中通过设计梯度稀释抗体来确定最佳抗体稀释浓度。抗体浓度过高也会产生非特异染色。②PBS洗涤要充分。试验中尽量使用新鲜的PBS,每次的洗涤时间也要严格按照说明书进行。③实验用的封阻血清要确保与一抗同源,封阻时间也要足够。④实验的整个过程中都要确保组织不能干掉。(3)DAB显色:对二甲胺基偶氮苯(DAB)显色的时间也不同程度影响免疫组化的最终效果。最好显微镜下控制显色,所以操作者应具备一定的常用抗体定位的知识,不要显色时间太长,如果无阳性物质,显色时间过长无益,只能使假阳性的机率倍增。
3.3结果的判断和分析
免疫组化染色结果的判断应该是阳性染色强而非特异染色很淡或无,两者形成鲜明的对比,阳性标记物的位置准确(核、质、膜、血管壁或间质等),细胞边界清楚。判断根据:根据阳性细胞的染色强度:(无着色细胞)(一),(+),(+ +),(卅)。免疫组化染色结果还要结合组织形态学判断是真正的阳性染色而非其他着色。另外实验的进行还必须设有对照,比如阳性对照,阴性对照,自身对照等,这对结果的分析很重要。
4总结
总之免疫组化是一项很精确的实验技术。它在小鼠组织研究上的应用有着很重要的科研价值和潜力。近年来,由于检测技术敏感性的不断增强;单克隆抗体的制备;基因库的建立;以及修复抗原性的各种措施、特别是热预处理法的出现与发展,使得免疫组化技术的使用迈出了崭新的一步。虽然该技术也同时存在很多困难,但是只要我们认真操作每一个步骤,一定能做出高质量的小鼠的免疫组化切片并且得到有用的实验结果。
参考文献
[1] 范尔钟,李颖,刘仲燕.免疫组化技术在实验动物组织中的应用体会[J].临床与实验病理学杂志,2005,21(1).
免疫组化染色范文5
【论文摘要】近年来分子生物学技术以及其它高、新技术在病理领域得到广泛的应用，同样作为体育界的基础研究学科运动人体科学的发展已经不能满足简单的宏观的研究，越来越多的医学检验以及病理学实验技术在运动人体科学广泛应用，尤其是组织病理学技术中定位技术，例如免疫组化、原位杂交等。本文就以上三种病理学常用的定位技术的方法进行综述。
1免疫组织化学实验技术
随着免疫组织化学染色技术的广泛应用，病理学研究产生了划时代的飞跃。免疫组织化学是病理学实验中常用的方法，是在蛋白质水平用各种特异性抗体检测细胞内各种抗原物质。根据标记物的不同，免疫组织化学技术可分为免疫荧光细胞化学技术、免疫酶细胞化学技术、免疫铁蛋白技术、免疫金-银细胞化学技术、亲和免疫细胞化学技术、免疫电子显微镜技术等。
1.1免疫组织化学实验步骤免疫组化技术是在组织化学的方法上结合免疫学的理论和技术发展起来的一门新技术。其原理是利用免疫学的核心——抗原体特异性结合的原理，用标记抗体追踪抗原，通过化学反应使标记于结合后的特异性抗体上的显示剂，如酶、金属离子、同位素等显示一定的颜色，并借助显微镜、荧光显微镜、电镜对其颜色进行观察，以达到检测抗原物的目的[1]。
1.2免疫组化技术的优点免疫组化技术的优点：①特异性强，免疫组化中抗体与组织细胞中的抗原的结合是特异的。如白细胞共同抗原（LCA）显示淋巴细胞成分。②敏感性高，而今，由于抗生物素—生物素（ABC）法和链酶素—过氧化物酶连接（SP）法的出现，使抗体的稀释度(代表敏感度)达到了上千、上万，甚至上亿倍，使免疫组化技术更加可靠。③定位准确，由于抗原抗体的结合是特异的，因而免疫组化技术可在组织和细胞内准确定位，对不同抗原在同一组织或细胞中进行定位观察，将形态与功能相结合，对疾病进行深入的研究。
2原位杂交实验技术
原位杂交是将组织化学与分子生物学技术结合来检测合定位核酸的技术。它是用一段已知序列的核苷酸片断来检测细胞内是否存在欲检测物质的DNA或RNA，是比免疫组化更加灵敏而深入一个层次的检验方法。根据所选探针和待测靶序列的不同，核酸原位杂交有DNA-DNA杂交、DNA-RNA杂交、RNA-RNA杂交等。
2.1原位杂交技术的应用原位杂交由于不需要从待测组织中提取核酸，可完好的保存组织、细胞的形态结构，将形态学与基因功能活动的变化相结合进行多层面的研究。主要应用：①细胞特异性mRNA转录的定位可用于基因图谱、基因表达和基因组进化的研究；②感染组织病毒DNA/RNA的检测和定位；③癌基因、抑癌基因及各种功能基因在转录水平的表达及其变化的监测；④基因在染色体上的定位；⑤检测染色体的变化；⑥间期细胞遗传学的研究。
2.2原位杂交技术与免疫组化的比较
2.2.1两者的区别原位杂交与免疫组化染色技术相比较，这两种方法的共同之处均具有定位检测的功能，且均有较高的敏感性和特异性，所不同的是免疫组化染色是用的是抗体，其检测对象是抗原，机制是抗原-抗体的特异性结合，是蛋白质表达水平的检测；原位杂交使用的是探针，遵循碱基互补配对的原则与待测靶序列结合，是DNA或mRNA水平的检测。从实验方法来看，免疫组化染色操作相对简单，成本相对较低，受外界因素的影响相对小；原位杂交技术无论从实验设计上，还是从实际操作上均较免疫组化染色复杂，成本的高低与试剂的种类和来源密切相关。一般而言，直接选用商品化的标记探测和检测试剂盒的实验成本较高；荧光标记探针较非荧光标记探针的成本高，对样本及实验条件的要求较高，也更容易受到外界因素的影响。
