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【摘要】
目的 探讨癫痫大鼠放射治疗中γ-氨基丁酸(GABA)及其受体的作用机制并选择合理放射剂量。方法 利用慢性点燃癫痫大鼠对照组、放射1组、放射3组进行0、24、6Gy的X线放射，对放射2组、放射4组和放射5组行12Gy的X线放射，每组10只，对照组和放射1组、放射3组于放射后1h断头取脑，放射4组于放射后1天、放射5组于放射后1周进行断头取脑，并观察放射5组其放射后癫痫发作情况，用氨基酸分析仪测定各组癫痫大鼠额叶皮层内的GABA含量变化，利用免疫组织化学方法观察抗GABAA受体阳性率。结果 放射5组于照射后1周内癫痫在鼠未出现诱发癫痫发作。放射1组的GABA含量为(254.16±44.68)ng，GABAA受体阳性率为(39.56±7.22)%，均明显高于对照组，12Gy照射后1h、24h、1周后均较对照组间GABA含量高，其中以24h最为明显，分别为(252.09±33.89)ng，(348.73±56.00)ng和(258.02±62.95)ng。抗GABAA受体阳性率在照射后1周内基本稳定于较高水平。结论 放射治疗癫痫主要是通过发生快速而持续的GABA与GABAA受体变化发生作用，癫痫大鼠接受12Gy的放射治疗较为合理。
【关键词】 γ氨基丁酸 受体 GABA-A 癫痫 大鼠 X线
Abstract: Objective To investigate the role of GABA and GABAA receptor play in radiotherapy of epileptic rat， and to look for the appropriate dose of radiotherapy for epilepsy. Methods A chronic pentylenetetrazole chemical kindling rat model of epilepsy was reproduced， and the rats were pided for control group and radio groups 1 to 5 with 10 rats in each group. Control group， groups 1 and 3 were given 0， 24， or 6Gy X ray irradiation to the brain in turns， and groups 2， 4 and 5 were given 12Gy X ray irradiation， the rats in control group， groups 1， 2， and 3 were killed 1 hour， and group 4 was killed on day 1， and group 5 was killed in 1 week after radiotherapy. Content of GABA was measured by amino acid analyzer， and GABAA receptor changes were assessed by immunohistochemical staining in frontal lobe of the brain of rats in all groups. Seizure of rat in group 5 were recorded in 1 hour， 24 hours or 1 week after irradiation. Results The epileptic rats in group 5 didn't suffer from seizure after radiotherapy. In group 1， the quantity of GABA was (254.16±44.68)ng，and positive rate of GABAA receptor was (39.56±7.22)%， which were higher than those in control group， the content of GABA in rats received 12Gy X-ray radiotherapy were (252.09±33.89)ng， (348.73±56.00)ng and (258.02±62.95)ng in 1hour， 1day and 1 week after irradiation， and significant higher than that in control group， also， the positive rate of GABAA R in those rats were significant higher than that in control group. Conclusions The efficacy of radiotherapy for epileptic rat might be attributable to rapid and sustained change in GABA and GABAA receptors， and 12Gy appeared to be the appropriate irradiation dose for epileptic rat.
