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[关键词] 远程教育 多媒体网络 动态分组传输DPT SRP 千兆位交换路由
随着网络时代的快速到来，网络教育将成为革新传统教育模式的重要动力。根据中国社会科学院的一项调查研究称，由于技术手段的快速发展以及在各行业的渗透和应用，网上教育将成为我国一种速度更快，传播空间更大，教学手段更加新颖的新型教育形式，它将与课堂教育、广播教育、电视教育一起构成多元化的现代教育体系。
我国现代远程教育工程的目标是建立一个开放式的教育网络，构建终身教育体系和社会化学习。为此，教育部在清华大学等几所高校试点的基础上，将这类学校的数额扩大到31所。我相信这才只是开头，随着网络经济的迅速发展和完善，远程教育将会更加如火如荼。
然而，从目前我国教育网络建设的实际发展情形来看，要构建真正意义上的网络教育体系，与国外的差距还不小。目前国内互联网提供商以“网校”或“教育频道”之类名义开设的有关教育方面的内容大多是静态的、局部的，真正的教学内容仍然相对匾乏。而许多网络大学的学习又都不是通过网上进行的，还需要在固定的时间到固定的教学点去上课，不能完成真正的网上教学服务。究其原因之一主要是由于目前我们国家的整个网络基础设施建设还未跟上现代教育发展的节奏，有限的带宽严重地制约了网络教育的进一步发展。因此建立一个真正高速的宽带基础主干网对于推动网络远程教育是十分必要的。
未来的远程教育模式应该是社会开放式的并且是交互式的，无论是学历教育，非学历教育甚至是属于技能培训的，任何人都可以坐在办公室里甚至轻松地坐在家里在他认为方便的时候泡上一杯咖啡后挑选他所感兴趣的课程进行学习，不懂的时候也可以及时地向老师提出疑问并在学生之间也能随时相互进行交流无论对方在那里，是否属于同一所学校。课后的作业及考试也可采取联机交互的方式来进行，当时做完当时就能知道自己今天做得如何。
首先让我们来看一下作为远程教育通常采用的几项手段的技术背景。进入20世纪90年代之后，由于对于声音、电视和数据流的多媒体网络应用的需求在不断地增加，因此也有不少的企业和机构加大了对此的开发和研究，近年来也不断有产品投入市场，用户也渴望得到服务质量好、服务费用低的产品，像电视会议、协同工作、远程教学、可视电话、视频点播VOD (video on demand)等等的多媒体网络应用都是非常受欢迎的应用。但由于多媒体的数据量大得惊人，尤其是声音和视频。为了克服数据传输通道带宽的限制，有效地在网上大量地传输数据流，有关企业和研究机构投入了大量的人力和物力来开发数据压缩和解压缩技术以及数据通信技术。目前MPEG-1和MPEG -2标准已经正式，并且得到广泛应用。例如，CD-交互系统，在网络上的数字声音广播、数字电视广播和影视点播等。表1是MPEG-1和-2的典型编码参数。
表 1
同时，国际电信联盟(ITU)还制定了许多多媒体通信的标准。其中，T.120， H.320， H.323和H.324标准组成了多媒体通信的核心技术标准。T.120是实时数据会议标准；H.320是综合业务数字网(ISDN)电视会议标准；H.323是局域网上的多媒体通信标准；H.324是公众交换电话网络上的多媒体通信标准。从上面我们可以看出即使采用了很好的压缩技术，传输多媒体数据所需要的带宽就目前而言仍然是巨大的。在目前要想实现真正的开放式教育就必须实现至少如MPEG-1一类的视频流能够畅通无阻的在网络中流动，基本无抖动和延迟。要实现这样的要求就必须为每个视频流分配至少1.5兆的带宽。假如使用MPEG-2的话带宽还需成倍地增加。这时我们可以假设即使采用IP多目传送方式的话有许多学生要想同时上不同的课的话也将有大量的数据流在主干上跑而且又不能有明显的延迟和抖动，随着课程数目的增加和学生人数的增加此类流量将急剧增加。也可设想在不久的将来如果采用个性化教育方式的话需要采用单目传送的方式来实现又需要多少带宽呢。同时中国目前的远程教育发展正处于发展期，受教育的学生的人数将会急剧增加远比国外就学的人要多的多。显然想要进行真正意义上的远程教育没有一个高带宽的并具有良好扩展性的传输平台做基础的话显然困难重重。
能成为一个良好的主干网基础设施应该符合起码以下几个基本条件：
随着流量的增长带宽也能跟着相应增长
在拥塞的情况下也能维持较高的带宽并能迅速适应并改变流量分布
在节点数量和距离方面都能符合大规模环形拓扑结构的要求
在主节点间应能保证各节点间的地位平等，避免产生某一节点产生黑洞吃掉大量带宽
在传输介质或节点失效时能迅速恢复其业务
加入某一个节点或去掉一个节点时尽量减少配置的需求
那么是否较好的方案可供选择呢？答案当然是有的。首先基于IP的数据网络似乎现在已是大家所公认的，目前世界电话业务年增长率仅为8%，数据通信业务增长率却超过100%，尤其是Internet业务，进入90年代中期以来一直以300%的速率在增长。由于TCP/IP已是事实上的标准，因此在网络层采用IP协议已无可非议。基于IP+路由的所有服务由于多年来的发展已进入到一个较为完善的阶段，有效的路由选择和非常丰富的应用服务功能可以说已到了一个相当高的境界，遗憾的是要想在当前的架构上让速度有进一步较大的提高就受到较多限制。所以最近提出的多协议标签交换技术（MPLS）等就是为了解决在有限的带宽内让那些真正想得到高质量服务的数据流能顺利通过，提高服务质量。因此增加总的可用带宽也就成了当前迫切需要解决的问题。
而光纤由于它的高质量、高带宽以及低成本也成为首选的物理介质。因此，目前真正的的焦点集中在数据链路层的实现。目前有几种方法已被用来或建议在光纤上传输高速IP业务，如图1所示图1
