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热休克蛋白范文1
关键词:热休克蛋白;结构;功能;针灸;中药
中图分类号:R456 文献标识码:A 文章编号:1673-7717(2010)04-0718-03
Comparison of Different Heat Shock Proteins and Their Relationship with the Chinese Medicine
HUANG Yun,Advisor:LING Yaping
(Department of Acu-moxibustion and Massage,Hunan College of Chinese Medicine,Changsha 410208,Hunan,China)
Abstract:Heat shock protein is a group of highly conserved protein molecules family who has important physiological functions. Physiology, pathology and environmental factors can be induced by heat shock protein production, it is also known as stress proteins. According to molecular size and degree of homology, HSPs can be divided into HSP110, HSP90, HSP70, HSP60, small molecular HSP family of five major. Current,We studied HSP90, HSP70 most, but few on the HSP110. HSPs have much in common, but each HSP family has a unique structure and function. HSPs can protect the body , so try to find a no toxic side effects of HSPs induction agent or method has become an active area of research at home and abroad. Acupuncture and Chinese medicine of Traditional Chinese Medicine can affect the expression of HSPs.We make a review aboutthe structure、function of the HSPs and the relationship with Chinese medicine.
Key words:heat shock protein ; structure; function ; acupuncture Chinese medicine
收稿日期:2009-11-11
基金项目:国家自然科学基金资助项目(30772707 )国家教育部博士点科研基金资助项目(20070541003)
作者简介:黄芸(1984-),女,湖南耒阳人,硕士研究生,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。
通讯作者:林亚平(1956-),女,湖南长沙人,教授,硕士研究生导师,研究方向:经脉脏腑相关机理研究。
热休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)是Ritossa在1962年首先发现的,当时在研究果蝇唾液腺染色体时发现一种在细胞高温应激时能产生对细胞有保护作用而且高度保守的蛋白质[1]。HSPs每个家族针对不同的亚细胞结构都有组成性和诱导性表达,如HSP60和HSP90在哺乳动物中为组成性表达,而HSP70和HSP27在受到高热、氧化应激或抗癌药物刺激时的高表达为诱导性表达。
HSPs的功能[2]主要有 :①维持细胞蛋白自稳。②“分子伴侣”作用。③提高细胞对应激原的耐受性。④参与免疫调节,增强免疫功能。⑤既有直接的神经元保护作用,又可诱导其他保护性机制的产生,直接或间接参与神经元的自身保护。⑥参与细胞周期的调节。
HSPs的分子生物学特性[3]:①生物界的普遍性。自然界所有的原核和真核生物都有HSP。②高度保守性。不同物种有同源性很高的HSP,其中氨基酸序列有50%～90%的一致性, 但不同家族HSPs之间则无明显序列同源性。③非特异性。除热环境以外,其他的物理、化学及生物应激原,如缺血、缺氧、感染、创伤、重金属离子、氧自由基等均可诱导HSPs的产生。④交叉耐受性。是指一种应激刺激诱导细胞产生HSPs后,不仅使细胞对该刺激的耐受性增加,也增加了细胞对其他应激原刺激的耐受性。⑤模拟性。指能以分子模拟宿主自身抗原,兼具迷惑宿主与致病的两重性。⑥双重性。指有自身抗原和特异抗原,能引起抗感染免疫及肿瘤防护,又能诱导多种自身免疫病及感染炎症。
除了上述的共同特点外,各个热休克蛋白家族又有独特的结构、功能及生物学特性。
HSP90:HSP90家族成员主要有HSP90α、HSP90β和gp96(Grp94)。HSP90 在胞浆内主要以同源二聚体的形式存在,每个同源二聚体又由2 个单体构成。HSP90 单体包括3 个主要的结构域:由1个保守的25×103的N 末端结构域和1个55×103的C末端结构域和1个中间结构域[4]。其N端结构域是结合底物蛋白结构域,类似蛋白酶结合底物口袋,C端为寡聚化结构域[5]。HSP90是胞浆蛋白,它通过与靶蛋白的活集团的结合,使其维持所谓“无活性稳态”。HSP90通常可逆性地结合并稳定胞浆中受体分子的活性结合位点,从而避免这些结构与胞浆中的其它生物分子形成聚合体而失活[6]。在抑制细胞凋亡、促进细胞存活上,HSP90主要作用于抑制IκB降解的各个通路上。HSP90能直接与Akt相互作用,抑制它的去磷酸化。磷酸化的Akt能使Bcl-2家族的Bad和caspase-9磷酸化,使它们的活性受到抑制,促进细胞存活。
HSP90作为HSPs 重要成员之一,在肿瘤中研究和应用最多。HSP90在肿瘤细胞中主要处于活化态,而在正常细胞中则主要处于静默态。pp60v2src 是第一个被发现能与HSP90 作用的原癌基因,它能够与HSP90 形成HSP902pp60v2src复合体。P53基因突变是至今已知的与人类癌症相关的最普遍的基因异常, HSP90 也能够和突变型p53 特异性结合,导致突变型p53 复合体的积聚和半衰期的延长[7]。HSP90 还参与肿瘤血管的生长、侵袭及转移。研究表明抑制HSP90 的功能可对肿瘤达到“多点攻击”,达到抑制肿瘤的生长和转移。HSP90抑制剂可以通过特异性抑制HSP90 阻断肿瘤生长转移信号网络通路中的多个靶点,还能逆转肿瘤的耐药性,使肿瘤对化疗药物敏感性增加。HSP90及其抑制剂是目前抗肿瘤研究的热点和前沿[8]。