Key words: GABA; receptor，GABA-A; epilepsy; rats; X-rays
临床发现放射治疗对癫痫发作可能有抑制作用，但其作用机制尚不明确。在癫痫的发作与治疗机制中γ氨基丁酸(gamma-aminobutyric acid，GABA)占有主导地位，本研究旨在通过观察X线照射对大鼠皮层内GABA和GABA A型受体(GABA A type receptor，GABAAR)α1亚单位含量的影响，探讨放射治疗癫痫的有效性及其可能的作用途径。
1 资料与方法
1.1 实验动物与分组
清洁级SD (Sprague Dawley)大鼠60只（本院实验动物中心提供），6～7周龄，体重(200±10)g。第一次实验40只，随机分为对照组、放射1组、放射2组、放射3组，第二次实验在前次实验基础上选择合理的放射剂量对其余20只大鼠进行放射，随机分为放射4组、放射5组。
1.2 仪器与试剂
戊四氮（pentetrazole， PTZ）、兔抗GABAAR α1亚单位抗体（G4416）购自美国Sigma公司、液体DAB酶显色试剂盒和酶标抗兔多聚复合物购自福建迈清公司，混合氨基酸标准液购自日本味之素公司、日立#2622-SC树脂氨基酸分析柱、日立L-8500氨基酸分析仪。
1.3 癫痫模型建立［1］
所有大鼠均每日上午9：00～10：00时给予PTZ 35mg/kg腹腔注射，连续1个月，注射后观察20min，癫痫发作分级标准参照Racine的方法。放射前所有大鼠及放射4、5组取样前1h均进行腹腔注射PTZ，放射5组在放射治疗后第4天再进行腹腔注射PTZ 1次。
1.4 放射治疗
用氯胺酮与速眠新（2∶1）混合液腹腔注射（0.8mg/kg）对所有大鼠进行麻醉，麻醉后1h内利用垂直X线对大鼠头部进行放射，放射1组剂量为24Gy，放射2、4、5组均为12Gy，放射3组剂量为6Gy，对照组剂量为0Gy。
1.5 组织标本采集［2］
1～3组照射后1h内进行断头取脑，放射4组照射后24h进行取脑，放射5组照射后1周进行断头取脑，取出大脑后用滤纸吸去血液，脑组织置于胶片包裹的冰面上。
1.6 组织匀浆和GABA含量分析
取下左侧额叶组织150mg放入匀浆管中并加入1.5ml磺基水杨酸，匀浆管置于0℃水中利用超声匀浆器破碎，在4℃低温高速离心机（1 5000r/min）离心15min，取上清液0.5ml，置于-81℃低温冰箱保存，1周内完成氨基酸含量分析。将样品融化后，用针头式滤器（0.45μl）过滤样品，在日立氨基酸分析仪上进行GABA测定，进样量为10μl，缓冲液流速0.4ml/min。
1.7 病理切片和免疫组织化学分析
取0.5cm×0.5cm大小右侧额叶组织，石腊包埋4μm胶片(APES+丙酮)切片，常规脱蜡至水，0.3%过氧化氢溶液封闭处理10min，PBS溶液冲洗3次，微波抗原热修复10min，PBS液冲洗3次。然后分别加入一抗抗GABAAR α1亚单位抗体（1∶200稀释），室温1h 孵育，PBS液冲洗3次，然后加入二抗酶标抗兔多聚复合物30min，PBS液冲3次，DAB加过氧化氢混合液显色，5min后水冲洗，苏木素复染细胞核，酒精梯度脱水，二甲苯透明后中型树胶封片，镜检分析。阳性细胞率为在10个高倍镜（10×40倍）时同一视野内阳性细胞数/同类细胞总数。
1.8 统计学分析
用SPSS 10.0统计软件进行统计分析，测定数据用（±s）表示，样本间按成组资料进行方差分析（F检验），然后进行Q检验组间比较。
2 结果
2.1 癫痫模型的建立及生存情况
大鼠出现Racine 3级以上发作在开始注射后的7～25天开始，至1个月时所有大鼠均在停药3天后重新注射PTZ可以出现3级以上发作，主要表现为双上肢阵挛、坐起、全身抽搐、跳起阵挛等症状。放射4、5组X线治疗大鼠在麻醉后3h恢复正常活动与饮食，无死亡，观察过程中未记录到癫痫发作情况。
2.2 不同剂量X线放射后GABA含量的测定
对氨基酸分析试测定放射1、2、3组与对照组间的GABA含量变化情况见表1。其中放射1、2组较对照组GABA含量高差异均有显著性。表1 不同放射剂量GABA含量及抗GABAARα1亚单位阳性率(略)
2.3 放射后不同时间内的氨基酸含量变化