从图1可清楚看到随着网络技术的逐步发展目前人们已越来越倾向于层次的简单化了，从IP over ATM/SDH/Optical，IP over ATM/Optical 到IP over SDH/Optical一直到IP over fiber），省去了中间层次转换的复杂性，中间的层次越少就越能降低管理开销来最大化可用的传输带宽，同时也大大降低了网络规划、操作、错误检测以及网络恢复的复杂性，当然也能进一步减少基础建设费用。
综上所述目前Cisco公司推出了一种全新的数据传输技术DPT（Dynamic Packet Transport）解决方案。关键就是简洁性，它在继承了以往IP数据服务的优点以外又同时吸取了传统电信传输SONET/SDH的高带宽和良好的自愈能力的优点，将两者完美地结合起来，中间不再有其它多余的层次。为此还提出了一种新的MAC层的协议，称为空间重利用协议SRP（Spatial Reuse Protocol）和两种新的专有算法：
SRP公平算法The SRP fairness algorithm（SRP-fa）
智能保护切换Intelligent protection switching（IPS）
形成了费用便宜，性能优越的解决方案，被称为优化的动态分组传输技术。具体见图2，由图可见由于它是直接建立在光纤上因此传输效率极高，Cisco也将其称为IP over Optical。而传统的时分多路复用
SONET/SDH网络则以小型64Kbps信道的层次结构为基础，必须再使用ADM来转换成较大型的OC-12/STM-4或OC-48/STM-16管网
下面我们来看一下这项技术的一些优点，首先在物理层上采用的是双向光纤环绕回技术，分成内环和外环且绕行方向互为相反。在两个环上都能同时利用起来传输数据和控制信息，在数据传送上两者互为反向，并且数据和控制信号分开在两个环上分别传送。如果一组数据在一根光纤环的一个方向发送数据（下行），那么就在另一个光纤环的反向环路上发送控制分组（上行）。这样就巧妙地避免了当某一环路上数据量过大时影响控制信号的通行，同时也最大限度地利用了两根光纤。因此DPT技术既最大程度地利用了可用的带宽又保证了用于自愈等目的的控制信号的传送信道。不像SONET/SDH那样为了保证整个信道的正常运行要保留带宽的一半出来给控制信号使用。
在MAC层使用了一种SRP（Spatial Reuse Protocol）协议，这种协议和原先在其它环形拓扑结构中所使用的有所不同。在环形网中标记环是最普遍采用的介质访问控制，环中同时只有一个标记在循环中传送，原来无论在FDDI环还是令牌环网中当由源站节点发出一个Token时一直要沿着环形循环一周后回到原先发出这个Token的源站点时才能决定是否抛弃，这样使得带宽的利用率大为降低，发送的帧在发送源不卸下前总是绕环运行的。而SRP的特点则采用目的地卸下分组的方式，在目的地的节点上把分组从环上卸下，同时在环上其它段的全部带宽均仍可被利用。由于每个环上的节点都可以同时发送分组到环上，因而使环上的带宽利用率最高。如图3所示当DPT环在4，5，6及A路由器间的业务量很大时，与此同时，在1，2，3和B路由器间的业务流量仍可以不受影响地分开地正常运行。可以说，从此例中空间再利用技术方便地提供了二倍带宽的复用。
使用了SRP-fa公平机制后每个在环上的节点都是公平，均可公平地分享带宽避免某个站点饿死并防止出现运行中断和时延过大等现象。SFR-fa 通过全局优化来控制送到环中的每个分组的速率不会使得某个节点持续地发送分组而其它节点呈现等待的现象，避免过度延迟现象，而本地优化又尽可能地使每个节点最大限度地利用空间重利用特性来使得局部地得到更大的带宽。由于以上的特性因此允许在分组环中能处理高达128个有高速接口的节点，使之具有良好的扩展性。
由于DPT在分组环中使用了SONET/SDH帧来封装数据因此它能透明地运行在所有的光纤传输体系中，比如裸光纤、WDM、SONET/SDH等，甚至还能在单膜光纤和多膜光纤之间混用。正由于这种特性还允许其运行在称为混合环境中，这大大提高了传输的灵活性和迁移性。即允许传统的传输设施能充分利用又能向新的DPT传输网逐渐转变。如光纤的距离太长时可加入IP再生器和SDH再生设备
在容错和错误恢复方面正如上面所说的那样DPT技术吸取了SONET/SDH的好的方面，如像SONET/SDH环那样提供了一系列的 主动的性能监测和快速的自愈能力（APS）。而DPT技术采用了一种被称为智能保护切换的技术（IPS），除了原有的那些基本特点外还具备了以下这些很好的特性
一，它的控制信号并不依赖于SDH的开销字节因此它可以运行在裸光纤或WDM这些非SDH基础上，非常灵活。
二，大家知道在Packet over SONET/SDH（POS）技术中传输用的SDH技术和上面所载IP服务是分开的，彼此是互不知道的。因此当下面的环结构有问题时SDH可以在50ms内侦测到问题并且恢复，但由于在上面跑的IP路由协议（RIP、OSPF、EGP等的收敛是需要相当长的时间，有时需要几分钟的时间。因此整个服务就会出现中断。而DPT技术是IP awareness的，在光纤环上跑的SDH帧是能够知道在它上面是什么样的协议。IPS不仅仅在第一层而在所有的三层都监视并处理发生的事件，因此整个服务恢复都将在50ms内完成。而且像FDDI环一样容错功能极好在光纤环多处出现故障时也能保证其一定的正常运行。
三，即插即用操作 不想其它技术那样，DPT尽量地减少了在一个DPT环中插入或去掉一个节点时所需的一些繁琐复杂人工配置操作，一切都是自动的过程。包括：全局唯一，永久地分配MAC地址，从环中快速地插入一个新节点和删除一个原有的节点，环上事件的自动自愈处理，拓扑自动发现和动态分组路径选择。