HSP70:HSP70家族包括GRP75,GRP78,BIP,HSP68,HSP72,HSC70等。根据表达形式的不同可分为结构型和诱导型两种:HSC70固定表达存在于胞液与细胞核中,被称为结构型HSP70;诱导型HSP70(又称为HSP72或HSP70)为高度应激所诱导。通常所指的HSP70即诱导型HSP70[9]。HSP70蛋白由两部分组成,即ATP酶区(AT-Pase domain)和底物识别区或叫多肽结合区(pep-tide-binding domain)[10]。HSP70是膜结构相关蛋白,其生物学作用主要是结合靶蛋白的疏水片断而防止肽链的错误盘绕。在细胞受到环境变化和有害刺激时,细胞的一部分结构和功能蛋白发生变性,在正常状态下处于分子内部的疏水片断暴露“外化”,而形成不稳定的空间结构。HSP70则通过与这些疏水片断的结合而稳定其结构,并通过复杂的分子间相互作用,利用水解ATP的能量,协助变性蛋白的复性[11]。在控制细胞凋亡中,HSP70高表达能抑制caspase的激活、线粒体的损伤和核断裂。可以通过直接或间接地抑制MEK激酶抑制JNK的磷酸化,还可作为天然的抑制蛋白结合到JNK,抑制其活性,从而抑制JNK细胞凋亡通路。
HSP70是HSPs中反应最为敏感研究最多最深入的。在临床上,HSP70与癫痫、心脑缺血、多发性硬化、感染、肿瘤等多种疾病关系密切。在脑血管病和心血管病中对心肌细胞和脑细胞有显著的保护作用,减少细胞缺血坏死范围,修复损伤蛋白质,提高细胞对缺血的耐受性[9,12]。急性脑创伤后在易受损伤区域的神经元HSP70的转录表达,能减少神经细胞凋亡,有助于延迟神经细胞的死亡,与神经保护关系最为密切[13-14]。HSP70可与突变型P53形成稳定复合物,从而使核内P53转移到胞浆中,丧失了控制细胞增殖的能力。HSP70可以激发抗肿瘤细胞的特异性反应,结合细胞内的全部异常肽库,因此HSP70 - 肽疫苗可以是多价的,这有利于防止免疫逃逸从而增强免疫效果,为肿瘤疫苗开发提供了新的思路。
HSP60:真核生物的HSP60主要位于线粒体内(约70～80%),另有小部分位于胞浆。此外, HSP60存在于某些细胞的分泌颗粒中,例如胰岛的β细胞。HSP60是线粒体内最主要的分子伴侣蛋白之一,它与HSP10组成的高分子量聚合物被形容为“巨型呼吸器”,是线粒体基质蛋白折叠和修复系统的关键组成部分。人类HSP60与其分子伴侣HSP10的基因头对头位于2号染色体上,两个基因之间有双向启动子,启动子中则含有热休克元件,接受热休克转录因子的调控[15]。正常条件下,HSP60以稳定状态存在于细胞质和线粒体基质中,维护抗凋亡因子的正常构象和功能;应激条件下,HSP60迅速从胞质中转移到线粒体基质以修复线粒体基质中的变性蛋白,对促凋亡因子产生保护和协同作用[16]。因此,HSP60有抗凋亡和促凋亡的双向调整作用。它的这种抑制或者促进作用可能与细胞种类、所受刺激类型、细胞状态、HSP60含量和活性等多种因素有关。HSP60 是一种T细胞信号,压抑或禁止化学反应,其中Peptide (p277) 是它的一个24个氨基酸片段,首先在非肥胖型糖尿病大鼠体内发现的一种抗原,p277能阻止先天的或适应性T细胞受体对B 细胞的损害,从而对1型糖尿病有治疗作用[17]。
sHSP:小热休克蛋白(small heat shock protein,sHSP)几乎存在于所有生物体中,其主要结构是由N端域和C端域2个部分组成,C端域含有一个相当保守的α晶体蛋白(α-crystallin)结构域,由约90个氨基酸残基组成,与其相邻的是可变的N端域。小热休克蛋白家族成员的共同特点是特殊丝氨酸残基上的磷酸化,磷酸化作用会导致sHSP低聚体状态发生改变,从而使sHSP的生物学功能得以发挥[18]。目前研究最多的sHSP有HSP47和HSP27。 HSP47是内质网内唯一的一种热休克蛋白,它是一种能与多种类型胶原和前胶原特异性结合的内质网驻留蛋白。在胶原合成及纤维化病理过程中发挥重要作用。国外有多项研究证实,抑制HSP47的表达,可抑制胶原合成,减弱纤维化程度[19-20]。HSP27为ATP非依赖性分子伴侣,其功能主要是防止蛋白质聚集. HSP27既可以维持细胞氧化还原稳态又可以维持线粒体的稳定性,结合和稳定肌动蛋白维持肌动蛋白网状系统的完整性,防止凋亡因子如激活的Bid进入线粒体膜。
HSPs与针灸、中药。HSPs对机体具有保护作用,故设法寻找一种没有毒副反应的HSPs诱导剂或方法,诱导HSPs合成,增加机体对细胞的保护过程,已成为国内外研究的活跃领域。中医中的针灸和中药能影响HSPs的表达。在机体受到疾病损伤时,用对机体没有损伤的针灸和中药诱导HSPs的表达,对机体产生保护作用。
祖国医学认为针刺作为一种刺激,作用于腧穴,通过经络系统的传导,调节机体脏腑功能,具有温通经络,消瘀散结,祛散阴寒,益气升陷,回阳救逆及保健强身,预防疾病等作用,已得到国内外医学界的公认[21]。临床上,刺血疗法治疗类风湿性关节炎具有镇痛和泻热作用显著的特点,用三棱针在大鼠患侧“昆仑”穴刺血,这种物理性刺激可以直接刺激机体促进HSP70的产生,增强HSP70表达。HSP70的增高又抑制炎症细胞因子如IL-1、PGE2的转录,使之减少分泌并降低循环中的含量[22]。对心脏手术者取双侧内关、列缺、云门穴位针刺,发现针刺对心肌细胞HSPmRNA基因表达有一定的增强作用,表明针刺对心脏手术者的心肌缺血有一定保护作用。刘志彬等对慢性脊髓损伤大鼠模型使用电针治疗后,通过增加HSP70的表达能量显著降低iNOS的活性,保护脊髓神细胞并减轻继发性脊髓损伤[23]。
艾灸是将艾叶点燃后放置在腧穴或病变部位进行烧灼和熏熨,借其温热刺激及药物作用以防治疾病的一种外治方法。艾灸具有镇痛、改善血循环、调整代谢紊乱、调节免疫功能和调整脏腑功能等作用。《医学入门》说:“虚者灸之使火气以助元气也,实者灸之使实部随火气发散也,寒者灸之使其气复温也,热者灸之引郁热外发”。易受乡等[24-26]对应激性胃溃疡大鼠艾灸“足三里”“梁门”穴。研究结果显示,与艾灸非穴对照点组比较,艾灸足三里、梁门穴组大鼠胃黏膜的HSP70家族的表达均明显增强、MDA含量明显减少胃黏膜损伤程度明显减轻,显著降低了应激性溃疡指数和溃疡面积比,并使应激模型大鼠的死亡率降低。
中药复方或单味药物的提取物能提高HSPs在机体的表达。于泽等[27]用三七五参汤作用与心肌缺血损伤的试验中,Western和免疫组化结果显示三七五参汤组大鼠心肌组织中HSP70的表达较正常组和模型组明显为高,心肌损伤程度明显减轻,说明三七五参汤对缺血心肌的保护作用可能与其诱发HSP70表达有关。涂胜豪等[28]观察雷公藤甲素对胶原诱导的关节炎大鼠的作用。结果发现,雷公藤甲素可以有效地下调模型大鼠关节滑膜和软骨细胞异常表达的HSP60、HSP70和MHC-Ⅰ类分子。在脑缺血再灌注中,分别用补阳还五汤、黄芪、川芎嗪、葛根素、丹参、复方阿魏酸来诱导HSP70,结果显示,虽然这些药物的作用机理不同,但是都使HSP70mRNA及蛋白表达明显增强,对脑缺血损伤有保护作用。补阳还五汤可明显抑制HSP70的转录,而黄芪则除了可明显抑制其转录外,还可轻度降低HSP70的翻译[29]。
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热休克蛋白范文2
[关键词] 宫颈癌;HSP70;免疫组化
[中图分类号] R737.33 [文献标识码]B[文章编号]1673-7210(2010)03(b)-161-02
热休克蛋白(heat shock protein,HSP)是一组进化上高度保守的蛋白质,机体细胞在热休克或受到其他外来刺激时诱导HSP产生,其在许多肿瘤中呈高表达[1-2]。本研究采用免疫组化SP法检测宫颈癌组织中HSP70的表达,从而探讨其与宫颈癌的关系。