2.2.2免疫组化与原位杂交双标技术双标技术是在同一张组织切片上标记两种不同的抗体或同时应用两种不同的检测手段，如免疫组化和原位杂交技术，在不同层次来检测同一细胞上某些物质的表达是否有相关性的一种实验方法。与传统的单项检测相比，双标记具有无可比拟的优越性，可以克服由于切片间各种差异而引起的时间或空间的样本误差。实验方法上先进行原位杂交会减少免疫组化过程中对待测DNA或RNA的破坏或影响，一般目前均推荐先进行原位杂交后进行免疫组化标记[2，3]。具体的操作跟单纯的免疫组化和原位杂交各自的方法一致。需要注意的问题就是：①所用的实验设备必须经DEPC水浸泡或200℃烤箱过夜，操作时须带口罩及手套；②当杂交步骤完成后，切片必须认真浸泡及长时间洗涤至少超过30min。③作免疫组化的各步骤时间均须适当延长，以增加抗原抗体间的结合，杨青春等人研究发现每个步骤均延长2～3倍时间。④免疫组化显色后不需要用苏木精复染，以免遮盖核信号。
参考文献
[1]纪小龙，施作霖.诊断免疫组织化学[M].北京：军事医学科学出版社，1997.5.
免疫组化染色范文6
[关键词] 组织细胞坏死性淋巴结炎；临床病理；免疫表型
[中图分类号] R55 [文献标识码] B [文章编号] 1673-9701（2012）30-0102-02
Clinical and pathological analysis of 35 cases histiocytic necrotizing lymphadenitis
YANG Baojun1，2 LI Wencai3
1.Zhengzhou University Basic Medical College， Zhengzhou 450052，China；2.Department of Pathology，Zhongping Nenghua Medical Group General Hospital，Pingdingshan 467000，China；3.Department of Pathology，First Affiliated Hospital of Zhengzhou University，Zhengzhou 450052，China
[Abstract] Objective To investigate the clinical， pathological characteristics of histiocytic necrotizing lymphadenitis. Methods Retrospective analysis of the clinical data of 35 patients histiocytic necrotizing lymphadenitis. Results The main performance of 35 cases was single or multiple lymphs enlarged node， and persistent fever； the lymph node biopsy showed different degree of coagulative necrosis with various forms of organization cells， lymphocytes， whose immunohistochemical stain reveals many organization cells and T cells， less B cells. Conclusion The histiocytic necrotizing lymphadenitis has not a specific clinical manifestations， the lymph node structure under the microscope is often destroyed，which is commonly coagulative necrosis， and bigger cellular atypia；it is easy to be misdiagnosed for lymphoma、tuberculosis；with careful observation of pathological slide， combining with the history， it can avoid misdiagnosis.