现在来看一看DPT技术对IP业务的支持。首先它能支持具有分组优先的特性，数据包将被分类并定位为高优先级和低优先级两种，那些需要低延迟、抖动控制并要求带宽保证的高优先级分组将得到优先的处理，而那些低优先级的分组则将采取尽力而为的方式传输。其次，DPT环支持IP组播技术，因而其增强性的服务包括多点信息传送和高质量的视频广播。第三，具有带宽的良好可扩展性—DPT环提供了能进行线速处理和带宽倍增能力的又大又宽的管道来将丢包和延迟减至最低，并能轻松地从低至OC-12c/STM-4扩展到OC-48c/STM-16乃至OC-192c/STM-64c。最后，DPT技术的MAC层能和大量的IP的COS（Class of Services）等协同工作来提供第三层的服务。
DPT还提供了一个全面，综合，基于SNMP的网络管理模式，其中包括DPT环中的分组交换和分组传送两大网络部件的管理，具有事件，告警，当前和历史的近端及远端性能监测信息。不像目前现有的网管系统，为管理路由器网络及传输网络的需求各自分开有自己的一套特有的网络管理系统，即麻烦又复杂。
在接入技术上DPT环通过环状体系结构即能对本地的访问接入汇聚又能对MAN/WAN联接提供很好的有层次的支持。现在很多学校都在当地有关部门的大力支持下建立了自己的城域网，因此只要在几个主要节点上放置了GSR千兆位交换路由机后充分利用DPT技术的上述优点后就能将现有的网络技术容纳进来，也可将有线电视网经千兆比交换路由器GSR接至主干网。DPT环集合了高带宽，线路速率处理，优先级排列，以及第三层IP CoS（服务等级）于一体，如能再加上多协议标签交换技术（MPLS），实时传输协议（RTP）和实时传输控制协议（RTCP）的支持，提供优质的实时业务，满足巨量话音和视频流并保证所需的时延和抖动控制的要求应能在相当长的时间不成问题。Cisco GSR的分布式交换和传送体系结构使用了纵横开关结构和独立线路卡，能自主地处理千兆位路由处理器的信息包发送。这种新型体系结构设计可实现速度的不断提高，国外目前已有OC-192速度的成功应用了。如此下去在各城市间如能实现各环网的相交话，那一个能满足急剧增长需求的全国性的远程教育网络基础设施就将为我国的开放性教育做出应有的贡献
参考文献
1 多媒体技术基础及应用 林福宗 （清华大学智能技术与系统国家重点实验室）
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博恒系统与CTP设备的匹配与衔接
羊城晚报于1998年开始应用CTP设备，早期采用单套RIP对应一台CTP设备，即每台CTP设备由固定的RIP完成版面解释和点阵输出两大功能，负荷大，运行慢，不利于快速生产。而且当多台CTP设备同时工作，有1台CTP设备闲置，即有1套RIP闲置时，也无法将尚未输出的版面传输给闲置的RIP进行版面解释和点阵输出。
经过一段时间的试验后，羊城晚报于2001年10月建成印务中心（其离报社办公大楼10km远），购置了4台CTP设备，这时如果继续采用单套RIP对应1台CTP设备的方式，会大大降低CTP设备的使用率。于是，根据印务中心建立时的技术情况，即版面的RIP解释和点阵输出对计算机硬件要求较高，单套RIP完成两个关键任务的效率低下，不适合报纸出版，我们采用了一种灵活的处理方式，采用2～4套RIP组成一个RIP组，所有的版面解释工作完全由这个RIP组完成，而RIP组解释完成的点阵信息以文件的方式传送到点阵信息服务器，CTP设备的输出控制计算机从点阵信息服务器中读取数据并控制CTP设备输出（如图1所示）。这样只要有RIP完的点阵信息，任何一台空闲的CTP设备都可以进行版面输出，从而将原来的流水输出改为并行输出，大大节约了RIP解释时间，提高了CTP设备的生产效率。同时，该方式支持集群，可以大幅度提高整个系统的扩展能力，当生产能力需要提高时，只要增加相应的RIP或CTP设备就可以了。
基于这一思路，我们采用了以博恒系统为核心的数字化工作流程，并将点阵信息服务器分为发送服务器和接收服务器，中间通过光纤连接，如图2所示，其流程如下：编辑部签发的PS文件传到生产车间，车间工作人员在客户端进行拼版，对拼版后的文件进行标准化命名，并放入热文件夹中，PS文件服务器根据工作计划将拼版后的PS文件动态地分配到RIP服务器群进行解释，RIP解释后，将点阵信息文件存放到发送服务器上，发送服务器再通过专用通信协议将点阵信息文件传送至接收服务器，接收服务器根据工作计划动态分配点阵信息文件至CTP控制器，CTP控制器通过控制CTP设备输出印刷版面。该系统具有以下特点。
（1）灵活的流程管理。可以对CTP设备进行有效管理，均衡分配作业，从而大大提高CTP设备的使用效率。
（2）完善的协作处理能力。支持远程和本地客户的协作处理，能迅速检查和修正错误，从而减少出错导致的时间损失，加快整个流程的处理速度。
（3）良好的监控、浏览版面功能和版面输出反馈功能。
（4）支持一次RIP解释，多次输出，保证高速生产的需求。
随着企业的不断发展以及新CTP设备的引进，这种流程在生产中也逐渐暴露出了一些问题，例如，自动化程度低，管理和控制环节多，流程的一致性不好，质量难以控制；由于技术条件和标准的限制，PS格式的文件须经RIP解释成TIFF文件进行输出，有时会出现无法解释、内嵌EPS拼版出错等非经常性错误，且有时印刷出来的效果与客户的要求有所差异，容易导致质量纠纷；以RIP技术为核心的博恒系统在控制CTP设备、印刷彩色印品时比较复杂，不便于节墨系统、全媒体管理系统等的开发应用。而且，近几年，软件开发商也停止了对博恒系统的升级和维护。
基于上述原因，原有系统的技术和性能已不能满足应用需求。同时，综合信息管理平台（EIP）的建成和采编系统的应用也迫切需要引入一套与之兼容的数字化工作流程。
畅流系统与CTP设备的匹配与衔接