1 对象与方法
1.1研究对象
选择2008年1月～2009年1月我院收治的47例宫颈癌患者,均接受手术治疗,留取手术切除标本。术前均未进行放、化疗。同时收集10例正常宫颈组织作为对照组。
1.2试剂
兔抗人HSP70多克隆抗体、SP免疫组化试剂盒及DAB显色剂均购自北京中杉生物技术有限公司。
1.3免疫组化SP法
切片经脱蜡、梯度酒精脱水后,自来水冲洗,蒸馏水冲洗3 min。3%甲醇-H2O2中室温孵育20 min,蒸馏水冲洗冲洗3 min,PBS冲洗5 min×2次。HSP70采用高压热修复。室温冷却,放入PBS内冲洗5 min×2次,用山羊血清封闭,37℃温箱内孵育45 min。滴加兔抗人HSP70抗体(一抗)按1∶100稀释,对照组用PBS,4℃过夜。PBS冲洗5 min×3次,滴加二抗工作液,37℃温箱内孵育30 min,PBS冲洗5 min×3次。滴加三抗工作液,37℃温箱内孵育30 min,PBS冲洗5 min×3次,DAB显色。苏木素复染,常规梯度酒精脱水,中性树胶封片,显微镜下观察。以已知阳性切片作阳性对照,PBS代替一抗作阴性对照。
1.4结果判定
阳性染色为胞质和(或)胞核中出现棕黄色颗粒。每张切片至少观察10个高倍视野,计数阳性细胞与肿瘤细胞的百分比:50%为(+++),(+)～(+++)为阳性。
1.5统计学方法
数据用SPSS 10.0软件进行分析,经确切概率法检验,P
2 结果
2.1 HSP70的表达
47例宫颈癌中HSP70阳性表达率为74.5%(35/47),10例正常宫颈组织中HSP70阳性表达率为20.0%(2/10),经确切概率法检验,差异有高度统计学意义(P
2.2 HSP70与组织分级的关系
47例宫颈癌包括高分化10例,中分化21例,低分化16例,其阳性率见表1。结果显示,宫颈癌分化程度越低,HSP70的表达越强。
表1 宫颈癌HSP70阳性率与组织分级的关系[n(%)]
2.3 HSP70与宫颈癌组织学类型的关系
宫颈癌组织分型及HSP70阳性率见表2。经统计学分析,差异无统计学意义(P>0.05)。
表2 宫颈癌HSP70阳性率与组织学类型的关系[n(%)]
3讨论
HSP广泛存在于原核和真核生物,在生理条件下,HSP呈基础表达,调控细胞的增殖与分化、胚胎的生长发育、激素的功能效应等。HSP能调节蛋白质的折叠、传递与降解,在维持组织细胞的自身稳定和环境适应性方面也有重要作用。在有害因素如热、冷、缺血、低氧、有机毒物、重金属、微生物、组织创伤、基因损伤等的刺激下,均可诱导HSP产生,并保护细胞对抗热休克和其他导致大量蛋白质损伤、变性的有害刺激,防止应激所致的蛋白质损伤,进而启动内源性保护机制,发挥抗损伤的应激保护效应。大量研究显示,表达HSP的肿瘤细胞对热休克、射线(如γ射线)、TNF-α等多种刺激诱导的凋亡有抑制作用。肿瘤细胞HSP70表达水平一般较高,赵霞等[3]用HSP70反义寡聚核苷酸阻断Molt-4等肿瘤细胞的内源性HSP70表达,结果发现,HSP70反义寡聚核苷酸的使用可以诱导肿瘤细胞凋亡,同时抑制肿瘤细胞增殖,提示HSP70的表达有助于肿瘤细胞的生存和增殖。
本研究发现,宫颈癌组织HSP70的阳性表达率为74.5%,正常宫颈组织HSP70的阳性表达率为20.0%,与郭云鸿等[4]的报道一致。本研究结果显示,HSP70的表达与宫颈癌细胞的分化程度和组织类型没有明显的相关性,但可以看出,高、中、低分化各自的阳性率差别很大,细胞分化程度越低,HSP70的表达越强,推测HSP70的表达可能与患者的预后有关,HSP70表达越强,患者预后越差。由此可以推断,HSP70的表达可能与宫颈癌的发生、发展及预后有关,检测其表达水平有望作为估计患者预后的指标之一。
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热休克蛋白范文3
【摘要】 目的 探讨谷氨酰胺（Gln）对缺血再灌注肝脏热休克蛋白70（HSP70）基因表达的影响及其对肝脏的保护作用。方法 雄性Wistar大鼠120只，随机分为3组（n＝40）：假手术组（1组）、生理盐水组（2组）和谷氨酰胺组（3组）。术前3组大鼠连续5天腹腔注射Gln，2组仅给予等量的生理盐水。2、3组采用Pringle's法阻断入肝血流，35 分钟后开放复流，1组仅行麻醉、开腹。分别于阻断前及再灌注后2、4、24小时，取血及肝组织，测定血清谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）、肿瘤坏死因子α（TNFα）及肝组织丙二醛（MDA）的含量，采用RTPCR法检测肝组织HSP70mRNA的表达。结果 再灌注后2、4、24小时，3组MDA、ALT、AST、LDH及TNFα水平与2组相比均显著降低（P
【关键词】 热休克蛋白70；谷氨酰胺；缺血再灌注；肝脏
Abstract： Objective To investigate the influence of Lglutamine on the expression of HSP70mRNA in liver and its protective role against ischemia/reperfusion damage.Methods One hundred and twenty male Wistar rats were pided randomly to three groups(n=40): shamoperation group (group 1)，saline group(group 2) and glutamine group (group 3).Rats in group 2 were pretreated with 4ml 0.9% saline intraperitonally twice per day for 5 days consecutively.In group 3，rats were pretreated with Gln dissolved in 4ml 0.9% saline intraperitoneally twice per day for 5 days consecutively.The rats of groups 2 and 3 underwent total hepatic inflow occlusion for 35min utes through the pringle′s method.Ten rats from each group were randomly chosen and killed before the initiation of occlusion and at 2hours，4hours，24hours after reperfusion respectively.The levels of MDA in liver tissue were measured.The levels of serum TNFα were detected.The serum concentrations of ALT，AST，LDH were assayed on a standard biochemistry autoanalyser.The expression levels of HSP70mRNA in hepatic tissue were assessed by reverse transcription polymerase chain reaction.Results Compared with group 2，the levels of MDA，ALT，AST，LDH and TNFα in group 3 decreased significantly at 2hours，4hours，24hours after reperfusion (P