氨基酸分析试测定12Gy放射后1h、1天、1周后与对照组间的氨基酸含量变化。其中放射各组均较对照组GABA含量高、抗GABAARα1亚单位阳性率高，且差异均有显著性，以放射后1天（4组）最为明显。见表2。表2 放射后不同时间GABA含量及抗GABAARα1亚单位阳性率 (略)
2.4 免疫组织化学结果
阳性细胞时GABAARα1亚单位存在于神经胶质细胞内，表现为核呈深棕色染色。阳性细胞率见表1，表2。
3 讨论
对脑肿瘤、血管畸形等疾病引起的症状性癫痫的放射治疗后发现癫痫症状有不同程度的好转，从而提示放射治疗对癫痫发作可能有抑制作用。Regis［3］用γ刀治疗16例颞叶癫痫的患者，随访1年中81%达到完全缓解，且除1例出现无症状性视野缺损外无明显并发症，但Srikijvilaikul［4］报道5例颞叶癫痫患者利用Regis同样的方法进行20Gy放射治疗，2例术后1年内死亡，另外3例均无效。所以放疗治疗癫痫的有效性及其可能的作用机制有待进一步研究。
GABA能神经元占大脑神经元的40%，当GABA含量下降超过40%时就可能出现癫痫发作。现有的抗痫药物也多是通过GABA产生作用，如苯二氮艹卓、苯巴比妥、丙戊酸是通过增加GABA的抑制，而新的抗痫药物的研究方面更加突出GABA的作用［5］，如氨己烯酸、加巴喷啶则、噻加宾等。GABA主要的作用是通过与突触部位的GABA受体结合而产生中枢兴奋的抑制作用，癫痫发作除了与GABA含量有关外还与GABA受体有关。GABA-R有多种类型［6～8］，其中主要包括A、B、C三种类型，Nishimura［6］等在电刺激癫痫持续状态和化学点燃的大鼠动物模型中都发现GABAAR的早期和持续的下降(43%～78%)，而B受体却有不同程度的升高，说明变化的最主要的是A受体。在A型受体中，又有很多的亚单位组成，Macdonald等［7］发现原发性强直—痉挛性癫痫与GABAAR的基因突变有关，而且不同亚单位的突变与不同的发作类型有明显的相关性。Ni等［8］发现在癫痫大鼠中不论是单次发作还是多次发作组中均有GABAAR α1亚单位的减少。本研究也选用了α1亚单位。
所以如果X线放射的方法使神经元中的GABA或者GABAARα1亚单位含量增加都可能产生抗痫作用。本研究显示癫痫大鼠在接受12～24Gy放射治疗后表现为GABA和GABAARα1亚单位含量的增加，而在6Gy的放射并不引起GABA的明显变化，说明在12～24Gy的X线放射都可能产生抗痫作用。长期效果的观察中发现GABA或者GABAARα1亚单位含量增加都可以在放射后24h达到高峰，并维持在较高水平达到1周以上，特别是GABAARα1亚单位在放射后1周内基本无明显的含量变化。而通过动物的癫痫发作情况也证实在治疗后癫痫未再见有自发或诱发的癫痫发作，与GABA和GABAARα1亚单位的增加结果相一致，说明这两个因素可能参与了X线照射后产生的抗痫作用，而且在早期就产生抗痫作用且维持时间较长。Ananeva等［9］认为低剂量照射后GABA的受体结构变化可能是影响突触电活动的主要因素。
放射治疗的剂量存在比较大的争议，尚不能确定多大的放射剂量对脑组织产生影响可以消除或减少癫痫的发作。Sun［10］在大鼠的海马癫痫模型上进行10、40Gy的放射治疗，发现40Gy组在放电频率和持续时间上都明显减少，而10Gy组效果不良。低剂量对脑组织无明显的细胞学的改变，而大剂量可以达到150Gy，此时则可引起明显的组织坏死和脑水肿，在癫痫治疗中应选择一个最低有效剂量，达到治疗的同时降低或避免脑组织损害。本研究中选择了6、12、24Gy三组剂量，发现后两组病例较对照组有明显的GABA和GABAARα1亚单位的增多，而两组间差异无显著性，且12Gy放射组中的这两者的增多也可能维持较长时间，所以12Gy应当是一个较为合理的癫痫治疗剂量，但对于大鼠治疗剂量与人类剂量间的关系尚待进一步研究。
参考文献
［1］Schandra AA， Mazarati AM， Godlevsky LS， et al. Chemical kinding: implications for antiepileptic drugs sensitive and resistant epilepsy models ［J］. Epilepsia，1996，37(3):269-274.