为了建立完善的工艺流程，使CTP设备的性能得到最大程度的发挥，在综合考虑了整体技术的先进性、升级成本、平稳过渡（系统切换时不影响生产）以及设备之间的性能匹配等各方面因素后，羊城晚报于2008～2011年购买了以畅流系统为核心的数字化工作流程以及3套爱克发紫激光报业CTP （Advantage N-DL） 设备。畅流系统采用标准的PDF/JDF开放格式，涵盖了报纸生产的各工艺环节，包括文件接收、文件规范化处理、边空调整、拼版计划、PDF挂网、CTP输出控制等，并可实现这些环节的统一控制与管理。由于畅流系统采用PDF内核技术，兼容性和稳定性更强大，从而避免了以往数字化工作流程中经常出现的版面文件无法解释、解释出错、内嵌EPS拼版出错等问题。
畅流系统的制版流程如下：编辑部排版后生成的PS文件传送到印前制版部门，通过畅流系统的规范化器对PS文件进行版心识别、边空调整等规范化处理，按照生产计划进行PDF挂网，从而处理成可用于CTP等设备输出的点阵信息。所有功能模块由主控服务器统一进行管理和调配，操作人员在网内任意客户端即可完成相关作业操作，并能监控版面数据处理的状态，检查版面是否符合后端印刷要求，提前发现缺字、缺图等问题，并及时报警提示。而且由于所有功能模块都集中在一个工作传票上统一操作，制版速度大大加快。经实际测算，一个版面从提交作业至畅流系统处理（包括打样、节墨处理）再到CTP输出，只需3～4分钟，而利用原有的数字化工作流程，作业通过拼版、打样、博恒RIP再到CTP输出，需要6～7分钟，可见，利用畅流系统几乎可节约一半时间。
此外，由于羊城晚报印务中心需要输出的CTP版较多，为了使各台CTP设备的负载均衡，我们又增加了PRODUCER服务器。PRODUCER服务器上装有CTP作业队列管理软件Arkitex Producer，其可以根据CTP设备的性能、负载以及使用的版材尺寸自动分配任务，确保有多台CTP设备时，能够将作业发送到空闲CTP设备上，并从主控服务器上获取版面信息，通过CTP驱动软件NewsDrive控制版面输出，从而保证在最短的时间内完成生产任务。同时，Arkitex Producer还能保证同一版面的所有色版由同一台CTP设备输出，即使是后期补版，其也能追踪到原来的CTP设备并进行版面输出，确保套印准确。
经过试验、试用、应用等阶段，我们逐渐熟悉和掌握了畅流系统的技术特点，并根据实际生产需求，配置和完善了所需功能模块，并逐渐把所有印前相关设备和软件进行了统一管理，建立了报纸印前生产管理调度中心，畅流系统的优势也逐渐显现。例如，畅流系统可将印前流程中的各独立功能模块进行系统集成与整合，使生产控制和流程管理得到统一，完善了整个制版流程，提高了生产效率，使业务分布处理和管理集中统一的预期效果得以实现；采用业界标准的开放格式和模块化设计，具有很好的兼容性和扩展性，随着报社的发展、业务量的提高和设备的增加，只需要增加相应的模块就能对系统进行快速扩展；其版面预览功能更直观、准确，避免了原有软件多次拼版可能出现的错误和造成的时间损失，能有效降低出错率及提高报纸印刷质量。
但是随着使用的不断深入，笔者认为畅流系统仍存在一些问题。
（1）设置用户权限后，即使已经限制某用户只能对一种报纸进行操作，但用户进入畅流系统后，仍然能够读取并修改无操作权限报纸的生产计划和拼版模板。
（2）当畅流系统的监控模块无法使用时，畅流系统无错误信息提示，只有重启服务器才能解决此问题。
（3）一些细节的操作界面仍需完善。例如，点阵中继系统功能中没有显示作业提交时间的窗口；作业栏窗口没有自动刷新功能，操作人员只能手动刷新，从而影响工作效率。
（4）有时经畅流系统处理后生成的PDF文件中的个别字体与数码打样样张上的字体不一致。
ppt结束语范文3
全书共20章。1.Python编程101：对使用Python语言编程进行总体介绍，包括创建对象、对象调用方法、运算符重载、读取文件方法、XML文件等内容；2.计算复杂度：包括计算机体系结构介绍、常见的计算复杂性、摊销复杂度的方法等；3.递归：包括时栈和堆的概念、简单递归函数的编写、运行，递归计算机图形学、列表与字符串等；4.排序：包括选择排序、归并排序、快速排序、链表、栈和队列等内容；5.集合与映射：数独游戏介绍、集、散列等相关概念，最后分析规划问题；6.树：抽象语法树和表达、前缀和后缀表达式、解析前缀表达式、二叉搜索树等内容；7.图：包括图的定义及理论、存储结构及算法实现、Kruskal算法、Dijkstra算法、图的表示方法等；8.Bloom过滤器、Trie数据类型等相关内容；9.堆：包括堆的主要思想及其建立、排序算法、与其他算法的比较等；10.平衡二叉搜索树：二叉搜索树的概念、存储结构与性质、AVL树与 Splay树等具体实例；11.B树：包括关系型数据库的概念、B树的组织结构、优势、实现、B树的插入与删除等内容；12.启发式搜索：包括深度优先搜索与广度优先搜索、A*搜索、最佳搜索等相关内容；13.附录A：整数操作符；14.附录B：浮算子；15.附录C：字符串运算符和方法；16.附录D：列表操作符和方法；17.附录E：字典操作和方法；18.附录F：Turtle方法；19附录G：TurtleScreen方法；20.附录H：完整的程序。
作者Kent D.Lee博士是美国艾奥瓦洲路德学院计算机科学教授，已成功出版两本著作：Python编程基础和编程语言基础。另一作者Steve Hubbard博士是路德学院数学与计算机科学系教授。
本书介绍了初级与高级的数据结构和算法问题，每一章开始提供了学习目标，复习题和编程练习，以及众多的例证；同时在相关的网站提供可下载的程序和补充文件。本书可以作为计算机学科相关专业的教材或参考书，同时对计算机科技工作者也有参考价值。
ppt结束语范文4
【关键词】 结核分枝杆菌