Key words:HSP70;Lglutamine;ischemia reperfusion;liver
通过启动内源性保护反应来增强肝脏本身的耐受性，是减轻缺血再灌注损伤最理想的方法。热休克蛋白（HSP）是一种细胞自我保护性蛋白，促进HSP表达是启动内源性保护反应的关键所在。目前，对于预防性应用谷氨酰胺（Gln）是否可促进HSP70表达和减轻机体继发性损害报告甚少，且存在着争议［1-3］。其作用机制如何也不明确。因此，本研究拟探讨Gln对缺血再灌注肝脏HSP70基因表达的影响及其作用。
材料与方法
1 实验动物分组及处理
雄性Wistar大鼠120只，体重300～350g ，随机分为3组（n=40）：（1）假手术组（1组）；（2）生理盐水组（2组）：生理盐水4ml，腹腔注射，每天2次，连续5天；（3）谷氨酰胺组（3组）：Gln溶液（300mg/kg，用生理盐水稀释至4ml），腹腔注射，每天2次，连续5天。术前禁食12小时，自由饮水。所有动物均采用戊巴比妥钠（3.5mg/100g）腹腔内注射进行麻醉。沿腹正中切口切开腹腔，显露第1肝门，采用Pringle's法用无创血管夹阻断肝十二指肠韧带，持续35分钟后，撤夹恢复血流。分别于缺血前及再灌注后2、4、24小时每组随机选取10只大鼠，自心脏取血5ml，静置20分钟，4000r/min离心10分钟，分离血清，-30℃保存待测。切取部分肝组织，置于-70℃中保存待测。1组除麻醉、开腹外不做任何处理。血清用于测定谷丙转氨酶（ALT）、谷草转氨酶（AST）、乳酸脱氢酶（LDH）及肿瘤坏死因子α（TNFα），肝组织用于丙二醛（MDA）及HSP70mRNA表达的测定。
2 主要试剂
LGln(上海康达氨基酸厂)；MDA及总蛋白定量试剂（双缩脲）（南京建成生物研究所），试剂配置序号参照说明书；TNFα采用夹心法ELISA检测试剂盒(上海森雄科技实业有限公司)测定；大鼠HSP70引物参照Genebank［TaKaRa（大连）公司合成］序列为（扩增片段为354bp）：5’AACGTGCTGCGGATCATCAA3’（上游引物），5’CTGGATGGACGTGTAGAAGT3’（下游引物）；内参照磷酸甘油醛脱氢酶（GAPDH）引物［TaKaRa（大连）公司合成］序列为（扩增片段为528bp）：5’ACCACCATGGAGAAGGCCGG3’（上游引物），5’CTCAGTGTAGCCCAGGATGC3’（下游引物） ；Trizol总RNA提取试剂（美国Promega公司）；逆转录试剂盒、DNA Market(M)及PCR扩增所需的其他试剂［TaKaRa（大连）公司］；电泳用聚丙烯酰胺、三羟甲基氨基甲烷（Tris）及琼脂糖等（上海化工生物工程公司）。
3 检测方法
血清ALT、AST、LDH含量采用岛津CL7150全自动生化分析仪测定；血清TNFα、肝脏MDA含量分别采用ELISA方法、硫代巴比妥酸法测定，操作步骤按试剂盒说明书进行；每组在各个时点分别随机选取5只大鼠的肝标本，采用RTPCR法检测肝组织HSP70mRNA的表达。
4 统计学处理
数据结果均以均值±标准差表示，统计学差异性检验采用SPSS11.5统计软件进行完全随机设计方差分析，样本之间采用LSD法进行两两比较。
结 果
1 血清ALT、LDH、AST水平的变化
再灌注后2、4、24小时，3组ALT、LDH、AST水平明显低于2组（P
2 肝组织MDA水平的变化
再灌注后2、4、24小时，3组肝组织MDA水平明显低于2组（P
3 血清TNFα水平的变化
再灌注后2、4、24小时，3组TNFα水平明显低于2组（P
4 各组大鼠肝组织HSP70mRNA表达的变化
术前：1、2组肝脏未见HSP70mRNA表达，而3组明显表达（P
讨 论
HSP是细胞应激蛋白的一种，细胞在受到急性非致死性刺激后，HSP基因即刻被激活，转录活性增强，细胞内可检测出mRNA表达［4］，这最早发现于热休克实验中的果蝇唾液腺细胞中，后来证明，它是一种普遍存在于生物界中的能被多种损伤因素和应激因子诱导的细胞应激反应蛋白。HSP根据分子量不同而命名为HSP70、HSP90、HSP27等。对于哺乳动物，HSP70是其中重要的活性成分，它可以被各种物理、化学、生物等刺激所诱导，产生非特异性保护作用。这是因为HSP70作为一种“分子伴侣”，可使应激损害所造成的变性蛋白质重新正确折叠得以修复，或指导它们进一步降解，防止在细胞内积聚而致细胞损伤。
尽管许多方法和药物可诱导HSP产生，但在临床实际中，由于受到剂量、毒副作用、诱导效率等许多条件的限制而得不到应用。本研究结果显示预防性给予Gln，肝脏HSP70mRNA表达水平明显提高。这表明Gln具有促进HSP70基因转录的效应。在缺血再灌注损伤中HSP具有保护作用，其机制可能与下列因素有关：（1）抑制中性粒细胞浸润［5］；（2）调节白细胞与内皮细胞间的相互作用［6］；（3）提高细胞的抗氧化能力［7］；（4）减少炎性介质的生成［8］，如TNFα等；（5）HSP70还可能调节NO的生成［9］。本研究发现在肝脏缺血再灌注前预防性给予Gln，可减轻再灌注后的脂质过氧化损伤，降低转氨酶水平，抑制TNFα的释放，说明Gln在肝缺血再灌注损伤中起保护作用，这可能与Gln促进HSP70mRNA的表达关系密切。因为Gln是一种人体正常需要的氨基酸，对人体无毒，临床中已广泛应用。所以，在缺血再灌注前给予Gln诱导HSP70以提高机体自身的耐受性，对减轻肝脏损伤，减少并发症，改善预后具有积极的临床意义。
目前对于Gln诱导HSP还存在着争议［1-3］，各研究结果之间的差异可能与Gln的剂量、应用时间、所作用的组织及动物种属有关。关于Gln诱导HSP的机制仍不清楚，该效应是由Gln本身还是其代谢产物作用的结果，仍有待深入研究。
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热休克蛋白范文4
热休克蛋白，也叫应激蛋白，是一种分子伴侣，除在细胞生长，发育，基因转录，蛋白质合成、折叠、聚集细胞骨架等方面发挥重要的生理作用外。还通过多种途径对细胞受到的不同损伤产生内源性保护[1]。根据分子量大小和同源程度可分为HSPll0，HSP90，HSF70，HSP60，HSP40，小分子热休克蛋白(Sall heat shock proteins，d-laps)，HSP10和泛素等类型。热休克蛋白27(heat shock protein 27，HSP27)又名热休克蛋白B1 (heat shock protein BHSPB1)、热休克蛋白 25(heat shock protein 25(HSP25)，是热休克蛋白家族中的小分子热休克蛋白亚家族(sHSP亚家族)的重要一员。近年 HSP27与细胞凋亡及心力衰竭的关系引人注目，本文就HSP27对细胞凋亡及老年心衰的保护作用作一综述 。
1 HSP27的抗凋亡机制