［2］王升旭，李求实.睡眠剥夺对大鼠脑组织氨基酸递质含量的影响［J］.第一军医大学学报，2002，22(10):888-890.
［3］Regis J， Bartolomei F， Rey M， et al. Gamma knife surgery in mesial temporal lobe epilepsy ［J］. J Neurosurg，2000，93(S3):141-146.
［4］Srikijvilaikul T， Najm I， Foldvary-Schaefer N， et al. Failure of gamma knife radiosurgery for mesial temporal lobe epilepsy: report of five cases ［J］. Neurosurgery，2004，54(6):1395-402.
［5］Czapinski P， Blaszczyk B， Czuczwar SJ. Mechanisms of action of antiepileptic drugs ［J］. Curr Top Med Chem，2005，5(1):3-14.
［6］Nishimura T， Schwarzer C， Gasser E， et al. Altered expression of GABA(a) and GABA(b) receptor subunit mRNAs in the hippocampus after kindling and electrically induced status epilepticus ［J］. Neuroscience，2005，134(2):691-704.
［7］Macdonald RL， Gallagher MJ， Feng HJ， et al. GABA(A) receptor epilepsy mutations ［J］. Biochem Pharmacol，2004，8(8):1497-506.
［8］Ni H， Jiang YW， Bo T， et al. C-Fos， N-methyl-d-aspartate receptor 2C， GABAA-alpha1 immonoreactivity， seizure latency and neuronal injury following single or recurrent neonatal seizures in hippocampus of Wistar rat ［J］. Neurosci Lett，2005，380(1-2):149-54.
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光棍节，光棍节，还真是到了那天就光棍啊！我无奈的抿了抿嘴。我看不透我的内心，我不知道我喜不喜欢他，但是，真的分了之后就感觉挺遗憾的吧。又成了一个人。如果当时能忍忍，现在何必这么痛苦。
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后来，我见到那个混头了，很吊的样子，带着学妹，身后跟着几个兄弟，那男的很帅，个子还比学妹要高一些。学妹看到我自然一笑。后来我们就不怎么联系了，学妹面临毕业季，我面临学业抉择。
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后来要和冬雪找对象的那个男孩就去了冬雪的老家，养育冬雪成人的爸爸妈妈和冬雪表明了想法，那个男孩也同意，就这样就算是把婚事定下来了。决定等秋后冬雪去那男孩家。冬雪太小，那时根本不懂考虑以后，和那男孩也没有怎么相处，就这样的把终身大事决定了。这一草率决定导致冬雪一生的痛苦。那个男孩在冬雪老家住了几天，准备回家了，冬雪送他去车站的时候，那男孩给了冬雪二斤粮票，五元钱，冬雪高兴的收下了。
那男孩回去以后，冬雪下地也不受气了，村里人都说冬雪和她亲生妈妈认了，也有了婆家了。人都羡慕不已，对冬雪一改以前的做法，做活也很照顾，也不提冬雪是地富子弟了。
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我妈咪准得说:“这要我闺女,敢这么丢人现眼,我就往派出所销户去。”这话是我在心里揣摩的,我妈咪这人浑身铮铮铁骨,女八路一样,看不惯一切歪风邪气。
半天,我问身旁边嗑瓜子边看电视的妈咪:“以您这老红娘的眼光,今天有能成的吗?”妈咪说:“这不就是娱乐节目吗?有正经人吗?人家根本不缺对象,来玩儿的。”
透彻!仔细看看那些名媛,光说长相,层次就挺多样的,有一女的满脸横肉一丝笑容没有,身上还裹着套美声唱法歌唱家的行头。也有长得漂亮的,当众表示不图物质就要感情,说话都是王菲版“我愿意为你”的味儿,软绵绵的调调,上来男的都选择她,但这闺女谁都看不上,依然场场屹立于节目之中。傻子都能看出这就是个托儿啊,黑婚介的惯用招数,可一旦上了电视,打110都没用。
我分析了一下,来参加这节目找对象的,都是刚从钱眼儿里捞上来的,估计回去全能拿个精算师资格证。
我那天看见一小伙有来砸场子的苗头,满嘴小品腔儿,穿得倒西装革履。他找对象有仨条件,其他两条我忘了,因为相比火爆的这条,那两个条件太普通了。那男的说,女的必须年薪在两百万到三百万之间。这时候,众多女宾抢答,有涵养的还举手示意主持人自己有话要说。把情绪的东西剔除,骂大街的语言不算,总结成为一句话:“有病吧你?”是够有病的,跑这趟雷来了,就算真有这想法,一般骗子也不直接说,法制频道不总给咱提醒吗?