【Abstract】 AIM: To explore the protective efficacy of the DNA vaccine encoding Mycobacterium tuberculosis MPT64 in mice infected with Mtb. METHODS: C57BL/6 mice were intramuscularly immunized with the DNA vaccines or BCG (i.d.). The mice were challenged with 106 CFU H37Rv via lateral tail vein 35 d after the third immunization for DNA vaccine groups and 100 d after for BCG vaccinated group. The mice in the vaccinated groups and control groups were sacrificed 42 d after challenge. The lungs and spleens were removed respectively and the number of CFU in organs and histopathologic changes were determined. The antibody level， IFNγ， IL4 and the survival time in all of the mice were evaluated. RESULTS: The antibody titer of pcDNA/MPT64 group was higher than that of other groups (P
【Keywords】 Mycobacterium tuberculosis; MPT64; DNA vaccine
【摘要】 目的： 研究MPT64 DNA疫苗对鼠结核杆菌感染的免疫保护效果. 方法： C57BL/6小鼠36只，随机分为4 组. A组（PBS）、B组（pcDNA3.1）、C组（BCG）、D组（pcDNA/MPT64）；分别于胫前肌注射质粒DNA免疫，70 μg/次， 1次/2 wk，共3次. 末次免疫后5 wk用106 CFU H37Rv经尾静脉攻击，攻击后6 wk处死小鼠，测血清总IgG，特异性脾淋巴细胞增殖实验、IFNγ及IL4分泌水平. 作脾、肺组织荷菌量和病理学检查以及观察小鼠存活时间. 结果：MPT64基因疫苗诱导小鼠特异性IgG的产生、脾淋巴细胞增殖以及IFNγ的分泌. MPT64 DNA免疫组肺、脾组织荷菌量，病理学改变和小鼠存活时间明显优于阴性对照组. 结论：MPT64 DNA疫苗在抗结核分枝杆菌(Mtb)感染过程中具有一定免疫保护作用.
【关键词】 结核分枝杆菌； MPT64； DNA疫苗
0引言
DNA疫苗是20世纪90年展起来的一种崭新的免疫接种技术，是继减毒活疫苗、亚单位疫苗之后的第3代疫苗，具有免疫效果良好、尤其是能诱导CTL的形成和性质稳定、生产简便、价格低廉等优点而倍受青睐［1，2］. MPT64是结核分枝杆菌(Mtb)早期分泌蛋白中免疫保护作用比较确切的抗原成分之一，我们在已经构建MPT64真核表达质粒并证实能在小鼠体内诱导特异性体液和细胞免疫应答的基础上，进一步研究其在小鼠体内抗Mtb感染的能力.
1材料和方法
1.1材料
Mtb H37Rv标准株(中科院微生物菌种保藏中心)； pcDNA3.1+，pcDNA/MPT64和E.coli DH5α由本教研室收藏; Endo free质粒抽提试剂盒(Qaigen公司)； IFNγ ELISA试剂盒(上海森雄生物公司); 冻干皮内注射用卡介苗（BCG）、PPD标准品(成都市生物制品研究所). SPF级雌性C57BL/6健康小鼠36只，6~8 wk，体质量18~22 g(重庆医科大学实验动物中心).
1.2方法
按说明书抽提质粒DNA，紫外分光光度计定量. 动物随机分为4 组，每组9只. A组（PBS， 100 μL）、B组（pcDNA3.1， 70 μg）、C组（BCG）、D组（pcDNA/MPT64， 70 μg）；分别于胫前肌注射75 g/L利多卡因和质粒混合物（1∶4，100 μL）. 间隔2 wk免疫1次，共3次. C组于每只小鼠胸壁皮内注射0.3 mL（相当于0.1 mg），含活菌1×106 CFU. 将经过小鼠体内毒力复苏的H37Rv转种于改良罗氏培养基上， 37℃保湿培养2 wk；自罗氏培养基上刮取生长良好的干菌落用体积分数为0.0005的吐温生理盐水研磨成3 mL的菌悬液，每0.3 mL菌悬液含M.H37Rv 1×106 CFU活菌1 mg. 攻击时间为BCG接种后100 d和末次质粒DNA免疫后5 wk，于每只小鼠尾静脉注射0.3 mL菌悬液，实施攻击；攻击后6 wk各组处死5只小鼠，测外周血总IgG，作PPD特异性脾淋巴细胞增殖实验，测量IFNγ，IL4分泌水平，取肺、脾作荷菌量测定和病理学检查等；余下的4只小鼠用来观察其自然存活时间(采用T50法， Scand J Immunol， 1992;36:307).
1.2.1肺、脾荷菌量及病理学检测无菌手术取左全肺，称取一定量的左肺组织加入经过灭菌的5 mL组织匀浆器中，加2 mL灭菌生理盐水，研磨成匀浆；用40 mL/L硫酸2 mL中和，摇匀后静置15 min，以此原液作10倍梯度稀释；选取3个稀释度的悬液100 μL，分别涂布于3个经过37℃复温的改良罗氏培养基上（含BCG抑制剂2thiophenecarboxylic acid hydrazide 2 mg/L），37℃保湿培养4 wk，进行菌落计数，计算每1 g肺组织的荷菌量. 脾组织荷菌量检测同肺组织. 肺、脾病理学检测：取右上肺叶和部分脾组织用40 g/L多聚甲醛固定，石蜡包埋切片，分别行抗酸染色和HE染色.