(1)HSP27与细胞内氧化还原水平：是HSP27抗凋亡最重要的并与衰老密切相关的机制。活性氧(reactive oxygen species，ROS)是由外源性氧化剂或胞内有氧代谢中产生的、具有很高生物活性的氧自由基，可直接损害或通过一系列过氧化链式反应引起广泛的生物大分子结构破坏，并可直接改变细胞内环境稳定性。在一些特定条件下，如 缺血、缺氧、离子辐射、紫外线照射、化疗药物、化学试剂等 都可通过介导活性氧的产生而导致细胞凋亡的发生。同时，ROS理论也是细胞老化的中心学说。 Mehlen[2]等将HSP27基因转染鼠 L929细胞，检测肿瘤坏死因子α(tumor necrosis factor-A，TNF-α)处理后的细胞，实验结果表明，HSP27能降低细胞中的ROS水平、延缓脂质过氧化及胞质蛋白的氧化等相关过程。还原型谷胱甘肽(GSH)是细胞合成的、胞内重要的水溶性抗氧化剂。实验证明，组成型和诱导表达增加的 HSP27，通过促进谷胱甘肽自身的氧化还原循环，提高葡萄糖-6-磷酸脱氢酶活性，使胞内GSH的水平增高，对TNF-或放射线等其他类型的氧化损伤具有保护作用[3]。(2)HSP2与caspases：近年越来越多的证据表明，HSP27可以抑制 pro-caspase的剪切活化而具有抗凋亡作用[4]。作为分子伴侣，它能与凋亡信号通路的信号分子结合，抑制胞浆程序化死亡途径。例如，它能与 Cyt C的结合，阻断 caspase-9前体的激活，阻止凋亡复合体的形成，抑制了凋亡的发生。[5]在蛋白酶级联剪切过程中，caspase-3处于核心位置，发挥着非常重要的作用，因此被称为死亡蛋白酶。前caspase-3被其他蛋白酶剪切后被激活，活化的caspase-3再剪切不同的底物，导致蛋白酶级联剪切放大，最终使细胞走向凋亡。实验表明，HSP27可以与前caspase-3结合，抑制其活性，作为该通路的负性调节因子，抑制细胞凋亡的发生。[6]因此，HSP27在应激条件下对caspase介导的凋亡通路的断作用可能是抑制细胞凋亡的重要机制。 (3)HSP27与凋亡抗原配体 ：凋亡抗原配体-1(apoptosis antigen ligand 1，Apo-1)、CD95又称死亡受体Fas，Mechlen[7]等采用 Fas敏感的、不表达内源性 HSP27的鼠纤维肉瘤细胞株(L929-Apo-1-6)，转染人HSP27基因，发现HSP27基因表达能明显抑制蛋白激酶 c抑制剂 Sturosporine和 TNF-a诱导的细胞凋亡，这一事实有力地证明了人类 HSP27是细胞内介导细胞凋亡的 Fas/Apo-1的抑制物研究表明，通过一条非 caspase依赖性的信号途径，Fas死亡域相关蛋白(fas death domain-associated protein，Daxx) 其本身虽然不引起细胞凋亡，但可通过 Fas和凋亡信号调节激酶 Ask1的相互作用而介导凋亡的发生。HSP27磷酸化使 HSP27从寡聚体变为二聚体，并与 Daxx结合，阻止了Daxx由胞核向胞浆的转位以及与 Fas、Ask1的结合，使该凋亡通路中断。然而，当细胞表达寡聚体形式的 HSP27或缺乏Daxx结合能力的突变体时，HSP27不能发挥抗凋亡作用[8]。这些都有力地证明HSP27与死亡受体 Fas介导的凋亡途径密切相关。 (4)HSP27与线粒体氧化磷酸化 ：线粒体是细胞内一个重要的细胞器，线粒体内的氧化磷酸化是真核细胞内 ROS产生的主要来源，而 ROS的大量产生可以对脂质和核酸产生破坏性分子链反应，会选择性地使离子通透性丧失或使线粒体膜通透性发生改变，导致线粒体膜势能发生改变，引起 Cyt C的释放，激活胞浆程序化死亡途径 有学者证明，线粒体是HSP27在细胞氧化损伤中起保护作用的作用靶点，热休克预处理能明显减轻 H2O2对线粒体的氧化损伤，稳定线粒体膜电位。在热应激处理的Jurkat细胞系中发现在线粒体片段上有 HSP27的表达;同时发现，HSP27的表达能在凋亡刺激因素的作用下保持线粒体膜电位的稳定，抑制 Cyt C的释放，而若在刺激因素作用之前加入 HSP27反义寡核苷酸，则出现相反的结果，未起到细胞保护作用[9]。如上所述，HSP27在应激条件下可通过减少细胞内 ROS水平，稳定线粒体膜电位，抑制Cytc释放，最终抑制细胞凋亡的发生 。 (5)HSP27与细胞骨架：真核细胞的空间结构由细胞骨架(eytoskeleton)维持，微丝是细胞骨架 的一种重要类型，由肌动蛋白构成。近年的研究表明，细胞骨架在细胞凋亡过程中的变化非常活跃，凋亡过程中可见的细胞体积缩小、凋亡小体形成等形态学变化被认为与微丝的改变密切相关。体内和体外实验均证实，微丝是caspase的底物，在caspase-3的作用下，微丝蛋白被剪切成长度为15000和 31000的片段，绿色荧光蛋白标记后发现这些片段的导入可引起并促进细胞凋亡的形态学变化。现已有实验证实，在氧化等应激条件下，通过 p38- MAPK 激活的蛋白酶-2-HSP-球形肌动蛋白(G-actin)信号途径，由被活的HSP27使 G-actin磷酸化，并聚合为丝样肌动蛋白 (F-actin)，导致细胞骨架重排，从而调节细胞的运动，稳定细胞结构。近来发现，HSP27的致细胞骨架稳定作用在凋通路的上游事件中可能也起重要作用，它能阻止一些凋因子和线粒体的结合，从而抑制了Cyt C的释放及凋亡的发生[10]。另外，在许多细胞类型中，强氧化刺激能引起微丝系统的破坏和肌动蛋白的解聚和片段化，这和 ROS对肌动蛋白半胱氨酸的巯基氧化有关[11]，即细胞骨架自身的氧化还原损伤参与了 ROS引起的细胞凋亡过程，因此，HSP27对ROS的抑制从另一个角度阐明了 HSP27对细胞骨架的保护和对细胞凋亡的抑制作用。(6)其他机制 ：各种如热、缺血、氧自由基和毒素等刺激导致细胞损伤，胞浆蛋白发生变性、错误折叠、凝聚等变化，HSP27能发挥分子伴侣作用，刺激 RNA及蛋白质的合成，协助细胞在死亡之前修复热休克造成的损伤，使细胞尽快恢复正常生理功能。另外，HSP27抗凋亡的作用机制还可能有抑制热休克过程 中蛋白的合成，使真核细胞中未折叠的蛋白的量减少，从而减轻应激对细胞的破坏作用[12]和作为凋亡抑制因子的蛋白激酶 B(Akt)相互作用，激活 Akt，阻止细胞凋亡[13]。总之，HSP27在细胞凋亡过程中能通过多个途径起到细胞保护作用，更加确切的机制有待进一步研究。
2 老年心力衰竭与心肌细胞凋亡的联系
心脏衰老过程中心肌细胞发生坏死和凋亡，造成心肌细胞数量减少，重塑性降低，收缩功能受损。心肌细胞在增龄过程中凋亡速度加快导致心脏质量减轻，功能退化。Kwak[14]等研究发现，左心室细胞凋亡速度与年龄成正比;与年轻对照组比较，衰老左心室心肌细胞减少 30%;性别也会影响细胞凋亡，老年雄性灵长类动物心肌细胞凋亡速度上升4倍，而同年龄组的雌性动物无明显变化。1996年 Sharov等[15]首次报道在用冠状动脉栓塞制作的犬 HF模型心脏发现凋亡证据。此后又在其他 HF病人和实验动物型心脏发现凋亡现象。Olivetti等通过 TUNEI 法发现，处于慢性心衰末期病人的心肌组织中有 0.2% 的细胞出现凋亡，一般看来，凋亡细胞的数量太少不至于对心功能造成不良影响。然而，凋亡是一个短暂事件，其发生过程需20 min～24 h，故推测即使每天有0.2% 细胞凋亡，持续数月或数年则可能造成相当多的心肌细胞缺失。因为心肌细胞数量的减少，可以使心肌收缩力下降，可能会导致 CHF的发生，并使存活的心肌细胞的负荷加重，而使 CHF进行陛恶化。由此对心衰发生的病理生理机制提出这样一个假说，即活性心肌细胞的持续性缺失可能是进行性心衰的重要机制之一。据报道不同动物有明显不同的细胞凋亡率，最高可达 35.5%[16]。这些死亡率仅能在很局限的区域见到，细胞凋亡可在24 h内发生并完成，如此速率可导致心脏的快速退化萎缩。最近研究，在终末期 HF已知出现小于 0.5% 的细胞凋亡率，又超出生理性的趋势。另外，终末期 HF中出现细胞坏死比细胞凋亡更多，最高可达7倍。现凋亡现象。大量研究表明，在心血管系统中，诱导心 肌细胞凋亡的因素有：压力负荷导致的机械压力 、急性心肌缺血、氧 自由基 、细胞 内钙离子超负荷和 AngII、 ALD、ET等神经内分泌激素以及 TNF、干扰素IL- 1、表皮生长因子、转化生长因子 -Gl等细胞因子。