[Key words] Histiocytic necrotizing lymphadenitis；Clinical pathology；Immunotype
组织细胞坏死性淋巴结炎（histiocytic necrotizing lymphadenitis，HNL）是一种特殊类型的非肿瘤性疾病，是一种良性、自限性、全身性疾病。HNL好发于青年女性，近年发病率呈上升趋势，2002年1月～2011年12月我院共诊断组织细胞坏死性淋巴结炎35例，现报道如下。
1 资料与方法
1.1 临床资料
本组病例35例，其中男15例，女20例，年龄14～40岁，平均24.5岁。以颈部淋巴结肿大常见，仅颈部淋巴结肿大有18例，颈部、腋下及腹股沟淋巴结同时肿大9例，仅腹股沟淋巴结肿大8例，淋巴结最大径为0.5～3.0 cm，皮肤无红肿、破溃，边界清楚，无融合、粘连，质地中等，轻度压痛，均有反复发热病史，体温38～40℃，血常规检查示白细胞计数：（2.4～6.5）×109/L，其中22例血白细胞低于正常值，占62.8%。
1.2 方法
本组病例标本采用常规HE染色与免疫组化染色相结合，在光学显微镜下综合观察对比分析得出结论。所选免疫组化抗体为CD68、CD20、CD30、CD15、CD3、CD45RO、CD163、CD1a、S-100、Ki-67。
2结果
35例均为完整淋巴结切除活检，淋巴结包膜完整，质软，切面灰白间灰黄色，其中20例显微镜下可见大小不等、形状不规则的图样的凝固性坏死区域，并可见形态多样的增生组织细胞及淋巴细胞，病变淋巴结内无中性粒细胞浸润（图1）。组织细胞增生并明显吞噬细胞碎片。另12例可见片状增生的组织和少量点状坏死；坏死周围也可见增生的组织细胞（图2），免疫组化显示CD68、CD163阳性细胞较多（图3）。另外3例在常规HE染色下既看不到大片坏死区，也看不到大片的组织细胞增生，组织细胞数量较多，弥漫分布，此时只能依靠免疫组化，CD3和CD45RO显示增生的T细胞较多，而CD20阳性显示滤泡生发中心细胞及少量散在B淋巴细胞，CD30阳性细胞数量较多，强弱不等。Ki-67阳性细胞数较高（图4），可达50%以上。CD15阴性、S-100阴性、CD1a阴性。见表1。
图1 形状不规则的凝固性坏死区域 图2 坏死周围增生的组织细胞
图3 CD68染色 图4 Ki-67染色
表1 HNL常见的组织结构
3 讨论
组织细胞坏死性淋巴结炎又称Kikuchi淋巴结炎，是一种自限性的良性的淋巴结疾病，该病具有以下特点[1]：①学龄期儿童及青年女性好发；②常有反复发热病史（可为高热），热型不规则，一般持续1～2周，有时可达一个月余；③颈部淋巴结肿大最常见，有时伴有腋下、腹股沟淋巴结肿大，也有少部分病例仅表现为腹股沟淋巴结肿大，随发热程度消长，偶有肝脾肿大；④外周血白细胞大多减少；⑤肿大淋巴结活检常可见大小不等、形状不规则的图样的凝固性坏死区域，并可见形态多样的增生组织细胞及淋巴细胞，病变淋巴结内无中性粒细胞浸润，病变可累及整个淋巴结或淋巴结的一部分；⑥免疫组化显示各种形态的组织细胞CD68、CD163阳性，CD1α、S-100阴性，活化的免疫母细胞CD30阳性，CD15阴性；⑦抗生素治疗无效[2]。
因本病的临床表现和实验室检查都缺乏特异性，早期容易误诊为病毒感染，所以明确诊断必须通过淋巴结活检。常见的组织结构有三种形态[3]：①有时可见大片状的组织细胞增生伴有碎片状坏死，坏死周围增生的组织细胞形态多样，同时有增生的免疫母细胞，坏死区内组织细胞吞噬大量的核碎片。所以凝固性坏死与含有大量核碎片的组织细胞增生是本病的特征性病变之一。文献报道此种坏死属于细胞毒淋巴细胞介导细胞凋亡，所以病灶内一般不见或少见炎细胞浸润[4]。以上情况出现的特征性比较明确，不容易造成误诊。但此时应与淋巴结结核、猫抓病等鉴别。淋巴结结核的干酪样坏死呈红染颗粒状，可见中性粒细胞，坏死周围可见郎罕氏巨细胞及增生的类上皮细胞；猫抓病的淋巴结内坏死中央区可见脓肿样的大量中性粒细胞，坏死周围可见大量放射状的上皮样细胞，最重要的是询问病史，有无养宠物或者被猫狗抓伤、咬伤的病史。但有时坏死周围除见到大量组织细胞外，还可见大量增生的T淋巴细胞，这些细胞 CD3、CD45RO（+），而CD20阳性B淋巴细胞较少，且Ki-67增殖期指数很高，有时可高达50%以上，此时极易误诊为恶性淋巴瘤，此时免疫组化CD30、CD20阳性细胞胞膜着色强弱不等可排除淋巴瘤[5]。②有时可见大片状的组织细胞和免疫母细胞增生伴有此少量的坏死，此时应与朗格汉斯组织细胞增生症在淋巴结单器官发生和间变大细胞T细胞淋巴瘤进行免疫组化鉴别，朗格汉斯组织细胞CD1α、S-100阳性。而HNL的组织细胞CD68、CD163阳性，有时除组织细胞外，还可见大量免疫母细胞增生，免疫组化显示，这些转化的免疫母细胞可表达CD30，呈强弱不等阳性，此特点可与间变大细胞T细胞淋巴瘤鉴别[6]。③有时既看不到大片状组织细胞增生，也看不到坏死，此时需与淋巴瘤、朗格汉斯组织细胞增生症等鉴别。
该病临床上容易误诊为细菌性或病毒性淋巴结炎。淋巴结活检为此病确诊的主要手段，有时诊断不清时，多部位的淋巴结活检可帮助诊断。显微镜下组织学形态复杂，除组织细胞增生外，有时还可见大量活化的免疫母细胞增生，当活化的免疫母细胞大量增生时，免疫组化CD30显示这些细胞胞膜及高尔基体着色，但胞膜着色强弱不等，若不仔细观察，此时易误诊为淋巴瘤[7]。所以免疫组化检查非常有必要，但同时免疫组化的判读也同样重要，必须综合分析、仔细观察常规HE染色切片及免疫组化染色切片，同时结合临床病史，才能做出正确的诊断。
[参考文献]
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