1.2.2免疫学评价① ELISA法检测血清特异性抗体. PPD标准品100 μL/孔（10 mg/L）包被酶标板，4℃过夜. 1 g/L牛血清白蛋白封闭30 min，洗涤后加入不同稀释度的待检血清，二抗为HRP酶标羊抗鼠IgG，DAB显色，波长490 nm测吸光度（A）值. 以正常鼠血清作阴性对照，A值0.05以上、A实验组/A对照组≥2.1为阳性. ②特异性淋巴细胞增殖实验. 分别分离各组小鼠的脾淋巴细胞，用含10 g/L FCS的RPMI 1640调整细胞密度为2×107/L，活细胞数为90%以上，200 μL/孔加入96孔细胞培养板中，实验组每孔加入5 μL PPD，对照孔不加PPD，调零孔不加淋巴细胞；37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养68 h后，每孔加入20 μL MTT（5 g/L溶于PBS，pH 7.2），继续培养4 h后终止培养，1000 r/min离心10 min，吸弃上清，每孔加入DMSO 150 μL，振荡10 min，测A570 nm值，结果用刺激指数（stimulation index，SI）=A实验组/A对照组表示. ③IFNγ的诱导和测定. 用含10 g/L FCS的RPMI 1640调整细胞密度为5×107/L，200 μL/孔加入96孔细胞培养板中，同时每孔加入5 μL PPD，37℃ 50 mL/L CO2孵箱培养72 h后，每组5个孔的培养液混合，5000 r/min离心5 min，取上清-20℃冻存备检. IFNγ的含量的检测用ELISA的方法，以IFNγ的标准品作标准曲线计算IFNγ的含量.
统计学处理: 所有计量资料用x±s表示. 采用SPSS软件包进行处理，方差不齐时应用秩和检验.
2结果
2.1免疫小鼠血清抗PPD IgGMtb尾静脉攻击后6 wk pcDNA/MPT64组抗PPD抗体滴度明显高于其余各组（P
2.2免疫小鼠脾淋巴细胞增殖BCG和pcDNA/MPT64免疫组小鼠脾淋巴细胞在体外经PPD刺激后，可引起淋巴细胞显著的增殖反应，其SI超过PBS组2倍以上；空质粒免疫组小鼠淋巴细胞增殖不明显，SI低于1.3(Tab 1). BCG组与pcDNA/MPT64组间差异有显著性（P
2.3免疫小鼠脾淋巴细胞特异性IFNγ分泌PBS和空质粒免疫组小鼠IFNγ分泌不明显. BCG组与pcDNA/MPT64组间差异显著(P
2.4 免疫小鼠肺、脾组织荷菌量BCG组和MPT64 DNA疫苗组明显低于对照组（P
2.5免疫小鼠肺组织病理Mtb尾静脉攻击后6 wk小鼠肺组织切片抗酸染色PBS对照组(Fig 1A)：Mtb呈多片簇状分布，数目众多. BCG组(Fig 1B)：Mtb呈零星分布，数目较PBS和pcDNA3.1+组(Fig 1C)明显减少. pcDNA/MPT64组(Fig 1D)：Mtb呈小簇状和散在分布，数目较PBS和pcDNA3.1+组明显减少，但比BCG组为多. Mtb感染后6 wk小鼠肺组织HE染色镜下病理改变：PBS和pcDNA3.1+组：肺组织充血、实变，部分肺泡结构消失，可见数量不等的浆液纤维素性渗出液、少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润以及明显的坏死灶，未见结核肉芽肿形成. pcDNA3.1+组病变程度比PBS组稍轻. BCG组：肺少量充血，渗出比B组轻；肺泡壁轻度肿胀、增厚，可见由上皮样细胞、多核巨细胞和少量淋巴细胞组成的结核肉芽肿，未见坏死灶. pcDNA/MPT64组：可见数量不等的浆液纤维素性渗出液及少量淋巴细胞和巨噬细胞浸润，结核性肉芽的形成不明显.
2.6动物存活时间观察200 d各组小鼠50%死亡的平均时间. BCG组无1例死亡，PBS和空质粒组的平均存活时间分别为59 d和75 d，MPT64 DNA疫苗的平均存活时间为95 d.
3讨论
目前，结核病仍然是严重威胁人类健康的主要传染病之一. 由于BCG的免疫效果不稳定，寻找一种比BCG更有效的抗Mtb感染的疫苗已经成为当务之急. MPT64是Mtb的早期培养液蛋白成分之一，Mr 23 000，由mpt64基因编码，ORF为687 bp. MPT64仅存在于Mtb的H37Rv， H37Ra， Erdman及BCG的一些亚株如Tokyo， Moreau， Russian株之中， 而BCG 的其他亚株Glaxo， Pasteur， Canadian， Tice， Danish 1331和麻风分枝杆菌则缺乏该基因. MPT64是重要的T细胞抗原，主要诱导特异性CTL的形成和IFNγ的分泌，也能诱导体液免疫［3，4］. 在本实验中H37Rv攻击后6 wk，免疫小鼠的PPD特异性抗体较对照组均有不同程度的增加，以pcDNA/MPT64组最高， BCG组次之. PPD特异性脾淋巴细胞增殖应答和IFNγ分泌水平，BCG组和pcDNA/MPT64组显著升高，说明pcDNA/MPT64 DNA疫苗和BCG一样在小鼠体内诱导了免疫记忆，当再次遇到相同抗原刺激时便激活了更为强烈的细胞和体液免
从肺脾器官荷菌量，组织病理改变和动物存活时间来看，阴性对照组（PBS和pcDNA 3.1）菌落计数（CFU和抗酸染色）都较高，肺组织主要病理改变为大量的浆液纤维素性渗出、极少的炎症细胞浸润和不同程度的灶性坏死，动物存活时间最短；脾组织病理表现不典型，多为淋巴细胞增生和组织细胞浸润. 阳性对照组（BCG）荷菌量较低，肺、脾组织都可见到大量的淋巴细胞增生、组织细胞浸润，肺组织还可看到大量类上皮细胞的聚集和结核肉芽肿的形成. pcDNA/MPT64 DNA免疫组荷菌量也较其PBS和空质粒组明显减低，但是增生性改变没有BCG组明显. 以上结果提示，MPT64 DNA疫苗对鼠Mtb感染有明显的保护作用，MPT64可作为结核病新型疫苗的候选抗原之一.