3 Hsp27在衰老心肌中的作用
近年来的一些研究表明，HSP27与衰老之间存在着密切的关系，可能对随年龄性的功能下降起着重要作用。Hsp27抑制过氧化的发生及被破坏蛋白的聚集，延缓疾病的发生延长生命周期[17]。衰老心脏的特征是心肌细胞数减少，剩余的心肌细胞代偿性肥大。随衰老的加重，减少的心肌细胞呈现出凋亡细胞所占比例增加，而坏死细胞所占比例减少的趋势，HSP27可通过对凋亡的抑制，起到延缓衰老作用。目前研究显示，老龄导致的心血管生理变化是舒张性心理衰竭的一个重要独立因素。
4 HSP27对心力衰竭的保护作用
慢性心力衰竭是众多心血管疾病的终末阶段，给患者机体带来严重损害，并给患者家庭和社会带来巨大的经济压力。目前研究表明，HSP27在对抗心肌细胞凋亡的过程中起到了重要的保护作用，而心肌细胞凋亡又是心肌细胞缺失的重要机制，在心衰尤其是老年心衰的发生、发展过程中起重要作用，让我们不难联想到HSP27对老年心力衰竭应起到一定的保护作用。C.D.Venkatakrishnan[18]等研究表明，HSP对心肌细胞的保护作用在于HSP27通过激活P38MAPK及磷酸化作用能对用阿霉素Doxorubicin (DOX)诱导的心肌细胞毒性产生保护作用，DOX诱导的活性氧族能够引起扩张型心肌病和充血性心力衰竭，而DOX引起心脏毒素是由线粒体触发的心肌细胞凋亡引起的。高温诱导的小分子热休克蛋白能够使DOX介导的氧化诱导的心肌细胞内的毒素减少到最低，也就是说HSP27起到了一个内源性的抗氧化剂作用，对抗DOX衍生的氧化产物，如：H2O2，从而对心肌细胞凋亡及心力衰竭起到保护作用。Hollander等[19]的研究也显示，Hsp27过表达可缩小体外灌流心脏短时间缺血/再灌注引起的心肌梗死灶面积、改善左心室功能。国内刘莉[20]等也通过建立心肌特异性高表达Hsp27的转基因鼠模型;并且经Dox诱导小鼠的慢性心衰，并观察Hsp27对小鼠生存率、左心室血流动力学的影响。结果表明Hsp27心肌特异性过表达显著改善了Dox诱导的小鼠死亡率和左心室血流动力学参数变化，最后得出结论：Hsp27心肌特异性过表达对Dox诱导的小鼠心衰具有显著的抑制。虽然心衰病理发生的确切分子机制尚有待进一步阐明，但大量来自动物和人类的研究证据表明，活性氧自由基(reactive oxygen species，ROS)生成增加产生的氧化应激以及由氧化应激触发的心肌细胞凋亡，是多种原因诱导的心衰发生发展的共同基础，而ROS同时也是细胞老化的中心学说，因此HSP27必然对老年心力衰竭也具有一定的保护作用。
5 研究前景及意义
目前小分子热休克蛋白对延缓细胞凋亡的作用已基本明确，HSP27作为小分子HSP的重要成员亦具有较强的抗凋亡作用，与衰老也有着密切的联系，这不仅让我们提出如下问题：小分子HSP是否对老年性疾病也据有一定的保护作用?各种能产生HSP27的治疗方法是否能成为抗衰老及治疗老年心衰的重要手段?而HSP27是否有可能成为未来心衰基因治疗的一个备选基因?目前较为流行的高压氧治疗能产生内源性的HSP27，那么高压氧治疗是否能成为心力衰竭的新的重要手段，而心力衰竭是否能通过基因治疗来预防及治疗，仍需进一步的研究。
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热休克蛋白范文5
【摘要】 目的 观察加味小柴胡汤对顺铂诱导的大鼠肝BRL细胞核转录因子-kB(NF-kB)、热休克蛋白70(HSP70)表达的影响。方法 将BRL细胞分为4组：空白组、顺铂组及加味小柴胡汤大、小剂量组。采用完整细胞蛋白质斑点印迹、免疫组织化学等方法，检测各组细胞NF-kB、HSP70变化。结果 顺铂组NF-kB表达明显较空白组升高，HSP70表达降低，组间比较差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组 NF-kB明显较顺铂组低，差异有统计学意义；加味小柴胡汤大、小剂量组HSP70表达均升高，但仅加味小柴胡汤大剂量组差异明显。结论 加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达，上调HSP70表达，此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡重要机理之一。
【关键词】 BRL细胞；顺铂；加味小柴胡汤；细胞核转录因子-kB；热休克蛋白70
Abstract：Objective To study the effect of modified Xiaochaihu Decoction on NF-kB and HSP70 of BRL cell induced by cisplatin. Methods BRL Cells were pided into control group， cisplatin group， high and low dose of modified Xiaochaihu decoction. Complete cell protein dot blot technique and immunohistochemisth analysis were appllied to detect the change of NF-kB and HSP70. Results There was a significant increase in NF-kB and decrease in HSP70 of BRL cell induced by cisplatin compared with control group. There was a significant decrease of NF-kB in modified Xiaochaihu decoction group compared with cisplatin group. There were increases of the expression of HSP70 in both high and low dose group， but only the high dose group demonstrated significant difference. Conclution The expression of NF-kB of BRL cell induced by cisplatin can be inhibited while the expression of HSP70 can be enhenced by modified Xiaochaihu decoction. It may be one of important mechanisms of relieving cell oxidize lesion and inhibiting apoptosis by modified Xiaochaihu decoction.