在这节目里倍儿有名的一女的说:“宁愿坐在宝马里哭,也不愿坐在自行车上笑。”坦言自己喜欢奔驰和宝马,交过的男友七八个仅是零头,时不时就对看不顺眼的男嘉宾来句“听你说话,我就觉得你欠抽”,还有女的说:“我要选择的是男人中的精英,精英中的人才,人才中的王子”。人家要豪宅,要求男朋友月薪必须二十万,甚至握手的价钱也得二十万。
我妈看得倍儿美,最后用简洁语言点评了一下所有女嘉宾:“这些人,怎么有点神似坐台小姐?节目应该归扫黄办管管。”
从这一档婚托儿当道,假戏真做的红娘节目看,现代人的价值观可见一斑。女的是满脑子帅哥、宝马、豪宅、富二代,她们巴不得不努力,不奋斗,一切的一切最好都由男人提供,等着吃现成的。男的呢,虽然不那么裸,但眼睛里也没那么纯净,希望女的也有钱,要吃要喝要浪漫要美貌,还得多要几个孩子,当众藐视计划生育国策。
节目结束的时候,我妈咪边倒瓜子皮儿边说:“这些人也成年了,怎么不知道尊重人呢?”
关灯,睡觉。
【原载2010年第6期《报
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感觉最后我们两个人都到过彼此曾经有过的生活都在曾经参与了我们的生活，都在曾经对我们的时光造成了一定的影响，在那一段时光里面留下了彼此的脚印。所以现在一定是抹不掉过去对自己的影响了，包括以后可能时间会淡化我们对彼此的感情，我们对现在这一份失去的难过。可是当时对方来过我们的生活中，这也是对我们以后的一些选择造成了一定的影响。
我想一定会的一定就是这样子的，就像自己看那些文章，虽然最后他们都从失去前任的难过中走出来了，可是他们终究还是会把前任和现任做对比，自己有在想，如果我遇到的不是行政那样子的人，那现在自己看到的那些文章，可能他们所选择的对象就不是那样子的了，毕竟总是会不自觉的就拿两个人做对比吧，那多少也是因为前面来过的那一个人，对自己现在的一些选择造成了一定的影响。
我觉得对我的话肯定也是会的，毕竟自己现在都会想着，以后找对象的时候就不要找，像他这样子的了，就不要找这种自己很喜欢，但是却不够爱自己的人，会觉得以后在感情中就不要刻意的去隐藏自己的情绪，要找那些心思细腻的人，可以感受到我情绪的人，可以在我提早说晚安的时候，请问起我究竟是怎么了？多给一些心理上的陪伴吧。
感觉挺悲哀的，那一段失败的经历最后成了抹不掉的记忆，成了对我们人生中抹不掉的影响。希望最后我们所做出的选择都没有错吧，都可以让我们开开心心快快乐乐的，虽然说有的时候自己会觉得他要是没有最终跟我在一起，他怎么可以开开心心快快乐乐的呢？他会真的喜欢另一个人吗？他会真的把完全全部的温柔都放到另一个人身上吗？