参考文献
［1］ Doherty TM， Andersen P. Tuberculosis vaccines: Developmental work and the future［J］. Curr Opin Pulm Med， 2000; 6(3): 203-208.
［2］ Enserink M. Driving a stake into resurgent TB［J］. Science， 2001; 293(5528): 234-235.
ppt结束语范文5
[关键词] 神经细胞；膜片钳技术；单细胞RT-PCR
[中图分类号]R34 [文献标识码]A [文章编号]1673-7210（2008）04（a）-015-02
膜片钳技术(patch-clamp technique)是1976年由Neher和Sakmann[1]在电压钳基础上发展而来的一种记录细胞膜离子通道电生理活动的技术。后经Hamill[2]等进一步完善，其电流测量灵敏度已达1 PA,空间分辨率达1 m，时间分辨率达10 s，并已发展出许多适合不同需要的记录模式。它能分辨通过细胞膜单个通道的电流,对通道电导及其动力学特性、药理学特性和调节机制进行研究，为通道分型提供了可靠标准；同时它扩展了电生理技术的应用范围，以往难以研究的哺乳类动物小细胞或脆性很大的细胞等，均可采用膜片钳技术进行研究。另外，应用膜片钳技术还可准确监测出与细胞分泌相关的膜电容的微小变化，因而它还是一种研究细胞分泌机制的电生理新方法。
聚合酶链式反应（polymerase chain reaction,PCR）技术是一种在体外由引物介导的特定DNA序列的酶扩增，能快速特异的扩增所需目的基因或DN段，是一种用途广泛且有效的核酸扩增技术。目前，PCR技术已广泛应用于基因分离、克隆和核酸序列分析，突变体和重组体构建，基因表达调控研究及基因多态性分析等。RT-PCR是将RNA的反转录（RT）与cDNA的PCR相结合的技术。首先经反转录酶作用从RNA合成 cDNA，再以cDNA为模板，扩增合成目的片段。RT-PCR技术灵敏且用途广泛，可用于检测细胞中基因表达水平，细胞中RNA病毒含量和直接克隆特定基因的cDNA序列。
膜片钳与单细胞RT-PCR相结合的目的是为了确定单细胞内多基因表达的方式。该技术应用于神经细胞的研究, 从电生理学和分子生物学角度揭示了神经细胞功能活动与结构之间的相互联系,使单个神经细胞离子通道的生物物理学和药理学特性得以表现，同时可以在同一细胞筛选出特异性的mRNA表达。
1基本原理
Eberwine等[3]于1991年首先将膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合起来，具体方法是:将逆转录酶、dNTP(DNA合成底物)及引物等在膜片钳记录之前加到电极内液中，使细胞内mRNA在膜片钳记录过程中即被逆转录生成cDNA，然后对生成的cDNA进行PCR扩增，扩增产物通过凝胶电泳进行分析。这两种技术的结合可对形态相似而电活动不同的细胞做出分子水平的解释。
1995年，美国哈佛大学医学院的Sucher和斯坦福大学的Deitcher[4] 在Neuron杂志上发表文章，首次介绍了膜片钳与单细胞RT-PCR技术结合在单个神经元研究中的应用，在完成对神经元离子通道的药理学和生物物理学特性观察后，研究同一细胞上特异mRNAs的表达情况。其具体操作是:在严格防止RNA酶污染的条件下先完成全细胞膜片钳记录，再将该细胞内容物吸入到记录电极中,然后用所研究的离子通道亚单位特异性引物将取自单细胞的mRNA逆转录成cDNA后进行PCR扩增，进而检测特异的mRNA。
膜片钳技术既可以对单细胞电生理功能进行研究，又可以借助其电极形成的吸收通道，吸取单个细胞，对其进行单细胞水平的分子生物学研究。借助于膜片钳电极，在相差显微镜观察下，直接用电极将待选取的单个细胞吸取出来，将其转入Eppendorf管，然后进行RT-PCR.