Key words：BRL cell；cisplatin；modified Xiaochaihu decoction；NF-kB；HSP70
核转录因子-kB(NF-kB)是一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子kB序列特异结合的蛋白因子，具有多向转录调节作用，当细胞氧化损伤后NF-kB的表达增强[1]。热休克蛋白(HSP)是机体在各种应激害时所产生的一种高度保守蛋白质， HSP70是HSP中最重要的一种中等分子量蛋白，其表达能够对应激状态下细胞产生保护作用。HSP的细胞保护作用可能是恢复和维持抗氧化酶功能，修复其在应激状态时被破坏的功能蛋白，从而稳定细胞结构，使细胞维持正常的生理功能[2]。笔者利用体外细胞培养方法，观察了顺铂诱导BRL细胞应激反应损伤时NF-kB、HSP70的异常表达及加味小柴胡汤的调控作用。
1 实验材料
正常大鼠肝BRL细胞，广州中山大学动物实验中心细胞库提供。胎牛血清、胰蛋白酶、DMEM、单克隆抗体、TUNEL检测试剂盒均购自Sigma公司。顺铂为齐鲁制药有限公司生产，批号0503007。加味小柴胡汤由中国第153中心医院中药制剂室制备(原药材1 g/mL)。
2 实验方法
2.1 细胞分组及处理
取处于对数生长的BRL细胞随机分为4组(每组6瓶)。空白组：加入含有10%胎牛血清的DMEM培养基；顺铂组：加入顺铂5 mg/L及10%胎牛血清的DMEM培养基；加味小柴胡汤大剂量组：加入顺铂5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤4 mg/mL；加味小柴胡汤小剂量组：加入顺铂5 mg/L、10%胎牛血清的DMEM培养基及加味小柴胡汤2 mg/mL。在37 ℃、0.5% CO2培养箱中培养48 h后，将胰蛋白酶消化的细胞制备成细胞混悬液。将收获的4组细胞分别制成细胞滴片(1×107/mL细胞混悬液滴加至预先处理过的硝酸纤维素膜和载玻片上)、细胞裂解液，并提取DNA和蛋白质，进行免疫组化检测。
2.2 完整细胞蛋白质斑点印迹
采用间接酶标抗体免疫组化法：点膜标本经氯仿蒸气裂解细胞膜暴露细胞质内的蛋白质，加0.5%吐温-20/TBS(Tris- HCl pH 7.2)封闭，加各自的一抗，0.01%吐温-20/TBS洗2次，加碱性磷酸酶标记的羊抗鼠或羊抗兔IgG，加DAB/NBT-BCIP底物液进行免疫组化显色，以PBS代替一抗作为阴性对照。
2.3 免疫细胞化学染色
4%多聚甲醛固定后的细胞标本入0.3%Triton X-100/PBS透化后，加10%正常羊血清，甩去多余血清，加1∶100稀释的各种一抗，置4 ℃湿盒内孵育过夜。PBS，pH 7.5洗后，加1∶200稀释的二抗(鼠IgG-HRP)，置37 ℃湿盒内孵育1.5 h，以DAB显色。阴性对照实验用PBS代替一抗。
2.4 检测指标
对细胞蛋白质斑点的印迹应用薄层层析扫描仪(Shimadu，日本)进行扫描并对免疫组织化学标本染色，应用图像分析仪(山富，中国)扫描各标本的免疫反应信号的灰度值。
3 统计学方法
采用SPSS11.5软件对以上数据进行统计学分析。所有数据用x±s表示，均值之间比较采用t检验。
4 结果
4.1 加味小柴胡汤对顺铂诱导BRL细胞核转录因子-kB、热休克蛋白70表达的影响
(见表1) 表1 各组细胞NF-kB、HSP70蛋白表达扫描灰度值(略)注：与空白组比较，**P＜0.01；与顺铂组比较，P＜0.05，P＜0.01
4.2 各组细胞免疫组化显色比较
细胞NF-kB经DAB染色呈棕黄色，正常组染色浅淡，顺铂组呈棕褐色，加味小柴胡汤大、小剂量组均明显较顺铂组浅淡，加味小柴胡汤大剂量组更为显著。提示顺铂处理组细胞NF-kB表达较正常组明显，应用加味小柴胡汤的实验组可下调NF-kB表达(见图1)。细胞HSP70染色呈棕色，正常组细胞染色较深，顺铂组较浅，加味小柴胡汤大、小剂量组染色均明显较顺铂组深。提示正常细胞HSP70表达明显，顺铂组HSP70表达降低，加味小柴胡汤大、小剂量组细胞HSP70表达明显上调(见图2)。
5 讨论
NF-kB是由B淋巴细胞核提取物中检测到的一种能与免疫球蛋白k轻链基因的增强子kB序列特异结合的蛋白因子，典型的NF-kB由p53和p65亚基组成。在静止状态下，NF-kB与I-kB抑制性蛋白结合处于未活化状态。当细胞受到炎性细胞因子、LPS等刺激时，I-kB激酶活化，I-kB从NF-kB复合体上解离，NF-kB发生核易位并与特定的DNA kB序列结合而促进基因转录。NF-kB可被炎性细胞因子激活，而后又诱导炎性细胞因子的表达。因此，早期应用抑制NF-kB活化药物，对控制炎症介质的大量释放将有所裨益[3]。由于活性氧(ROS)可激活NF-kB的表达[4]，在H2O2诱导的细胞凋亡中，可见NF-kB激活转录因子p53的表达[5]。本实验结果表明，顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达明显升高，提示顺铂致肝细胞损伤的发生机制与NF-kB的高表达有关。
HSP蛋白作为分子伴侣作用，是生物体或离体培养细胞在不良环境因素作用下所产生的一组具有高度保守性的应激蛋白，能保护细胞不受或少受损害。HSP70是目前发现的主要分子伴侣之一，能与蛋白分子结合，保护新合成的恰当构型。当蛋白质受损变性时，能促使其恢复或加速其降解和消除，以维护细胞的功能和生存。HSP70的增加可以提高细胞在各种应激状态下的生存能力，其细胞保护作用与应激时受损蛋白质的修复或移除有关，主要有抗氧化作用、协同免疫作用、抗细胞凋亡作用等几方面[6]。HSP70可增强机体对多种应激原的耐受能力，由于各种有害应激可激活细胞内应激激酶而导致细胞凋亡，而HSP70基因表达水平的增加，可抑制应激激酶的激活，防止细胞凋亡，这无疑对预防肝细胞损伤有积极意义。
本研究提示，加味小柴胡汤可下调顺铂诱导的BRL细胞NF-kB表达，上调HSP70表达，此作用可能是该方减轻细胞氧化损伤、抑制细胞凋亡的重要机理之一。
参考文献
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热休克蛋白范文6
[关键词] 慢性心房颤动； 热休克蛋白； 酶联免疫法； Western斑点印迹法
[中图分类号] R541.7； Q786[文献标识码] A[文章编号] 1671-7562（2008）04-0260-04
Expressionandsignificance ofHSP27/60/70in rightserum and atrial of
patients with chronicatrialfibrillation
PAN Yan-qing, CHEN Xin
(DepartmentofCardiovascularSurgery, theNanjingFirstHospitalAffiliatedof
NanjingMedicalUniversity,Nanjing 210006, China)