2研究进展
2.1分析神经元离子通道
Srinivasan Kanumilli等[5]运用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，对成年鼠小脑和小脑蒲肯野神经元中的CaV2.1转录本进行表达分析，发现单个小脑蒲肯野细胞虽然表达多种CaV2.1转录本，但其种类比小脑中的少。他提出不同类型的CaV2.1转录本可在不同脑区和脑神经元中进行选择性表达。Mechaly I等[6]应用膜片钳和单细胞RT-PCR研究2种不同类型哺乳动物的可兴奋细胞（海马神经元和非神经头发囊状上皮细胞），发现在这两种细胞中Nav1.2 mRNA 和Nav1.6 mRNA表达最多,而Nav1.3 mRNA 和Nav1.7 mRNA分别在胚胎海马神经细胞和新生儿的头发囊状上皮细胞有适度表达。Lidong Liu等[7]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术，在分离的2~5个月的SD雄性大鼠前舌蕈状味觉感受器细胞上研究延迟整流钾(DRK)通道的表达，发现其上有许多种来自KCNA, KCNB和 KCNC 亚家族的DRK通道，其中 Shaker Kv1.5通道(KCNA5)是蕈状味觉感受器细胞主要的DRK通道。
2.2观察神经元受体分布
Whyment等[8]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析新生大鼠脊髓交感神经元组胺受体mRNA的表达，观察到75％交感节前神经元表达H1受体的mRNA而未表达H2，H3和H4受体的mRNA。该研究首次报道了交感节前神经元中表达H1受体，并推测组胺通过对H1受体直接的突触后效应对交感节前神经元的兴奋性进行调节。Julia E. Fries等[9]应用膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究增殖性玻璃体视网膜病变病人视网膜Müller 细胞中P2Y受体亚型的类型，发现Müller 细胞表达P2Y1，P2Y2，P2Y4，P2Y6受体。Sergeeva OA等[10]在急性分离的TM神经元中,运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究AMPA受体特征。发现所有神经元上都有AMPA受体GLUR2的mRNA，75%的神经元有GLUR1的mRNA，其次是GLUR4（56%）, GLUR3（0％）。
2.3分析神经元的分子基础
Sosulina L等[11]运用膜片钳、单细胞RT-PCR及无监督聚类分析方法,依据电生理特性和分子参数的不同把大鼠侧杏仁核神经元分成五类。第一类是投射神经元，此类神经元具有低发放频率，对长期去极化刺激具有频率适应性等电生理特性并表达囊泡膜谷氨酸转运体1（VGLUT1）。其根据电紧张性的不同和是否存在血管活性肠肽（VIP）又分class IA和class IB两类。其余四类都是含有谷氨酸脱羧酶(GAD67)的中间神经元。第二类神经元产生快速棘波，并伴有一些早期的频率适应。第三类神经元无频率适应而产生快速棘波，它与第两类神经元的区别在于后者存在VIP和相对较少的神经肽Y(NPY)及生长抑素(SOM)。第四类和第五类通过分子标记不能明确区别，但可根据膜电位值和棘波图形的不同进行区分。Hüttmann K等[12]通过膜片钳和单细胞RT-PCR技术研究顽固性颞叶癫痫病人的侧杏仁核神经元特性，发现投射性神经元具有棘状树突, 不同程度频率适应性的动作电位和γ-氨基丁酸受体耦联的内向整流K+通道(Kir)。而中间神经元的树突无棘或很少棘,动作电位小且常常是自发的,且无γ-氨基丁酸受体。单细胞RT-PCR发现，在投射神经元中表达Kir通道亚型Kir3.1 和Kir3.2及囊泡膜谷氨酸转运体VGLUT1和VGLUT2；而中间神经元也表达Kir通道亚型Kir3.1 和Kir3.2，但其缺乏VGLUT1 和VGLUT2受体。结果表明,根据形态学、电生理和分子生物学标准可以区分人脑杏仁核投射神经元和中间神经元。
2.4研究药物对神经细胞的作用
Zhong CB等[13]运用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析急性分离的东莨菪碱诱导的认知缺损的大鼠海马锥体神经元延迟整流钾电流的特征以揭示由胆碱能损伤导致记忆缺失的离子机制。他发现海马锥体神经元IK电流密度增大、振幅峰值变高；Kv2.1 mRNA增加,而Kv1.5 mRNA没有明显的改变，提示海马锥体细胞Kv2.1 mRNA表达增加可能是IK增加的原因及东莨菪碱诱导记忆缺陷的离子基础。Mark Fry等[14]应用全细胞膜片钳和单细胞RT-PCR技术分析了Adiponectin对大鼠最后区（AP）神经元的作用，观察到60％大鼠AP神经元对Adiponectin敏感，且对Adiponectin敏感的所有AP神经元均表达AdipoR1 and AdipoR2 两种Adiponectin受体。
3展望
膜片钳与单细胞RT-PCR技术相结合应用于神经科学领域的研究, 从分子生物学和电生理角度揭示了神经细胞的功能活动与结构之间的相互联系，也使得检测单个细胞的基因改变成为可能。该技术能够精确地研究特定单细胞的基因表达，成为研究功能基因组学的有力工具。而许多疾病的发生都是由于单个细胞的分子改变引起的，因此准确地找到发生改变的细胞对于疾病的诊断、机制的研究及防治都有重要的意义。但由于对技术的高度要求以及对外界干扰的高度敏感，单细胞RT-PCR 的应用受到了一定的限制。因此这项技术在体系上有待于进一步的完善，在应用上有待于进一步的扩展。
[参考文献]
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[3]Eberwine J,Yeh H,Miyashiro K,et a1.Analysis of gene expression in single Live neurons[J].PANS,1992,89:3010-3014.
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2、设置目录和超链接，为了使PPT条理清楚，目录是很必要的，这样可以让听众对你所要表达的内容有一个总体的把握。此外，建议使用超链接实现目录——分页面之间的跳转，从而能在播放中实时汇报播放进度。
3、图文并茂，以图为主，PPT不宜通篇都是文字，显得页面单调乏味，毫无设计感。设计页面时，可以适量加入一些图片，与文本信息相辅相成。注意PPT上的信息只应该起指示性作用，详细内容要由讲解人自己通过语言表述完成，而不是直接朗读PPT。
4、图文视觉效果要清晰，因为PPT最终要播放出来给人们观看，所以在设计页面的时候要留意一下播放效果。不光要在电脑上预览，还要脑补一下，播放在大屏幕上，坐在稍远处的人们是否能够看得清播放的内容。因此需要考虑图片、文字的大小，以及与背景的对比度等。
5、根据场合适量使用动画
6、PPT自带的动画功能适当使用一些能为整体效果增色不少。但是应以点缀为主，不要太过花哨以致喧宾夺主。并且需要考虑一下播放场合，试想，如果是十分严肃重要的会议，而你播放的PPT总在不停地“掉星星，下雪花”，就很不合时宜了。