Abstract:Objective To investigate the expression and significance of heat shock protein (HSP) in human chronicatrialfibrillation.MethodsRight atrial samples and serum samples were obtained from forty patients undergoing valve replacement, in which twenty patients had chronic atrial fibrillation(AF). The rest of patients suffered from sinus rhythm(SR).The HSP27/60/70 expression level in right atrial samples was determined by Western-blot, while the expression in serum samples was determined by enzyme-linked immunosorbent assay（ELISA）. Results(1)There was no difference of HSP27/60/70 expression between serum samples of two groups. (2) HSP 27 were expressed in both groups, while no significant difference of expression level existed (605.66±189.03 vs 584.34±144.79,P>0.05). (3) Compared with SR, the AF group had higher level of HSP 60(5 965.03±1 564.92 vs 3 159.80±1 055.41, P
Key words:chronic atrial fibrillation； heat shock protein； enzyme-linked immunosorbentassay； Western-blot
（Modern Medical Joural，2008，36：260-263）
慢性心房颤动(简称慢性房颤)是临床最常见的心律失常，有70％左右发生于器质性心脏病患者，其中以瓣膜性心脏病、先天性心脏病和冠心病常见[1]。热休克蛋白(heat shock protein，HSP)是一种在进化过程中序列高度保守的生物蛋白，对维持机体的自身稳定性起重要作用,是细胞应激反应的生物标志及细胞的内源性保护蛋白[2-3]。近年来，部分研究提示HSP家族和房颤的发生发展可能存在一定联系。本研究对慢性心房颤动患者血清及右心房心肌中HSP 27/60/70的表达进行检测，旨在探索慢性房颤可能的发生发展机制。
1 资料与方法
1.1 病例选择
选取2007年8月至2007年10月间在本院行瓣膜置换手术患者，慢性房颤（AF）组选取20例房颤持续时间>36个月者，其中行二尖瓣置换术8例、主动脉瓣置换术6例、二尖瓣加主动脉瓣置换术6例；窦性心律（SR）组选取20例，其中行二尖瓣置换术10例、主动脉瓣置换术6例、二尖瓣加主动脉瓣置换术4例。两组患者年龄及性别比较差异无统计学意义(P>0.05)，右房直径（RAD）、左房直径(LAD)及左心室舒张末期直径（LVDd ）均AF组大于SR组（均P＜0.01),射血分数(EF) SR组大于AF组(P＜0.01)。见表1。所有患者的瓣膜术后均送检，病理检查结果符合风湿性瓣膜病变表现。
1.2 标本留取及保存
所有患者入院时抽取静脉血10ml,离心后取血清保存于-20℃冰箱备用。组织标本于手术进行到体外循环开始前，取右心耳组织,立即置-70℃液氮保存。
1.3 实验方法
用ELISA法检测血清HSP27/60/70, 试剂盒均为美国ADL公司产品，实验步骤按说明书进行操作。用Western斑点印迹法检测心肌中HSP27/60/70，检测方法按参考文献[4]。
1.4 数据统计及比较
所有的定量数据均用x-±s表示，采用SPSS11.5软件进行统计学处理，组间数据比较采用t检验。
2 结果
2.1 两组患者血清中HSP27/60/70含量测定
见表2。两组患者血清中HSP27/60/70含量比较差异均无统计学意义(P>0.05)。
2.2 两组患者心肌中HSP27/60/70含量测定
两组患者心肌组织中HSP27表达未见明显统计学差异(P>0.05)；HSP70表达水平AF组含量明显低于SR组(P
2.3 两组患者血清及心肌中HSP27/60/70相关性分析
只有SR组血清与右心房心肌中HSP27存在低度相关性（r=0.541，P＜0.05),见表4、5。
3 讨论
HSP又称应激蛋白(stress protein，SP)，根据其分子质量大小和氨基酸序列同源性不同，将主要的HSP分为4个家族：HSP90家族、小分子量smHSP家族、HSP60家族和HSP70家族。HSP在抗氧化、协同免疫、抗细胞凋亡方面发挥重要作用[2-3]。
心房颤动是临床最常见的心律失常之一。近年来，国内外学者部分研究结果提示房颤的发生和HSP家族可能有相关性[5-14]。本研究提示两组患者术前血清中HSP27/60/70含量差异均无统计学意义(P>0.05)，和Mandal等[6]观察结果相符，故目前认为血清中HSP27/60/70和慢性房颤发生关系不大。
本研究结果显示两组患者心肌组织中HSP27表达差异未见统计学意义(P>0.05)。HSP27 是smHSP亚家族中的重要一员，Yang等〔15〕研究结果提示特发性房颤组患者心肌中HSP27表达较另两组增高。Kampinga等[16]认为HSP27可抑制房颤的持续发作，Brundel等[17]研究提示特发性房颤组患者心肌中HSP27表达较另两组增高，故目前认为HSP27能够抑制特发性房颤向持续性房颤转化，但对已经形成的慢性持续性房颤无特殊抑制作用。HSP27对心肌细胞的保护机制主要包括：(1)促进GSH 生成,提高细胞内还原能力; (2)抑制细胞色素C (CytC) 释放和Cyt C 凋亡蛋白酶激活因子1复合物形成; (3)抑制caspase 前体活化; (4)稳定细胞骨架。
本研究结果提示患者右心房心肌组织中HSP70表达AF组低于SR组，差异有统计学意义(P
本研究结果提示两组患者心肌中HSP60表达差异有统计学意义(P
热休克蛋白家族和慢性房颤的发生发展有关。细胞内HSP70合成增多，可能通过参与心肌细胞离子通道修复、稳定细胞膜和溶酶体膜、防止蛋白质变性等途径以维持心肌细胞的正常结构及功能以避免房颤的发生；心肌细胞合成HSP60增多，通过抗细胞凋亡及参与抑制应激激活激酶途径、增强分解ATP满足心肌细胞需氧等途径以保护心肌细胞，但同时也可能导致细胞间黏附分子的表达来促进心肌结构重构，故HSP60在慢性房颤患者心肌中表达后可能不完全是保护性作用。HSP27可能是通过防止心肌细胞溶解从而保护心肌，防止突发性房颤向慢性持续性房颤转化。HSP27、HSP60及HSP70可能是在慢性房颤的发生及持续发作的不同阶段发挥其心肌保护作用，但具体保护机制尚有待进一步研究。
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